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Medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de Colacium sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo Cuvette

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método beneficioso para medir la fotofisiología del fotosistema II y la productividad primaria. Aquí describimos un protocolo para medir la fotofisiología PSII del alga epizoica, Colacium sp. sobre sustrato zooplancton utilizando FRRf tipo cubeta.

Abstract

El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método beneficioso para medir la fotofisiología del fotosistema II (PSII) y la productividad primaria. Aunque FRRf puede medir la sección transversal de absorción de PSII (σ PSII), la máxima eficiencia fotoquímica (Fv / Fm), la eficiencia fotoquímica efectiva (Fq ′ / Fm ′) y el enfriamiento no fotoquímico (NPQNSV) para varias algas eucariotas y cianobacterias, casi todos los estudios de FRRf hasta la fecha se han centrado en el fitoplancton. Aquí, el protocolo describe cómo medir la fotofisiología PSII de un alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), en su etapa adjunta (unida al zooplancton), utilizando FRRf de tipo cubeta. En primer lugar, estimamos los efectos del zooplancton de sustrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) sobre la fluorescencia basal y la σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′, y NPQNSV del planctónico Colacium sp. Para validar esta metodología, se registraron las mediciones fotofisiología de Colacium sp. adherido en S. mucronata y se compararon estos resultados con su etapa planctónica. Los resultados representativos mostraron cómo el protocolo podría determinar los efectos del calcio (Ca) y el manganeso (Mn) en la fotofisiología de Colacium sp. e identificar los diversos efectos del enriquecimiento de Mangan entre las etapas adjuntas y planctónicas. Finalmente, discutimos la adaptabilidad de este protocolo a otras algas perifíticas.

Introduction

La fluorescencia variable de clorofila es una herramienta útil para medir la fotofisiología del fotosistema de algas II (PSII). Las algas responden a diversas tensiones ambientales, como el exceso de luz y la deficiencia de nutrientes, alterando su fotofisiología PSII. El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método común para medir la fotofisiología psiI1,2 y estimar la productividad primaria1,3,4, que permite monitorear la fotofisiología psiI del fitoplancton, así como la productividad primaria en amplias escalas espaciales y temporales5,6,7. FRRf puede medir simultáneamente la sección transversal de absorción de PSII (σ PSII), la concentración del centro de reacción ([RCII]), la eficiencia fotoquímica máxima (Fv / Fm), la eficiencia fotoquímica efectiva (Fq ′ / Fm ′) y el enfriamiento no fotoquímico (NPQNSV) (Tabla 1). En general, Fv/Fm y Fq′/Fm′ se definen como actividad PSII8, mientras que NPQNSV se define como energía relativa disipada por calor9.

Es importante destacar que los destellos de rotación única (ST) de FRRf reducen completamente el aceptor primario de electrones de quinona, QA, pero no el grupo de plastoquinona. Por el contrario, los destellos de rotación múltiple (MT) de un fluorómetro de modulación de amplitud de pulso (PAM) pueden reducir ambos. El método ST tiene una clara ventaja sobre el método MT al identificar los posibles orígenes de NPQNSV al medir simultáneamente la cinética de recuperación de Fv / Fm, Fq ′ / Fm ′, NPQNSV y σ PSII10. Hasta la fecha, varios tipos de instrumentos FRRf, como el tipo sumergible, el tipo cuvette y el tipo de flujo a través, están disponibles comercialmente. El FRRf de tipo sumergible permite mediciones in situ en océanos y lagos, mientras que el FRRf de tipo cubeta es adecuado para medir pequeños volúmenes de muestra. El tipo de flujo a través se usa comúnmente para medir continuamente la fotofisiología del fitoplancton en aguas superficiales.

Dado el desarrollo de fluorómetros PAM, incluido el tipo cubeta, para una amplia gama de sujetos11, los fluorómetros PAM siguen siendo más comunes que los FRRf en la investigación de fotofisiología de algas12. Por ejemplo, aunque la estructura de la cámara de muestreo y la capacidad de la cubeta entre estas herramientas solo difieren ligeramente, el PAM tipo cubeta se ha aplicado a fitoplancton13,14,15, microalgas bentónicas16,17,18, algas de hielo19 y algas epizoicas20, mientras que el FRRf de tipo cubeta se ha aplicado principalmente a fitoplancton21,22,23 y un número limitado de comunidades de algas de hielo24,25. Dada su eficacia, el FRRf de tipo cubeta es igualmente aplicable a las algas bentónicas y epizoicas. Por lo tanto, la expansión de su aplicación proporcionará una visión considerable de la fotofisiología PSII, particularmente para la fotofisiología de algas epizoicas menos conocida.

