Summary
Este protocolo apresenta metodologia para realizar o crescimento de biofilmes e medições de biomassa utilizando dispositivos de placa PCR de poço profundo auto-montados para triagem de biofilme de tampa estática de alta produtividade de 96 bem-equipados.
Abstract
Biofilmes bacterianos são difíceis de erradicar de superfícies usando intervenções antimicrobianas convencionais. Métodos de microplacas de alta produtividade de 96 poços são frequentemente usados para cultivar biofilmes bacterianos para testes rápidos de suscetibilidade antimicrobiana para calcular valores mínimos de concentração de erradicação de biofilm (MBEC). Os dispositivos de biofilme padrão consistem em tampas de poliestireno instaladas em microplacas de 96 poços e são ideais para medir biomassa biofilme e valores MBEC, mas esses dispositivos são limitados pela área de superfície de pino disponível para acúmulo e custo de biomassa. Aqui, delineamos um protocolo para usar o dispositivo de tampa pcr de placa pcr de auto-montado 96-bem profundo para cultivar biofilmes de escherichia coli BW25113 e pseudomonas aeruginosa PAO1. Uma comparação de biofilmes 24 horas formados em dispositivos de poços padrão e profundo por cada espécie usando manchas de biomassa violeta cristalina e ensaios de determinação do MBEC são descritos. A maior área de superfície de dispositivos de poços profundos aumentou a formação global de biofilmes por ambas as espécies 2-4 vezes. P. aeruginosa formou-se significativamente maior biomassa/mm2 em pinos de poços profundos em comparação com o dispositivo padrão. E. coli apresentou maior biomassa/mm2 em dispositivos de poliestireno padrão em comparação com o dispositivo de poço profundo. Ensaios de erradicação de biofilmes com desinfetantes como hipoclorito de sódio (alvejante) ou cloreto de benzalkonium (BZK) mostraram que ambos os compostos poderiam eliminar biofilmes de E. coli e P. aeruginosa de ambos os dispositivos, mas com valores diferentes de MBEC. A erradicação do biofilme BZK resultou em valores variáveis de E. coli MBEC entre os dispositivos, no entanto, o alvejante demonstrou valores de MBEC reprodutíveis para ambas as espécies e dispositivos. Este estudo fornece um método de poço profundo de alto rendimento para o crescimento de grandes quantidades de biofilmes em dispositivos de polipropileno para estudos a jusante que requerem maiores quantidades de biofilme estático.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli são proteobactérias gram-negativas que são comumente estudadas por sua capacidade de formar comunidades celulares sessile, ligadas à superfície conhecidas como biofilmes1. Ambas as espécies, ao crescerem como biofilmes, podem segregar uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) compostas principalmente de diferentes polissacarídeos e proteínas, que também podem incluir DNA extracelular e/ou lipídios, fornecendo proteção celular adicional e maior sobrevida em ambientes severos e limitados a nutrientes2,3. A fisiologia e a formação de biofilmes por ambas as espécies são de relevância clínica, pois representam os cinco patógenos antimicrobianos mais isolados do sangue hospitalar, trato urinário e infecções pulmonares no Canadá4,5. Também é importante notar que estima-se que os biofilmes compõem cerca de 80% de todas as infecções crônicas e recorrentes causadas por essas espécies bacterianas6. Devido às substâncias EPS secretadas e à atividade metabólica mais lenta7,8, os biofilmes estabelecidos tornam-se mais difíceis de erradicar quando se formam em superfícies como dispositivos médicos implantados, tecidos cicatricais e nos pulmões de pacientes com fibrose cística9,10, aumentando sua resistência antimicrobiana.
As propriedades de crescimento recalcitrante de biofilmes bacterianos muitas vezes os tornam mais resistentes à inibição antimicrobiana e/ou erradicação2,9. Assim, estabelecer métodos in vitro para estudar a erradicação antimicrobiana bacteriana é primordial para a seleção de compostos eficazes para erradicar infecções quando se formam em plásticos médicos (por exemplo, cateteres em habitação) e implantes médicos. Os métodos de cultivo de erradicação antimicrobiana in vitro mais rápidos examinam o crescimento do biofilme como uma cultura de biofilme "estático" em vez de culturas "contínuas", onde o crescimento bacteriano estático é monitorado em estágios iniciais e tardios da formação de biofilmes em um curto (24-96 h) no mesmo meio de crescimento. Os métodos contínuos de biofilme são complicados para análise rápida, pois requerem o crescimento do biofilme avaliado em prazos mais longos cultivados em câmaras que permitem o fluxo contínuo e a substituição de meios de crescimento com menos réplicas11. Devido ao tempo e esforço necessários para manter e estabelecer biofilmes contínuos, biofilmes in vitro estáticos são os mais populares, pois são facilmente adaptados para ensaios de teste de suscetibilidade antimicrobiana de alta produtividade em placas de microtiter plásticas de 96 poços em vez de sistemas elaborados de câmara de fluxo que limitam o número de culturas testadas simultaneamente 12,13 . Os ensaios de microparstamento biofilme "em bem" mais simples estáticos "em poço" usam placas de microtiter de poliestireno padrão ou vinil (capacidade de 300 μL) para medir a formação de biofilmes nas laterais e nas partes inferiores de cada poço e muitas vezes como anéis no ar para a interface de superfície líquida. A formação de biofilme bacteriano é medida pela coloração da biomassa depositada aderida aos poços após a remoção do líquido médio de crescimento e lavada 12,13. Esses ensaios são economicamente populares, mas muitas vezes têm problemas de reprodutibilidade devido ao seu design inerente, uma vez que os biofilmes depositados são propensos a danos ou perdas durante a lavagem para procedimentos de recuperação celular e coloração de biomassa11,14.
