Summary
Il presente protocollo descrive il controllo completamente ottico e l'osservazione dell'attività cellulare innescata nei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CM) per lo screening dei farmaci ad alto rendimento e i test di tossicità. Viene mostrata la quantificazione multiparametrica dei modelli fenotipici nel tempo e nello spazio. Vengono dimostrati gli effetti a lungo termine dei farmaci nell'arco delle ore o delle misurazioni sequenziali nei giorni.
Abstract
Capire come funzionano le cellule eccitabili in salute e malattia e come quel comportamento può essere alterato da piccole molecole o manipolazione genetica è importante. Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) con finestre di emissione multiple possono essere combinati (ad esempio, per l'osservazione simultanea di eventi subcellulari distinti) o utilizzati in applicazioni estese con altri attuatori dipendenti dalla luce in cellule eccitabili (ad esempio, combinando il controllo optogenetico codificato geneticamente con indicatori di calcio spettralmente compatibili). Tali approcci sono stati utilizzati in neuroni primari o derivati da cellule staminali, cardiomiociti e cellule beta pancreatiche. Tuttavia, è stato difficile aumentare il throughput, o la durata dell'osservazione, di tali approcci a causa delle limitazioni degli strumenti, del software di analisi, delle prestazioni degli indicatori e dell'efficienza della consegna genica. Qui, un GECI verde ad alte prestazioni, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) e un GECI SPOSTATO VERSO IL ROSSO, K-GECO, sono combinati con il controllo optogenetico per ottenere un controllo completamente ottico e la visualizzazione dell'attività cellulare in un formato di imaging ad alto rendimento utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto. Vengono mostrate le applicazioni che dimostrano i test di cardiotossicità e lo screening fenotipico dei farmaci con iPSC-CM sane e derivate dal paziente. Inoltre, le valutazioni multiparametriche che utilizzano combinazioni di varianti spettrali e di indicatori di affinità calcica (NIR-GECO, LAR-GECO e mtGCEPIA o Orai1-G-GECO) sono limitate a diversi compartimenti cellulari sono dimostrate anche nel modello iPSC-CM.
Introduction
I modelli derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) basati sull'uomo sono considerati una soluzione promettente per gli obiettivi delle 3R (sostituzione, riduzione e perfezionamento) stabiliti per gli studi sugli animali 1,2. I cardiomiociti derivati da iPSC sono stati utilizzati per la modellazione delle malattie e la scoperta di farmaci in quanto ricapitolano aspetti essenziali della biologia umana3. L'imaging del calcio, tipicamente con coloranti chimici, è stato utilizzato per osservare l'attività cellulare prima e dopo il trattamento farmacologico 4,5. Tuttavia, le sonde sensibili al calcio a base di coloranti chimici inibiscono direttamente la Na, la K-ATPasi e interrompono la funzione cellulare6. Pertanto, il monitoraggio delle stesse cellule per ore o giorni è stato problematico quando vengono utilizzati coloranti chimici. Qui, una serie di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI)7,8,9,10 sono utilizzati in un ampio spettro di eccitazione / emissione e affinità del calcio per formare una piattaforma di test di tossicità cardiaca che offre misurazioni multi-organelli in tempo reale per lunghi periodi di tempo 11.
Per sviluppare ulteriormente il concetto di screening basato sul calcio ad alto rendimento nel modello iPSC-CM oltre il contesto accademico precedentemente dimostrato utilizzando strumenti geneticamente codificati per il controllo ottico e l'imaging del calcio mediante co-espressione di un indicatore di calcio spostato verso il rosso, R-GECO o K-GECO con uno strumento optogenetico, sono stati generati kit virali pronti all'uso. Trasformando l'imaging in uno strumento ad alto contenuto dotato di un sistema auto-microfluidico, il pipettaggio a canale singolo dell'aggiunta di composti viene stratificato sopra l'imaging di cellule vive. Infine, entrambi gli aspetti cruciali del percorso sperimentale, l'elaborazione delle immagini e l'analisi sono migliorati e automatizzati.
Protocol
I cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CM) del paziente con cardiomiopatia ventricolare ventricolare sinistra (LVNC) sono stati forniti dal National Taiwan University Hospital. La raccolta di campioni di pazienti per la riprogrammazione a iPSC e i protocolli di mantenimento14 per scopi di ricerca hanno seguito la Dichiarazione WMA di Helsinki (principi etici per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani) e sono stati approvati dall'Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office presso NTUH (#201612099RINC). Altri iPSC-CM sono stati ottenuti da venditori commerciali. L'uso di derivati iPSC non richiede autorizzazioni specifiche nel nostro istituto.
