Summary
Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung der viskoelastizität der extrazellulären Matrix und ihrer Abhängigkeit von der Proteinzusammensetzung oder Umweltfaktoren. Das zielgerichtete Matrixsystem ist die Mauszonule. Die Leistungsfähigkeit der Methode wird durch den Vergleich des viskoelastischen Verhaltens von Wildtyp-Zonularfasern mit denen ohne Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-1 demonstriert.
Abstract
Elastizität ist essentiell für die Funktion von Geweben wie Blutgefäßen, Muskeln und Lungen. Diese Eigenschaft leitet sich hauptsächlich von der extrazellulären Matrix (ECM) ab, dem Proteingeflecht, das Zellen und Gewebe miteinander verbindet. Wie sich die elastischen Eigenschaften eines ECM-Netzwerks auf seine Zusammensetzung beziehen und ob die Relaxationseigenschaften des ECM eine physiologische Rolle spielen, sind Fragen, die noch nicht vollständig geklärt sind. Ein Teil der Herausforderung liegt in der komplexen Architektur der meisten ECM-Systeme und der Schwierigkeit, ECM-Komponenten zu isolieren, ohne deren Struktur zu beeinträchtigen. Eine Ausnahme ist die Zonule, ein ECM-System, das im Auge von Wirbeltieren vorkommt. Die Zonule besteht aus hunderten bis tausenden Mikrometer langen Fasern, die den zellfreien Raum zwischen Linse und Augenwand überspannen. In diesem Bericht beschreiben wir eine mechanische Technik, die die hochorganisierte Struktur der Zonule nutzt, um ihre viskoelastischen Eigenschaften zu quantifizieren und den Beitrag einzelner Proteinkomponenten zu bestimmen. Die Methode beinhaltet die Dissektion eines festen Auges, um die Linse und die Zonule freizulegen, und verwendet eine Pull-up-Technik, die die Zonularfasern gleichmäßig dehnt, während ihre Spannung überwacht wird. Die Technik ist relativ kostengünstig, aber empfindlich genug, um Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Zonularfasern bei Mäusen ohne spezifische zonuläre Proteine oder mit zunehmendem Alter nachzuweisen. Obwohl die hier vorgestellte Methode in erster Linie für die Untersuchung der Augenentwicklung und -erkrankung konzipiert ist, könnte sie auch als experimentelles Modell dienen, um breitere Fragen zu den viskoelastischen Eigenschaften elastischer ECMs und der Rolle externer Faktoren wie Ionenkonzentration, Temperatur und Wechselwirkungen mit Signalmolekülen zu untersuchen.
Introduction
Das Auge eines Wirbeltiers enthält eine lebende optische Linse, die hilft, Bilder auf die Netzhaut zu fokussieren1. Die Linse wird an der optischen Achse durch ein System empfindlicher, radial orientierter Fasern aufgehängt, wie in Abbildung 1A dargestellt. An einem Ende heften sich die Fasern an den Linsenäquator und am anderen Ende an die Oberfläche des Ziliarkörpers. Ihre Längen reichen von 150 μm bei Mäusen bis zu 1 mm beim Menschen. Zusammen sind diese Fasern als die Zonule von Zinn2, die Ziliarzonule oder einfach die Zonule bekannt. Augentraumata, Krankheiten und bestimmte genetische Störungen können die Integrität der zonulären Fasern3 beeinträchtigen, was zu ihrem eventuellen Versagen und dem damit einhergehenden Verlust des Sehvermögens führt. Bei Mäusen haben die Fasern einen Kern, der hauptsächlich aus dem Protein Fibrillin-2 besteht, umgeben von einem Mantel, der reich an Fibrillin-14 ist. Obwohl zonuläre Fasern einzigartig für das Auge sind, haben sie viele Ähnlichkeiten mit Elastin-basierten ECM-Fasern, die anderswo im Körper vorkommen. Letztere sind von einem Fibrillin-1-Mantel5 bedeckt und haben ähnliche Abmessungen wie zonuläre Fasern6. Andere Proteine, wie latent transformierende Wachstumsfaktor-β-bindende Proteine (LTBPs) und Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-1 (MAGP-1), werden in Verbindung mit beiden Fasertypen gefunden7,8,9,10,11. Der Elastizitätsmodul von Zonularfasern liegt im Bereich von 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, vergleichbar mit dem von Elastin-basierten Fasern (0,3-1,2 MPa)17. Diese architektonischen und mechanischen Ähnlichkeiten führen uns zu der Annahme, dass jeder Einblick in die Rolle von zonuli-assoziierten Proteinen dazu beitragen kann, ihre Rolle in anderen EKVM-Fasern aufzuklären.