Para reduzir as perdas de biofilme, os dispositivos comerciais de biofilme padrão melhoraram em projetos de microplaca de biofilme intrometido, adicionando uma tampa de poliestireno inserível de 96 bem atreladas ao design de placa padrão 96 em poço, referido como o "dispositivo biofilme padrão" aqui. A adição de uma tampa atrética expande a área de superfície disponível em cada poço de microplaca, permitindo maior adesão à superfície e formação de biomassa biofilm15,16. Os dispositivos de tampa de biofilme padrão permitem uma maior recuperação, remoção e lavagem de biofilm para testes subsequentes de suscetibilidade e erradicação de biofilm antimicrobianos quando tampas atreladas são inseridas em novas placas de microtátrica que contenham desafios de medicamentos ou condições de crescimento. Semelhante às técnicas de microplaca de biofilme em poço, os materiais recuperados dos dispositivos de tampa desarmada e lavada permitem testes de sobrevivência celular e coloração de biomassa biofilm, tipicamente envolvendo formulações de corantes cristal violeta (CV) 17,18,19. Os dispositivos de biofilme padrão também são ideais para a triagem de susceptibilidades antimicrobianas de biofilme. Esses ensaios monitoram a inibição do crescimento do biofilm de duas maneiras: 1) Quando os antimicrobianos são adicionados às células no início do crescimento, ele pode determinar o valor mínimo de concentração de inibição de biofilm (MBIC). 2) Quando os biofilmes estabelecidos são formados nos pinos após 24 horas e, em seguida, expostos a antimicrobianos, pode determinar o valor mínimo de concentração de erradicação de biofilm (MBEC) de 17,20. Semelhantes aos dispositivos microplata biofilme em poço, os dispositivos de biofilme padrão têm algumas limitações notáveis, como seu alto custo por dispositivo, eles são não autoclaváveis e menos duráveis para solventes químicos devido ao material da placa de poliestireno utilizado. Os dispositivos de biofilme padrão também têm uma baixa relação superfície/pino, que limita os volumes máximos de trabalho em cada poço a 200 μL. Esses fatores podem tornar os dispositivos de biofilme padrão mais desafiadores de usar para estudos que exigem maiores quantidades de biofilme em um formato de alto rendimento.
Aqui, descrevemos um método de biofilme estático de 96 poços desenvolvido em nosso laboratório usando placas de microfinano de 0,5 mL de 0,5 mL de 96 poços instaladas em placas de microtiter de 96 poços com poços mais profundos que a placa padrão (Tabela de Materiais). Estes dispositivos montados têm um volume máximo de trabalho de 750 μL quando usados para o cultivo de biofilme (aqui conhecido como "dispositivo de biofilme de poço profundo"). As vantagens de usar esses dispositivos de biofilme de poços profundos são seu menor custo quando comparados com dispositivos biofilm padrão, eles podem ser esterilizados por autoclaving, e aumentam a área de superfície para formação de biofilm no maior "tubo/pinos" externos. Com este método mostramos as aplicações desses dispositivos para o cultivo e caracterização da biomassa biofilme formada por Escherichia coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1. Métodos para determinar valores MBEC usando ensaios de erradicação de biofilm são descritos usando os antimicrobianos desinfetantes do composto de amônio quaternário (BZK) e hipoclorito de sódio (branqueamento). O BZK antisséptico/desinfetante foi selecionado, pois este composto é frequentemente usado para inibir biofilmes de superfícies contaminadas, mas é supostamente menos eficaz na erradicação de biofilmes bem estabelecidos21. Alvejante é um produto químico altamente eficaz para a erradicação de biofilmes estabelecidos e é um pilar na desinfecção química 22. Ambos os desinfetantes fornecem uma comparação útil dos valores mbec para cada dispositivo de biofilme21. Um protocolo para esta avaliação de dispositivo de biofilme usando ensaios de erradicação de manchas de CV e biofilm para determinação do MBEC é resumido neste artigo. Um fluxograma de protocolo foi incluído para uma visão geral simplificada do fluxo de trabalho para esses métodos (Figura 1).
