Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ערכת כלים בקוד פתוח: מערך מיקרו-אלקטרוניקה של סיבי פחמן עבור הקלטת עצבים

Published: October 29, 2021 doi: 10.3791/63099
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 1,4,5,6
1Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Massachusetts Lowell, 4Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, Ann Arbor, 5Neuroscience Graduate Program, University of Michigan, Ann Arbor, 6Robotics Graduate Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

כאן, אנו מתארים מתודולוגיית ייצור עבור מערכי אלקטרודה סיבי פחמן להתאמה אישית להקלטה ב vivo בעצב ובמוח.

Abstract

בדיקות עצבים היקפיות קונבנציונליות מיוצרות בעיקר בחדר נקי, הדורשות שימוש בכלים יקרים ומתמחים מאוד. מאמר זה מציג תהליך ייצור "אור" חדר נקי של מערכי אלקטרודות עצביות סיבי פחמן שניתן ללמוד במהירות על ידי משתמש חדר נקי חסר ניסיון. תהליך ייצור מערך אלקטרודות סיבי פחמן זה דורש רק כלי ניקוי אחד, מכונת תצהיר Parylene C, שניתן ללמוד במהירות או במיקור חוץ למתקן עיבוד מסחרי בעלות שולית. תהליך ייצור זה כולל גם איכון ידני של מעגלים מודפסים, בידוד ואופטימיזציה של טיפים.

שלוש אופטימיזציות הקצה השונות שנחקרו כאן (לייזר Nd:YAG, מבער ולייזר UV) גורמות למגוון גיאומטריות קצה ועוכבה של 1 kHz, עם סיבים מבערים וכתוצאה מכך העכבה הנמוכה ביותר. בעוד ניסויים קודמים הוכיחו יעילות אלקטרודה לייזר מבער, מאמר זה גם מראה כי סיבים לחתוך לייזר UV יכול להקליט אותות עצביים ויוו. מערכי סיבי פחמן קיימים אינם כוללים אלקטרודות מחולקות לטובת חבילות או דורשים מדריכים מפוברקים בחדר נקי לאוכלוסייה ובידוד. המערכים המוצעים משתמשים רק בכלים שניתן להשתמש בהם בספסל לאוכלוסיית הסיבים. תהליך ייצור מערך אלקטרודות סיבי פחמן זה מאפשר התאמה אישית מהירה של ייצור מערך בתפזורת במחיר מופחת בהשוואה לבדיקות זמינות מסחרית.

Introduction

רוב המחקר במדעי המוח מסתמך על הקלטת אותות עצביים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה (ePhys). אותות עצביים אלה חיוניים להבנת הפונקציות של רשתות עצביות וטיפולים רפואיים חדשניים כגון מכונת מוח וממשקי עצב היקפיים1,2,3,4,5,6. מחקר סביב עצבים היקפיים דורש אלקטרודות הקלטה עצביות מותאמות אישית או זמינות מסחרית. הקלטה עצבית אלקטרודות - כלים ייחודיים עם ממדים בקנה מידה מיקרוני וחומרים שבירים - דורשים קבוצה מיוחדת של מיומנויות וציוד כדי לפברק. מגוון בדיקות מיוחדות פותחו לשימושי קצה ספציפיים; עם זאת, זה מרמז כי ניסויים חייבים להיות מתוכננים סביב בדיקות מסחריות זמינות כיום, או מעבדה חייבת להשקיע בפיתוח של בדיקה מיוחדת, שהוא תהליך ממושך. בשל המגוון הרחב של מחקר עצבי בעצבים היקפיים, יש ביקוש גבוה לבדיקת ePhys רב-תכליתית4,7,8. בדיקה ePhys אידיאלית תכלול אתר הקלטה קטן, עכבה נמוכה9, ונקודת מחיר מציאותית מבחינה כלכלית ליישום במערכת3.

אלקטרודות מסחריות נוכחיות נוטות להיות אלקטרודות חיצוניות או חפתים (Neural Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff Electrode11), שיושבות מחוץ לעצב, או תוך-פשוליות, החודרות לעצב ויושבות בתוך הפשיזם של העניין. עם זאת, ככל שאלקטרודות חפתים יושבות רחוק יותר מהסיבים, הן קולטות יותר רעש מהשרירים הסמוכים ומפשקים אחרים שאולי אינם המטרה. בדיקות אלה נוטות גם לכווץ את העצב, אשר יכול להוביל biofouling- הצטברות של תאי גליה ורקמת צלקת - בממשק האלקטרודה בזמן הרקמה מרפאת. אלקטרודות תוך-חשמליות (כגון LIFE12, TIME13 ו-Utah Arrays14) מוסיפות את היתרון של סלקטיביות פאשיסטית ובעלות יחסי אות לרעש טובים, החשובים בהפלת אותות למתממשקים במכונה. עם זאת, בדיקות אלה יש בעיות עם תאימות ביולוגית, עם עצבים הופכים מעוותים לאורך זמן 3,15,16. כאשר נרכש מסחרית, שתי בדיקות אלה יש עיצובים סטטיים ללא אפשרות להתאמה אישית ספציפית לניסוי והם יקרים עבור מעבדות חדשות יותר.

בתגובה לבעיות העלות וההתאמה הביולוגית הגבוהות המוצגות על ידי בדיקות אחרות, אלקטרודות סיבי פחמן עשויות להציע שדרה למעבדות מדעי המוח לבנות בדיקות משלהן ללא צורך בציוד מיוחד. סיבי פחמן הם חומר הקלטה חלופי עם גורם צורה קטן המאפשר החדרת נזק נמוך. סיבי פחמן מספקים תאימות ביולוגית טובה יותר ותגובת צלקת נמוכה בהרבה מאשר סיליקון17,18,19 ללא עיבוד חדר ניקוי אינטנסיבי5,13,14. סיבי פחמן גמישים, עמידים, משולבים בקלות עם ביו-חומרים אחרים19, ויכולים לחדור ולתעד מהעצבים 7,20. למרות היתרונות הרבים של סיבי פחמן, מעבדות רבות מוצאות את הייצור הידני של מערכים אלה מפרך. קבוצות מסוימות21 לשלב סיבי פחמן לתוך חבילות כי באופן קולקטיבי לגרום בקוטר גדול יותר (~ 200 מיקרומטר); עם זאת, למיטב ידיעתנו, חבילות אלה לא אומתו בעצב. אחרים המציאו מערכי אלקטרודות של סיבי פחמן, אם כי השיטות שלהם דורשות מדריכי סיבי פחמן מפוברקים בחדר נקי22,23,24 וציוד כדי לאכלס את המערכים שלהם17,23,24. כדי לטפל בכך, אנו מציעים שיטה של ייצור מערך סיבי פחמן שניתן לבצע בספסל המעבדה המאפשר שינויים מאולתרים. המערך המתקבל שומר על טיפים אלקטרודות אינדיווידואליים ללא כלים מיוחדים לאכלוס סיבים. בנוסף, גיאומטריות מרובות מוצגות כדי להתאים לצרכים של הניסוי המחקרי. מאמר זה, שנבנה מעבודה קודמת8,17,22,25, מספק מתודולוגיות מפורטות כדי לבנות ולשנות מספר סגנונות של מערכים באופן ידני עם זמן אימון מינימלי בחדר נקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. בחירת מערך סיבי פחמן

  1. בחרו לוח מעגלים מודפס (PCB) מאחד משלושת העיצובים המוצגים באיור 1.
    הערה: עבור פרוטוקול זה, מערכי Flex יהיו המוקד.
    1. עיין בעיצובי PCB באתר האינטרנט של מעבדת צ'סטרק (https://chestekresearch.engin.umich.edu), ללא תשלום ומוכן לשליחה ולהזמנה להדפסה דרך בית דפוס PCB.
    2. ראה טבלה 1 לקבלת סיכום של מחברים עבור כל לוח והמפרטים שלהם כדי לסייע בבחירת המחבר שיעבוד עבור ההתקנה הניסיונית הספציפית.