Der Hauptzweck der Entwicklung der hier beschriebenen Methode besteht darin, Einblicke in die Rolle spezifischer zonulärer Proteine beim Fortschreiten der erblichen Augenerkrankung zu gewinnen. Der allgemeine Ansatz besteht darin, die viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern in Wildtypmäusen mit denen von Mäusen zu vergleichen, die gezielte Mutationen in Genen tragen, die für zonuläre Proteine kodieren. Während zuvor mehrere Methoden verwendet wurden, um die elasto-mechanischen Eigenschaften von zonulären Fasern zu messen, wurden alle für die Augen von viel größeren Tieren entwickelt12,13,14,15,16. Da solche Modelle genetisch nicht behandelbar sind; Wir wollten eine experimentelle Methode entwickeln, die besser für die kleinen und empfindlichen Augen von Mäusen geeignet ist.
Die von uns entwickelte Methode zur Beurteilung der Viskoelastizität von Mauszonulafasern ist eine Technik, die wir als Pull-up-Assay4,18 bezeichnen und die in Abbildung 1 visuell zusammengefasst ist. Eine detaillierte Beschreibung der Pull-up-Methode und der Analyse der Ergebnisse finden Sie unten. Wir beginnen mit der Beschreibung der Konstruktion der Apparatur, einschließlich der dreidimensionalen (3D)gedruckten Teile, die im Projekt verwendet werden. Als nächstes beschreiben wir das Protokoll, das zum Erhalten und Vorbereiten der Augen für das Experiment verwendet wird. Schließlich geben wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen, wie Sie Daten für die Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern erhalten. Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse teilen wir bisher unveröffentlichte Daten, die mit unserer Methode zu den viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern von Mäusen ohne MAGP-119 gewonnen wurden, sowie einen Kontrollsatz, der von altersangepassten Wildtyptieren erhalten wurde. Schließlich schließen wir mit allgemeinen Bemerkungen zu den Vorteilen und Einschränkungen der Methode und Vorschlägen für mögliche Experimente, die aufklären können, wie Umwelt- und biochemische Faktoren die viskoelastischen Eigenschaften von ECM-Fasern beeinflussen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Animal Studies Committee der Washington University genehmigt und hielten sich an die ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.
1. Herstellung von Spezialteilen und Konstruktion von Apparaten
- Herstellung von Spezialteilen
- Sondenfertigung. Halten Sie eine Glaskapillare in einem Winkel, wie in der linken Abbildung 2A dargestellt. Legen Sie eine Flamme aus einem Zigarettenanzünder etwa 2 cm von einem Ende entfernt und halten Sie sie dort, bis sich das Ende um 90° biegt, wie in der rechten Abbildung 2A gezeigt.
- Beispiel für die Herstellung von Plattformen. Entwerfen Sie mithilfe einer 3D-Zeichensoftware eine Plattform mit den Maßen 30 x 30 x 5 mm und halbkugelförmigen Vertiefungen mit einem Durchmesser von 2,0, 2,5 mm und 3,0 mm, wie in Abbildung 2B dargestellt.
- Herstellung von Sondenhaltern. Entwerfen Sie mit der 3D-Zeichensoftware eine Halterung, die die Kapillarsonde hält, und befestigen Sie sie an einem Mikromanipulator (siehe Abbildung 2C).
HINWEIS: Eine Beispiel-3D-Datei für die Plattformherstellung und die Herstellung von Sondenhaltern im STL-Format ist auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. - Negative Linsenmontage. Platzieren Sie eine negative zylindrische Linse (-75 mm Brennweite und ca. 50 mm in Höhe und Länge), wie in Abbildung 1C und Abbildung 1D gezeigt, um die Verzerrung zu korrigieren, die durch die Zugabe von Flüssigkeit zur Petrischale verursacht wird (die Zugabe von Flüssigkeit verzerrt die Sicht auf das sezierte Auge, wenn es von der Seite aufgenommen wird).
- Kleben Sie die Negativlinse auf eine der 2-schlitzigen Basen (siehe Abbildung 2D für die Positionierung der Linse auf der Basis).
- Setzen Sie die verbleibenden Teile wie in Abbildung 2D dargestellt zusammen.
- Stellen Sie die Höhe des Pfostens so ein, dass das Objektiv kaum über der Skala schwebt und ziehen Sie die Schraube im Pfostenhalter fest.
- Bau von Apparaten
- Installieren Sie das mit der Waage gelieferte Protokollierungsprogramm, die Mikroskopkamerasoftware und die motorisierte Mikrometer-Controller-Anwendung auf einem Computer.
- Schließen Sie das motorisierte Mikrometer an den Servomotorregler und diesen an den Computer an. Starten Sie die Motorsteuerungsanwendung und bearbeiten Sie die Motoreinstellungen.