Protocol
1. Preparação da cultura asséptica para o crescimento do biofilme (Dias 0-1)
- No dia 0, coloque diretamente a cepa bacteriana desejada para testes a partir de um estoque preservado por crio-condicionado (em glicerol ou dimetilsulfoxida (DMSO)) diretamente em uma placa de ágar nutriente com seleção antimicrobiana como a cepa exige. Incubar placas de ágar na temperatura ideal (37 °C) e tempo (18-22 h) para o crescimento da tensão.
- No dia seguinte (dia 1), inocular uma colônia da placa de ágar em 5 mL de mídia de crescimento em condições ideais de crescimento. Essas culturas serão utilizadas como inoculatos inoculados do dia 2 para dispositivos de biofilme (ver passo 2.2; Figura 1).
NOTA: Para este estudo, E. coli K-12 BW21153 e P. aeruginosa PAO1 foram cultivados em luria-bertani (LB) médio a 37 °C por 18 h com agitação a 160 revoluções por minuto (rpm).- Prepare pelo menos 3 cepas cultivadas independentemente para gerar réplicas biológicas para medição de biofilmes devido à variabilidade estatística da formação de biomassa biofilm nos dispositivos de tampa atreladas.
2. Preparação e inoculação de placas (Dia 2)
- Encha os poços externos de uma placa de polipropileno autoclaved de 96 poços, 1,1 mL/poço com 750 μL/água estéril (Figura 2A). Encha os poços de controle negativos (poços de mídia nãoculados; coluna B) com mídia de crescimento de 750 μL e os poços restantes com 675 μL de mídia de crescimento.
NOTA: Passo 2.1 acima e passos abaixo listam volumes apropriados para o dispositivo de biofilme de poço profundo. Se usar o dispositivo biofilme padrão, os volumes devem ser alterados da seguinte forma: 75 μL de cultura inóculo para 20 μL; 675 μL de mídia de crescimento para 180 μL; 750 μL de água estéril/mídia de crescimento a 200 μL; 800 μL de soluções de coloração/ácido acético/ácido acético/enxágue cv a 210 μL. Além disso, para a etapa 3.6 abaixo, a Absorvância a 500nm (A550 nm) pode ser lida diretamente na microplaca do poliestireno após a mistura ao usar a microplaca padrão do dispositivo biofilme. - Usando culturas noturnas do dia 1, padronize as culturas para uma densidade óptica a 600 nm (OD600nm) =1,0 ou a um padrão McFarland de 0,5-1 unidades.
- Crie uma diluição serial de 10 vezes de cada cultura padronizada em tubos de ensaio ou uma placa microtiter bem profunda de 96 poços até que uma diluição de 10-3 seja alcançada.
- Inocular a mídia contendo poços como mostrado na Figura 2B com 75 μL da cultura diluída 1 x 10-3 , para uma diluição bacteriana final em poço de 10-4.
- Insira cuidadosamente uma placa PCR autoclavada (tampa atrética) na placa de poço profundo inoculada. Incubar placas em condições ideais de tensão (37 °C) com agitação (máxima de 160 rpm) em uma incubadora com 50-60% de umidade para 24 h.
3. Determinação de biomassa biofilm de dispositivos que utilizam coloração CV (Dia 3)
- Asepticamente remova a tampa biofilmada de cada dispositivo e enxágue inserindo em uma placa de poço profundo autoclaved preparada com 800 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato estéril (PBS)/bem para 30 s para remover células planctônicas.
- Para coloração de CV de biomassa, transfira a tampa da placa PCR atrelada para uma nova placa preparada com 800 μL/well 0,1% (w/v) CV em dH2O e colora por 5 minutos.
- Remova o excesso de mancha enxaguando a tampa a fixada em uma placa de poço profunda preparada com PBS 800 μL/bem estéril. Deixe as placas secarem por 10 minutos em um armário de biossegurança com pinos voltados para cima.
- Transfira a tampa seca da placa PCR para uma placa contendo 800 μL/well 30% (v/v) de ácido acético e deixe a tampa descolorar por 5 minutos.
- Remova a tampa de pino PCR detida e misture bem a solução através da pipetação. Transfira 200 μL das placas de poços profundos para uma microplaca padrão de 96 poços e meça a absorvência da solução de destalagem a um comprimento de onda de 550 nm (A550nm) em um leitor de microplatos de alcance ultravioleta (UV)/ visível (Vis).
- Utilizando os valores medidos de A550nm , subtraia o valor médio em branco (controle negativo) de A550nm de cada valor amostral de biofilme. Em média, cada valor amostrado em branco de A550nm biofilme representando réplicas biológicas amostrais.
4. Desafiando biofilmes com antimicrobianos para calcular seu valor mbec antimicrobiano de 24 horas (Dia 3)
- Prepare uma solução de estoque antimicrobiano em água que é duas vezes (2x) a concentração da maior concentração antimicrobiana desejada a ser testada.
- Crie uma série de diluição dupla da solução de estoque antimicrobiano em 2x mídia de crescimento concentrada para que haja 8 concentrações antimicrobianas.