1. Preparazione di cardiomiociti derivati da iPSC
- Preparare la piastra multipozzetto prima che iPSC-CM venga rimosso dalla cella frigorifera per lo scongelamento. Rivestire ciascun pozzetto della micropiastra da 96 pozzetti con 100 μL di soluzione di fibronectina/gelatina allo 0,2% da 50 μg/mL (vedere Tabella dei materiali) per coprire accuratamente tutte le superfici.
- Incubare la piastra a 37 °C per 1 h in un incubatore umidificato.
- Riscaldare il mezzo (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 30 minuti prima dello scongelamento cellulare.
NOTA: Il presente protocollo descrive la temperatura ambiente come 25 °C. - Trasferire l'iPSC-CM dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto liquido a bagnomaria a 37 °C.
NOTA: gli iPS-CM vengono generalmente spediti su ghiaccio secco da fonti accademiche o commerciali. Vengono trasferiti allo stoccaggio di azoto liquido al ricevimento fino all'uso. - Rimuovere la fiala prima che il ghiaccio si sciolga completamente e spruzzare la fiala con etanolo al 75%.
- Portare il flaconcino in un armadio di biosicurezza di classe II e trasferire delicatamente il contenuto in un nuovo tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di mezzo a temperatura ambiente.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante mediante pipetta e risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di terreno con 10 μM di inibitore ROCK (Y27632) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Evitare il pipettaggio ripetuto delle cellule scongelate per garantire il massimo recupero delle cellule. - Rimuovere la soluzione di rivestimento dal pozzetto e aggiungere rapidamente 50 μL di terreno con 10 μM di inibitore ROCK.
- Confermare il numero di cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del blu tripano con un emocitometro15.
- Celle a piastre in piastra rivestita a 96 pozzetti ad una densità di 100.000-150.000 celle/cm2, secondo le istruzioni del produttore16.
- Dopo 24 ore, assicurarsi che le cellule attaccate alla superficie della piastra siano in contatto con altre cellule.
NOTA: Le singole cellule sopravvivono male in coltura a lungo termine e in genere si comportano in modo più variabile. - Sostituire il mezzo di manutenzione preriscaldato ogni 2 giorni.
NOTA: Per il trattamento farmacologico a lungo termine, LVNC iPSC-CM è stato cambiato con sostituzioni semimedie con, o senza, farmaci a piccole molecole ogni 2 giorni.
2. Espressione di indicatori di calcio geneticamente codificati
- Dopo aver placcato le cellule per 72 ore, scongelare i kit virali GECI (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio.
- Preparare una soluzione stock di kit virale 2x con il mezzo di manutenzione.
- Preparare le cellule per l'infezione regolando il volume medio a 100 μL per pozzetto. Aggiungere 100 μL della soluzione virale premiscelata e incubare per 8-16 ore a 37 °C.
- Sostituire con 200 μL di terreno preriscaldato dopo l'incubazione.
- Visualizzare l'espressione dei GECI 24 ore dopo la trasduzione utilizzando un sistema di imaging (vedi Tabella dei Materiali).
NOTA: Il livello di espressione raggiunge il massimo a 48-72 h dopo la trasduzione. Le celle possono essere visualizzate dal punto temporale di 24 ore. Tuttavia, i segnali ottenuti dai GECI durano per più di un mese. - Mantenere le cellule nell'incubatore umidificato prima che vengano eseguiti i saggi funzionali.
- Infettare le iPSC-CMs (LVNC patient-derived iPSC-CMs) con il kit virale ChR2-K-GECO (vedi Tabella dei materiali) al giorno 25 dopo la differenziazione utilizzando il protocollo di infezione (fase 2.1-2.6).
3. Imaging del calcio a base di coloranti con Fluo-4
- Sciogliere la polvere di Fluo-4 (vedere la tabella dei materiali) in DMSO come soluzione madre (5 mM).
- Diluire la soluzione madre fino a una concentrazione di 10 μM di Fluo-4 nel tampone di Tyrode.
