프로토콜은 세포외 매트릭스 점성 및 단백질 조성 또는 환경 요인에 대한 의존성 연구를 위한 방법을 설명합니다. 대상 매트릭스 시스템은 마우스 구역입니다. 이 방법의 성능은 야생식 구역 섬유의 점탄성 거동을 미세피브릴 관련 당단백질-1이 부족한 것과 비교하여 입증된다.
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이 논문에서
요약
초록
탄력은 혈관, 근육 및 폐와 같은 조직의 기능에 필수적입니다. 이 성질은 세포와 조직을 함께 결합하는 단백질 메쉬워크인 세포외 매트릭스(ECM)에서 주로 유래된다. ECM 네트워크의 탄성 특성이 그 구성과 어떻게 관련이 있는지, 그리고 ECM의 이완 특성이 생리적 역할을 하는지 여부는 아직 완전히 해결되지 않은 질문입니다. 과제의 일부는 대부분의 ECM 시스템의 복잡한 아키텍처와 구조를 손상시키지 않으면서 ECM 구성 요소를 분리하는 데 어려움을 가지는 것입니다. 한 가지 예외는 척추 동물의 눈에서 발견되는 ECM 시스템인 조눌(zonule)입니다. 구역은 렌즈와 안벽 사이의 세포 없는 공간에 걸쳐 길이가 수백에서 수천 마이크로미터의 섬유를 포함한다. 이 보고서에서는 구역의 고도로 조직된 구조를 활용하여 점성탄성 특성을 정량화하고 개별 단백질 성분의 기여를 결정하는 기계 기술을 설명합니다. 이 방법은 렌즈와 구역을 노출하기 위해 고정 된 눈의 해부를 포함하고 장력을 모니터링하는 동안 구역 섬유를 동등하게 뻗어당기는 풀업 기술을 사용합니다. 이 기술은 상대적으로 저렴하지만 특정 구역 단백질이 부족하거나 노화가 있는 마우스의 구역 섬유의 점탄성 특성의 변화를 감지할 만큼 민감합니다. 여기에 제시된 방법은 주로 안구 발달 과 질병을 연구하기 위해 설계되었지만, 탄성 ECM의 점탄성 특성및 이온 농도, 온도 및 신호 분자와의 상호 작용과 같은 외부 요인의 역할에 관한 광범위한 질문을 탐구하기위한 실험 모델역할을 할 수 있습니다.
서론
척추 동물의 눈에는 망막1에 이미지를 집중하는 데 도움이되는 살아있는 광학 렌즈가 포함되어 있습니다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 렌즈는 섬세하고 복사 지향적인 섬유 시스템에 의해 광축에 매달려 있습니다. 한쪽 끝에서 섬유는 렌즈 적도에 부착하고 다른 쪽은 주모 체의 표면에 부착합니다. 그들의 길이는 마우스에 있는 150 μm에서 인간에 있는 1 mm에 구역 수색하는 거리입니다. 전체적으로, 이 섬유는 Zinn2의 구역, 섬모 구역 또는 단순히 구역으로 알려져 있습니다. 안구 외상, 질병 및 특정 유전 질환은 구역 섬유3의 무결성에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 최종 실패와 시력 상실이 발생할 수 있습니다. 마우스에서 섬유는 피브릴린-14가 풍부한 맨틀에 둘러싸여 주로 단백질 피브릴린-2로 구성된 코어를 가지고 있다. 구역 섬유는 눈에 고유하지만 신체의 다른 곳에서 발견되는 엘라스틴 기반 ECM 섬유와 많은 유사점을 지니고 있습니다. 후자는 피브릴린-1 맨틀5로 덮여 있으며 구역 섬유6
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프로토콜
모든 동물 실험은 워싱턴 대학 동물 연구 위원회에 의해 승인되고 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 ARVO 성명서를 준수했다.
1. 특수 부품 의 제조 및 장치의 건설
- 특수 부품의 제조
- 프로브 제작. 도 2A의 왼쪽 패널에 도시된 바와 같이 유리 모세관을 비스듬히 잡습니다. 한쪽 끝에서 약 2cm 의 담배 라이터에서 불꽃을 놓고 그림 2A의 오른쪽 패널에 표시된 것처럼 끝이 90 °까지 구부러질 때까지 거기에 보관하십시오.
- 샘플 플랫폼 제작. 3D 드로잉 소프트웨어를 사용하여 도 2B와 같이 30 x 30 x 5mm의 반구형 들여쓰기를 포함하는 플랫폼을 설계합니다.
- 프로브 홀더 제작. 3D 도면 소프트웨어를 사용하여 모세관 프로브를 보유하는 마운트를 설계하여 미세 조작기에 부착합니다( 그림 2C 참조).