- Como mostrado na Figura 2B, encha os poços externos de uma placa de poço profundo autoclaved com 750 μL/água estéril. Encha as colunas B (controle negativo; sem bactérias) e C (controle positivo; sem exposição antimicrobiana) da placa com 750 μL/bem de crescimento. Encha os poços restantes com 750 μL/bem da série de diluição antimicrobiana, conforme mostrado na Figura 2B.
- Remova e enxágue a tampa afiada, conforme descrito na etapa 3.1 e transfira-as para a placa de desafio antimicrobiana.
- Incubar placas com agitação (máximo 160 rpm) em condições adequadas de tensão e para o período de exposição desejado.
5. Recuperação da biomassa biofilm de tampas atreladas (Dia 4)
- Remova as tampas expostas antimicrobianas e enxágue conforme descrito na etapa 3.1. Transfira a tampa fixada para uma placa de poço profundo com 750 μL/bem de recuperação nos poços internos e 750 μL/bem estéril dH2O nos poços externos.
- Para preparar 70 mL de mídia de recuperação, combine 35 mL de 2x concentrado LB, 0,7 mL de 100% interpolação-20, 3,5 mL de solução de neutralização universal 20x e 30,8 mL de dH2O estéril em uma garrafa estéril.
- Para preparar a solução de neutralização universal concentrada de 20x, adicione 1,0 g de L-histidina, 1,0 g de L-cisteína e 2,0 g de glutationa reduzida a um volume final de 20 mL de dH2O. O filtro esteriliza a solução através de um filtro de 0,2 μm e armazena a 4 °C.
- Coloque o dispositivo da etapa 5.1 em uma lixeira secundária instalada dentro de um banho de água sônico. Sonicar os dispositivos por 30 minutos para desalojar o biofilme de pinos para a mídia de recuperação.
- Após a sônica, remova a tampa atada e coloque uma tampa de tampa plana estéril na placa de mídia de recuperação de poços profundos. A tampa apetosa pode ser descartada.
- Incubar placas com mídia de recuperação da etapa 5.3 nas condições ideais de crescimento da tensão durante a noite (16-18 h).
6. Determinação dos valores mbec do dispositivo (Dia 5)
- No dia seguinte, transfira 200 μL de cada poço da placa de poços profundos incubada da etapa 5.4 para uma nova placa de microtiter de 96 poços. Leia o OD600nm de cada poço usando um leitor de microplacas de gama UV/Vis.
- Subtrair valores de controle negativo (não aquiculados) OD600nm de cada biofilme contendo bem a amostra.
- Calcule o valor mbec para cada amostra usando valores OD600nm , onde o valor MBEC é a menor concentração antimicrobiana que resultou no menor valor OD600nm (indistinguível do controle não vacinado) para uma espécie/amostra de cepa tratada antimicrobiana específica.
Representative Results
O objetivo deste estudo foi fornecer um método para a condução de medidas de dispositivos de biofilme de maior volume, de alto rendimento (96 poços), estáticos usando dispositivos de biofilme de poços profundos. Aqui, comparamos uma placa de PCR semi-contornada auto-montada inserida em uma microplaca de poço profundo, conhecida como o dispositivo de poço profundo, a um dispositivo de tampa padrão comumente usado para examinar suas capacidades de formar biofilmes estáticos. Foram utilizados ensaios de erradicação de biomassa e biofilm (MBEC) manchados de CV para avaliar a formação de biofilmes por ambos os dispositivos.
Para comparar a formação de biofilme por diferentes espécies em cada dispositivo, avaliou-se a biomassa biofilm formada por E. coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1 utilizando o protocolo de coloração de CV biofilm17. Embora a coloração cv seja geralmente relatada como valores A550nm, devido às diferenças nos volumes de crescimento de cada dispositivo e suas áreas de superfície disponíveis, convertemos valores de mancha CV A550nm em concentrações de CV molar em solução. As concentrações molares cv contabilizaram diferenças de volume de cada dispositivo e permitiram uma comparação das concentrações de CV representando biomassa recuperada de cada dispositivo. Os resultados mostraram que ambas as espécies produziram significativamente mais biomassa em dispositivos de biofilme de poços profundos (2,1 vezes E. coli; 4,1 vezes P. aeruginosa) em comparação com o dispositivo biofilme padrão (Figura 3A-B). Este resultado era esperado dada a maior área de superfície do pino pcr de poço profundo (320,4 mm2) em comparação com a área de superfície de pino do dispositivo padrão (108,9 mm2). Este achado também é consistente com o aumento dos volumes (750 μL) usados no dispositivo de biofilme de poço profundo em comparação com os poços de dispositivo padrão (200 μL). Assim, os dispositivos de poços profundos aumentaram o acúmulo de biomassa de biofilm em pinos de tubo PCR em comparação com pinos menores com dispositivos de biofilme padrão.