2. הלחמת המחבר ללוח המעגלים

  1. הגדר מגהץ הלחמה ל 315 °C (600 °F).
  2. יש למרוח שטף על כל רפידות ההלחמה על ה-PCB.
    הערה: שטף בתוך צינור ניתן לסחוט על פני הרפידות, בעוד שטף בסיר ניתן להחיל עם קצה העץ של אפליקטור כותנה קצה על ידי מריחת השטף על פני כל רפידות בנדיבות.
  3. צרו ערימות קטנות של הלחמה על הרפידות האחוריות של מערך Flex (איור 2A).
  4. הלחמו את השורה התחתונה של פיני המחבר לשורה האחורית של רפידות הלחמה (איור 2B).
    הערה: כל עיצובי הלוח שסופקו על ידי מעבדת Chestek תוכננו כך שהמחברים ישולבו בדיוק עם הלוח הייעודי שלהם.
    1. כדי לעשות זאת, הלחמה את הסיכות משני צדי המחבר עם גישה קלה לתלוליות הלחמה. לאחר האבטחה, יש לדחוף בעדינות את קצה הברזל הלחמה בין הפינים הקדמיים כדי להלחים את החיבורים הנותרים מאחור.
      הערה: לאחר שהשורה האחורית של הפינים מאובטחת, שאר המחבר יתיישר עם כל פין מעל משטח ההלחמה שהוקצה לו.
  5. הלחמה השורה הראשונה של סיכות על הלוח על ידי החלת כמות קטנה של הלחמה על כל סיכה. החל שכבה נוספת של שטף אם הלחמה אינה מתרחשת במהירות.
    1. יש לנקות את השטף העודף עם 100% אלכוהול איזופרופיל (IPA) ומברשת זיפים קצרה.
  6. לתמצת את החיבורים המולחמים באפוקסי סט מושהה (איור 2 C,D) באמצעות מחט 23 G ומזרק 1 מ"ל להציב צד משופע על הסיכות. לדחוף אפוקסי דרך המזרק לאט, כך שהוא זורם לתוך ולאורך החיבורים.
    1. השאירו את הלוח ללילה כדי שאפוקסי הסט המתעכב יוכל לרפא.
      הערה: בעוד המוצר להוסיף עבור אפוקסי להגדיר מושהה קובע כי הוא מרפא בתוך 30 דקות, השארת אותו לילה מאפשר חיבור יציב יותר להיווצר.
  7. אבטח את החלק האחורי של הלוח לצדי המחבר על-ידי הנחת קו קטן של אפוקסי מוגדר מושהה על פני הצד האחורי של הלוח ומשיכתו אל קצות המחבר.
    1. תשאיר את הלוח כדי לרפא בן לילה שוב.
      הערה: בשלב זה, אחסן את המערכים או המשך בבנייה. אם אתם עוצרים במבנה, אחסנו את המערכים בקופסה נקייה ויבשה בטמפרטורת החדר.

3. אוכלוסיית הסיבים

  1. חותכים נימי זכוכית משוך כך שהקצה שלו יתאים בין עקבות המערך (איור 3A).
    1. באמצעות משיכת זכוכית ו חוט, לעשות נימים באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 900, למשוך = 70, מהירות = 35, זמן = 200, לחץ = 900.
      הערה: המספרים הם ללא יחידה וספציפיים להתקן זה (עיין בטבלת החומרים).
  2. השתמשו בקצות העץ של שני אפליקטורים בעלי קצה כותנה (אחד לכל חלק של אפוקסי כסף) כדי לגרוף יחס קטן של 1:1 של אפוקסי כסף בצלחת פלסטיק ולערבב באמצעות אותם מקלות המשמשים לגרוף. יש להשליך את האפליקטורים לאחר ערבוב.
  3. חותכים 2-4 מ"מ מקצה חבילת סיבי הפחמן על פיסת נייר מדפסת באמצעות סכין גילוח. כדי להפריד בקלות את הסיבים בחבילה, אשר קשה להקניט זה מזה, למשוך פיסת נייר למינציה בעדינות על החלק העליון של החבילה.
    הערה: פיסת נייר למינציה מעבירה סטטי לתוך הסיבים, אשר ייפרדו בעצמם.
  4. החל אפוקסי כסף בין כל זוג אחר של עקבות בצד אחד של הלוח עם נימי הזכוכית (איור 3B).
    1. קח טיפה קטנה של אפוקסי על הקצה של נימי משך. יש למרוח בעדינות בין כל עקבות אחרים בקצה הלוח, ולמלא את הרווח.
      הערה: יש למלא את הפער בחלק העליון של שני העקבות מבלי לעלות על גדותיו כדי לגעת בעקבות שכנים. כל עקבות מחוברים לערוץ אחד. שיטה זו של אוכלוסיית אפוקסי פירושה שלכל סיב יהיו שני ערוצים המחוברים אליו. הסיבה לכך היא ששני עקבות מאפשרים יישור סיבים טוב יותר, ויתירות בערוץ מסייעת להבטיח חיבור חשמלי.
  5. השתמשו בפינצטה מצופה טפלון כדי למקם סיבי פחמן אחד בכל עקבות אפוקסי (איור 3C).
  6. השתמשו בנימי משוך ונקי כדי להתאים את סיבי הפחמן, כך שהם יהיו מאונכים עד סוף לוח מערך Flex ויקברו מתחת לאפוקסי (איור 3D).
  7. מניחים את המערכים על בלוק עץ עם קצוות סיבים מעל קצה הבלוק.
    הערה: המשקל של הקצה האחורי ישאיר את המערך בבלוק.
  8. אופים את בלוק העץ ואת מערכים ב 140 °C (50 °F) במשך 20 דקות כדי לרפא את אפוקסי הכסף ולנעול את הסיבים למקומו.
  9. חזור על שלבים 3.4-3.8 עבור הצד השני של הלוח.
    הערה: ניתן לאחסן מערכים לאחר כל שלב אפייה; עם זאת, סטטי מתיבות האחסון עלול לגרום לסיבים להתרחק מהלוח אם מעט מדי אפוקסי כסף הוחל בעת אכלוס הלוח.
    1. צור פלטפורמת דבק מוגבהת בתוך קופסה, כך שרוב הלוח יכול להיות דבוק לדבק המאפשר את הקצוות הסיבים של הלוח להיות מושעה בתוך הקופסה כדי למנוע שבירת סיבים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: אם סיבים מתרחקים מהלוח במהלך האחסון, לגרד את האפוקסי מתוך העקבות עם נימי זכוכית משוך נקי ולחזור על שלבים 3.1-3.8 כדי להחליף את הסיבים. מנקודה זו ואילך, מערכים חייבים להיות מאוחסנים עם הסיבים מושעים באופן זה כדי למנוע שבירת סיבים.

4. החלת אפוקסי אולטרה סגול (UV) כדי לבודד את סיבי הפחמן

  1. השתמשו בנימי נקי והחלו טיפה קטנה (בקוטר של כ-0.5 מ"מ של אפוקסי UV על העקבות החשופים בצד אחד של הלוח (איור 4A). המשך להוסיף טיפות אפוקסי UV עד העקבות מכוסים לחלוטין.
    הערה: אין לאפשר לאפוקסי UV לעלות על סיבי הפחמן מעבר לסוף ה- PCB כדי להבטיח הכנסה חלקה מאוחר יותר.
  2. לרפא את אפוקסי UV תחת אור עט UV במשך 2 דקות (איור 4B).
  3. חזור על שלבים 4.1-4.2 עבור הצד השני של הלוח.
  4. חותכים את הסיבים ל 1 מ"מ באמצעות רשת סטריאוסקופ ומספריים כירורגיים.
    הערה: ניתן לאחסן מערכים בשלב זה עד שיהיו מוכנים להמשיך לשלבים הבאים. הם צריכים להיות מאוחסנים בקופסה שתרומם את סיבי הפחמן הרחק מהקופסה עצמה. ניתן לאחסן מערכים בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.

5. בדיקת חיבורים חשמליים באמצעות סריקות עכבה של 1 קילו-הרץ (איור 5)

  1. שקוע סיבי פחמן 1 מ"מ לתוך 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS).
  2. כדי להשלים את המעגל, השתמש בכלוריד כסף-כסף (Ag| AgCl) אלקטרודת התייחסות מוט נירוסטה (אלקטרודה נגד).
    1. באמצעות מהדק, להשעות את Ag| אלקטרודה AgCl ב 1x PBS ולחבר אותו להפניה של מערכת עכבה בשימוש.
    2. באמצעות מהדק, להשעות את מוט נירוסטה ב 1x PBS ולהתחבר לקלט אלקטרודה מונה של מערכת עכבה בשימוש.
  3. הפעל סריקת עכבה של 1 kHz עבור כל סיב באמצעות potentiostat המוגדר לתדר סריקה של 1 kHz ב- 0.01 Vrms בצורת גל סינוס אחת. הגדר את potentiostat ל 0 V בתחילת כל סריקה עבור 5 s כדי לייצב את האות המוקלט. הקלט את המדידות באמצעות התוכנה הקשורה לפוטנציוסטאט.
    הערה: ניתן לנקוט מדידות בכל נקודה בבנייה; עם זאת, הם נחוצים רק לפני בידוד ובמהלך הכנת קצה. טבלה 2 מפרטת טווחים אופייניים של עכבה לאחר כל שלב בנייה ב- 1 kHz עבור הפניית המשתמש.
  4. לשטוף את הסיבים במים deionized (DI) על ידי טבילתם לתוך קטנה שלוש פעמים ולהשאיר אותם להתייבש בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן להשאיר מערכים באחסון עד שהמשתמש יוכל להמשיך לשלב הבא.