NOTA: Il tampone di Tyrode è costituito da 1,0 g/L di bicarbonato di sodio, 0,2 g/L di cloruro di calcio, 0,1 g/L di cloruro di magnesio, 0,2 g/L di cloruro di potassio, 8,0 g/L di cloruro di sodio, 0,05 g/L di fosfato di sodio monobasico e 1,0 g/L di D-glucosio. - Sostituire mezzo mezzo con 10 μM di soluzione di Fluo-4 (dando una concentrazione finale di 5 μM).
- Incubare le cellule a 37 °C per 30 minuti.
- Lavare le celle con tampone Tyrode preriscaldato e sostituirle con il mezzo prima dell'acquisizione dell'immagine.
- Avviare la registrazione con il protocollo di acquisizione del flusso.
NOTA: l'acquisizione del flusso acquisisce continuamente immagini senza intervalli. La frequenza di battimento di iPSC-CM è di circa 1 Hz e questo protocollo di acquisizione del flusso viene utilizzato per raccogliere modelli di battimento.
4. Acquisizione di immagini e saggi funzionali per test di tossicità e screening fenotipico
- Accendere tutti i dispositivi del sistema di imaging ad alto contenuto (vedere Tabella dei materiali).
- Verificare che la temperatura della camera raggiunga i 37 °C, con un'integrazione di CO2 al 5%. Mantenere il sistema in equilibrio per 2 ore prima dell'acquisizione dell'immagine.
NOTA: La deriva termica è un problema significativo per le osservazioni a lungo termine di cellule vive, 1 °C può cambiare il piano focale di ~ 1 μm, quindi consentire alla lente e allo stadio di raggiungere la temperatura target è essenziale prima dell'acquisizione dell'immagine. - Aprire il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) e scegliere l'impostazione della piastra per una lastra da 96 pozzetti.
- Posizionare una piastra a 96 pozzetti senza coperchio nella camera e caricare con l'anello di tenuta a celle sotto tensione sulla parte superiore.
NOTA: L'anello di tenuta a celle vive è un adattatore per raggiungere l'equilibrio ambientale. - Scegliere l'obiettivo ad immersione in acqua 20x (Figura 1 e Figura 2), 60x (Figura 3 e Figura 4) e 20x (Figura 5) in base alla risoluzione spaziale richiesta.
- Regolare la messa a fuoco per scattare immagini nitide prima dell'acquisizione sperimentale.
- Selezionare 3-5 regioni in modo casuale per pozzetto per la registrazione dell'attività del calcio.
NOTA: ogni regione deve includere almeno 20 celle (n ≥ 20). - Scegli filtri appropriati per diversi indicatori. FITC 475/536 per mNG-GECO, mtGCEPIA3 e Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 per NIR-GECO2; ER 530/593 per ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 per K-GECO.
- Impostare la potenza del diodo a emissione luminosa (LED) appropriata per ciascun canale di imaging utilizzato.
NOTA: quando si ottimizza la potenza del LED per l'acquisizione di immagini tramite il rapporto segnale (intensità rilevata dell'oggetto) e rumore (intensità rilevata dello sfondo), il rapporto S/N deve essere superiore a 2. In questo protocollo, 10% di potenza LED per TRITC e FITC; Il 20% per Cy5 era tipico. - Impostare il tempo di esposizione della telecamera su un massimo di 40 ms (25 Hz) e una durata di registrazione di 30 sper l'acquisizione del flusso per osservare i transitori di calcio riportati dalle sonde mNG-GECO e K-GECO espressi nei cardiomiociti (Figura 1-3 e Figura 5). Aumentare la potenza del LED se il segnale/rumore è <2 a frame rate più elevati.
- Per la stimolazione optogenetica (Figura 2 e Figura 3C,D), ottimizzare la potenza (tipicamente 5%-10%) e la frequenza della luce blu a 1 Hz.
NOTA: Generalmente, l'iPSC-CM umano batte spontaneamente intorno a ~ 1 Hz e l'operatore deve accelerare il ritmo rispetto alla frequenza spontanea. - Se sono previste misurazioni sequenziali (Figura 3) o estese (Figura 4), evitare la fototossicità a tutti i costi. Ciò può significare ridurre l'intensità della potenza di illuminazione e compensare questo aumentando il tempo di esposizione della fotocamera, ad esempio, a 100 ms con il protocollo time-lapse utilizzato per l'osservazione in tempo reale a tre canali dei segnali subcellulari Ca2+ (Figura 4).