HINWEIS: Die unten aufgeführten motorischen Einstellungen wurden nach vorläufigen Experimenten ausgewählt, die zeigten, dass sich die Belastungen auf einer Zeitskala von 10-20 s entspannten. Basierend auf dieser Bestimmung wählten wir eine Geschwindigkeit und Beschleunigung, die es dem Motor ermöglichten, eine Verschiebung von 50 μm in einer Zeit zu vollenden, die kleiner als die Relaxationszeit war, aber nicht zu kurz, um ein Ruckeln der Probe zu vermeiden. Hier wählten wir eine Verdrängungszeit von ca. 5-10 s. - Stellen Sie die maximale Geschwindigkeit auf 0,01 mm/s und die Beschleunigung auf 0,005 mm/s2 ein.
- Installieren Sie die Kamera im Inspektionsmikroskop und testen Sie die Kamerabildgebungssoftware.
- Platzieren Sie die Waage auf dem Bankraum, der dem Gerät gewidmet ist.
- Kleben Sie eine 3D-gedruckte Plattform (ab Schritt 1.1.2) auf eine Petrischale und fügen Sie eine 2-3 mm große Glasperle zu einer der Vertiefungen hinzu. Stellen Sie die Petrischale auf die Waage, so dass sich die Perle in der Nähe der Mitte der Pfanne befindet.
- Ersetzen Sie das manuelle Mikrometer des Mikromanipulators durch das motorisierte.
- Schrauben Sie die beiden 4-40 Schrauben in den Sondenhalter. Befestigen Sie den Sondenhalter am Manipulator, wie in Abbildung 1C dargestellt.
- Bereiten Sie eine Sonde wie in Abbildung 2A dargestellt vor, legen Sie sie mit dem gebogenen Teil nach unten in den Sondenhalter, und ziehen Sie die Schrauben fest.
- Positionieren Sie den Mikromanipulator so auf dem Tisch, dass sich die Spitze der Sonde über der Perle auf der Plattform befindet. Befestigen Sie den Mikromanipulator auf dem Tisch, um eine versehentliche Bewegung während des Experiments zu verhindern.
- Positionieren Sie das Seitenmikroskop so auf dem Tisch, dass sich die Perle in der Mitte ihres Sichtfeldes befindet und scharf ist.
2. Probenvorbereitung und Datenerfassung
- Augenfixierung und Dissektion
- Pflegen Sie Wildtypmäuse und Magp1-Null-Tiere auf einem identischen C57/BL6J-Hintergrund. 1 Monat alte oder 1-jährige Mäuse durch CO2-Inhalation einschläfern.
- Die Augen mit einer feinen Pinzette entfernen und die enukleierten Kugeln über Nacht bei 4 °C in 4% Paraformaldehyd/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) fixieren. Halten Sie während des Fixierungsprozesses einen Überdruck von 15-20 mmHg im Auge aufrecht, wie beschrieben6.
HINWEIS: Experimente werden an männlichen Mäusen durchgeführt, um mögliche geschlechtsspezifische Unterschiede in der Größe des Augenglobus zu kontrollieren. Der Überdruck sorgt dafür, dass der Globus aufgeblasen bleibt und der Spalt zwischen der Linse und der Wand des Auges, die von den zonulären Fasern überspannt wird, erhalten bleibt. - Waschen Sie die Augen für 10 minuten in PBS. Machen Sie mit einer ophthalmologischen chirurgischen Schere und unter einem Stereomikroskop einen Einschnitt in voller Dicke in die Augenwand in der Nähe des Sehnervenkopfes.
- Verlängern Sie den Schnitt nach vorne zum Äquator und dann um den Äquatorumfang des Auges. Achten Sie darauf, die empfindlichen Ziliarprozesse und die damit verbundenen zonulären Fasern zu schonen.
- Entfernen Sie die Rückseite des Globus und legen Sie die hintere Oberfläche des Objektivs frei.
- Verwenden Sie die Pinzette, um ein seziertes Auge aus der Pufferlösung zu entfernen und es mit der Hornhaut nach unten auf ein trockenes Aufgabenwischen zu legen. Ziehen Sie die Hornhaut vorsichtig über die Oberfläche des Tuchs, um sie zu trocknen.
- Fügen Sie 3 μL Sofortkleber zu den Plattformschächten hinzu, die das Auge in der Petrischale aufnehmen.
- Legen Sie die Schüssel auf die Bühnenplatte des Stereomikroskops, so dass der Brunnen mit dem Kleber in Sicht ist.
- Übertragen Sie das Auge vom Tuch auf den Rand des Brunnens, der Klebstoff enthält. Ziehen Sie dann das Auge vorsichtig in den Brunnen und passen Sie seine Ausrichtung schnell so an, dass sich die Rückseite der Linse ganz oben befindet.
- Trocknen Sie die belichtete Seite der Linse, indem Sie sie vorsichtig mit der Ecke eines Trockentuchs abtupfen.
- Tragen Sie einen Klecks Instantkleber auf den Boden einer 50 mm Petrischale auf und zementieren Sie die Plattform darauf.
- Messung der zonulären viskoelastischen Reaktion
- Schalten Sie die Waage ein, starten Sie das Waagenprotokollierungsprogramm und die Kamerasoftware. Stellen Sie sicher, dass das Protokollierungsprogramm Daten für 30 Minuten erfassen kann, da einige Versuche so lange dauern können.
- Schalten Sie den Servomotorregler ein und starten Sie die Steuerungsanwendung auf dem Computer. Stellen Sie sicher, dass der Regler so eingestellt ist, dass er sich in Schritten von 50 μm bewegt, indem Sie Bewegungsparameter verwenden, die denen ähneln, die im HINWEIS in Schritt 1.2.2 beschrieben sind.
- Erzeugen Sie eine 90°-Biegung in einem Kapillarstab, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
- Schieben Sie die gebogene Kapillare in den Kapillarsondenhalter und ziehen Sie die Sicherungsschrauben fest.
HINWEIS: Um die Austrocknung der Probe zu minimieren, empfehlen wir, die Schritte 1-4 vor oder während der Augendissektion abzuschließen. - Fügen Sie eine kleine (~ 1 mm) Perle aus UV-härtendem Klebstoff an die Spitze der Kapillare hinzu.
- Bewegen Sie die Spitze der Kapillarsonde mit den manuellen Einstellungen am Manipulator so, dass sie sich direkt über der Mitte der Linse befindet. Überprüfen Sie, ob der untere Teil des UV-Klebers über der Oberseite des Objektivs zentriert erscheint, wenn er von vorne (durch visuelle Inspektion) und von der Seite (durch die Mikroskopkamera) betrachtet wird.
- Während Sie durch die Kamera schauen, senken Sie die Sondenspitze ab, bis der UV-Kleber mit dem Objektiv in Kontakt kommt und ein Drittel bis die Hälfte seiner Oberseite bedeckt.
- Verwenden Sie eine direktionale, nahezu sichtbare UV-Lichtquelle (380-400 nm) mit geringer Intensität (~ 1 mW), um den Klebstoff auszuhärten.
HINWEIS: Diese Spezifikationen reichen aus, um den Klebstoff in wenigen Sekunden auszuhärten und gleichzeitig das Potenzial für die Induktion einer Proteinvernetzung zu minimieren. Die mit handelsüblichen UV-Klebestiften gelieferten UV-Lichtquellen erfüllen diese Spezifikationen. - Fügen Sie PBS-Lösung in die Schüssel hinzu, bis das Auge bis zu einer Tiefe von mindestens 2 mm von Flüssigkeit bedeckt ist.
- Platzieren Sie die zylindrische Linse vor dem Inspektionsmikroskop und so nah wie möglich an der Petrischale, ohne sie zu berühren.
- Starten Sie gleichzeitig das Protokollierungsprogramm und ein Timer-Programm. Machen Sie ein Foto des Auges / der Sonde mit der Kamera.
- Nach 60 s werden weitere 50 μm Verschiebung eingeleitet und danach alle 60 s, bis das Experiment abgeschlossen ist, d.h. bis alle Fasern gebrochen sind. Beachten Sie, dass das Signal aufgrund der Pufferverdampfung während des Experiments nicht auf das Ausgangsniveau zurückkehrt. Korrigieren Sie die daraus resultierende Abweichung der Messwerte während der Datenanalyse, wie in Schritt 2.2.14 veranschaulicht.
- Speichern Sie nach Abschluss eines Durchlaufs die Skalenprotokollierungsdaten und exportieren Sie sie in ein format, das mit der Tabellenkalkulation kompatibel ist, z. B. ein .csv Format. Speichern Sie die Objektivbilder, die während des Laufs gesammelt wurden.
- Importieren Sie Daten in eine Kalkulationstabelle. Verwenden Sie den ersten und den letzten Skalenwert, um die Drift im Hintergrundwert im Laufe der Zeit aufgrund von Verdunstung zu interpolieren (siehe Abbildung 3). Subtrahieren Sie den interpolierten Messwert von dem Messwert zu jedem Zeitpunkt.
HINWEIS: Wenn Sie eine Tabelle verwenden, kann die Interpolation automatisch durchgeführt werden, indem Sie die Formel = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 in die Zelle rechts neben dem ersten Maßstabsmesswert eingeben, dann den Cursor in die rechte untere Ecke der Zelle bewegen und bis zum letzten Datenwert nach unten ziehen. Bei der Formel wird davon ausgegangen, dass die Daten in einer Spalte organisiert sind, wobei der erste Datenpunkt in Zelle B2 angezeigt wird. Falls gewünscht, können die in Schritt 2.2.14 verarbeiteten Daten mit dem quasi-elastischen viskoelastischen Modell analysiert werden, das von einem der Co-Autoren, Dr. Matthew Riley4, entwickelt wurde.