6. בידוד פארילן C

הערה: Parylene C נבחר כחומר הבידוד עבור סיבי הפחמן כפי שניתן להפקיד בטמפרטורת החדר על פני קבוצות של מערכים ומספק ציפוי קונפורמי מאוד.

  1. הסוך את מחבר מערך Flex באמצעות מחבר ההזדווגות.
  2. מקם אצווה של 8-12 מערכים לתוך תיבת אחסון עם פלטפורמת דבק מוגבהת, כך שהם יכולים להיות מבודדים בריצה אחת. הניחו את המערכים כך שקצה המחבר של המערך יהיה על פלטפורמת ההדבקה עם הקצה הסיבי של המערך (איור 6) כדי למנוע מהסיבים להידבק ולמשוך החוצה ולהבטיח ציפוי פארילן אחיד על הסיבים.
  3. מצופה את המערכים במערכת תצהיר Parylene C לעובי של 800 ננומטר בחדר נקי, לובש ציוד הגנה אישי מתאים (PPE) כפי שהוגדר על ידי חדר הניקוי הבודד בשימוש.
    הערה: כאן, PPE הוגדר כנעלי חדר נקי, חליפה, כיסוי ראש, משקפי מגן, מסכה וכפפות לטקס. יש לציין כי זהו PPE סטנדרטי לכניסה לחדר נקי. צעד זה יכול להיות במיקור חוץ לחברת ציפוי Parylene תמורת תשלום; עם זאת, ייתכן ששירות מסחרי יוכל לצפות מערכים נוספים בו-זמנית. לכל מערכת תצהיר של פארילן C עשויים להיות אמצעי זהירות שונים. יש ליצור קשר עם הטכנאי לפני השימוש כדי להבטיח את בטיחות המשתמש.
  4. הסר את מחבר ההזדווגות המשמש כמסיכה ממערך Flex.
  5. מקם את המערכים בתיבה חדשה לאחסון עד שיהיה מוכן לשימוש.

7. שיטות הכנת טיפים

הערה: שתי תכשירי קצה בסעיף זה משתמשים בלייזר כדי לחתוך סיבים. PPE תקין, כגון משקפי מגן עמידים לאורכי הגל המשמשים, תמיד צריך להיות משוחק בעת שימוש בלייזר, ומשתמשי מעבדה אחרים בקרבת הלייזר צריך להיות גם PPE. למרות שאורכי הסיבים המפורטים בשלבים אלה הם אורכים מומלצים, משתמשים עשויים לנסות כל אורך שמתאים לצרכים שלהם. המשתמש חייב לבחור אחת משיטות הכנת הטיפים הבאות כמו חיתוך מספריים לבד לא יספיק כדי לחשוף מחדש את electrode25.

  1. גארנט אלומיניום yttrium מסומם Neodymium (Nd:YAG) חיתוך לייזר
    1. חותכים את הסיבים ל 550 מיקרומטר עם מספריים כירורגיות.
    2. השתמש בלייזר 532nm Nd:YAG פעמו (5 mJ / דופק, 5 ns משך, 900 mW) כדי לחתוך 50 מיקרומטר מקצה הסיבים כדי לחשוף מחדש את הפחמן מתחת Parylene C (בדרך כלל לוקח 2-3 פולסים).
      1. יישר את קצות הסיבים באמצעות הסטריאוסקופ המובנה שמגיע עם מערכת לייזר זו.
        הערה: מערכת זו מאפשרת למשתמש ליישר חלון (כאן, 50 מיקרומטר x 20 מיקרומטר (גובה x רוחב)) שימש להקיף את קצה הסיבים.
      2. מקד את הסטריאוסקופ בקצה הסיבים בהגדלה של פי 500 לחיתוך מדויק ומדויק.
        הערה: Parylene C יתפוגג מעט (<10 מיקרומטר) מהקצה וישאיר קצה גלילי קהה.
  2. חידוד מבער25,26,27
    1. חותכים את הסיבים ל 300 מיקרומטר עם מספריים כירורגיים.
    2. שקועים את המערך בצלחת של מים deionized, מחבר בצד למטה, ומאובטח לתחתית המנה עם כמות קטנה של מרק.
    3. השתמש במצלמת עט כדי ליישר את הסיבים עם פני המים, כך הסיבים הם רק בקושי נוגעים פני השטח של המים.
    4. התאימו להבת מבער בוטאן ל-3-5 מ"מ והעבירו אותה על גבי הסיבים בתנועה קדימה ואחורה כדי לחדד סיבים.
      הערה: טיפים לסיבים יזהרו בכתום כשהלהבה תעבור מעליהם.
    5. הסר את המערך מהמרק ובדוק אותו תחת סטריאוסקופ לקבלת עצות מחודדות תחת הגדלה של פי 50.
      הערה: אם טיפים מחודדים נצפים, אז אין צורך מבער נוסף. אם העצות נראות בוטה, חזור על שלבים 7.2.2-7.2.5.
  3. חיתוך לייזר UV28
    הערה: לייזר UV יכול לשמש רק על אפס כוח הכנסה (ZIF) ועיצובי לוח רחב כרגע בשל נקודת המוקד הגדולה של לייזר UV בשימוש להיות גדול יותר מאשר המגרש של סיבי פחמן Flex Array.
    1. חותכים את סיבי הפחמן ל 1 מ"מ עם מספריים כירורגיים.
    2. הצמדת לייזר UV לשלושה שלבים ממונעים המוגדרים באורתוגונל.
      הערה: לייזר UV הוא מוליך למחצה אינדיום גליום ניטריד (InGaN) רב-מצבי עם הספק יציאה של 1.5 ואט ואורך גל של 405 ננומטר.
      1. ודא שללייזר יש קרן רציפה ליישור וחיתוך מהירים ויעילים.
    3. אבטחו את המערך במקום כדי לשמור על מישור אלקטרודות סטילס ברמה של אלקטרודות כדי שהלייזר יעבור. ודא שהמערך מוחזק במרחק מתאים מהלייזר כך שהסיבים יהיו קלים עם נקודת המוקד של הלייזר. כדי לעשות זאת, לספק כוח נמוך יותר לייזר ולהתאים את המרחק כדי להתמקד בצורה הטובה ביותר על סיבים28.
    4. הזז את נקודת המוקד לייזר UV על פני מישור הסיבים במהירות של 25 מיקרומטר לשנייה כדי לחתוך את הסיבים לאורך הרצוי (כאן, כל הסיבים נחתכים ל 500 מיקרומטר).
      הערה: סיבים יפלטו אור בהיר לפני חיתוך. לאחסן את הסיבים לאחר הטיפול עד שהם מוכנים להיות מצופים עם פולימר מוליך.

8. פולי (3,4-אתילנדיוקסיתופין) :p-טולואנסולפונט (PEDOT:pTS) ציפוי מוליך עבור עכבה מופחתת

  1. יש לערבב פתרונות של 0.01 M 3,4-ethylenedioxythiophene ו-0.1 M נתרן p-toluenesulfonate ב-50 מ"ל של מי DI ומערבבים למשך הלילה על צלחת ערבוב (כ-450 סל"ד) או עד שלא ניתן לראות חלקיקים בתמיסה.
    הערה: יש לאחסן את הפתרון במיכל עמיד באור. יש לשמור את הפתרון בקירור לאחר ערבוב כדי לשמור על הפתרון שמיש עד 30 יום.
  2. הפעל סריקת עכבה של 1 kHz באמצעות אותם פרמטרים כמו קודם (שלבים 5.2-5.3) ב- 1x PBS. שים לב אילו סיבים יש חיבור טוב (<1 MΩ, בדרך כלל 14-16 של 16 סיבים).
  3. אלקטרופלט עם PEDOT:pTS כדי להוריד את העכבה של האלקטרודות.
    1. שקוע את קצות הסיבים בתמיסת PEDOT:pTS.
    2. בצע את השלבים המפורטים בשלב 5.2, תוך החלפת פתרון 1x PBS עבור PEDOT:pTS וקצר את כל החיבורים ללוח לערוץ הנוכחי המוחל.
    3. יש למרוח 600 pA לכל סיבים טובים למשך 600 שניות באמצעות פוטנציוסטאט.
    4. כבה את התא ואפשר לו לנוח במשך 5 שניות בסוף הריצה.
  4. הסר את הסיבים מן הפתרון ולשטוף אותם במים DI.
  5. יש ליטול מחדש עכבה של 1 kHz כדי לבדוק שהסיבים היו מצופים בהצלחה (השתמש באותם פרמטרים המפורטים בשלבים 5.2-5.3).
    הערה: סיבים טובים מוגדרים כמו כל סיבים בעלי עכבה של פחות מ 110 kΩ.