Ambos os dispositivos de biofilme formaram biofilmes reprodutíveis quando comparamos biofilmes biologicamente replicados formados por E. coli e P. aeruginosa (Figura 3A-B). Apesar de observar maior variabilidade na replicação técnica dos valores M A550nm manchados de CV para qualquer cepa cultivada no dispositivo do poço profundo, não houve diferenças estatisticamente significativas quando comparamos os valores médios de CV M para as réplicas biológicas de cada espécie nos dispositivos profundos ou padrão usando análise de variância bidirecional (ANOVA) ou testes T do Aluno (ambos p p > 0,05). Este achado mostra que a formação de biofilmes por bem profundo e dispositivos padrão formam biofilmes reprodutíveis. No entanto, os resultados da coloração cv também mostraram que, quando contabilizamos diferenças de área de superfície de pinos em cada dispositivo, a formação de biomassa biofilm por E. coli e P. aeruginosa mostrou diferenças estatisticamente significativas no acúmulo de biomassa (Tabela 1). O cálculo da média de biomassa manchada de CV (M) por área de superfície de peg em mm2 (CV M/mm2) para E. coli mostrou que a formação de biofilmes foi 1,5 vezes menor em dispositivos de poços profundos de polipropileno quando comparado com o dispositivo biofilme padrão (Tabela 1). No entanto, o resultado oposto foi obtido para P. aeruginosa, que demonstrou 1,4 vezes mais CV M/mm2 em dispositivos de poços profundos de polipropileno quando comparado com dispositivos de biofilme padrão (Tabela 1). Apesar das diferenças específicas das espécies observadas no acúmulo de biomassa de biofilm com cada dispositivo, o dispositivo de poço profundo ainda demonstrou maior formação global (2-4 vezes maior) de biomassa biofilm por cada espécie (Figura 3).
Para determinar as aplicações de teste de suscetibilidade antimicrobiana do dispositivo de biofilme de poço profundo, comparamos dois desinfetantes comumente usados, BZK e alvejante, para seu potencial de erradicação de biofilm. Ambos os produtos químicos são comumente usados para prevenir (BZK) e/ou erradicar (alvejante) biofilmes bacterianos em aplicações clínicas e industriais21,22,23. Cada composto foi adicionado no aumento de concentrações de 2 vezes aos biofilmes formados por E. coli e P. aeruginosa nos dispositivos de biofilme padrão e profundo 22,23 (Figuras 1, 2B). A menor concentração de BZK ou alvejante que resultou em valores de OD600nm que eram indistinguíveis dos poços de controle negativo foram definidas como o valor MBEC. O tratamento de biofilmes formados em dispositivos biofilmes padrão com alvejante resultou nos mesmos valores de MBEC alvejante de 0,625% para E. coli e P. aeruginosa (Tabela 1, Figura 4A-B). Os valores de MBEC de alvejante determinados para o biofilme E. coli e P. aeruginosa formados em dispositivos de poços profundos mostraram valores mbec 2-4 vezes menores por ambas as espécies (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313%) quando comparado com dispositivos padrão (Tabela 1). Uma diferença de 2 vezes nos valores de MBEC alvejante entre as espécies foi notada para o dispositivo de poço profundo, onde P. aeruginosa exigiu uma concentração 2 vezes maior de alvejante para erradicar biofilmes em comparação com E. coli (Figura 4A-B, Tabela 1). A diferença de 2 vezes alvejante MBEC entre P. aeruginosa e E. coli no dispositivo de poço profundo parece se correlacionar inversamente com uma formação de biomassa manchada de CV de 1,5 vezes maior por P. aeruginosa em comparação com E. coli (Figura 3A-B). A maior quantidade de biomassa formada por P. aeruginosa em pinos de dispositivos de poços profundos também pode explicar por que uma maior concentração de alvejante foi necessária para erradicar biofilmes P. aeruginosa quando comparado com E. coli em poços profundos (Figura 3A-B, Tabela 1). Assim, os ensaios de erradicação do biofilme do dispositivo profundo mostram que ambas as espécies eram suscetíveis ao alvejante, mas em concentrações alvejantes inferiores (2-4 vezes) em comparação com dispositivos padrão. Isso inversamente se correlaciona com a área de superfície de pino 3 vezes maior e volumes das pinos de placa PCR do dispositivo de poço profundo. Isso sugere que, para exposição alvejante, uma maior área de superfície de biomassa pode diminuir as concentrações de alvejante necessárias para a erradicação do biofilme.
