이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
염증성 카스파제는 카스파제-1, -4, -5, -11, 및 -12를 포함하고, 개시제 카스파제의 하위군에 속한다. Caspase-1은 염증 신호전달의 정확한 조절을 보장하기 위해 요구되며, 염증에 대한 모집 후 근접-유도된 이량체화에 의해 활성화된다. Caspase-1은 단핵구 세포 계보에 풍부하고, 전염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-1β 및 IL-18의 성숙을 활성 분비 분자로 유도한다. 다른 염증성 카스파제, 카스파제-4 및 -5 (및 이들의 뮤린 상동체 카스파제-11)는 피로옵토시스를 유도함으로써 IL-1β 방출을 촉진한다. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)은 카스파제 활성화의 판독으로서 염증성 카스파제 유도 근접성을 측정하는데 사용되는 도구이다. 인플라마좀에 결합하는 영역을 포함하는 카스파제-1, -4, 또는 -5 프로도메인은 카스파아제가 유도된 근접성을 겪을 때 형광성 복합체를 개혁하기 위해 연관되는 황색 형광 단백질 금성(Venus-N[VN] 또는 Venus-C[VC])의 비형광 단편에 융합된다. 이 프로토콜은 핵을 사용하여 이러한 리포터를 일차 인간 단핵구 유래 대식세포 (MDM)에 도입하고, 세포를 치료하여 염증성 카스파제 활성화를 유도하고, 형광 및 공초점 현미경을 사용하여 카스파제 활성화를 측정하는 방법을 설명합니다. 이러한 접근법의 장점은 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화 복합체의 성분, 요건 및 국소화를 확인하는데 사용될 수 있다는 것이다. 그러나 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않도록 신중한 통제를 고려해야합니다. 이 기술은 인플라마솜 수준에서 동적 카스파제 상호작용을 분석하고 살아있는 MDM 및 인간 혈액 샘플로부터 유래된 단핵구에서 염증성 신호전달 캐스케이드의 심문을 위한 강력한 도구입니다.
서론
카스파제는 개시제 카스파제 및 집행자 카스파제로 그룹화될 수 있는 시스테인 아스파르테이트 프로테아제의 패밀리이다. 사형 집행자 카스파제는 카스파제-3, -6 및 -7을 포함한다. 그들은 이량체로서 세포에서 자연적으로 발견되며 아폽토시스1을 실행하기 위해 개시제 카스파제에 의해 절단됩니다. 개시제 카스파제는 인간 카스파제-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 및 -12를 포함한다. 이들은 근접-유도된 이량체화에 의해 활성화되고 자가-단백질 분해 절단 2,3에 의해 안정화되는 비활성 효소원(pro-caspases)으로서 발견된다. 염증성 카스파제는 개시제 카스파제2의 서브세트이고, 인간에서 카스파제-1, -4, -5, 및 -12를 포괄하고, 마우스4,5에서 카스파제-1, -11, 및 -12를 포괄한다. 아폽토시스 역할보다는 염증에서 중심적인 역할을합니다. 이들은 프로인터루킨(IL)-1β 및 프로-IL-18 6,7의 단백질 분해 처리 및 분비를 매개하며....
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프로토콜
이 프로토콜은 인간 샘플의 조작에 대한 Baylor College of Medicine의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 혈액 샘플은 인간 샘플에 대한 제도적 안전 지침에 따라 처리됩니다. 혈액 샘플은 지역 혈액 은행에서 얻어지며, 구연산 인산염 덱스트로스 (CPD) 용액으로 수집됩니다. 그러나, 나트륨 헤파린, 리튬 헤파린 또는 EDTA와 같은 다른 항응고제로 수집된 혈액은 또한 이 프로토콜28,29에 사용될 수 있다.
1. 인간 단핵구의 분리 및 대식세포로의 분화
- 지역 혈액 은행에서 식별되지 않은 건강한 개인으로부터 항응고 된 혈액을 얻고 아래에 표시된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하십시오.
참고: 조직 배양 층류 후드의 모든 단계를 수행하십시오. 멸균 튜브 만 사용하고 장갑을 착용하십시오. 처분 할 때 모든 혈액 관련 제품에 10 % 표백제를 첨가하십시오. 멸균 PBS (1x) 또는 DPBS (Ca 제외)2+ 및 밀리그램2+)를 서로 바꿔서 사용할 수 있습니다.- 희석 완충액을 준비하십시오: 1x 멸균 PBS를 ....
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결과
도 2에 도시된 반응식은 인간 MDM을 수득, 형질감염 및 이미지화하는 방법에 대한 개요를 제공한다. 선택된 CD14+ 단핵구를 GM-CSF로 7일 동안 인큐베이션한 후, 분화 기간에 걸쳐 세포 형태가 변화하고(도 3A), 구형 현탁액 세포로부터 스핀드하고 완전히 부착되는 과정(제3일 및 제4일), 마지막으로 완전히 분화되었을 때 세포를 더 많이 퍼뜨린다(제7일째). 완전히 분화된 세포는 이어서 플레이트로부터 분리되고 카스파제 BiFC 쌍 (VC 및 VN)과 함께 리포터 플라스미드 (예를 들어, dsRedmito, 미토콘드리아를 표적화하는 적색 형광 단백질을 코딩하는 플라스미드)로 형질감염되고, 이는 형질감염된 세포를 표지하는데 사용되고(도 3B), 24시간 후에 형질감염의 효율을 평가하기 위해 사용된다. 도 3B-D
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토론
이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 분리된 단핵구로부터 대식세포를 수득하는 워크플로우 및 세포 생존력 및 거동을 손상시키지 않으면서 염증성 카스파제 BiFC 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 방법을 기술한다.
이 프로토콜은 BiFC 기술(35 )을 활용하여 카스파제 모집 도메인(CARD)에서 염증성 카스파제를 비형광 단백질 금성의 비형광 단편으로 태그한다. 염증성 카스파제는 큰 (p20) 및 작은 (p10) 서브유닛으로 구성된 촉매 도메인을 코딩하고, 보존된 단백질-단백질 상호작용 모티프는 그들의 N 말단 또는 프로도메인36 에서 CARD로 명명된다 (도 1B). 그들의 활성화 플랫폼에 염증성 카스파제의 모집은 손상되지 않은 카드에 달려 있습니다. 이러한 접근법을 위해, 두 개의 카스파제 프로도메인 작제물(CARD 모티프를 코딩함)이.......
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공개 사항
저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는이 기술의 발전에 기여한 LBH의 과거와 현재의 실험실 구성원들에게 감사드립니다. 이 실험실은 NIH / NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH / NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH / NIGMS R01GM121389 (LBH)가 지원합니다. 도 2는 바이오렌더 소프트웨어를 사용하여 도출하였다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 48 웰 조직 배양2:34 플레이트 | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10cm 조직 배양 접시 | VWR | 25382-166 | |
| 2 메르캅토에탄올 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 웰 챔버 커버 글라스, 1.5 HP 커버 글라스 | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS 컬럼 | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | AutoMACS Pro Separator만 사용한 자동 분리 |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | AutoMACS Pro Separator만 사용한 자동 분리용 |
| AutoMACS Pro 세척 솔루션 | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | AutoMACS Pro Separator만 사용한 자동 분리용 |
| AutoMACS 헹굼 솔루션 | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | AutoMACS Pro Separator를 사용한 자동 분리의 경우 |
| 버퍼를 실행하는 AutoMacs | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | QuadroMACS 또는 AutoMACS pro Separator를 사용한 수동 또는 자동 분리의 경우 |
| CSU-X1A 5000 회전 디스크 장치가 장착된 Axio Observer Z1 전동 도립 현미경 | Zeiss | 568nm(RFP) 및 488 또는 512nm(GFP 또는 YFP) 파장의 레이저 라인이 장착된 레이저 모듈이 장착된 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다 | |
| AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope | Zeiss | 568nm(RFP) 및 488 또는 512nm(GFP 또는 YFP) 파장을 자극할 수 있는 형광 필터가 있는 모든 상피 형광 현미경을 사용할 수 있습니다. | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | 염화칼슘 및 염화마그네슘이 없는 QuadroMACS 또는 AutoMACS pro Separator DPBS를 사용한 수동 또는 자동 분리의 경우 |
| Sigma | D8537-6x500ML | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | 광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100에서 찾을 수 있습니다. mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX 보충제 (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, from Porcine, ≥ 96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | LBH lab | ||
| LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Columns | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | QuadroMACS 분리기를 사용한 수동 분리만 |
| MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | QuadroMACS Separator only를 이용한 수동 분리용 |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | QuadroMACS Separator 전용 수동 분리 |
| mCherry plasmid | Yungpeng Wang Lab | 형광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene | |
| Neon Transfection System에서 찾을 수 있습니다. | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Neon electroporation 장치, 피펫 및 피펫 스테이션 Neon |
| Transfection System 10 µ가 포함됩니다. L Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | 재부유 완충액 R, 재부유 완충액 T, 전해 완충액 E, 96 x 10 µ L 네온 팁과 네온 electroporation 튜브 |
| Nigericin 나트륨 염, 기성품 솔루션 | Sigma | SML1779-1ML | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS 분리기 | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | 수동 분리용 QuadroMACS 분리기 전용 |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드 | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (blue edition) 소프트웨어 | Zeiss | 선택한 컨포칼 현미경을 작동하는 데 사용되는 모든 소프트웨어 |
참고문헌
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....
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