9. חיבור חוטי קרקע והפניה

  1. לגרד בעדינות את פארילן C מהקרקע ולהתייחס דרך על הלוח באמצעות פינצטה. קצר את הקרקע ואת ההתייחסות דרך יחד בזוגות על עיצוב לוח זה.
    הערה: ניתן למצוא דרך קרקע והפניה ליד המחבר במערך Flex והם ארבעת עיגולי הזהב הקטנים ליד המחברים. משתמשים יצטרכו רק להסיר Parylene C מן vias הקרוב ביותר סיבי פחמן למדידות.
  2. חותכים שני אורכים 5 ס"מ של חוט כסף מבודד עם סכין גילוח. לנטרל את קצות החוטים 2-3 מ"מ מקצה אחד להיות מחובר למערך Flex ו ~ 10 מ"מ מהקצוות הנגדיים כדי לאפשר הארקה קלה יותר והפניה במהלך הניתוח.
  3. מחממים את מגהץ ההלחמה בחזרה ל 600 ° F. החל כמות קטנה של שטף על vias.
  4. הכנס חוט אחד (קצה חשוף של 2-3 מ"מ) לכל אחד מה- ePhys vias על הלוח. החל הלחמה על החלק העליון של vias (איור 7A). אפשרו לגשוש להתקרר, ואז הפכו אותו כדי למרוח כמות קטנה של הלחמה על החלק האחורי של ה-via (איור 7A).
  5. באמצעות מספריים כירורגיות, לגזור את כל חוט חשוף בולט מתוך תלולית ההלחמה האחורית כמו זה עוזר להפחית את הרעש שנראה בהקלטה (איור 7B).
  6. הנח את המערכים בחזרה לתיבת האחסון, כיפוף החוטים אחורה והרחק מהסיבים. אבטחו את החוטים בסרט הדבקה כדי למנוע אינטראקציות פוטנציאליות של חוטי סיבים (איור 7C).

10. הליך כירורגי

הערה: קליפת המוח חולדה שימשה כדי לבדוק את היעילות של סיבים מוכנים לייזר UV כפי שתואר בעבר 7,20. בדיקות אלה יעבדו בעצב בשל הגיאומטריה הדומה שלהם ורמות עכבה כדי מבער סיבים מוכנים. ניתוח זה בוצע בשפע של זהירות כדי לאמת כי לייזר UV לא שינה את התגובה של אלקטרודות.

  1. להרדים עכברוש לונג אוונס זכר בוגר באמצעות שילוב של קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). אשר הרדמה עם בדיקת צביטת בוהן. יש למרוח משחה על העיניים כדי למנוע מעיני החולדה להתייבש במהלך הניתוח.
  2. צור גולגולת 2 מ"מ x 2 מ"מ מעל קליפת המוח המוטורית של חצי הכדור הימני. זהה את הפינה השמאלית התחתונה של הגולגולת על ידי מדידת 1 מ"מ קדמי של ברגמה ו 1 מ"מ לרוחב של קו האמצע.
  3. הר את המערך לתוך מכשיר סטריאוטקסי, ואפס את המכשיר הסטריאוטקסי בדוורה על ידי הנמכה עדינה של הסיבים עד שהם נוגעים בפני השטח של הדורה. הרימו את המערך הרחק מאתר הניתוח והעבירו אותו לצד עד שהוא מוכן להכנסה.
  4. לכרות את הדורה על ידי משיכה עדינה של מחט עם קצה תיל על פני השטח של הרקמה. ברגע שחלק מהדורה נפתח למוח, השתמש בזוג מלקחיים עדינים כדי לסייע עוד יותר בהרחקת הדורה.
  5. הכנס את הסיבים לתוך גולגולת ו 1.2 מ"מ לתוך המוח באמצעות מכשיר סטריאוטקסי, מוריד לאט ביד.
  6. הקלט נתוני ePhys למשך 10 דקות עם הבמה הספציפית ל- ePhys ומקדם הבמה.
    1. הגדר את מסנן המעבר הגבוה של preamplifier כך שיעבד את האות ב- 2.2 הרץ, אנטי-alias ב- 7.5 kHz ודגימה ב- 25 קילו-הרץ.
      הערה: עבור מדידות אלה, רק פעילות ספונטנית נרשמת. אין גירוי מוחל.
  7. המתת חסד
    1. מניחים את החולדה תחת איזופלוריין ב 5% מתחת 1 ליטר / דקה של חמצן עד סימני חיים הפסיקו (20-30 דקות). אשר המתת חסד עם עריפת ראש.

11. מיון ספייק

  1. השתמש בתוכנת מיון ספייק כדי למיין ולנתח את הנתונים באמצעות שיטות שדווחו בעבר8.
  2. השתמש במסנן בעל מעבר גבוה בכל הערוצים (פינת 250 הרץ, באטרוורת' מסדר רביעי ), והגדר את רמת הזיהוי של צורת הגל למינוס 3.5 × סף RMS.
    1. השתמש במודל גאוסי כדי לאגד קוצים עם מאפיינים דומים. שלב אשכולות ממוצעים של לפחות 10 צורות גל שייכללו בניתוח נוסף.
    2. ביטול או מחיקה של כל צורות הגל שאינן קוצים מערכת הנתונים.
  3. יצא נתונים לאחר מיון כל הערוצים והשתמש בתוכנת ניתוח כדי להתוות ולנתח עוד יותר את צורות הגל.

12. סריקת הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית (SEM)

הערה: שלב זה יהפוך מערכים לבלתי שמישים ויש להשתמש בהם רק כדי לבדוק את תוצאות הטיפול בעצות כדי לבדוק שהמערךים מעובדים כראוי. אין צורך לבצע שלב זה כדי לבנות מערך מוצלח. לסיכום להלן חלוקה לרמות כללית של תהליך SEM; עם זאת, משתמשים שלא השתמשו בעבר ב- SEM צריכים לקבל עזרה ממשתמש מיומן.

  1. חותכים את הקצה הסיבי של ה-PCB ומרכיבים אותו על ספח SEM עם מסיכת סרט פחמן. הנח את המערכים על פלטפורמה קטנה של סרט פחמן מוערם (4-5 שכבות) כדי למנוע מסיבי הפחמן להידבק לספח SEM.
  2. מקציפים את המערכים בזהב (100-300 Å) בעקבות הליכים שמתוארים על ידי היצרן של מעיל פולט הזהב.
  3. כדי לבדוק את השפעות הטיפול בקצה, דמיינו את המערכים ב-SEM במרחק עבודה של 15 מ"מ ועוצמת קרן 20 kV.
    הערה: ניתן לצלם מערכים ללא ציפוי מבעבע תחת ואקום נמוך, כפי שמוצג באיור 8D לסיבים בחיתוך לייזר UV. עבור התקנה זו, מומלץ להיות מרחק עבודה של 11-12 מ"מ וכוח קרן 4 kV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימות עצה: תמונות SEM
עבודה קודמת20 הראתה כי חיתוך מספריים הביא עכבה לא אמינה כמו Parylene C מקופל על פני אתר ההקלטה. חיתוך מספריים משמש כאן רק כדי לחתוך סיבים לאורך הרצוי לפני עיבוד עם שיטת חיתוך גימור נוספת. תמונות SEM של הטיפים שימשו לקביעת אורך הפחמן החשוף וגיאומטריית הקצה (איור 8).

מספריים וסיבים חתוכים בלייזר Nd:YAG נבדקו בעבר17,20. סיבים חתוכים במספריים (איור 8A) כוללים גיאומטריות קצה לא עקביות, כאשר פארילן C מתקפלת לאורך הקצה בעת חיתוך20. הסיבים החתוכים בלייזר Nd:YAG נשארים עקביים באזור אתר ההקלטה, הצורה והעכבה (איור 8B). סיבים מבערים20 מובילים לגודל האלקטרודה הגדולה ביותר ולשונות הצורה ולקצה מחודד, המאפשרים החדרה לרקמה קשה. בממוצע, 140 מיקרומטר של פחמן נחשפו מחדש, עם אזור מעבר חלק בין בידוד הפחמן לפרילן C (איור 8C). סיבים חתוכים בלייזר UV היו דומים לסיבים מבערים, והראו 120 מיקרומטר של פחמן שנחשף מהקצה (איור 8D). עכבה הצביעה על כך ששיטות חיתוך קצה לייזר UV או מבער מתאימות ל- ePhys והן פתרונות מעשיים למעבדות ללא גישה ללייזר Nd:YAG.