Las algas epizoicas han recibido poca atención, con pocos estudios que examinen su fotofisiología PSII20,26, muy probablemente debido a sus funciones menores en las redes tróficas acuáticas27,28. Sin embargo, los epibiontes, incluidas las algas epizoicas, pueden influir positivamente en la dinámica de la comunidad de zooplancton, como el aumento de las tasas de reproducción y supervivencia29,30, así como impactar negativamente en procesos, como el aumento de la tasa de hundimiento29,31 y la vulnerabilidad a los depredadores visuales32,33,34,35,36 . Por lo tanto, explorar los factores ambientales y biológicos que controlan la dinámica de los epibiontes en las comunidades de zooplancton es crucial.

Entre las algas epizoicas, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) es un grupo de algas comunes, de agua dulce32,37,38,39 con varias etapas de vida, incluyendo etapas planctónicas adjuntas (Figura 1A-D), planctónicas no móviles (Figura 1E, F) y planctónicas móviles40,41 . Durante la etapa planctónica no móvil, las células viven como plancton unicelular, colonias agregadas o colonias de láminas de una capa, cubiertas por mucílago42. En la etapa de unión, Colacium sp. utiliza mucílago excretado desde el extremo anterior de la célula37,39,41 para adherirse a organismos sustratos (basibionts), particularmente microcrustáceos41,43. Su ciclo de vida también implica desprenderse del exoesqueleto muda o basibionte muerto y nadar con sus flagelos para encontrar otro organismo sustrato39. Tanto la etapa planctónica como la unida pueden aumentar el tamaño de su población en mitosis40. Aunque se presume que su etapa adjunta es un rasgo evolutivo para la recolección de recursos, como la luz44 y los oligoelementos41,45,46, o como una estrategia de dispersión27, se dispone de poca evidencia experimental sobre estos aspectos37,41,44 y los mecanismos clave de unión son en gran parte desconocidos. Por ejemplo, Rosowski y Kugrens esperaban que Colacium obtuviera manganeso (Mn) a partir de copépodos de sustrato41, concentrados en el exoesqueleto47.

Aquí, describimos cómo medir la fotofisiología PSII de algas planctónicas y el método de aplicación relacionado para apuntar a algas adheridas (uniéndose al zooplancton) con células de Colacium sp. utilizando el FRRf de tipo cubeta. Utilizamos el sistema Act2 equipado con tres diodos emisores de luz (LED) que proporcionan energía de excitación de flash centrada en 444 nm, 512 nm y 633 nm48. Aquí, 444 nm (azul) corresponde al pico de absorción de la cromalina a (Chl-a), mientras que 512 nm (verde) y 633 nm (naranja) corresponden a los picos de absorción de ficoeritrina y ficocianina, respectivamente. El pico de detección de señal fluorescente es de 682 nm con medio ancho de banda de 30 nm. Dado que es difícil encontrar la etapa planctónica de Colacium sp. en ambientes naturales, su etapa adjunta se recolectó para los experimentos. Entre los numerosos organismos sustratos, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figura 1A, B, G) es una de las más simples de manejar debido a su lenta velocidad de natación, gran tamaño corporal (400-650 μm) y comportamiento único (colgando boca abajo en la superficie del agua). Por lo tanto, este protocolo utiliza Colacium sp. unido en S. mucronata como un estudio de caso del sistema Colacium-basibiont. Para evitar la fluorescencia derivada del contenido intestinal, S. mucronata se murió de hambre. Como un estudio anterior informó que la señal de fluorescencia del contenido intestinal (algas ingeridas) muestra una disminución de cinco veces después de 40 min49, esperábamos que la inanición de 90 min fuera suficiente para minimizar la posibilidad de que la fluorescencia del contenido intestinal afectara la medición de FRRf con efectos mínimos de estrés experimental para Colacium sp., como la deficiencia de nutrientes. Además, este protocolo se aplicó para aclarar el mecanismo de unión de Colacium sp. y determinar cómo dos metales, el calcio (Ca) y el manganeso (Mn) afectan la fotofisiología de las etapas planctónica y adjunta. El calcio juega un papel clave en las vías fotosintéticas50 de múltiples maneras, y ambos metales son necesarios para construir los complejos de evolución de oxígeno de la PSII51. Como el calcio y el manganeso están altamente concentrados en el caparazón del zooplancton de crustáceos47, planteamos la hipótesis de que la fotofisiología de Colacium sp. podría responder más prominentemente al enriquecimiento de Ca y Mn durante la etapa planctónica si esta etapa de la vida obtiene estos elementos de S. mucronata durante la etapa adjunta.