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Representative Results
Die hier beschriebene Pull-up-Technik bietet einen einfachen Ansatz zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern in Mäusen. Kurz gesagt, das Mausauge wird zuerst durch Injektion eines Fixiermittels beim physiologischen Augeninnendruck konserviert. Dieser Ansatz behält die natürliche Inflation des Auges bei und hält die Fasern richtig vorgespannt (die Fixierung wurde als akzeptabel angesehen, nachdem vorläufige Experimente gezeigt hatten, dass sie die Elastizität oder Festigkeit der Fasern nicht signifikant veränderte). Die Rückseite des Mausauges wird dann durch Dissektion entfernt, um die Linse und die zonulären Fasern, die sie suspendieren, freizulegen. Die Vorderseite des Auges wird auf einer Plattform befestigt und in einer Petrischale platziert, die auf einer digitalen Skala ruht. Als nächstes wird eine Glaskapillare, die an einem Mikromanipulator befestigt ist, an der hinteren Oberfläche der Linse zementiert. Die Linse wird dann in Schritten von 50 μm angehoben, während die Kraft auf der Skala aufgezeichnet wird. Eine Verringerung des scheinbaren Gewichts der Zubereitung gibt Aufschluss über die Kräfte, die die Fasern dehnen. Auf jede Verschiebung folgt eine Gleichgewichtsperiode von etwa 1 Minute, um eine durch die Verschiebung induzierte Entspannung der Spannung zu beobachten. Schließlich werden die Ergebnisse unter Verwendung eines quasilinearen viskoelastischen Modells analysiert, das speziell für die Geometrie der Mauszonularfasern und die Richtung des Einzugs für den Assay entwickelt wurde4.
Typische viskoelastische Daten, die mit unserer Methode gewonnen werden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Kurve erscheint invertiert (negativ), da die Auftriebskraft auf die Linse das Gewicht der Schüssel / Plattform / Augenbaugruppe auf der Waage um einen entsprechenden Betrag reduziert. Die Reaktion umfasst momentane Kraftspitzen während jeder der 50 μm vertikalen Verschiebungen der Linse, gefolgt von einer Relaxationsphase mit einer Lebensdauer in der Größenordnung von 10 s. Eine ähnliche Stressentspannung wurde für bovine Zonulafasern beobachtet12. Die Größe der momentanen und entspannten Kräfte steigt mit jedem Schritt auf etwa 1000 s (~ 800 μm Gesamtverschiebung) und beginnt dann zu sinken, wenn die Fasern zu versagen beginnen. Der Zonule-Ausfall ist zum Zeitpunkt von 1.500 s (~1,25 mm Gesamtverdrängung) abgeschlossen. Beachten Sie, dass aufgrund der Verdunstung des Puffers im Laufe des Experiments die Kurve nicht zum ursprünglichen Messwert zurückkehrt, nachdem die Linse vom Auge befreit wurde.
Abbildung 4 kontrastiert die Reaktionen, die für eine Magp-1-Knockout-Maus (rote Kurve) und ein altersangepasstes Wildtyptier (blaue Kurve) erhalten wurden. Diese Kurven wurden für die Verdampfung korrigiert, invertiert, und die Rohmessungen der Masse (siehe Abbildung 3) werden nun als Kraft (mit Einheiten von mN) ausgedrückt. Die anfängliche viskoelastische Reaktion der Magp-1-depletierten Zonule (Zeit 0-600 s) ähnelt stark der des Wildtyps, was darauf hindeutet, dass die viskoelastischen Eigenschaften der Zonule durch das Fehlen von Magp-1 nicht signifikant verändert wurden. Die Fasern scheinen jedoch im Vergleich zu ihren Wildtyp-Pendants bei einer viel geringeren Spannung zu reißen.
Um die Zuverlässigkeit der Methode zu veranschaulichen, sammelten wir Daten von mehreren Tieren über die maximale Momentankraft, die auf die Augen ausgeübt wurde, bevor ihre Fasern rissen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Daten für 1 Monat alte Mäuse zeigen trotz der relativ geringen Anzahl der verwendeten Proben (n = 5 oder 6) sehr kleine Werte für den Standardfehler des Mittelwerts (REM), was auf eine hohe Reproduzierbarkeit hindeutet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die Stärke der Fasern zwischen den beiden Genotypen signifikant unterscheidet (p-Wert = 2,4 x 10-6). Ergebnisse, die in den Abbildungen nicht gezeigt werden, deuten auch darauf hin, dass es bei Wildtyptieren eine subtile, aber statistisch signifikante Zunahme der Bruchkraftstärke mit dem Alter gibt (p-Wert = 0,024).
Die Pull-up-Methode kann auch quantitative Schätzungen der viskoelastischen Parameter generieren, die die beobachteten Variationen der zeitlichen Reaktionen berücksichtigen. Tabelle 1 fasst die Best-Fit-Parameter zu unseren MAGP-1-Daten zusammen, die mit einem zuvor beschriebenen quasilinearen viskoelastischen Modell erhalten wurden4. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die MAGP-1-Deletion als auch die Alterung hochsignifikante Auswirkungen auf einige der mechanischen Eigenschaften von zonulären Fasern haben können.
Abbildung 1: Eine visuelle Zusammenfassung der Pullupmethode. (A) Querschnittsansicht eines Wirbeltierauges, die die Linse und die zonulären Fasern zeigt, die es suspendieren. (B) Ein allgemeiner Ansatz zur Bestimmung des viskoelastischen Verhaltens in zonulären Fasern durch Verschiebung der Linse nach oben (weg von der Hornhaut). (C) Tatsächliche Ansicht eines sezierten Auges, das auf eine Plattform geklebt ist, wobei seine Linse von einer Glassonde nach oben gezogen wird, die an einem Mikromanipulator befestigt ist. (D) Schematische Darstellung der gesamten Apparatur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Herstellung verschiedener Teile. (A) Herstellung der Glassonde. Eine Glaskapillare wird in einem Winkel gehalten und eine Flamme wird an einer Stelle etwa 2 cm von einem Ende aufgebracht. Innerhalb weniger Sekunden beginnt das Ende der Kapillare zu fallen. Die Flamme wird entfernt, wenn das Ende der Kapillare um ca. 90° gebogen ist. (B) Herstellung der Augenplattform. Das Teil wird mit einem 3D-Stereolithographie-Drucker (SLA) hergestellt. Es misst 30 x 30 x 5 mm und enthält drei halbkugelförmige Vertiefungen mit Durchmessern von 2,0, 2,5 und 3,0 mm, in die sezierte Augen unterschiedlicher Größe eingeklebt werden. (C) Herstellung des Sondenhalters. Auch dieses Teil wurde mit einem 3D-SLA-Drucker gefertigt. Es besteht aus zwei orthogonalen Stäben mit einem Durchmesser von 7,3 mm. Die untere Stange enthält eine 1,5-mm-Bohrung und zwei 2,5-mm-Durchgangslöcher auf der Außenseite, um Metallschrauben aufzunehmen, die die Kapillarsonde an Ort und Stelle sichern. (D) Negative Linsenanordnung. Bilder, die vom Seitenmikroskop aufgenommen wurden, enthalten eine astigmatische Verzerrung aufgrund der Krümmung der Petrischale und der Pufferlösung. Die Linsenanordnung wurde entwickelt, um die Verzerrung zu kompensieren, so dass das Seitenmikroskop Bilder scharf aufnehmen kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Typische Rohdaten, die mit dem Assay erhalten wurden. Die gezeigte Grafik wurde mit einer Protokollierungssoftware aufgezeichnet, die Daten von einer digitalen Waage mit einer Genauigkeit von 0,01 g aufzeichnet. Der linke Rand des Graphen (Zeit 0) spiegelt das Gewicht der Probe ohne Hubkraft wider. Die y-Achse stellt die Masse in g dar. Die Linse wird dann in 50 μm Schritten angehoben, bis alle zonulären Fasern gebrochen sind und die Petrischale wieder voll auf der Waage aufliegt. Beachten Sie, dass der Endwert vom ursprünglichen Messwert versetzt ist. Der Offset ist auf die allmähliche Verdampfung der Pufferlösung während des Versuchs zurückzuführen und kann während der Datenanalyse berücksichtigt werden, wie in Schritt 2.2.14 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative zonuläre Kraft-Verschiebungs-Kurven für Wildtyp- und MAGP-1-defiziente Mäuse. Die Grafik vergleicht die viskoelastische Reaktion, die nach diskreten Verschiebungen der Linse von ihrer Gleichgewichtsposition erhalten wird. Die Reaktion eines Auges von einer MAGP-1 Knockout (KO) Maus verfolgt die eines altersgerechten Wildtyptiers bis zu dem Punkt, an dem die Fasern in der Knockout-Maus vorzeitig brechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zonuläre Faserbruchkräfte, die mit der Pull-up-Methode für MAGP-1 KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen und in zwei Altersstufen erhalten wurden. Alle gezeigten Messungen basieren auf n = 5 oder 6 Augen, wobei Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwerts (REM) darstellen. Abkürzungen: WT = Wildtyp; KO = MAGP-1 Knockout. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Genotyp/Alter | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (Sek.) | σ f (Pa) | |
| WT 1-Monat | BEDEUTEN | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| SD | 2.83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% Cl | 5.55E+04 | 5.76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1-Monat | BEDEUTEN | 2.73E+05 | 6.74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7.85E+04 | |
| 95% Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| p-Werte | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 Jahr | BEDEUTEN | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| 95% Cl | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1 Jahr | BEDEUTEN | 1.70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| 95% Cl | 1.78E+04 | 1.58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| p-Werte | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p-Werte, Alter | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tabelle 1: Viskoelastische Eigenschaften, erhalten mit einem quasilinearen viskoelastischen (QLV) Modell. Datenscans wie die in Abbildung 4 gezeigten wurden mit einem QLV-Modell analysiert, das speziell für den Pull-up-Assay und die Mauszonule entwickelt wurde. Best-Fit-Parameter für die Momentan- (G0) und Gleichgewichtssteifigkeiten (G∞), die Relaxationszeitkonstante (τ) und die Zugfestigkeit (σ f) werden dargestellt. Abkürzungen: SD = Standardabweichung; CI = Konfidenzintervall.