- Utilizzare il protocollo di erogazione asincrona per l'aggiunta di caffeina a 10 mM tramite il sistema di microfluidica automatica (vedere la tabella dei materiali) (Figura 4).
NOTA: Il protocollo di erogazione asincrona consente l'acquisizione delle immagini mentre vengono aggiunti farmaci come la caffeina, senza spazi tra le immagini. - Inizia l'acquisizione.
5. Preparazione di piccole molecole
- Risospendere E4031, dofetilide e verapamil nel DMSO e diluirli con il tampone di Tyrode. La concentrazione finale di DMSO nel substrato è stata dello 0,1% (v/v).
- Preparare le soluzioni composte al doppio (cioè 2x) della concentrazione di lavoro desiderata ed equilibrare a 37 °C prima dell'aggiunta.
NOTA: Ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura dopo l'aggiunta del mezzo è vitale poiché la contrattilità dipende dalla temperatura e l'effetto del cambiamento di temperatura è rapido. - Disporre bene i composti sul bersaglio corrispondente.
- Aggiungere 100 μL dei composti a doppia resistenza (2x) tramite il sistema di microfluidica automatica (vedere Tabella dei materiali) nei pozzetti e iniziare l'acquisizione dopo il periodo di incubazione desiderato (tipicamente 15 minuti).
6. Elaborazione e analisi delle immagini
- Isolare l'area del segnale dallo sfondo rilevando automaticamente la caratteristica dell'impulso nel tempo-rivoluzione con il software.
- Utilizzare il software di analisi del picco di calcio (vedere la tabella dei materiali) per analizzare la frequenza di battimento (BPM), il segnale di picco (ampiezza), la durata transitoria del calcio 50% (CTD50), la durata transitoria del calcio 90% (CTD90), il tempo di salita e il tempo di decadimento (Figura 1C).
NOTA: In queste impostazioni, il fotosbiancamento era evidente nei primi 10 secondi e i segnali si sono stabilizzati successivamente. Pertanto, il picco di calcio è stato analizzato da 11-30 s. Nelle registrazioni a tre canali (Figura 4), il contorno della cella è bordato manualmente per misurare la variazione di intensità.
Representative Results
L'osservazione dell'oscillazione spontanea del calcio in mNG-GECO10 espressa da cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CMs) con o senza trattamenti farmacologici è dimostrata nella Figura 1 e nel Video Animato 1. Le tracce cinetiche ottenute usando mNG-GECO mostrano che i piccoli inibitori dei canali ionici molecolari, verapamil, dofetilide ed E4031, hanno influenzato i transitori di calcio (Figura 1B) come previsto. Il tipico transitorio di calcio mostrato in Figura 1C può essere analizzato dal software di analisi del picco di calcio per derivare il segnale di picco (ampiezza), la durata transitoria del calcio 50% (CTD50), la durata transitoria del calcio 90% (CTD90), il tempo di salita e il tempo di decadimento. Verapamil, un calcio-bloccante di tipo L17, inibisce completamente l'afflusso di calcio nelle cellule come previsto (Figura 1B). Dofetilide ed E4031 sono inibitori dei canali hERG18,19,20, elencati come farmaci antiaritmici sperimentali di classe III. Il tempo di decadimento è prolungato sia con il trattamento con Dofetilide (p < 0,05) che con E4031 (p < 0,001) rispetto al gruppo di veicoli. È stato osservato un prolungamento di CTD50 (p < 0,01) e CTD90 (p < 0,001) con trattamento con E4031 rispetto al solo veicolo (Tabella 1), questi risultati sono coerenti con gli effetti riportati sull'intervallo QT, una misurazione clinicamente rilevante della ripolarizzazione determinata dall'elettrocardiogramma di superficie da un lungo periodo di tempo tra l'inizio dell'onda Q e la fine dell'onda T, negli studi precedenti 12,21.
Una difficoltà della valutazione della CTD nelle cellule che battono spontaneamente è la variabilità che la frequenza di battimento impone alla CTD. Questo è un problema particolare per il modello iPSC-CM, in cui ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti può avere la propria frequenza di battitura anche se tutte le celle provengono dalla stessa fiala madre. È possibile imporre una frequenza di battimento mediante stimolazione ottica o elettrica. Per valutare la dose-risposta di E4031 in condizioni di ritmo standardizzato, ChR2 e K-GECO7 che esprimono iPSC-CM sono stati controllati otticamente utilizzando impulsi di luce a 1 Hz 470 nm e osservati utilizzando il segnale rosso K-GECO (Figura 2A e Figura supplementare 1). Riduzioni progressive dell'ampiezza del picco (p < 0,01) e aumento del tempo di decadimento (p < 0,05) dei transitori di calcio si verificano con concentrazioni crescenti di E4031 (Figura 2B1). Un effetto dose-dipendente di E4031 è stato più evidente per le riduzioni dell'ampiezza del picco (Figura 2B1,B2).
Sebbene gli studi a breve termine della durata di minuti siano tipicamente utilizzati per le valutazioni di cardiotossicità, esiste un punto cieco per le valutazioni di tossicità cronica che parallelamente le esposizioni dei pazienti ai farmaci per settimane, mesi o anni. Sarebbe vantaggioso studiare gli effetti della malattia o della tossicità negli intervalli che riflettono le durate del trattamento rilevanti per la pratica clinica. Abbiamo utilizzato il nostro sistema di controllo e rilevamento completamente ottico per studiare i cardiomiociti derivati da iPSC da un paziente con non-compattazione ventricolare sinistra (LVNC). Le iPSC-CM sono state trasdotte con un kit virale K-GECO (step 2.2-2.6) dopo il 25° giorno di differenziazione. Il segnale K-GECO è stato poi monitorato ogni 1-2 settimane negli stessi pozzi, con o senza ulteriori trattamenti farmacologici. Sia l'attività spontanea del calcio (Figura 3A,3B) che la dinamica del calcio sotto stimolazione ottica (Figura 3C,D, fase 4.11) sono state ottenute utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto (fase 4.1-4.12) ed elaborate dal software di analisi del picco di calcio (fase 6). Come dimostrato nella Figura 3A,C, i transitori di calcio chiaro rimangono visibili un mese dopo la trasduzione virale, con o senza la luce aggiuntiva utilizzata per la stimolazione ottica. Questo lavoro ha identificato un farmaco che sembra aumentare la frequenza di battito, regolarizzare l'intervallo di contrazione e aumentare l'ampiezza transitoria del calcio nel modello LVNC iPSC-CM (Figura 3A, B). Ci sono due importanti osservazioni da fare da questi dati. In primo luogo, dal punto di vista terapeutico, l'effetto del farmaco appare duraturo nei punti temporali del giorno 63 e del giorno 70. In secondo luogo, e di rilevanza per un campo che in generale analizza gli effetti composti durante brevi finestre (<1 min) in punti temporali precedenti (tipicamente <50 giorni); gli effetti modificanti il fenotipo della malattia del composto sono evidenti solo dopo il giorno 60, suggerendo che potrebbe essere facile scartare i farmaci che hanno meccanismi d'azione lenti nei protocolli di screening standard.
La variabilità della frequenza del battito e il conseguente impatto sulla durata dei transitori di calcio non è solo un problema da pozzo a pozzo in un dato punto temporale. Cambia anche quando le iPSC-CM vengono mantenute in coltura, che varia all'interno di un pozzo nel tempo (Figura 3B). Per imporre coerenza all'interno di esperimenti sequenziali, la stimolazione ottica a 1 Hz può essere applicata con o senza trattamento farmacologico (Figura 3C,D). Qui, sebbene i risultati del Day 63 mostrino le tendenze incoraggianti nel transitorio di calcio con un'ampiezza significativamente più elevata, CTD90 più breve e un tempo di decadimento più breve; entro il punto temporale di 70 giorni - e indicativo della necessità di valutazioni croniche durante il processo di screening dei farmaci per le malattie rare - vengono rilevate le depolarizzazioni anticipate (EAD). Il valore dell'aggiunta di un protocollo di stimolazione alla fenotipizzazione della malattia, o alla valutazione di piccole molecole, può essere valutato qualitativamente confrontando i risultati presentati in Figura 3B,D per la frequenza di battimento, l'ampiezza transitoria del calcio, CTD90 e il tempo di decadimento.