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Protocol

1. Muestreo

  1. Recoge el agua del lago de la superficie con un cubo. Para apuntar a Colacium sp. unido a S. mucronata (Figura 1A-C) filtra 0.5-10 L de agua de lago utilizando una red de malla de nylon de 100 μm52.
    NOTA: S. mucronata a menudo se agrega densamente en aguas poco profundas, eutróficas y fangosas, como entre las áreas de juncos (fragmitas).
  2. Almacene las muestras concentradas en botellas de plástico de 500 ml con 350 ml de agua de lago. Mantener en condiciones de oscuridad.
  3. En el laboratorio, vierta el agua de la muestra en un vaso de precipitados de 500 ml y deje que se asiente durante unos minutos.
  4. Filtre el agua del lago a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm.
  5. Recoger S. individuos mucronata usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x. Realizar la identificación de especies según Błędzki y Rybak53.
  6. Transfiéralos a una gota de agua de lago filtrada (FLW) de 0,2 μm colocada en un portaobjetos de vidrio.
    NOTA: S. mucronata puede nadar a la superficie o adherirse a la pared del vaso de precipitados.
  7. Compruebe S. mucronata bajo microscopía de luz.
  8. Lavar S. individuos mucronata que usan PDA (3 gotas o más) para prevenir la contaminación de otros organismos (Figura 2).
  9. Mantener S. mucronata a temperatura in situ en una cámara de crecimiento inferior a 40 μmol de fotón·m−2·s−1.

2. Efectos de S . mucronata en la fluorescencia basal

  1. S. cultivo de mucronata
    1. Recoja a los individuos de S. mucronata usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x y lávese con FLW, como en el paso 1.8.
    2. Airear el agua del grifo usando una bomba de aire eléctrica a través de una piedra de aire durante al menos 1 semana. Vierta 300 ml de agua del grifo aireada en un frasco de vidrio de 350 ml.
    3. Alimentar Chlorella (1 mg C·L−1) y mantener a 20 °C por debajo de 40 μmol de fotón·m−2·s−1 en una cámara de crecimiento.
    4. Después de aproximadamente 14 días, recoja a 5-30 individuos usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x e inocularlos en 300 ml de agua del grifo limpia y aireada para mantener el medio fresco.
  2. Configuración de FRRf
    1. Inicie el software Act2Run.
    2. Haga clic en la pestaña Opciones y seleccione Act2 FLC (LED blancos) en Modo de operación para establecer el color de los LED actínicos.
    3. Haga clic en el valor de Oscuro en el paso 1 de la configuración de la curva de luz fluorescente en la ventana principal y escriba 30 para establecer la duración del período oscuro (Figura 3A).
    4. Haga clic en la combinación de LED B, C y D para desactivar los LED verdes y naranjas (Figura 3C).
    5. Haga clic en el valor de Fets y Pitch en Sat, y escriba 100 y 2, respectivamente, para establecer el número y el tono del flashlet en la fase de saturación (Figura 3D).
    6. Haga clic en el valor de Fets y Pitch debajo de Rel, y escriba 40 y 60, respectivamente, para establecer el número y el tono del flashlet en la fase de relajación (Figura 3E).
    7. Active la bomba de la camisa de agua haciendo clic en Durante FLC (Figura 3F) para controlar la temperatura de la muestra durante la medición.
    8. Actívelo haciendo clic en Auto-LED y Auto-PMT (Figura 3F).
    9. Haga clic en Sincronizar para conectar FRRf-Act2.
  3. Mediciones de FRRf
    1. Para examinar los efectos de los individuos con zooplancton sobre la fluorescencia basal, prepare S adulto. mucronata (tamaño corporal 400-650 μm) del cultivo en los pasos 2.1.1-2.1.4 sin ningún organismo adherido.
    2. Para evitar la fluorescencia del contenido intestinal, muera de hambre a los individuos en LA PDA a 20 ° C durante al menos 90 minutos.
    3. Vierta 1,5 ml de PDA en una cubeta. Recoja individuos de 0, 1, 5 y 10 S. mucronata usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x.
    4. Transferencia S. mucronata individuos en la cubeta y añadir FLW para llevar la muestra hasta 2 mL.
    5. Aclimatarse con poca luz (1-10 μmol de fotón·m−2·s−1) a 20 °C durante 15 min antes de la medición de FRRf.
    6. Haga clic en Act2 Run para iniciar la medición. Repita las mediciones >3 veces por muestra.
    7. Lea el valor Fo de la gráfica de resultados (Figura 4).