Os testes de erradicação de biofilmes BZK mostraram maior variabilidade no crescimento recuperado (valores OD600nm) e mbec por cada espécie quando comparados aos resultados alvejantes (Figura 4C-D). Essa variabilidade não é inesperada com base em estudos anteriores mostrando que o BZK foi mais eficaz na prevenção da formação de biofilmes do que erradicar biofilmes bem estabelecidos24,25,26. Utilizando o dispositivo biofilme padrão, apenas os biofilmes P. aeruginosa tratados com BZK mostraram um valor MBEC consistente (2560 μg/mL) que foi 8 vezes menor do que o valor MBEC (20480 μg/mL) obtido para esta cepa no dispositivo de poço profundo (Tabela 1, Figura 4C). Esses resultados podem refletir diferenças nas quantidades de biomassa P. aeruginosa formada em superfícies profundas bem atreladas e composições plásticas quando comparadas com os pinos padrão do dispositivo. A erradicação bzk de biofilmes formados por E. coli tanto no poço profundo quanto nos dispositivos padrão foram igualmente pobres, resultando em uma ampla gama de valores BZK MBEC de 2560-40960 μg/mL para o dispositivo de poço profundo e 320-10240 μg/mL no dispositivo padrão (Figura 4D). Para E. coli, essa variabilidade foi explicada pelo momento ocasional em que os poços de replicação 1-2 apresentaram crescimento baixo, mas estatisticamente significativo, na mídia de recuperação, que aumentou o erro e reduziu a precisão de determinação do BZK MBEC com ambos os dispositivos (Figura 4D, Tabela 1). Essa variabilidade destaca a ineficácia do uso do BZK na erradicação dos biofilmes de E. coli, como observado anteriormente nos estudos24,25,26. Em contraste, os biofilmes P. aeruginosa poderiam ser erradicados de forma confiável pelo BZK em uma concentração definida com ambos os dispositivos, mas com uma diferença de concentração BZK de 8 vezes (Figura 4C). Em resumo, os valores mbec de erradicação BZK de biofilmes formados por P. aeruginosa mostram valores MBEC distintos com cada dispositivo, no entanto, ambos os dispositivos são igualmente pobres em distinguir fenótipos de erradicação BZK precisos de E. coli.
Assim, o método de dispositivo de biofilme de poço profundo descrito aqui é igualmente eficaz para formar biofilmes reprodutíveis quando comparado a um dispositivo biofilme padrão..
Figura 1. Visão geral do experimento. Dia 0 de isolamento de colônias únicas de estoque criopreservado; Dia 1 a inoculação da mídia de crescimento com colônias únicas; 2º dia de inoculação da placa de biofilme; Dia 3 CV de coloração ou desafio antimicrobiano; Dia 4 de sônica biofilm em mídia de recuperação; e dia 5 leitura OD600nm de placa de recuperação para determinar valores MBEC. Algumas imagens em figura fornecidas pela Servier Medical Art (smart.servier.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplos de layouts de placas mostrados para várias etapas do protocolo. A) A configuração final da placa para o crescimento inicial do biofilme de 24 horas utilizando culturas bacterianas do dia 1 de duas cepas bacterianas (E. coli e P. aeruginosa), cada uma com três réplicas biológicas. Os poços de controle negativos (cinza) são usados como controles de esterilidade (sem bactérias adicionadas). B) Configuração de placa para desafio antimicrobiano de biofilmes. As cores escurecida indicam o aumento da concentração antimicrobiana. Controle negativo são poços sem bactérias adicionadas (Cinza) e controles positivos são biofilmes sem exposição antimicrobiana (laranja). As tampas de pinos biofilmes retiradas do painel A são transferidas para esta placa de poço profundo para exposição antimicrobiana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A concentração molar (M) de E. coli BW25113 manchada de CV. (A) e P. aeruginosa PAO1 (B) biomassa biofilm recuperada de dispositivos padrão (círculos) e poços profundos (triângulos). A coloração cv foi medida pela leitura da absorção de CV em 550 nm (A550nm), e as leituras do poço profundo A550nm foram ajustadas por um fator de 3.809 (800 μL/ 210 μL) para explicar as diferenças de volume entre os dispositivos. A concentração molar cv (M) foi determinada pela lei Beer-Lambert (Concentração cv =A550nm/εl); onde o comprimento de caminho (l) de 210 μL na placa de microtitre inferior bem plano foi determinado como 0,56 cm e o coeficiente de extinção (ε) de CV em água a A550nm de 251500 cm-1M-139. Os resultados representam 9 réplicas técnicas de três réplicas biológicas de cada cepa cultivada como um biofilme e o valor médio de cada réplica biológica é mostrado como uma barra horizontal em cada parcela. Foram determinadas diferenças estatisticamente significativas na biomassa entre os dispositivos entre os valores medianos de replicação biológica utilizando-se um teste t-t emparelhado de duas caudas (E. coli p= 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) mostrado como barras com asteriscos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Determinação da concentração de MBEC antimicrobiano. Determinação da concentração de MBEC antimicrobiano para alvejante (A,B) e BZK (C,D) para dispositivos p. aeruginosa PAO1 (A, C) e E. coli BW25113 (B,D) quando cultivados em dispositivos biofilmes padrão (barras brancas) e poços profundos (barras cinzas). Os resultados foram determinados pela leitura do OD600nm de biofilme recuperado após a sônica em mídia de recuperação e incubação noturna. Poço profundo OD600nm foi ajustado por um fator de 3,75 (750 μL /210 μL) para contabilizar as diferenças de volume entre os dispositivos. Os resultados são representativos de três réplicas biológicas e as barras de erro mostram o desvio padrão entre as réplicas em cada concentração antimicrobiana39. Asteriscos (*) acima de cada parcela da barra indicam diferenças estatisticamente significativas nos valores de OD600nm de controles em branco com valores p < 0,05 usando cálculos t-test de duas caudas do Student. Símbolos de círculo (o) acima de cada parcela da barra indicam medições onde apenas 1 ou 2 réplicas tinham valores OD600nm estatisticamente significativos a partir de controles em branco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| BZK MBEC (μg/mL) | Alvejante MBEC (% v/v) | |||
| Tensão testada | Dispositivo profundo | Dispositivo padrão | Dispositivo profundo | Dispositivo padrão |
| E. coli BW25113 | 2560-40960 | 320-10240 | 0.156 | 0.625 |
| P. aeruginosa PAO1 | 20480 | 2560 | 0.313 | 0.625 |
| Dispositivo profundo | Dispositivo padrão | p-valor** | Mudança do fold (Profundo bem/ Padrão) | |
| Tensão testada | Média CV M*/ mm2 ± SD | Média CV M*/ mm2 ± SD | ||
| E. coli BW25113 | 1.99 x 10-8 ± 3.25 x10-9 | 3.03 x 10-8 ± 3.31 x 10-9 | 0.0176 | -1.52 |
| P. aeruginosa PAO1 | 8.01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 | 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 | 0.034 | 1.4 |
Mesa 1. Um resumo de E. coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1 significa valores M/mm2 de biomassa manchados de CV e valores MBEC de erradicação de biofilm para BZK e alvejante em vários dispositivos.
*Valores médios cv M/mm2 calculados utilizando valores de réplica biológica mediana cv m (Figura 3).
**p-valores determinados usando o teste T do aluno de duas caudas.
Discussion
Este estudo descreve métodos para o uso de um dispositivo de crescimento de biofilme estático de maior volume de 96 poços de alta produtividade envolvendo uma microplaca de poço profundo de polipropileno equipada com uma tampa de placa PCR semi-contornada para formação de biofilm (dispositivo de biofilme de poço profundo; Tabela de Materiais). Comparamos biofilmes gerados com este dispositivo a um dispositivo biofilme padrão de poliestireno comercialmente disponível (Tabela de Materiais). O método do dispositivo deep well utiliza as mesmas etapas e soluções metodológicas que o dispositivo padrão17 em volumes ajustados modificados para os dispositivos de poço profundo, tornando este dispositivo ideal para formação de biofilmes em larga escala e análise experimental. O crescimento de E. coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1, duas espécies Gram-negativas que são conhecidas por formar biofilmes, foram examinados por sua formação de biomassa e valores MBEC desinfetantes (BZK/alvejante) utilizando em ambos os dispositivos. A comparação da biomassa manchada de CV formada em pinos de cada dispositivo mostrou que tanto E. coli quanto P. aeruginosa formaram biofilmes com maior biomassa no dispositivo biofilme de poço profundo quando comparado com o dispositivo padrão (Figura 3A-B). O aumento da biomassa de biofilme refletiu a maior área superficial de pinos de poços profundos quando comparada com a área padrão da superfície do pino do dispositivo. Quando contabilizamos diferenças nas áreas de superfície de peg (mm2) com ambos os dispositivos, observou-se diferenças na formação de biomassa, onde a E. coli formou biomassa CV significativamente maior por mm2 em pinos de dispositivo padrão de poliestireno do que com os pinos de tubo PCR do dispositivo de poço profundo (Tabela 1). P. aeruginosa formou maior biomassa/pino mm2 manchados de CV em comparação com dispositivos padrão (Tabela 1). Esses achados podem destacar diferenças específicas das espécies na formação de biomassa de biofilm nos diferentes dispositivos.
Deve-se notar que a erradicação alvejante de biofilmes de E. coli e P. aeruginosa em dispositivos de poços profundos ocorreu em concentrações 2-4 vezes menores do que o dispositivo padrão (Figura 4A-B, Tabela 1). As diferenças nos valores de MBEC de alvejante identificados de cada dispositivo são provavelmente impactadas por diferenças nas formas de pinos do dispositivo (os "pinos" do poço profundo são tubos afilados e os pinos padrão são cilíndricos), diferenças de composição plástica (polipropileno versus poliestireno) e diferenças de volume (750 μL versus 200 μL). Por exemplo, P. aeruginosa tinha maior biomassa CV M/ mm2 em pinos de dispositivos de poços profundos quando comparado com dispositivos padrão, mas E. coli tinha menos biomassa em pinos de poços profundos (Figura 3). Isso sugere que as concentrações de desinfetantes necessárias para a erradicação do biofilme podem ser impactadas pela biomassa formada por cada espécie, bem como pela área de superfície disponível. Além disso, as diferenças na forma do pino do dispositivo podem influenciar várias condições de crescimento para determinadas espécies. Em nosso estudo, p. aeruginosa pode formar maior biomassa em pinos de poços profundos devido à sua maior área de superfície e aeração, uma vez que esta espécie é um aerobe obrigatório em contraste com E. coli, que é um anaerobe facultativo. Até o momento, não foram identificados estudos publicados que tenham comparado diretamente a formação de biofilme E. coli e P. aeruginosa em ambos os materiais de polipropileno27,28,29 e poliestireno30,31. No entanto, relatos de robusta formação de biofilme E. coli e P. aeruginosa têm sido observados em estudos independentes que examinam materiais de polipropileno ou poliestireno. Com relação aos Pseudomonads, muitos Pseudomonas spp. podem usar plásticos como polipropileno como potenciais fontes de carbono32. Assim, a disponibilidade deste dispositivo de biofilme de poço profundo de polipropileno é um avanço útil nos estudos estáticos de biofilme. O polipropileno é quimicamente mais durável que o poliestireno e é um material clinicamente relevante, pois é frequentemente utilizado em implantes médicos, suturas e malhas para hérnia ou cirurgias pélvicas33,34.