Un vantaggio di un GECI, rispetto alla metodologia basata sul colorante chimico, per visualizzare il transitorio di calcio è la capacità di limitare la sonda a un compartimento specifico all'interno di una cellula. Questo può essere ulteriormente ampliato multiplexando più varianti di colore e/o affinità in singole celle. Quindi, diversi GECI tra cui ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (o Oria1-G-GECO) e NIR-GECO2 8,24 sono stati sviluppati per l'espressione singolarmente o in combinazione in modelli cellulari per la misurazione in tempo reale dell'attività del calcio che si verifica rispettivamente nel reticolo endoplasmatico / reticolo sarcoplasmatico (ER / SR), nei mitocondri (o canale CRAC) e nel citosol. Possono essere combinati nel modello iPSC-CM (Figura 4A,C) per studiare l'interazione tra diverse riserve intracellulari di calcio. Ad esempio, il trattamento con caffeina 10 mM può essere utilizzato per svuotare la riserva di calcio SR. Qui una diminuzione del segnale ER-LAR-GECO (indicativo di perdita di calcio dall'SR) è andata di pari passo con un declino del segnale NIR-GECO (indicativo di un aumento della concentrazione citosolica di calcio) come previsto. Come altri compartimenti intracellulari siano influenzati da queste fluttuazioni non è ben studiato. Tuttavia, l'inclusione di un mtGCEPIA3 mirato ai mitocondri verdi mostra che l'assorbimento di calcio si verifica nei mitocondri in queste condizioni (Figura 4A,B).
Allo stesso modo, la visualizzazione dell'interazione tra diverse correnti di calcio può essere vista includendo una sonda, Orai1-G-GECO25, per rivelare la corrente Ca2+ del canale attivato dal rilascio di calcio (CRAC) (Figura 4C, D). Nel modello iPSC-CM, questo segnale aumenta con il transitorio citosolico spontaneo del calcio (Figura 4D1,D2). In linea con questo, il trattamento con caffeina evoca un grande transitorio di calcio sia nel citosol che dal canale Orai1.
È riconosciuto che la maggior parte dell'imaging transitorio di calcio nei modelli di cardiomiociti è stato determinato utilizzando coloranti di calcio26. Un indicatore di calcio geneticamente codificato è stato confrontato con un colorante chimico nel modello di cardiomiociti derivato da iPSC per consentire un confronto fianco a fianco di diversi approcci di imaging del calcio. Le iPSC-CM espresse da K-GECO sono state visualizzate insieme alle celle caricate con Fluo-4. I cardiomiociti espressi da K-GECO hanno mostrato un comportamento di battitura costante nel tempo (Figura 5A,C). Tuttavia, il caricamento di Fluo-4 ha influenzato sia la frequenza di battimento che la CTD in questo modello (Figura 5B, C), suggerendo che Fluo-4 stesso potrebbe influenzare i risultati di tali esperimenti. Ciò sarà particolarmente vero dopo l'esposizione a lungo termine alla sonda di imaging, che può verificarsi nel formato di imaging multiparete se l'imaging well-by-well si verifica con un tempo di permanenza minuto per pozzetto.
Figura 1: Inibitori dei canali ionici di piccole molecole applicati ai cardiomiociti derivati da iPSC. (A-B) Immagini time-lapse di iPSC-CM che esprimono mNG-GECO scattate a 25 Hz. Barra di scala = 50 μm. (B) Oscillazioni rappresentative di Ca2+ dopo aggiunta composta. I segnali fluorescenti ottenuti dalle cellule che esprimono mNG-GECO sono presentati come un rapporto di fluorescenza F/F0, dove F0 è definito come intensità basale e F l'intensità rilevata in ogni punto temporale. (C) Il software di analisi del picco di calcio può estrarre parametri tra cui la larghezza massima della metà (CTD50), la durata transitoria del 90% (CTD 90), il tempo di salita e il tempo di decadimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Esempio dose-risposta utilizzando l'inibitore hERG E4031 all'interno di un sistema di stimolazione ottica. (A) Tracce di stimolazione ottica con il 10% di luce blu in diverse concentrazioni di E4031. Immagini time-lapse di cardiomiociti derivati da iPSC che esprimono K-GECO prelevati a 25 Hz. (B1) Tracce rappresentative di transitori di calcio ottenuti con diverse dosi composte. Analisi dei picchi e dose-risposta di E4031 in ampiezza (B2) e tempo di decadimento (B3). Le barre blu indicano una stimolazione luminosa a impulsi a 1 Hz 470 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Piattaforma interamente ottica applicata per lo screening fenotipico a lungo termine dei farmaci nei cardiomiociti derivati dal paziente LVNC . (A) Traccia rappresentativa dell'attività di battitura spontanea nei cardiomiociti derivati dal paziente (post differenziazione Giorno 70) con (rosso) o senza (blu) trattamento farmacologico da 5 μM. (B) Analisi dei picchi di attività di battitura spontanea con o senza trattamento farmacologico a 5 μM. (C) Tracce di intensità della risposta al farmaco in iPSC-CM derivata dal paziente sotto stimolazione ottica a 1 Hz. (D) Analisi dei picchi di cardiomiociti derivati dal paziente con stimolazione ottica a 1 Hz. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Imaging subcellulare a tre canali Ca 2+ nel modello iPSC-CM. (A-B) Le iPSC-CM sono state trasdotte con sonde subcellulari di calcio per il citoplasma, NIR-GECO2 (rosso), il reticolo endoplasmatico ER-LAR-GECO (giallo) e mtGCEPIA3 (ciano), un indicatore mitocondriale Ca2+. (B) Imaging del calcio time-lapse a tre canali prima e dopo il trattamento con caffeina a 10 mM. (C-D) Sono stati visualizzati gli indicatori iPSC-CM trasdotti con citoplasma, NIR-GECO2 (rosso), reticolo endoplasmatico ER-LAR-GECO (giallo) e indicatori del canale CRAC Orai1-G-GECO (ciano). (D) È stata catturata l'imaging del calcio time-lapse a tre canali. (D1) L'attività spontanea beat-to-beat è stata osservata con NIR-GECO2 e Orai1-G-GECO. (D2) L'efflusso di calcio dall'ER (diminuzione del segnale ER-LAR-GECO) ha accompagnato un aumento del segnale citosolico del calcio dopo il trattamento con caffeina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Confronto tra l'indicatore di calcio codificato geneticamente (K-GECO) e il colorante chimico sensibile al calcio (Fluo-4) nelle iPSC-CM. (A-B) Nel tempo sono presentate tracce rappresentative di calcio di K-GECO (A) e Fluo-4 (B). (C) Analisi dei transitori di calcio di K-GECO trasdotta, o caricata con Fluo-4 iPSC-CM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| BPM | CTD50 (s) | CTD90 (s) | Ampiezza (f/f0) | Tempo di salita | Tempo di decadimento (s) | |
| Veicolo (0,1% DMSO) | 112.3657+/-10.95 | 0.25+/-0.04 | 0.41+/-0.01 | 1.99+/-0.02 | 0.07+/-0.01 | 0.28+/-0.01 |
| Verapamil (1 uM) | 0 | - | - | - | - | - |
| Dofetilide (5 nM) | 103.42+/-9.87** | 0.23+/-0.03 | 0.46+/-0.03 | 1.91+/-0.03 | 0.07+/-0.01 | 0.35+/-0.02* |
| E4031 (30 nM) | 75.73+/-12.08*** | 0.37+/-0.04** | 0.58+/-0.08*** | 1.55+/-0.02** | 0.11+/-0.04*** | 0.35+/-0.07** |
Tabella 1: Effetti dell'aggiunta di composti ai parametri transitori del calcio nel modello iPSC-CM. I valori di significatività sono indicati da *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) e ***(p < 0,001).
Video animato 1: L'attività spontanea del calcio è stata osservata da mNG-GECO in cardiomiociti derivati da iPSC con solo veicolo. Viene fornito un filmato pseudo-colorato con un'immagine in scala di grigi. Clicca qui per scaricare questo video.