אימות טיפ: הקלטה חשמלית
איור 9 מציג את העכבות הנובעות מכל שיטת הכנה באמצעות מערכי Flex. הערכים המתקבלים נמצאים בטווח המתאים להקלטת ePhys. סיבים חתוכים בלייזר של YAG הביאו לשטח הפנים הקטן ביותר אך העכבות הגבוהות ביותר, אפילו עם ציפוי PEDOT:pTS (פחמן חשוף: 4138 ± 110 kΩ; עם PEDOT:pTS: 27 ± 1.15 kΩ; n = 262). לאחר מכן נוצר הקשר ההופכי במבער (פחמן חשוף: 308 ± 7 kΩ; עם PEDOT:pTS: 16 ± 0.81 kΩ; n = 262) ו- UV Laser-cut (פחמן חשוף: 468 ± 85.7 kΩ; עם PEDOT:pTS: 27 ± 2.83 kΩ; n = 7) סיבים בעלי שטח פנים גדול ועכבות נמוכות. עם זאת, בכל המקרים, סיבים מצופים PEDOT:pTS נופלים מתחת לסף 110 kΩ שנקבע בעבר כדי להצביע על אלקטרודה טובה, עכבה נמוכה.

הקלטות ePhys חריפות נלקחו מחולדת לונג אוונס שהושתלה באופן חריף עם מערך ZIF עם חיתוך לייזר UV וסיבים שטופלו ב- PEDOT:pTS כדי להדגים את הכדאיות של שיטה זו. ePhys נבדק בעבר והוכח עם מספריים לחתוך20 ו Nd:YAG-17 וסיבים שטופלו מבער7,8 ולכן לא היה revalidated בטקסט זה. הקלטות חריפות מארבעה סיבי לייזר UV (באורך 2 מ"מ) שהושתלו בו זמנית בקליפת המוח המוטורית של חולדה (n = 1) מוצגות באיור 10. שלוש יחידות נמצאו על פני כל הסיבים, דבר המצביע על כך שהטיפול בסיבים עם לייזר UV הזול דומה לשיטות חיתוך אחרות המאפשרות לסיבי הפחמן לתעד יחידות עצביות, כפי שניתן היה לצפות על ידי SEMs ועכבות. בעוד מערכי סיבי פחמן בנויים בקלות ומשתנים כדי להתאים לצרכי המשתמש, יש לציין כי אימות נוסף נחוץ עבור כמה builds (טבלה 3), בעוד שאחרים פחות מתאימים למשימות קצה מסוימות.

פארילן C מסחרי
מערכים מצופים מסחרית נקבעו להיות עובי Parylene C של 710 ננומטר על ידי הספק, גם בתוך טווח היעד של בידוד. המערכים הוכנו להקלטות ePhys באמצעות הכנת קצה המבער. מכשולים נלקחו לאחר הכנת הטיפים בהשוואה לנתונים הקיימים. גשוש מצופה מבער ו- PEDOT:pTS היה בממוצע של 14.5 ± 1.3 kΩ עכבה על פני 16 סיבים. תמונות SEM צולמו של הקצה והשוק כדי להשוות את תצהיר פארילן C (איור 11 A,B, בהתאמה). תוצאות אלה מראות כי השימוש בספק מסחרי לא שינה את ערכי העכבה הצפויים, דבר המצביע על כך שזו תהיה תחליף בר קיימא באותה מידה לתצהיר בחדר הניקוי של האוניברסיטה.

ניתוח עלות התקן
בתנאי שכל הכלים והחומרים בתפזורת (למשל, אפוקסי, הלחמה) נגישים לחוקר, דמי משתמש של Parylene C של $41, וקבוצה של 8 בדיקות, עלות החומרים הכוללת היא $1168 ($146 לכל בדיקה). מאמץ כוח אדם (טבלה 4) הוא ~ 25 שעות עבור האצווה. אם משתמשים בשלב ייצור חלופי, עלות הבדיקות תשתנה בהתאם לעלות ציפוי פארילן C מסחרית (500-800 דולר מצוטט). הזמן עבור שלבי הבנייה (טבלה 4) מקובץ עבור כל המופעים של משימה חוזרת לפשטות. זמני הבנייה עבור עיצובים עם גובה גדול יותר (לוח רחב ו- ZIF) מצטמצמים באופן דרמטי מכיוון שהצעדים האינטנסיביים באופן ידני (לדוגמה, מיקום סיבי פחמן) קלים ומהירים יותר להשלמתם.

Figure 1
איור 1: מחברים ולוחות מעגלים מודפסים משויכים. (A) לוח רחב עם אחד מ-16 מחברים נחוצים בכניסה (סרגל קנה מידה התחלתי = 5 מ"מ). (B) ZIF ואחד משני מחברים ותכריכים אחד. (C) מערך Flex עם מחבר של 36 פינים; סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שלבי הלחמה ובידוד עבור מערך Flex. (א) הנחת הלחמה עבור סיכות המחבר התחתונות. (ב) סיכות אחוריות מאובטחות במקום עם הסיכות הקדמיות מוכנות להלחמה. (ג) מערך Flex מבודד אפוקסי מוגדר מושהה; שים לב שהאפוקסי המושהה אינו מכסה את ההתייחסות ואת הקרקע דרך משני הצדדים. (D) החלק האחורי של מערך Flex עם רצועה של אפוקסי מוגדר מושהה על פני דרך הפד (לא דרך הקרקע וההפניה) ועטוף סביב צד הלוח לכיוון קצה המחבר. סרגל קנה מידה = 0.5 ס"מ (B) ו- 1 ס"מ (A, C, D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: החלת אפוקסי כסף ויישור סיבי פחמן בין עקבות מערך Flex. נימים הודגשו עם כיסוי לבן. (א) סוף הנימים מתאים בין העקבות כדי לקבל (B) אפוקסי כסף נקי (מסומן עם חצים בסוף הנימים ובתוך העקבות) תצהיר ללא גלישה מחוץ לזוגות העקבות. (C) סיבי פחמן ממוקמים לתוך אפוקסי ולאחר מכן (D) מיושרים עם נימי נקי. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: בידוד עם יישום אפוקסי UV (A) אפוקסי UV מוחל באמצעות נימי נקי ושתי טיפות של אפוקסי UV (מסומן בשכבות-על לבנות). אפוקסי UV מוחל בטיפות של 0.25-0.75 מ"מ קוטרים עד אפוקסי UV יוצר בועה חלקה על החלק העליון של העקבות. (B) אפוקסי UV נרפא תחת אור UV. מערך Flex ממוקם במרק על בלוק עץ כדי להקל על התנועה והיישור מתחת לאור UV. אור UV מוחזק עם מחזיק ~ 1 ס"מ מעל קצה מערך Flex. Inset (B) מציג את הפרופיל הצדדי של מערך Flex מבודד אפוקסי UV כראוי. בועת אפוקסי UV משני צדי הלוח היא בערך 50 מיקרומטר גובה. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר (A ו- inset B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התקנה עבור מדידות עכבה. כל החלקים מסומנים בתווית, ומחברי מערכת ומתאמי מערכת תלויים במערכת. PBS הוא מככב כמו הפתרון מוחלף עבור PEDOT:pTS בהמשך לבנות; עם זאת, ההתקנה זהה אחרת. קיצורים: PBS = תמיסת מלח חוצצת פוספט; PEDOT:pTS = פולי (3,4-אתילנדיוקסיתופין):p-טולואנסולפונט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מערך Flex מוכן לציפוי פארילן C. מערך Flex מאובטח לפלטפורמת קצף מוגבהת עם סרט הדבקה, צד דבק כלפי מעלה במהלך תהליך הציפוי. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: חוטי קרקע וייחוס המחוברים למערך Flex הסופי. הלחמה הוחלה על כל צד של via משני צדי הלוח (A) כדי ליצור קשר מאובטח. ePhys vias מסומנים על הלוח כ - GND ו - Ref ומזווגים משני צידי הלוח זה מזה. ישנם שני דרךים נוספים המסומנים גם הם תחת הכותרת GND ו - Ref2. שני דרך GND קצרים יחד. Ref2 אמור לשמש בניסויים אלקטרוכימיים. חוט עודף (A) מסומן בקופסה אדומה ומוסר (B) מהחלק האחורי של הגשוש (קופסה אדומה מראה היכן החוט היה אמור להיות) כדי לסייע בהפחתת רעש וטיפול בגשוש. (ג) מערך Flex סופי המאוחסן לשימוש עתידי. שים לב כי GND ו Ref vias המשויך על לוח זה להפוך אותו מיועד להקלטות ePhys. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A, B). קיצורים: ePhys = אלקטרופיזיולוגיה; GND = קרקע; שופט = הפניה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תמונות SEM של סיבים עם טכניקות שונות לחיתוך טיפים. (A) סיבים חתוכים במספריים עם מעט מאוד פחמן חשוף. (ב) Nd: חתך לייזר YAG. (C) סיבים מבערים עם ~ 140 מ"מ של פחמן חשוף מהקצה. (D) סיבים חתוכים בלייזר UV עם ~ 120 מ"מ של פחמן חשוף מהקצה. חצים אדומים מציינים את אזור המעבר בין פארילן C וסיבי פחמן חשופים. סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר (A), 10 מיקרומטר (B), 50 מיקרומטר (C, D). קיצורים: SEM = סריקת אלקטרונים מיקרוסקופיים; Nd:YAG = גארנט אלומיניום yttrium מסומם Neodymium. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: הבדלי עכבה בין החלת הטיפול בלבד (חשוף פחמן חשוף) לבין תוספת של PEDOT:pTS. בכל המקרים, התוספת של PEDOT:pTS מקטינה את העכבה בסדר גודל. גודל המדגם: Nd:YAG = 262, מבער = 262, UV = 7. הבדל גודל מדגם UV נובע החידוש של שיטת ההכנה; עם זאת, הוא מראה טווח דומה למבער, כצפוי. נתוני עכבה באים לידי ביטוי כממוצע ± שגיאה סטנדרטית. קיצורים: PEDOT:pTS = פולי (3,4-אתילנדיוקסיתופין):p-טולואנסולפונט; גארנט אלומיניום yttrium מסומם Neodymium. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: נתונים אלקטרופיזיולוגיים חריפים מארבע אלקטרודות חתוכות בלייזר UV. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 11
איור 11: מערכים מסחריים מצופים פארילן C. (א) המערך המחדד מציג חידוד אחיד בכל הסיבים המעיד על כך שאין חסרונות לציפוי מסחרי. (ב) לאחר המבער, המעבר (קופסה אדומה) בין סיבי פחמן חשופים לבין Parylene C אינו מראה הבדל ניכר בין מערכים מצופים במתקן חדר נקי. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A) ו 10 מיקרומטר (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שם PCB מחבר גודל כרית הלחמה (מ"מ) גודל מעקב חשוף (מ"מ) משטח מעקב (מיקרומטר) ערוצי
לוח רחב מיל-מקס 9976-0-00-15-00-00-00-03-0 3.25 x 1.6 1.5 x 4.0 3000 8
ZIF Hirose DF30FC-20DS-0.4V, 0.23 x 0.7 0.75 x 0.07 152.4 16
מערך Flex Omnetics A79024-001 0.4 x 0.8 0.6 x 0.033 132 16