참고: STL 형식으로 플랫폼 제작 및 프로브 홀더 제작을 위한 샘플 3D 파일을 해당 작성자의 요청에 따라 사용할 ....
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결과
여기에 설명된 풀업 기술은 마우스에서 구역 섬유의 점탄성 특성을 결정하기 위한 간단한 접근법을 제공한다. 간단히 말해서, 마우스 눈은 먼저 생리 내혈압에 고정의 주입에 의해 보존된다. 이러한 접근법은 눈의 자연적인 인플레이션을 유지하고 섬유를 적절하게 미리 장력하게 유지합니다(예비 실험 후 고정이 섬유의 탄력이나 강도를 크게 변경하지 않았다는 것을 입증한 후에 허용된다고 간주되었습니다). 마우스 눈의 뒷면은 그것을 중단 렌즈와 구역 섬유를 노출하기 위해 해부에 의해 제거됩니다. 눈의 전면은 플랫폼에 부착되어 디지털 스케일에 달려 있는 페트리 접시 안에 놓입니다. 다음으로, 마이크로 조작기에 부착된 유리 모세관은 렌즈의 후방 표면에 시멘트된다. 렌즈는 50 μm 단위로 상승한 다음 스케일의 힘이 기록됩니다. 준비의 명백한 무게의 감소는 섬유를 스트레칭 힘에 대한 정보를 제공합니다. 각 변위는 변위에 의해 유도된 응력의 어떤 이완을 관찰하기 위하여 대략 1 분 지속되는 평형 기간에 선행됩니다. 마지막으로, 결과는 마우스 구역 섬유의.......
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토론
구역은 섬유가 대칭으로 배열되고 광학 축을 따라 눈 렌즈를 대체하여 동일하게 조작 할 수있는 특이한 ECM 시스템입니다. 공간은 또한 세포 중단 없이 쉽게 접근할 수 있고, 섬유는 그들의 네이티브 상태에 가까운 환경에서 공부될 수 있습니다. 풀업 기법은 이 ECM 프레젠테이션을 활용하여 유전적으로 방인하는 마우스의 섬세한 섬유를 조작하고 기계적 특성을 정확하게 정량화합니다. 이를 통해 우리는 주요 ECM 단백질(fibrillin-118, LTBP-24 및 MAGP-1)의 기여도를 구역 섬유의 생체 역학적 특성에 대해 검토할 수 있게 되었습니다. 피브릴린-1-결핍 마우스의 우리의 분석은 피브릴린-1이 결여된 구역 섬유가 나이가 들면서 약화되고 결국 파열되어 눈 내의 렌즈 변위로 이어진다는 것을 밝혔습니다(인간에서, ectopia lentis로 알려진 조건). 크게, 렌즈 탈구는 또한 FBN1 gen.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH R01 EY01 EY029130 (S.B)과 P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 및 Ines Mandl 연구 재단 (R.P.M.), 마르판 재단, 워싱턴 대학의 안과 및 시각 과학 학과에 대한 무제한 보조금에 의해 지원되었습니다. J.R.은 또한 이 프로젝트를 지원하기 위해 건강 과학 및 약학 대학에서 보조금을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1/4-20 육각 나사 3/4인치 길이 | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 너트 | 하드웨어 스토어 | ||
| 3D SLA 프린터 | Anycubic | Photon | |
| 4-40 나사 3/8인치 길이, 2 | 하드웨어 스토어 | ||
| 모세관, OD 1.2mm 및 3인치 길이, 필라멘트 없음 | WPI | 1B120-3 | |
| 시아노아크릴레이트(슈퍼) | 접착제 록타이트 | ||
| 디지털 저울 | 버니어 | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | 스프레드시트 | |
| 가스 담배 라이터 | |||
| 검사/해부 현미경 | Amscope | SKU: SM-4NTP | 작동 거리 ~ 15cm |
| Micromanipulator, 경제적인 4축 | WPI | Kite-L | |
| 전동 마이크로미터 | Thorlabs | Z812B | |
| 네거티브 원통형 렌즈 | Thorlabs | LK1431L1-75mm 초점 거리 | |
| 페트리 접시, 50mm | |||
| 포스트 홀더, 3인치 | Thorlabs | PH3 | |
| 포스트, 4인치 | Thorlabs | TR4 | |
| 스케일 로깅 소프트웨어 | 버니어 | LoggePro | |
| 서보 모터 컨트롤러 | Thorlabs | KDC101 | |
| 서보 모터 컨트롤러 소프트웨어 | Thorlabs | APT | |
| 슬롯 베이스, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| 슬롯 베이스, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| 마이크로 매니큘러 | WPI | M-10 | |
| 현미경용 USB 카메라 | Amscope | SKU: UV | |
| UV 활성 접착제 |
참고문헌
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn's zonule. Progress i....
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