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Discussion
Die Zonule ist ein ungewöhnliches ECM-System, bei dem die Fasern symmetrisch angeordnet sind und identisch manipuliert werden können, indem die Augenlinse entlang der optischen Achse verschoben wird. Der Raum kann auch ohne zelluläre Störung leicht zugänglich gemacht werden, so dass die Fasern in einer Umgebung in der Nähe ihres ursprünglichen Zustands untersucht werden können. Die Pull-up-Technik nutzt diese ECM-Präsentation, um die empfindlichen Fasern von Mäusen, einem genetisch handhabbaren System, zu manipulieren und ihre mechanischen Eigenschaften genau zu quantifizieren. Dies hat es uns ermöglicht, den Beitrag der wichtigsten ECM-Proteine (Fibrillin-118, LTBP-24 und MAGP-1, über die hier berichtet wird) zu den biomechanischen Eigenschaften der zonulären Fasern zu untersuchen. Unsere Analyse von Fibrillin-1-defizienten Mäusen ergab, dass zonuläre Fasern, denen Fibrillin-1 fehlt, mit zunehmendem Alter schwächer werden und schließlich reißen, was zur Verschiebung der Linse im Auge führt (beim Menschen ein Zustand, der als Ektopie lentis bekannt ist). Bezeichnenderweise tritt eine Linsenluxation auch häufig bei Patienten mit Marfan-Syndrom auf, einer Krankheit, die durch Mutationen im FBN1-Gen verursacht wird20. Damit bietet der Pull-up-Assay die Möglichkeit, Aspekte menschlicher Bindegewebserkrankungen bei Mäusen zu modellieren. Bei Mäusen, denen LTPB-2 fehlte (ein Protein, von dem angenommen wird, dass es an der Entstehung von Mikrofibrillen beteiligt ist), konnten wir zeigen, dass zonuläre Fasern in Abwesenheit dieses Proteins produziert wurden, aber bei signifikant geringeren Belastungen rissen und schließlich mit zunehmendem Alter zerfielen4. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LTBP-2 eher zur Langlebigkeit der Fasern als zu ihrer Synthese beiträgt. In der aktuellen Studie stellten wir fest, dass MAGP-1-defiziente Fasern ähnliche viskoelastische Eigenschaften wie Wildtypfasern hatten, aber bei geringeren Belastungen rissen, ohne Anzeichen eines weiteren altersbedingten Abbaus. Dies wäre konsistent mit einem Modell, in dem Fasern, denen MAGP-1 fehlt, intrinsisch schwächer sind, sobald sie sich entwickeln.
Wir stellen fest, dass die in Tabelle 1 aufgeführten Zugfestigkeiten unter der Annahme geschätzt werden, dass die Fasern irgendwo in der Mitte der Spannweite brechen. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass ein Faserversagen auf die Ablösung von Verankerungspunkten auf der Linsenoberfläche oder dem Ziliarkörper zurückzuführen ist. Wäre dies der Fall, könnte die Bruchzugfestigkeit der Faser höher sein als die in Tabelle 1 aufgeführten Werte. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, ist eine mikroskopische Analyse erforderlich. Eine solche Analyse ist alles andere als trivial, da die beteiligten Fasern sehr dünn sind (~ 0,5-0,6 μm breit) und fast indexangepasst auf Wasser, was sie im Wesentlichen unsichtbar macht. In Ermangelung dieser zusätzlichen Informationen können wir nur feststellen, dass die in Tabelle 1 aufgeführten Zugfestigkeiten ihre unteren Grenzen darstellen. Prinzipiell wäre es auch interessant zu überprüfen, ob sich die Kraftmessungen unterscheiden, je nachdem, in welche Richtung die Linse gezogen wird. In der Praxis würde das Ziehen der Linse von der vorderen Seite jedoch erfordern, die Iris zu entfernen, ohne die unmittelbar darunter liegenden Zonularfasern zu beschädigen. Eine solche präzise Sezierung geht über das hinaus, was wir derzeit mit dem Mausauge erreichen können.
Die relative Einfachheit der Methode und die hohe Reproduzierbarkeit ihrer Ergebnisse sind wünschenswerte Eigenschaften für vergleichende Untersuchungen der mechanischen EZM-Eigenschaften. Darüber hinaus ist es, wie hier gezeigt, auch möglich, den Pull-up-Assay zu verwenden, um absolute Werte viskoelastischer Parameter zu erhalten, indem ein viskoelastisches Modell angenommen und die Zeitkurven daran angepasst werden. Zum Beispiel konnten wir mit einem standardmäßigen quasilinearen viskoelastischen (QLV) Modell Werte für momentane (G0) und Gleichgewichtssteifigkeiten (G∞), die Relaxationszeitkonstante (τ) und die ultimative Zugfestigkeit (σ f) von zonulären Fasern von Wildtypmäusen sowie solchen, denen LTBP-24 oder MAGP-1 fehlt, extrahieren. Die in beiden Studien für Wildtyptiere erhaltenen Werte für G0 und G∞ variieren von 6,7 x 104 Pa bis 2,3 x 105 Pa, ein Bereich, der weitgehend mit denen vergleichbar ist, die in viel größeren Fasern aus menschlichen, rinder- und schweineähnlichen Zonolen (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa) gefunden wurden)12,13, 14,15,16. Diese Übereinstimmung zwischen den Arten legt nahe, dass dies universelle Merkmale dieser Fasern sind, und gibt uns die Gewissheit, dass mit unserer Methode aussagekräftige viskoelastische Parameter extrahiert werden können.
Ein kritischer Schritt zur Erzielung hochwertiger viskoelastischer Reaktionen ist die Ausrichtung des auf die Plattform geklebten Sezierten Auges (Schritt 2.1.9). Geringfügige Neigungen (weniger als 10°) scheinen die Ergebnisse nicht signifikant zu beeinflussen. Experimente, die außerhalb dieser Grenze durchgeführt werden, können Kurven mit Formen erzeugen, die von den in Abbildung 4 gezeigten abweichen. Zum Beispiel können einige dieser Kurven zwei breite Spitzen anstelle von einem besitzen.
Im Idealfall wäre das in diesem Papier beschriebene Verfahren ohne Fixierung der Augen durchgeführt worden, was unsere Fähigkeit einschränkt, die wahren viskoelastischen Parameter frischer zonulärer Fasern zu beurteilen. Nachdem unsere vorläufigen Experimente jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den paraformaldehydfixierten und frischen Proben zeigten, entschieden wir uns für die Fixierung, da sie mehrere Vorteile bot. Wie im Protokoll angedeutet, hilft die Verwendung von festsitzenden Geweben, die native Dehnung der Fasern für die Klimmzugexperimente zu erhalten. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Fixierung eine größere Haftung des UV-Klebstoffs an der Augenkapsel förderte, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wurde, dass sich die Sonde während der Pull-up-Aktion von der Linse löst, wie es bei frischen Proben üblich ist (die Sondenablösung kann leicht als plötzliche Rückkehr der Kraft auf ein Ausgangsniveau erkannt werden). Die Fixierung verhinderte auch ein Einknicken der Augenwand in Zugrichtung. Trotz dieser Einschränkung bietet unsere Methode einen robusten Ansatz zur Bestimmung des relativen Beitrags von Proteinkomponenten zu den viskoelastischen Eigenschaften der zonulären Fasern.
Obwohl sich unsere bisherige Arbeit auf den Beitrag spezifischer Proteine konzentriert hat, könnte die Methode leicht angepasst werden, um den Einfluss von Faktoren außerhalb der Fasern auf ihre mechanischen Eigenschaften zu untersuchen. Solche Faktoren umfassen Temperatur, pH-Wert, Kalziumkonzentration und das Vorhandensein oder Fehlen von vernetzenden Enzymen. Hochpräzise Messungen konnten mit unserer Methode im Differentialmodus erreicht werden, d.h. indem die Zonularfasern mit einer Anfangsspannung/-dehnung vorgespannt und dann die Spannungsdifferenz abgelesen wurde, die bei veränderten äußeren Bedingungen entsteht. Einige dieser Eingriffe können die Elastizität der Gewebe, die die Zonule umgeben, beeinflussen und daher Spannungsänderungen hervorrufen, die mit denen in der Zonule konkurrieren. Kontrollmessungen mit isolierten Geweben wären erforderlich, um ihre Relevanz für die vorgeschlagenen Experimente zu beurteilen. Wir erwarten, dass solche Effekte vernachlässigbar sein können, basierend auf Beobachtungen mit der Seitenkamera, die zeigen, dass sich zusammenhängende Gewebe wie hochsteife Materialien verhalten, die im Wesentlichen keine Verformung erfahren, selbst wenn die zonulären Fasern vollständig gedehnt sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH R01 EY029130 (S.B.) und P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 und der Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), der Marfan Foundation und einem uneingeschränkten Zuschuss an das Department of Ophthalmology and Visual Sciences der Washington University von Research to Prevent Blindness unterstützt. J.R. erhielt auch ein Stipendium von der Universität für Gesundheitswissenschaften und Pharmazie zur Unterstützung dieses Projekts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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