טבלה 1: לכל PCB יש מחבר ומגרש שונים המשויכים אליו. קיצור: PCB = מעגל מודפס.

שלב בנייה עכבה צפויה של 1 kHz (kΩ)
סיבים חשופים 150-300
סיבים חשופים עם בידוד UV 400-500
סיבים מבודדים של פארילן C >50,000
Nd:YAG לייזר לחתוך 15,000 <
מבער 300-400
חיתוך לייזר UV* 300-500
PEDOT:pTS מצופה <110

טבלה 2: טווח טיפוסי של עכבה לאחר כל שלב בנייה (n = 272). *n = 16. בדיקות PEDOT:pTS שטופלו מעל 110 kΩ עדיין עשוי להקליט אותות; עם זאת, כל האלקטרודות שטופלו בדרך כלל נופלות תחת ערך זה. קיצורים: PEDOT:pTS = פולי (3,4-אתילנדיוקסיתופין):p-טולואנסולפונט; גארנט אלומיניום yttrium מסומם Neodymium.

שיטת הכנה לוח רחב ZIF מערך Flex
Nd:YAG עכבה, SEM, ePhys חריפה עכבה, SEM, ePhys חריפה/כרונית עכבה, SEM, ePhys חריפה/כרונית
מבער עכבה, SEM, ePhys חריפה עכבה, SEM, ePhys חריפה/כרונית עכבה, SEM, ePhys חריפה/כרונית
לייזר UV טרם אומת עכבה, SEM, ePhys חריפה/כרונית לא בר קיימא

טבלה 3: שימושים מאומתים בכל לוח עם שיטות החיתוך המתוארות. כל שיטות החיתוך כללו אלקטרודיפוזיציה של PEDOT:pTS. 'לא בר קיימא' מציין כי גורם צורה של העיצוב מונע טיפול קצה זה להיבדק בשלב זה (כלומר, גובה סיבים). קיצורים: גארנט אלומיניום איטריום מסומם Neodymium; SEM = סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים; ePhys = אלקטרופיזיולוגיה; ZIF = אפס כוח הכנסה.

פעילות זמן ל-8 מכשירים (ח)
כל הלחמה 5
בידוד Omnetics 1
אכלוס סיבי פחמן 10
עקבות בידוד עם אפוקסי UV 0.5
תצהיר פארילן C 1.5
Nd:YAG חיתוך לייזר 1
מבער 1
חיתוך לייזר UV 1.5
כל בדיקות העכבה 4.5
PEDOT:תצהיר pTS 1.5
מתכון בשימוש סה"כ שעות
Nd:YAG לייזר לחתוך 25
מבער 25
חיתוך לייזר UV 25.5

טבלה 4: הזמן הנדרש עבור כל שלב בתהליך ייצור. הלחמה של המחבר וחוטי הקרקע והייחוס שולבו כאן כדי לפשט את רשימת הפעילות. קיצורים: PEDOT:pTS = פולי (3,4-אתילנדיוקסיתופין):p-טולואנסולפונט; גארנט אלומיניום yttrium מסומם Neodymium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החלפת חומרים
בעוד שכל החומרים המשמשים מסוכמים בטבלת החומרים, מעט מאוד מהחומרים נדרשים להגיע מספקים ספציפיים. לוח מערך Flex חייב להגיע מהספק הרשום מכיוון שהם החברה היחידה שיכולה להדפיס את הלוח הגמיש. יש להזמין גם את מחבר מערך Flex מהספק המפורט מכיוון שהוא מחבר קנייני. פארילן C מומלץ מאוד כחומר הבידוד לסיבים מכיוון שהוא מספק ציפוי קונפורמי בטמפרטורת החדר באופן אמין שיכול לעמוד בסביבת in vivo . לוח הפולימיד והאפוקסי על הלוח לא יכולים לסבול את הטמפרטורות הגבוהות הנדרשות לטכניקות בידוד אחרות. ניתן לרכוש את כל החומרים האחרים מספקים אחרים או להחליף אותם לחלופות לפי שיקול דעת המשתמשים. מבנה גוף זה אמור להיות גמיש וניתן להתאמה אישית כדי להתאים לניסוי של משתמש הקצה. עם זאת, יש לציין כי כל שינוי בחומרים או מהספקים המפורטים חייב להיות מאומת על ידי משתמש הקצה.

פתרון בעיות בנייה
תצהיר אפוקסי כסף נוטה להיכשל מכמה סיבות: רוחב הנימים רחב מדי כדי להתאים בין עקבות, רוחב הנימים דקים מכדי להרים ולהפקיד אפוקסי, או עודף אפוקסי הוא על הנימים. שתי הבעיות הראשונות ניתן לפתור על ידי חיתוך נימי חדש בגודל מתאים יותר; האחרון על ידי טבילת הנימים לתוך אפוקסי עם יד קלה יותר או הסרת חלק של בועת אפוקסי על ידי בעדינות מטבל הנימי על כפפת ניטריל חילוף.

ההחלטה כיצד להכין את האלקטרודה היא לעתים קרובות החלטה קשה עבור משתמשים רבים. עם זאת, קביעת מה נדרש לניסוי תסייע להאיר את ההחלטה. עבור ניתוחים חריפים, טיפים בוטים ניתן להשתמש אם גודל האתר של האלקטרודה חשוב; עם זאת, הם ייכנסו רק לרקמות רכות יותר (מוח) ורק בעומקי יעד מתחת ל-500 מיקרומטר.