3. Efectos del organismo sustrato sobre la fluorescencia Chl- a

  1. Cultivo de Colacium sp.
    1. Preparar el medio FLW y AF-654 para el cultivo (Tabla 2).
    2. Recoger Colacium sp. unido a S. mucronata como en los pasos 1.1 y 1.2 y, mantener a temperatura in situ en una cámara de crecimiento.
    3. Recoja Colacium sp. con un caparazón mudado (Figura 1D) usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x. Lávelos con FLW, como en el paso 1.8.
    4. Inocular asépticamente Colacium sp. y AF-6 medio en un tubo de vidrio de 10 ml en un banco limpio.
    5. Mantener el cultivo a temperatura in situ por debajo de 200 μmol de fotón·m−2·s−1 en una cámara de crecimiento. Agite el tubo de vidrio suavemente con la mano al menos una vez al día para evitar el asentamiento celular.
      NOTA: Para mantener el efecto de atenuación de las colonias agregadas lo más bajo posible, verifique las colonias bajo un microscopio antes de la medición de FRRf. La agregación celular puede causar colonias densas y afectar a la fotofisiología de algas55.
  2. Mediciones de FRRf
    1. Para examinar los efectos de los individuos de zooplancton en la fluorescencia de Chl-a de Colacium sp., prepare S adulto. mucronata (tamaño corporal 400-650 μm) sin ningún organismo adherido.
    2. Para evitar la fluorescencia del contenido intestinal, muera de hambre a las personas en LA PDA durante al menos 90 minutos.
    3. Configure un fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) tipo cubeta.
    4. Vierta una submuestra de 1,5 ml de Colacium sp. precultivado en una cubeta. Transferencia 0, 5, 10 y 15 S. mucronata individuos en estas cubetas y añadir 2 μm de medio filtrado para llevar la muestra hasta 2 mL.
    5. Aclimatarse con poca luz (1-10 μmol de fotón·m−2·s−1) a 20 °C durante 15 min antes de tomar la medición de FRRf.
      NOTA: Mantenga las muestras a temperatura de incubación durante las mediciones
    6. Haga clic en Act2 Run para iniciar la medición. Repita las mediciones >3 veces por muestra.
    7. Lea los valores FO y Fm de la gráfica de resultados (Figura 4).
      NOTA: Compruebe el valor RσPSII (Tabla 1), que muestra si la potencia del LED está dentro del rango óptimo para estimar correctamente los parámetros PSII. Cuando se activa el Auto-LED, el sistema Act2run controla la potencia del LED para lograr un rango RσPSII óptimo (0.042-0.064). El valor de corte experimental de RσPSII se definió en 0,03 y 0,08 en un estudio previo48.
    8. Para corregir la fluorescencia basal22, filtre el medio de cultivo utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm y mida la fluorescencia. Reste FO de la muestra de referencia de FO y Fm de Colacium sp., o modifique el valor de corrección en blanco en la configuración de la ficha Opciones.

4. Fotofisiología de Colacium sp. (etapa adjunta)

  1. Aislar individuos de S. mucronata con Colacium sp. usando una pipeta bajo un microscopio óptico.
  2. Lavar S. mucronata usando FLW, como en el paso 1.8.
  3. Transferencia S. mucronata en 100 mL de PDA. Para la inanición, mantener en condiciones de oscuridad a temperatura in situ durante 90 min.
  4. Vierta 1,5 ml de PDA en una cubeta.
  5. Transferencia ~10 S. individuos mucronata con Colacium sp. en una cubeta. Para las mediciones, se necesitan más de 100 células de Colacium por 2 ml. Agregue FLW para llevar la muestra hasta 2 ml.
  6. Aclimatarse a baja luz (1-10 μmol de foton·m−2·s−1) a temperatura in situ durante 15 min. Mida la fluorescencia de Chl-a como en los pasos 3.2.6-3.2.8.
  7. Para enumerar el número de células adheridas, fije la muestra con glutaraldehído (volumen final del 2%) después de tomar la medición de FRRf. Tome fotografías a varias profundidades focales y posiciones de S. mucronata bajo un microscopio de luz.

5. Fotofisiología de Colacium sp. (etapa planctónica)

  1. Cultivar Colacium sp. muestreado en medio AF-6 a temperatura in situ como en los pasos 3.1.1-3.1.5.
  2. Para la fase estacionaria, tome 2 ml de Colacium sp. cultivado y vierta en una cubeta.
  3. Aclimatarse a baja luz (1-10 μmol de foton·m−2·s−1) a temperatura in situ durante 15 min. Mida la fluorescencia de Chl-a como en los pasos 3.2.6-3.2.8.

6. Efectos de la adición de Ca y Mn en la fotofisiología de Colacium sp.

  1. Efectos en el escenario adjunto
    1. Aislar individuos de S. mucronata con Colacium sp. usando una pipeta bajo un microscopio óptico. Lavar con PDA, como en el paso 1.8.
    2. Transfiera seis individuos cada uno en 12 vasos de vidrio con 30 ml de PDA. Asegúrese de que cada vaso de precipitados contenga >100 células de Colacium sp.
    3. Añadir 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamiento con Ca), 40 μmol· L−1 MnCl4 (tratamiento Mn), o agua ultrapura (control) a cada vaso de precipitados. Incubar las muestras bajo 200 μmol de fotón·m−2 ·s−1 a temperatura in situ en una cámara de crecimiento.
    4. A las 3 h y 21 h, transfiera todos los individuos y pieles mudas a una cubeta con 2 ml del medio.
    5. Para examinar la respuesta rápida al aumento de la luz, haga clic en Arriba de los períodos de 8 pasos de luz actínica y escriba 20 (Figura 3A) para establecer la duración de cada paso en 20 s. Para establecer la luz actínica paso a paso como 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 y 200 μmol foton·m−2·s−1, haga clic en High E y Step Up y cambie los valores a 200 y 34, respectivamente (Figura 3B).
    6. Después de 15 min de aclimatación oscura, mida la fluorescencia Chl-a de cada muestra similar a los pasos 3.2.6-3.2.8.
      NOTA: Verifique que los valores de RσPSII y RσPSII' estén dentro del rango óptimo (0.03-0.08)48.
  2. Efectos sobre la etapa planctónica
    1. Cultivar Colacium sp. muestreado en medio AF-6 a temperatura in situ como en los pasos 3.1.1-3.1.5.
    2. Transfiera el Colacium sp. cultivado a FLW y aclimata a una temperatura in situ inferior a 200 μmol de foton·m−2·s−1 durante 3 días.
    3. Transfiera 1 ml de las muestras aclimatadas a tres viales de vidrio con 10 ml de PDA.
    4. Añadir 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamiento con Ca), 40 μmol· L−1 MnCl3 (tratamiento Mn), o agua ultrapura (control) a viales. Incubar las muestras bajo 200 μmol de fotón·m−2·s−1 a temperatura in situ en una cámara de crecimiento.
    5. A las 3 h y 21 h, mida la fluorescencia Chl-a de cada muestra como en los pasos 3.2.6-3.2.8.

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Representative Results

No hubo efecto significativo de la fluorescencia basal (Figura 5) o de la fluorescencia Chl-a (Figura 6) por S. mucronata hasta 5 individuos (inds.) mL−1. Sin embargo, Fv/Fm y NPQNSV se vieron significativamente afectados cuando S. mucronata fue de 7,5 inds·mL−1. Por lo tanto, para medir la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa adjunta, elegimos S. mucronata con la mayor carga de Colacium sp. para alcanzar suficiente abundancia de Colacium sp. (>50 células·mL−1) y un bajo número de S. mucronata (≤5 inds·mL−1) en la cubeta.

La Tabla 3 muestra la variación estacional en la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa adjunta. Aunque la temperatura de muestreo varió, su fotofisiología se mantuvo relativamente constante. σ PSII varió de 3,42 nm2 a 3,76 nm2 (media 3,60 nm2), Fv/Fm varió de 0,52 a 0,60 (media 0,55) y NPQNSV varió de 0,66 a 0,85 (media 0,82). Para validar estos resultados, investigamos más a fondo las variaciones en la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa planctónica para la fase estacionaria en el medio AF-6 (Tabla 4). La media de Fv/Fm y NPQNSV para la etapa adjunta fue similar a las de la etapa planctónica cuando se incubaron en medio AF-6.

Para determinar el efecto de Ca y Mn sobre la fotofisiología de Colacium sp. tanto en las etapas adjuntas como planctónicas, realizamos experimentos de enriquecimiento de Ca y Mn. Se tomaron muestras del área de juncos del lago Biwa el 7 de mayo de 2021. Para la etapa adjunta de Colacium sp. en condiciones oscuras, no hubo diferencias significativas en los parámetros fotofisiológicos entre los tratamientos, a excepción de NPQNSV entre los tratamientos de Mn y Ca a las 3 h, donde Ca < Mn (Figura 7A, C, E). Además, σ PSII′, Fq′/Fm′ y npQNSV a las respuestas al aumento de la luz durante la etapa adjunta no mostraron diferencias claras entre los tratamientos (Figura 8A, C, E y Figura 9A, C, E). Sin embargo, el NPQNSV tendió a ser menor en el tratamiento con Ca que en el control a una intensidad de luz baja a las 21 h (11 y 25 μmol de foton·m−2·s−1, Figura 9E). Para la etapa planctónica, σ PSII fue significativamente menor en el tratamiento de Mn que Ca a las 3 h (Figura 7B). Fq′/Fm′ fue significativamente mayor, pero npQNSV fue menor en el tratamiento de Mn que en control a las 21 h (Figura 7D,F). Bajo el aumento de la luz, el Manganeso tendió a disminuir σ PSII y aumentar Fq′/Fm′ durante la etapa planctónica, en comparación con el control a las 3 h (Figura 8D). Del mismo modo, el Manganeso redujo significativamente el NPQNSV durante la etapa planctónica en comparación con el control a las 21 h (Figura 9F). Similar a la etapa adjunta, el calcio mejoró ligeramente el NPQNSV para la etapa planctónica bajo luz creciente (Figura 9F). Sin embargo, el Ca disminuyó Fq′/Fm′ y aumentó el NPQNSV para la etapa planctónica en comparación con el tratamiento con Manganeso bajo 44-200 μmol de fotón·m−2·s−1 a las 3 h (Figura 8D,F).

Figure 1
Figura 1: Colacium sp. y sustancia del organismo Scapholeberis mucronata. (A) S. mucronata infectada. (B) S. mucronata infectada fijada con glutaraldehído. (C) Células de Colacium adheridas en S. mucronata viva. (D) Células de colacio unidas en el caparazón fundido. (E, F) Colacium sp. de etapa planctónica (palmella). G) S. mucronata no infectada. Las flechas indican células de Colacium. Barras de escala: 200 μm (A, B y G), 10 μm (C, E y F) y 100 μm (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Lavado del zooplancton mediante pipeteo bajo agua filtrada del lago (PDA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Interfaz de usuario del software Act2Run. (A) Tiempo de exposición a cada paso de luz actínica; (B) Número de pasos y flujo de fotones de luz actínica; (C) Combinación de longitud de onda de excitación; (D) Secuencia de flashetas de saturación y relajación; E) Frecuencias e intensidades de la camisa de agua y de las bombas mezcladoras de muestras; (F) Flujo de fotones del destello de excitación a 444 (denotado como 450 aquí), 512 (530) y 633 nm (624), voltaje del tubo fotomultiplicador (PMT) y réplicas e intervalo de secuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Lectura de fluorescencia de la muestra de algas en el software Act2Run. Las líneas rojas y azules indican la señal de fluorescencia en bruto mediante una secuencia de destellos y curvas que encajan en las fases de saturación y relajación, respectivamente. Véase Kolber et al.2 para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: El efecto de la densidad de S. mucronata sobre la fluorescencia basal. Los puntos pequeños representan réplicas (n = 3). También se muestran los resultados de la prueba ANOVA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Los efectos de las densidades de S. mucronata sobre (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm, y (D) NPQNSV para Colacium sp. durante la etapa planctónica. Los puntos pequeños representan réplicas (n = 3). Colacium sp. se cultivó en medio AF-6. También se presentan los resultados de la prueba post-hoc ANOVA y Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Respuestas de (A,B) sección transversal de absorción, (C,D) fotoquímica PSII, y (E,F) enfriamiento no fotoquímico de (A,C,E) etapa adjunta y (B,D,F) etapa planctónica de Colacium sp. a las 3 h y 21 h después de la adición de Ca y Mn. Los puntos pequeños representan réplicas (n = 4). También se presentan los resultados de la prueba post-hoc ANOVA y Tukey. * p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Respuestas rápidas a la luz de (A, B) sección transversal de absorción, fotoquímica PSII (C, D) y enfriamiento no fotoquímico de Colacium sp. en etapas adjuntas y planctónicas al protocolo de luz paso a paso a las 3 h después de la adición de Ca y Mn. C, control; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Diferencias significativas entre (a) C y Ca, (b) C y Mn, y (c) Ca y Mn en cada flujo par, con un nivel de significancia de p < 0,05 mostrado en cada panel. Barra de error, SD media (n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Respuestas rápidas a la luz de la sección transversal de absorción (A, B), fotoquímica PSII (C, D) y enfriamiento no fotoquímico (E, F) de Colacium sp. en etapas adjuntas y planctónicas al protocolo de luz paso a paso a las 21 h después de la adición de Ca y Mn. C, control; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Diferencias significativas entre (a) C y Ca, (b) C y Mn, y (c) Ca y Mn en cada flujo par, con un nivel de significancia de p < 0,05 mostrado en cada panel. Barra de error, SD media (n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Término Definición Unidades
Fluorescencia basal Valor fo sin fluorescencia Chl-a
F' Fluorescencia en el destello cero de una sola medición de rotación cuando C>0
Fo (ʹ) Rendimiento mínimo de fluorescencia PSII (bajo luz de fondo) en el destello cero
Fv (ʹ) Fm(ʹ) − Fo(ʹ)
Fm (ʹ) Rendimiento máximo de fluorescencia PSII (bajo luz de fondo)
Fv/Fm Máxima eficiencia fotoquímica PSII bajo oscuridad
Fqʹ/Fmʹ Máxima eficiencia fotoquímica PSII bajo luz de fondo, (Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV Enfriamiento normalizado de Stern-Volmer, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[RCII] Concentración del centro de reacción
RσPSII (ʹ) Probabilidad de que un RCII se cierre durante el primer flashlet de una sola fase de saturación de rotación (bajo luz de fondo)
σ PSII (ʹ) Sección transversal de absorción funcional de PSII para flashetas de excitación (bajo luz de fondo) nm2

Tabla 1: Términos utilizados en este protocolo.

Componente Cantidad
NaNO3 140 mg· L−1
NH4NO3 22 mg· L−1
mgSO4·7H2O 30 mg· L−1
KH2PO4 10 mg· L−1
K2HPO4 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 mg· L−1
CaCO3 10 mg· L−1
Fe-citrato* 2 mg· L−1
Ácido cítrico* 2 mg· L−1
Biotina 0,002 mg· L−1
Vit.B 1 0,01 mg· L−1
Vit.B 6 0,001 mg· L−1
Vit.B 12 0,001 mg· L−1
Metales traza 1 mL·L−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 mg·mL−1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 mg·mL−1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 mg·mL−1)
(CoCl2·6H2O) (0,002 mg·mL−1)
(Na2MoO4) (0,004 mg·mL−1)
(Na2-EDTA) (7,5 mg·mL−1)

Tabla 2: Receta para el medio AF-6. Ajuste el pH a 6.6. Disolver el fe-citrato y el ácido cítrico en H2O caliente por separado y añadir HCl (1 mL·L−1) después de mezclar ambos reactivos. El contenido de metales traza se muestra entre paréntesis.

Fecha de muestreo Ejemplo No. Temperatura del agua.
(°C) 		Densidad de S. mucronata
(inds.· mL−1)		 Colacium sp. densidad celular
(inds.· mL−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
Abril 27/2020 No. 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
SE 0.22 0.01 0.04
Mayo 21/2020 No. 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
No.3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
No.4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
Junio 18/2020 No.5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
No.6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
No.7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
Julio 20/2020 No. 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
SE 0.10 0.00 0.00
Significar 3.60 0.55 0.82
S.D. 0.120349 0.03 0.10

Tabla 3: Fotofisiología de Colacium sp. adjunta sobre S. mucronata.

Fecha de muestreo Ejemplo No. Medio Temperatura de crecimiento (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
Mayo 21/2020 No. 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
SE 0.03 0.00 0.01
Junio 18/2020 No. 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
SE 0.08 0.02 0.07
Julio 20/2020 No.3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
SE 0.06 0.01 0.02
Significar 2.90 0.59 0.70
S.D. 0.18 0.05 0.16

Tabla 4: Fotofisiología de la etapa planctónica de Colacium sp. Cada muestra se midió durante la fase estacionaria.

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Discussion

Este protocolo demostró por primera vez que la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa adjunta en un entorno natural es comparable a su etapa planctónica en medio AF-6. Además, el contenido intestinal de S. mucronata hambrienta no afectó la fluorescencia basal y Chl-a cuando la densidad fue ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 y Figura 6). Estos resultados sugieren que este protocolo puede medir la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa adjunta sin corrección bajo baja abundancia de organismos de sustrato. Sin embargo, los resultados de los pasos 3.2.1-3.2.8 mostraron que la mayor abundancia de S. mucronata afectó significativamente a Fv/Fm y NPQNSV, pero no a FO y σ PSII (Figura 4). Aquí, es posible que una mayor densidad de organismos exacerbe el estrés físico en los individuos de Colacium sp. y posteriormente disminuya la actividad fotosintética. Para las mediciones bajo una alta abundancia de organismos de sustrato u otras especies, los efectos de la densidad del organismo de sustrato en la línea de base y la fluorescencia de Chl-a requieren mayor atención.

Los FRRf se han utilizado para examinar el impacto de la manipulación de nutrientes en el flujo lineal de electrones y el enfriamiento no fotoquímico del fitoplancton22,56,57. Los resultados primarios muestran que el enriquecimiento de Ca y Mn difirió significativamente entre las etapas de vida de Colacium sp. (Figura 7, Figura 8 y Figura 9). Específicamente, el manganeso mejoró claramente el rendimiento fotoquímico (máximo) de PSII (Fv/Fm y Fq′/Fm′) y disminuyó la disipación de calor (NPQNSV)50 de las etapas planctónicas en condiciones oscuras (Figura 7D,F) y de luz (Figura 8D,F y Figura 9D,F). Estos resultados pueden provenir de la reducción del tamaño de la antena en PSII, σ PSII y σ PSII′ (Figura 7B y Figura 8B), lo que reduce el exceso de absorción de luz58,59. La medición del tamaño de la antena además del flujo de energía entre complejos PSII permitiría mediciones más precisas de la respuesta de las algas10. Este protocolo también permite el examen de las limitaciones de la fotosíntesis por otros recursos. Por ejemplo, las limitaciones de nitrógeno y fósforo se han examinado en diversas comunidades de fitoplancton, pero no en algas epizoicas, a pesar de los efectos previstos sobre Colacium41 y las diatomeas epizoicas marinas60,61. Además de los nutrientes, el ambiente ligero puede influir aún más en la distribución de algas epizoicas44.

Como se muestra en la Figura 7, la Figura 8 y la Figura 9, el FRRf de tipo cubeta nos permite examinar simultáneamente los efectos de nutrientes y luz sin largos tiempos de incubación y esfuerzo de medición. Este protocolo de luz paso a paso (paso 6.1.5) también puede dibujar curvas de luz rápida de velocidades relativas de transporte de electrones (rETR = Fq′/Fm′× luz) vs. luz como un análogo para curvas de producción vs. luz62. Sin embargo, aunque el flujo lineal de electrones en PSII puede estimarse a partir de parámetros fotofisiológicos por el FRRf, no es necesariamente análogo a la tasa de fijación de carbono63,64. Para estimar la producción primaria basada en el carbono, el requerimiento de electrones por fijación de CO2 (Фe, C), que puede variar temporal y espacialmente5,48, debe examinarse al evaluar las comunidades sujetas.

Si la red de plancton está obstruida por escombros, preseleccione con una malla más grande, como una red de malla de 5 mm, o recoja zooplanctones directamente del agua del lago usando una pipeta sin filtración. Cabe señalar que puede ocurrir algún daño a las algas adheridas incluso cuando la filtración se realiza suavemente utilizando un tamaño de malla relativamente grande (200 μm). Aunque los resultados muestran que la desviación estándar de los parámetros PSII fue pequeña (Tabla 3), y los valores medios de los parámetros fueron muy similares a los de la etapa planctónica cultivada (Tabla 4), el muestreo sin filtración podría ser ideal.

Otra limitación de este estudio fue derivar σ PSII. La luz actínica y la atenuación de la fluorescencia Chl-a pueden ejercer una gran influencia/distorsión sobre los FRRfs, que se basan en muestras ópticamente delgadas para la determinación precisa de σ PSII65. Aunque demostramos que S. mucronata no afectó la σ PSII de las células planctónicas de Colacium, eso debe examinarse relacionado con la σ PSII de las células de Colacium unidas. Además, se necesitaría un factor de corrección espectral (SCF) para la estimación de σ PSII in situ66, ya que la longitud de onda de excitación del sistema ACT2 (444 nm) difiere de la distribución espectral del entorno de luz in situ. En general, la técnica de la almohadilla filtrante se utiliza para medir el espectro de absorción específico de Chl-a para calcular el SCF. Este procedimiento es necesario para estimar la productividad primaria de algas por los FRRfs. Como no pudimos cosechar suficientes células de Colacium adheridas durante el período de estudio, el espectro de absorción específico de Chl-a debe examinarse en estudios futuros.

La implementación de FRRf de tipo cubeta debe depender del tamaño del sustrato, ya que las algas perifíticas requieren una fijación de sustrato. Por ejemplo, los estudios de algas sobre sustancias indestructibles, como rocas67, organismos más grandes26,68 o algas simbióticas, incluido Symbiodinium asociado con corales duros10,69,70, podrían requerir el FRRf69 de tipo sumergible. Por el contrario, si el basibiont es lo suficientemente pequeño como para suspenderse en una cubeta, un FRRf tipo cubeta podría ser suficiente además de un PAM tipo cubeta, como las algas bentónicas16,17,18. De hecho, estudios recientes han explorado un FRRf de tipo cubeta para medir la fotofisiología de las algas de hielo24,25. Además, activar el flash de excitación a 512 y 633 nm permite la aplicación a cianobacterias con diferentes pigmentos de antena PSII, ficoeritrinas y ficocianinas, y por lo tanto diferentes picos de absorción con Chl-a71. Dado que los modelos FRRf actuales que incorporan longitudes de onda de múltiples excitaciones son herramientas útiles para examinar la fotofisiología y la productividad de las cianobacterias7,66,72, estos deberían ser métodos útiles para evaluar las cianobacterias bentónicas, si se mejoraran los efectos del grosor de la muestra sobre los parámetros fotofisiológicos65 . En estudios futuros, los FRRfs deben dirigirse a una gama más amplia de organismos sujetos para arrojar más información sobre los complejos mecanismos de la fotofisiología de algas en varios hábitats.

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Disclosures

Los autores no tienen divulgaciones que declarar.

Acknowledgments

La labor contó con el apoyo del Fondo de Investigación Colaborativa de la Prefectura de Shiga titulado "Estudio sobre la calidad del agua y el medio ambiente del fondo de los lagos para la protección de la solidez del medio ambiente acuático" en el marco de la Subvención Japonesa para la Revitalización Regional y el Fondo de Investigación y Desarrollo Tecnológico del Medio Ambiente (Nº 5-1607) del Ministerio de Medio Ambiente del Japón. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Los autores desean agradecer a Enago (www.enago.jp) por la revisión en inglés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

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Biología Número 177 FRRf de sobremesa Colacium sp. epibionte algas epizoicas Lago Biwa fotofisiología
Medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de <em>Colacium</em> sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo Cuvette
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Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

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