Figura supplementare 1: Rappresentazione schematica del vettore adenovirale. Ciò include il canale della rodopsina ChR2 come attuatore, con un indicatore di calcio fluorescente rosso K-GECO come reporter di calcio per un test completamente ottico. Il canale ionico sensibile alla luce consente alle cellule eccitabili di essere depolarizzate dalla luce nella gamma blu-verde dello spettro visibile. In questi esperimenti è stata utilizzata una luce a 470 nm. I transitori di calcio nelle cellule eccitabili possono essere ripresi simultaneamente da K-GECO, che richiede una luce di eccitazione verde, producendo emissioni rosse. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Per eseguire con successo lo screening ad alta produttività, i segnali devono essere distribuiti uniformemente attraverso il recipiente di coltura, garantendo che le regioni di interesse (ROI) selezionate casualmente possano essere applicate automaticamente durante l'acquisizione dell'imaging. Sebbene gli indicatori chimici di calcio soddisfino facilmente questo requisito, le sonde geneticamente codificate hanno storicamente prodotto patch, piuttosto che fogli, di segnale che ne limitano l'uso. L'uso di un sistema di trasduzione virale fornisce elevatilivelli di espressione di 27,28 ed equivalenti di più indicatori tra le cellule bersaglio rispetto ai metodi di trasfezione convenzionali. Diversi tipi di cellule possono richiedere promotori diversi e la scelta del sistema di consegna genica potrebbe dover cambiare di conseguenza 29,30,31. In modelli cellulari eterogenei, l'efficienza di trasduzione ed espressione può essere diversa in specifici tipi cellulari. Da un lato, ciò può limitare l'applicazione a particolari cellule, ma il fenomeno può essere sfruttato per distinguere particolari cellule in un sistema di co-coltura32.
L'impatto principale di questo approccio è la liberazione dalla relazione uno-a-uno tra lo sperimentatore e il campione da parte dell'automazione. In un esperimento standard multi-pozzo, per raccogliere dati in quattro posizioni all'interno di un singolo pozzo, stimiamo che ci vogliano circa 15 ore al microscopio per raccogliere video di 30 s da una piastra da 96 pozzetti. Nel sistema automatizzato, questo richiede ~ 4 ore. Inoltre, l'analisi manuale dei dati richiede molto più tempo rispetto all'acquisizione dei dati. Il sistema di analisi utilizzato qui è circa 200 volte più veloce dell'equivalente manuale. Il risultato netto è un flusso di lavoro migliorato e un elevato risparmio di costi e tempo.
A differenza dei cardiomiociti primari caricati con coloranti di calcio che sopravvivono nell'ordine delle ore, i GECI espressi in iPSC-CM tramite sistemi di consegna virale possono produrre un segnale in un modello sperimentale che vive per alcuni mesi. Questi modelli possono essere mantenuti in un formato multi-pozzo e tracciati simultaneamente per l'analisi seriale in sistemi di imaging ad alto contenuto sviluppati per lo screening di piccole molecole. Ciò produce una semplice piattaforma sperimentale umana per testare gli effetti dei farmaci su durate più vicine a quelle sperimentate dai pazienti (settimane o mesi) piuttosto che i minuti tipicamente utilizzati nei saggi tossicologici.
Il sistema può essere ampliato per fornire misurazioni multiparametriche includendo GECI con proprietà di emissione distinte dal verde al vicino infrarosso. Tali esperimenti richiedono un'adeguata luce di eccitazione e set di filtri nel progetto sperimentale per mantenere separati i segnali. Un'ampia applicazione in un contesto di screening dei farmaci richiede piattaforme di analisi robuste ed efficienti oltre alla distribuzione di farmaci. Sebbene il modello qui descritto si concentri sull'uso di più indicatori dinamici di calcio, questo potrebbe essere modificato in marcatori strutturali della forma o della funzione cellulare. Questi sono in genere più facili da visualizzare in quanto mostrano poca variabilità da battito a battito rispetto alla variazione di cento volte nella concentrazione intracellulare di calcio. Questo approccio può essere particolarmente utile per le malattie rare in cui l'intermedio iPSC derivato dai pazienti può contenere tutti i driver genetici e i modificatori di una particolare condizione che possono essere conservati in un modello cellulare scalabile, facilitando la scoperta di farmaci in varie malattie basate su fenotipi cellulari che possono essere visualizzati indipendentemente dal meccanismo biologico sottostante che può essere difficile da chiarire.
Disclosures
LumiSTAR ha depositato la protezione brevettuale dell'uso di K-GECO, NIR-GECO e LAR-GECO.
Acknowledgments
Ringraziamo il Prof. Robert Campbell dell'Università di Tokyo per aver condiviso il materiale e la preziosa discussione; Dr. Chia-Lin Ho in Dispositivo molecolare per il supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
| auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
| Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
| E4031 | Tocris | 1808 | |
| ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
| iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
| iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
| K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
| LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
| mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
| mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
| NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
| Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
| Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |
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