כניסה למבני מוח עמוקים יותר אפשרית באמצעות צינורית זכוכית22; עם זאת, זה יכול לגרום הצטלקות וחוסר אמינות הקשורים בהקלטות ePhys. סיבים חייבים להיות פחות מ 300 מיקרומטר כאשר חידד כדי להיות מסוגל לחדור רקמות קשה יותר (עצב) כמו האורך הקצר יותר מספק עמוד שדרה נוקשה יותר עבור החדרה7,8. סיבים מחודדים נצפו גם לאחרונה לחדור לעומק של 1 מ"מ במוח8.

בעוד המערכים שנדונו במאמר זה הם נקודת התחלה מצוינת עבור מעבדות רבות, בדיקות חדשות יותר באמצעות סיבי פחמן פותחו גם כדי למקד באופן כרוני אזורים עמוקים יותר במוח21,22,29. בעצב, אלקטרודות של פולשניות נמוכה וסלקטיביות גבוהה הן נושא מחקר מתמשך5,8,30. Jiman et al.7 הצליחו לזהות פעילות רב-תכליתית בתוך העצב עם פולשניות מינימלית וסלקטיביות מוגברת באמצעות מערך סיליקון סיבי פחמן8, המשקף את העיצוב של מערך Flex המוצג כאן.

נגישות פארילן C
Parylene C היא שיטה של ציפוי קונפורמי בטמפרטורת החדר ששימשה כמבודד תואם ביולוגי במכשירים מושתלים רבים. הטכניקה דורשת כלי מיוחד בחדר נקי ולוקח כשעה ללמוד. סקר שטחי של מוסדות שביקשו בעבר מערכי סיבי פחמן מהקבוצה שלנו נערך כדי לקבוע את נגישות התצהיר של פארילן C. גילינו שמתוך 17 מכונים, ל-41% הייתה גישה למערכות ציפוי פארילן סי בקמפוס שלהם. עבור אוניברסיטאות ללא גישה למערכת ציפוי פארילן C, שירותי ציפוי מסחריים הם חלופה מעשית, כפי שמוצג כאן. לחלופין, מיקור חוץ לחדר נקי באוניברסיטה הסמוכה עשוי לעניין גם מעבדות ללא גישה ישירה למערכת תצהיר Parylene C. כדי להפחית את העלות למכשיר, אנו ממליצים לשלוח קבוצות גדולות יותר של מערכים מכיוון שמערכות מסחריות יכולות לעתים קרובות להכיל דוגמאות גדולות יותר.

מיטוב ההכנות לעצות
הכנות טיפ נוספות צריך להיחקר עבור סיבים אלה כמו ההכנות קצה הנוכחי לדרוש ממשתמש הקצה לבחור בין יכולת חדירה לבין אתר הקלטה קטן. בעוד הסיבים חתוכים בלייזר Nd:YAG מספקים גודל אתר קטן20, היכולת לחדור רקמות נוקשות יותר (שריר, עצב) היא כמעט לא קיימת, וגישה למערך לייזר המסוגל לטכניקת חיתוך זו יכולה להיות קשה ויקרה. בעוד מבער מאפשר דרך מהירה וחסכונית כדי לקבל טיפים מחודדים שיכולים לחדור רקמות רבות7, גיאומטריית הקצה היא גדולה ועשויה להיות עקבית מסיבים לסיבים20. חיתוך לייזר UV מספק גם עכבה נמוכה ושטחי פנים גדולים אך עם היתרון הנוסף של חשיפה עקבית יותר. לייזר UV נגיש יותר מאשר לייזר Nd:YAG; עם זאת, מעבדות יצטרכו להנדס דרך ליישר את הלייזר עם סיבים ולא יוכלו להשתמש במערך Flex בשל המגרש של הסיבים להיות קטן יותר מאשר קוטר נקודת המוקד של הלייזר. עבודה קודמת הראתה ייצור של סיבים קטנים, מחודדים באמצעות תחריט31,32. גישה זו עלולה לגרום לגיאומטריה אלקטרודה קטנה ואמינה ולשמר את הקצה המחדד הדרוש לחדירת עצב ושרירים.