Embora a biomassa de biofilme tenha sido formada por ambos os dispositivos, o dispositivo de poço profundo apresentou variabilidade ligeiramente maior na biomassa com base no método de coloração CV e valores MBEC de erradicação de biofilm oD600nm para alvejante e BZK. Isso pode ser explicado por 3 fatores principais: 1) Dispositivos de poços profundos têm maior área de superfície de pino do que dispositivos padrão que foram angulares em comparação com pinos de dispositivo padrão. 2) Ambas as espécies testadas podem ter habilidades diferentes para aderir a materiais de polipropileno e poliestireno de cada dispositivo. 3) Os volumes de mídia de crescimento utilizados em cada dispositivo (750 μL profundo bem, padrão de 200 μL) e espaçamento entre o pino inserido para as paredes laterais do poço diferem. Esses problemas não são um problema se apenas um tipo de dispositivo for usado para todos os experimentos de biofilm, no entanto, se ambos os dispositivos forem selecionados, as comparações aqui conduzidas devem ser realizadas para identificar diferenças36,37. Devido às diferenças no material plástico utilizado em cada dispositivo, a biomassa biofilm manchada de CV e os valores mbec não devem ser diretamente comparados entre diferentes dispositivos. No entanto, se métodos e experimentos forem realizados no mesmo dispositivo (bem ou padrão profundo), os resultados obtidos para espécies e antimicrobianos testados são comparáveis.
Este protocolo mostra que os dispositivos de placa PCR de poço profundo auto-montados são dispositivos de biofilme de maior volume para medir a formação e erradicação de biofilmes que também é econômico. Do ponto de vista de custo, dispositivos de biofilme padrão com uma gama de 96 tampas bem atreladas variam de varejo a US$ 29-36 dólares americanos (USD) por dispositivo (Tabela de Materiais). Os dispositivos biofilm padrão de poliestireno não são autoclaváveis e são menos tolerantes a solventes/ácidos devido às suas propriedades químicas plásticas. As placas de poços profundos de polipropileno auto-montadas descritas aqui, equipadas com uma placa de 96 bem-contorno (Tabela de Materiais) auto-montadas custam um total de US$ 14 por dispositivo montado, o que é metade do custo padrão do dispositivo biofilme. Deve-se notar que os preços podem variar dependendo da região, distribuidor e disponibilidade, e nossos custos após descontos institucionais trabalhados para US$ 9 USD/deep well device. Estes dispositivos auto-montados de placa de polipropileno de poço profundo têm a vantagem adicional de serem autoclaváveis para esterilização e oferecem 2-4 vezes mais biomassa de biofilme do que dispositivos padrão.
Em conclusão, este protocolo e os achados representativos das comparações de crescimento de biofilmes dos dispositivos de biofilme profundo e padrão mostram que ambos os dispositivos são capazes de cultivar biofilmes bacterianos, mas dispositivos de poços profundos formam 2-4 vezes mais biofilm. O dispositivo de biofilme de poço profundo oferece uma alternativa viável e acessível para experimentos de formação de biofilm de alto volume, como estudos de triagem de suscetibilidade a medicamentos. Esta técnica pode gerar biofilmes úteis para extrações a jusômicas (ensaios proteômicos, metabólicos, transcriptômicos) ou experimentais (enzimáticos, fluorescentes) que podem exigir maiores quantidades de materiais biofilmes para análises. O dispositivo de biofilme de poço profundo é recomendado para laboratórios que gostariam de estudar biofilmes em um ensaio de alta produtividade de 96 poços usando materiais plásticos de menor custo, maior volume e quimicamente duráveis que são clinicamente relevantes.
Disclosures
Os autores não têm revelações para fazer.
Acknowledgments
O financiamento para este trabalho foi fornecido por subvenções operacionais ao DCB do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) e à MRM e GRG do programa Government of Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) (GRDI7 2254557).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| 2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
| Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
| Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
| crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
| Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
| Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
| Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
| L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
| L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
| L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
| MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
| McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
| McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
| NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
| PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
| Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
| Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
| sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
| Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
| Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | --- | materials for deepwell device sterilization |
| Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
| Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
| Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
| Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |
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