ציפוי הקצה הנוכחי שלנו, PEDOT:pTS, עשוי גם להיות מוחלף כפי שהוא נוטה להתפרק לאורך זמן, המהווה תכונה לא רצויה עבור בדיקה כרונית17,25,33. חוסר PEDOT:pTS אריכות ימים מוביל עכבה גבוהה יותר, ולכן, איכות אות נמוכה יותר, בין היתר בשל רעשי רקע מוגברים. כדי להגדיל את תוחלת החיים בטיפים אלה סיבים, חקירה לגבי ההיתכנות של ציפויי פלטינה-אירידיום מתנהלת. פלטינה-אירידיום תאפשר שטח פנים גדול יותר25,34 המרוכז בקצה האלקטרודה, תוך שמירה על עכבה נמוכה34,35,36 ותאפשר יציבות ארוכה וכרונית יותר34,36. ציפויים אחרים, כגון תחמוצת PEDOT / גרפן37 וזהב38, נוצלו כדי להוריד את עכבה אלקטרודה סיבי פחמן, אם כי ציפויים אלה משמשים בדרך כלל לבדיקות חישה כימית ולא להקלטות ePhys. בשל המאפיינים הטבעיים של סיבי פחמן39, מערך סיבי הפחמן המוצג כאן ניתן להמיר מגשוש מותאם עבור ePhys למכשיר חישה כימית עם שינוי פשוט של הכנת קצה22,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המכונים הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (UF1NS107659 ו- UF1NS115817) והקרן הלאומית למדע (1707316). המחברים מכירים בתמיכה כספית מהמכללה להנדסה של אוניברסיטת מישיגן ותמיכה טכנית ממרכז מישיגן לאפיון חומרים ומעבדת התואר הראשון של ואן ולאק. המחברים מודים לד"ר ח'ליל נג'אפי על השימוש בלייזר Nd:YAG ובמתקן Nanofabrication Lurie על השימוש במכונת התצהיר פארילן C שלהם. ברצוננו גם להודות למערכות ציפוי מיוחדות (אינדיאנפוליס, IN) על עזרתם במחקר השוואת הציפוי המסחרי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 prong clams 05-769-6Q Fisher Qty: 2
Unit Cost (USD): 20
3,4-ethylenedioxythiophene (25 g)
(PEDOT)		 96618 Sigma-Aldrich Qty: 1
Unit Cost (USD): 102
353ND-T Epoxy (8oz)++
(ZIF and Wide Board Only)		 353ND-T/8OZ Epoxy Technology Qty: 1
Unit Cost (USD): 48
Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3) 50-854-570 Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 100
Autolab PGSTAT12 Metrohm
Blowtorch 1WG61 Grainger Qty: 1
Unit Cost (USD): 36
Carbon Fibers T-650/35 3K Cytec Thornel Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Carbon tape NC1784521 Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 27
Cotton Tipped Applicator WOD1002 MediChoice Qty: 1
Unit Cost (USD): 0.57
Delayed Set Epoxy++ 1FBG8 Grainger Qty: 1
Unit Cost (USD): 3
DI Water n/a n/a Qty: n/a
Unit Cost (USD): n/a
Dumont Tweezers #5 50-822-409 Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 73
Flex Array** n/a MicroConnex Qty: 1
Unit Cost (USD): 68
Flux SMD291ST8CC DigiKey Qty: 1
Unit Cost (USD): 13
Glass Capillaries (pack of 350) 50-821-986 Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 60
Glass Dish n/a n/a Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Hirose Connector
(ZIF Only)		 H3859CT-ND DigiKey Qty: 2
Unit Cost (USD): 2
Light-resistant Glass Bottle n/a Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Heating Filiment FB315B Sutter Instrument Co Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Puller P-97 Sutter Instrument Co Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Nitrile Gloves (pack of 200) 19-041-171C Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 47
Offline Sorter software n/a Plexon Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Omnetics Connector*
(Flex Array Only)		 A79025-001 Omnetics Inc Qty: 1
Unit Cost (USD): 35
Omnetics Connector*
(Flex Array Only)		 A79024-001 Omnetics Inc Qty: 1
Unit Cost (USD): 35
Omnetics to ZIF connector ZCA-OMN16 Tucker-Davis Technologies Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Pin Terminal Connector
(Wide Board Only)		 ED11523-ND DigiKey Qty: 16
Unit Cost (USD): 10
Probe storage box G2085 Melmat Qty: 1
Unit Cost (USD): 2
Razor Blade 4A807 Grainger Qty: 1
Unit Cost (USD): 2
SEM post 16327 lnf Qty: 1
Unit Cost (USD): 3
Silver Epoxy (1oz)++ H20E/1OZ Epoxy Technology Qty: 1
Unit Cost (USD): 125
Silver GND REF wires 50-822-122 Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 423.2
Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g 152536 Sigma-Aldrich Qty: 1
Unit Cost (USD): 59
Solder 24-6337-9703 DigiKey Qty: 1
Unit Cost (USD): 60
Soldering Iron Tip T0054449899N-ND Digikey Qty: 1
Unit Cost (USD): 13
Soldering Station WD1002N-ND Digikey Qty: 1
Unit Cost (USD): 374
SpotCure-B UV LED Cure System n/a FusionNet LLC Qty: 1
Unit Cost (USD): 895
Stainless steel rod n/a n/a Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Stir Plate n/a Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Surgical Scissors 08-953-1B Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 100
TDT Shroud
(ZIF Only)		 Z3_ZC16SHRD_RSN TDT Qty: 1
Unit Cost (USD): 3.5
Teflon Tweezers 50-380-043 Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 47
UV & Visible Light Safety Glassees 92522 Loctite Qty: 1
Unit Cost (USD): 45
UV Epoxy (8oz)++
(Flex Array Only)		 OG142-87/8OZ Epoxy Technology Qty: 1
Unit Cost (USD): 83
UV Laser n/a WER Qty: 1
Unit Cost (USD): 30
Weigh boat
(pack of 500)		 08-732-112 Fisher Qty: 1
Unit Cost (USD): 58
Wide Board+ n/a Advanced Circuits Qty: 1
Unit Cost (USD): 3
ZIF Active Headstage ZC16 Tucker-Davis Technologies Qty: 1
Unit Cost (USD): 925
ZIF Passive Headstage ZC16-P Tucker-Davis Technologies Qty: 1
Unit Cost (USD): 625
ZIF* n/a Coast to Coast Circuits Qty: 1
Unit Cost (USD): 9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: Requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
  2. Cunningham, J. P., et al. A closed-loop human simulator for investigating the role of feedback control in brain-machine interfaces. Journal of Neurophysiology. 105 (4), 1932-1949 (2011).
  3. Yoshida, K., Bertram, M. J., Hunter Cox, T. G., Riso, R. R. Peripheral nerve recording electrodes and techniques. Neuroprosthetics: Theory and Practice. Horch, K., Kipke, D. , World Scientific. 377-466 (2017).
  4. Dweiri, Y. M., Stone, M. A., Tyler, D. J., McCallum, G. A., Durand, D. M. Fabrication of high contact-density, flat-interface nerve electrodes for recording and stimulation applications. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54388 (2016).
  5. Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. 336, 108602 (2020).
  6. Ciancio, A. L., et al. Control of prosthetic hands via the peripheral nervous system. Frontiers in Neuroscience. 10, 116 (2016).
  7. Jiman, A. A., et al. Multi-channel intraneural vagus nerve recordings with a novel high-density carbon fiber microelectrode array. Scientific Reports. 10 (1), 15501 (2020).
  8. Welle, E. J., et al. Sharpened and mechanically robust carbon fiber electrode arrays for neural interfacing. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 29, 993-1003 (2021).
  9. Moffitt, M. A., McIntyre, C. C. Model-based analysis of cortical recording with silicon microelectrodes. Clinical Neurophysiology. 116 (9), 2240-2250 (2005).
  10. Neural cuff. Ardiem Medical. , Available from: http://www.ardiemmedical.com/neural-cuff/ (2021).
  11. Nerve-cuff electrodes. Micro-Leads Neuro. , Available from: https://www.microleadsneuro.com/research-products/?jumpto=nerve-cuff (2021).
  12. Mortimer, J. T., et al. Perspectives on new electrode technology for stimulating peripheral nerves with implantable motor prostheses. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 3 (2), 145-154 (1995).
  13. Boretius, T., et al. A transverse intrafascicular multichannel electrode (TIME) to interface with the peripheral nerve. Biosensors & Bioelectronics. 26 (1), 62-69 (2010).
  14. Grill, W. M., Norman, S. E., Bellamkonda, R. V. Implanted neural interfaces biochallenges and engineered solutions. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 1-24 (2009).
  15. Larson, C. E., Meng, E. A review for the peripheral nerve interface designer. Journal of Neuroscience Methods. 332, 108523 (2020).
  16. Christensen, M. B., et al. The foreign body response to the Utah Slant Electrode Array in the cat sciatic nerve. Acta Biomaterialia. 10 (11), 4650-4660 (2014).
  17. Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
  18. Yoshida Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
  19. Saito, N., et al. Application of carbon fibers to biomaterials: A new era of nano-level control of carbon fibers after 30-years of development. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3824-3834 (2011).
  20. Welle, E. J., et al. Fabrication and characterization of a carbon fiber peripheral nerve electrode appropriate for chronic recording. FASEB Journal. 34 (1), 1 (2020).
  21. Guitchounts, G., Cox, D. 64-Channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
  22. Patel, P. R., et al. High density carbon fiber arrays for chronic electrophysiology, fast scan cyclic voltammetry, and correlative anatomy. Journal of Neural Engineering. 17 (5), 056029 (2020).
  23. Massey, T. L., et al. Open-source automated system for assembling a high-density microwire neural recording array. 2016 International Conference on Manipulation, Automation and Robotics at Small Scales (MARSS). , 1-7 (2016).
  24. Schwerdt, H. N., et al. Subcellular probes for neurochemical recording from multiple brain sites. Lab Chip. 17, 1104-1115 (2017).
  25. Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
  26. Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
  27. Gillis, W. F., et al. Carbon fiber on polyimide ultra-microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (1), 016010 (2018).
  28. Dong, T., Chen, L., Shih, A. Laser sharpening of carbon fiber microelectrode arrays for brain recording. Journal of Micro and Nano-Manufacturing. 8 (4), 041013 (2020).
  29. Massey, T. L., et al. A high-density carbon fiber neural recording array technology. Journal of Neural Engineering. 16 (1), 016024 (2019).
  30. Romeni, S., Valle, G., Mazzoni, A., Micera, S. Tutorial: a computational framework for the design and optimization of peripheral neural interfaces. Nature Protocols. 15 (10), 3129-3153 (2020).
  31. Khani, H., Wipf, D. O. Fabrication of tip-protected polymer-coated carbon-fiber ultramicroelectrodes and pH ultramicroelectrodes. Journal of The Electrochemical Society. 166 (8), 673-679 (2019).
  32. El-Giar, E. E. D. M., Wipf, D. O. Preparation of tip-protected poly(oxyphenylene) coated carbon-fiber ultramicroelectrodes. Electroanalysis. 18 (23), 2281-2289 (2006).
  33. Venkatraman, S., et al. In vitro and in vivo evaluation of PEDOT microelectrodes for neural stimulation and recording. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (3), 307-316 (2011).
  34. Petrossians, A., et al. Electrodeposition and Characterization of Thin-Film Platinum-Iridium Alloys for Biological Interfaces. Journal of the Electrochemical Society. 158 (6), 269-276 (2011).
  35. Lee, C. D., Hudak, E. M., Whalen, J. J., Petrossians, A., Weiland, J. D. Low-impedance, high surface area Pt-Ir electrodeposited on cochlear implant electrodes. Journal of The Electrochemical Society. 165 (12), 3015-3017 (2018).
  36. Cassar, I. R., et al. Electrodeposited platinum-iridium coating improves in vivo recording performance of chronically implanted microelectrode arrays. Biomaterials. 205, 120-132 (2019).
  37. Taylor, I. M., et al. Enhanced dopamine detection sensitivity by PEDOT/graphene oxide coating on in vivo carbon fiber electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 89, 400-410 (2017).
  38. Mohanaraj, S., et al. Gold nanoparticle modified carbon fiber microelectrodes for enhanced neurochemical detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59552 (2019).
  39. Pusch, J., Wohlmann, B. Chapter 2 - Carbon fibers. Inorganic and composite fibers. Production, properties, and applications. , Woodhead Publishing. 31-51 (2019).
  40. Budai, D., Hernádi, I., Mészáros, B., Bali, Z. K., Gulya, K. Electrochemical responses of carbon fiber microelectrodes to dopamine in vitro and in vivo. Acta Biologica Szegediensis. 54 (2), 155-160 (2010).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 176
ערכת כלים בקוד פתוח: מערך מיקרו-אלקטרוניקה של סיבי פחמן עבור הקלטת עצבים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Richie, J. M., Patel, P. R., Welle,… More

Richie, J. M., Patel, P. R., Welle, E. J., Dong, T., Chen, L., Shih, A. J., Chestek, C. A. Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording. J. Vis. Exp. (176), e63099, doi:10.3791/63099 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter