Summary
Dette arbeidet presenterer en fleksibel protokoll for bruk av fluorescerende merket elastomerisk kontraktable overflater (FLECS) Teknologi i mikrowellformat for forenklet, hands-off kvantifisering av encellede kontraktilkrefter basert på visualiserte forskyvninger av fluorescerende proteinmikropatterner.
Abstract
Cellulær kontraktil kraftgenerering er et grunnleggende trekk som deles av praktisk talt alle celler. Disse kontraktile kreftene er avgjørende for riktig utvikling, fungerer både på cellulært og vevsnivå, og regulerer de mekaniske systemene i kroppen. Tallrike biologiske prosesser er kraftavhengige, inkludert motilitet, vedheft og oppdeling av enkeltceller, samt sammentrekning og avslapning av organer som hjerte, blære, lunger, tarmer og livmor. Gitt sin betydning for å opprettholde riktig fysiologisk funksjon, kan cellulær kontraktilitet også drive sykdomsprosesser når overdrevet eller forstyrret. Astma, hypertensjon, preterm labor, fibrotisk arrdannelse og underaktiv blære er alle eksempler på mekanisk drevne sykdomsprosesser som potensielt kan lindres med riktig kontroll av cellulær kontraktil kraft. Her presenterer vi en omfattende protokoll for bruk av en ny mikroplatebasert kontraktilitetsanalyseteknologi kjent som fluorescerende merket elastomeriske kontraktbare overflater (FLECS), som gir forenklet og intuitiv analyse av encellet kontraktilitet på en massivt skalert måte. Heri gir vi en trinnvis protokoll for å oppnå to sekspunkts doseresponskurver som beskriver effekten av to kontraktile hemmere på sammentrekning av primære menneskelige blære glatte muskelceller i en enkel prosedyre ved hjelp av bare en enkelt FLECS analysemikroplate, for å demonstrere riktig teknikk for brukere av metoden. Ved hjelp av FLECS Technology får alle forskere med grunnleggende biologiske laboratorier og fluorescerende mikroskopisystemer tilgang til å studere denne grunnleggende, men vanskelig å kvantifisere funksjonelle cellefenotypen, og effektivt senke inngangsbarrieren innen kraftbiologi og fenotypisk screening av kontraktil cellekraft.
Introduction
Cellegenererte mekaniske krefter er avgjørende for at de skal fungere riktig i ulike organer i hele kroppen, for eksempel tarmene, blæren, hjertet og andre. Disse organene må generere stabile mønstre for cellekontraksjon og avslapning for å opprettholde den indre homeostatiske tilstanden. Unormal glatt muskelcelle (SMC) sammentrekning kan føre til utbruddet av ulike lidelser, inkludert for eksempel intestinal dysmotility, preget av unormale mønstre av tarm glatt muskelkontraksjon1, samt de urologiske forholdene til overaktiv2 eller underaktiv blære3. Innenfor luftveiene kan SMB-er som har uregelmessige sammentrekningsmønstre utløse astmatisk hyperresponsivitet4, potensielt stramme luftveiene og redusere oksygenstrømmen inn i lungene. En annen utbredt fysisk tilstand, hypertensjon, er forårsaket av svingninger i den glatte muskelsammentrekningen i blodårene5. Det er klart at kontraktile mekanismer i celler og vev kan føre til sykdommer som krever behandlingsalternativer. Ettersom disse forholdene umiskjennelig stammer fra cellenes dysfunksjonelle kontraktile oppførsel, blir det logisk og nødvendig å måle selve cellekontraktilfunksjonen når du screener potensielle narkotikakandidater.
Ved å erkjenne behovet for verktøy for å studere cellulær sammentrekningskraft, er flere kvantitative sammentrekningsanalysemetoder utviklet av akademiske forskere, inkludert trekkraftmikroskopi (TFM)6, mikropatterned TFM7, flytende gelanalyser8 og elastomeriske mikropostanalyser9. Disse teknologiene har blitt brukt i enkeltrettsformat samt multi-well-plate format i mange studier og har til og med blitt foreslått for tredimensjonale kraftmålinger10,11,12,13,14. Selv om disse teknologiene har gjort det mulig for banebrytende forskning innen det ekspansive feltet cellekraftbiologi, har de alle i stor grad vært begrenset til laboratorier som har spesifikke evner og ressurser, spesielt: evne til å fremstille TFM-substrater, evne til å bruke komplekse og ikke-intuitive algoritmer riktig for å løse TFM-forskyvningskart, og relativt presise mikroskopisystemer som kan registrere bilder tatt før og etter prøvefjerning fra scenen (for celledissosiasjon). For en utrent forsker kan derfor inngangsbarrieren for å bruke disse metodene være ganske høy gitt det omfattende settet med krav for å bruke disse teknologiene. I tillegg kan bildeoppløsningen som kreves for mange eksisterende teknologier (40x mål eller høyere), begrense eksperimentell gjennomstrømning betydelig, mens massemålingsteknologier kan maskere bidrag fra ytre celler og forhindre oppdagelse av mildere kontraktilforskjeller. Vær oppmerksom på at så vidt forfatterne er klar over, er det bare lavgjennomstrømningen og den semi-kvantitative flytende gelanalysetilnærmingen som har modnet tilstrekkelig til å bli tilgjengelig for forskere (se figur 1).
Figur 1: Samlet skjematisk for FLECS Technology-metoden. (A) Celler følges av limproteinmikropatterner som er kovalent innebygd i et tynt elastomerisk lag støttet av glass. (B) Toppvisning av ulike mulige mikropatternformer og en oppblåsning av en celle som trekker sammen en "X"-formet mikropattern. (C) Overlegg av fluorescerende mikropatterner og fasekontrastbilder av en kontraherende celle. (D) Tidsforløpbilder av en enkelt kontraherende celle. Skalastenger = 25 μm. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Pushkarsky et al15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter nylige fremskritt innen mikroteknologi utviklet forfatterne en mikroplatebasert teknologi som muliggjør kvantitative målinger av encellet sammentrekning i hundretusenvis av celler kalt FLECS (fluorescerende merket elastomeriske kontraktbare overflater)15,16,17,18,19,20 , som et alternativ til TFM. I denne tilnærmingen er fluorescerende proteinmikropatterner innebygd i myke filmer som deformerer og krymper når celler bruker trekkraftkrefter på dem, på en intuitiv og målbar måte. Det er viktig at proteinmikropatternene begrenser celleposisjon, form og spredningsområde, noe som fører til ensartede testforhold. Disse tillater enkle målinger basert bare på deres dimensjonale endringer, som er svært løst romlig selv i 4x forstørrelsesbilder. Metoden inkluderer en nettleserbasert bildeanalysemodul og muliggjør enkel analyse av kontraktilcellekraft uten å kreve delikate håndteringsprosedyrer eller registrering av fiduciary markører, slik at den skal fungere av enhver forsker med et grunnleggende cellekulturanlegg og enkelt fluorescerende mikroskop med lav forstørrelse (figur 2 ). Denne teknologien, som er hylleklar og kommersielt tilgjengelig, ble designet med sluttbrukeren i tankene og tar sikte på å redusere inngangsbarrieren for enhver laboratorieforsker for å studere cellulær kraftbiologi.
Figur 2: Skjematisk for 24-brønns plateformatet for encellet kontraktilitetsanalyse. Dette formatet ble brukt i eksperimentene beskrevet heri og avbildet i videodelen av artikkelen. Skalastenger = 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I dette arbeidet presenterer vi en protokoll for å bruke 24 brønnplateformatet til FLECS Technology-plattformen for å kvantifisere effekten av kraftmodulerende legemidler på cellulær kontraktilitet i primære blære glatte muskelceller. Denne generelle protokollen kan tilpasses og modifiseres etter behov for å ta hensyn til ulike andre tidsskalaer, celletyper og behandlingsbetingelser av interesse, og skaleres for å svare på andre spørsmål i kraftbiologi.
Protocol
1. Dag 1: Klargjøring av 24 brønnplaten
- Begynn prosedyren ved å legge til 20 ml av cellekulturmediet i et 50 ml konisk rør. I dette eksperimentet brukes F12 Hams baserte medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS).
- Få en 24 brønnplate designet for å analysecellekontraktilitet. Sett pipetten til 500 μL og få en cellesil for cellepassering.
MERK: Platen er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. - Løft og hold platen i den ene hånden og fortsett å skrelle plastfilmen forsiktig fra toppen av platen. Sett deretter platen forsiktig ned igjen.
- Slå på en vakuumaspirator og aspirer det øverste laget av fosfatbufret saltvann (PBS) fra brønnene for å forhindre søling. Fjern PBS én rad om gangen. Når brønnene ikke lenger er helt fulle, holder du platen i den ene hånden og fjerner forsiktig resten av PBS fra brønnene. Fyll raskt med 500 μL cellekulturmedium. Pass på at du unngår kontakt mellom aspiratoren og bunnen av brønnen.
- Rist platen forsiktig og trykk på siden for å sikre at hele bunnen av brønnen er dekket med løsning. Når alle brønnene er fylt med medium, sett platen på siden.
2. Dag 1: Celle såing
- Hent kulturflasken med passasje 7 eller lavere primære humane blære glatte muskelceller (BSM) fra 37 °C inkubatoren. Under et mikroskop, sjekk cellemorfologi og sørg for at cellene har vokst til minst 90% samløp, men mindre enn 100% samløp.
- Utfør celledissosiasjonsprotokollen. I et sterilt biosikkerhetsskap, prøv cellene i 2,5 min til cellene løsnes før de slukkes med serumsupplert medium (10% FBS).
- Når cellene er dissosiert, bruk et hemocytometer for å telle cellene og fortynne celleopphenget til ca. 50 000 celler/ml i serumsupplert medium. Det er viktig at celler krever minst 2% serum for å feste seg til mikropatternene.
- Før sådd, spenne celleopphenget raskt gjennom en 40 eller 100 μm cellesil i et 50 ml konisk rør med en serologisk pipette for å bryte opp klumper av celler i enkeltceller.
- Tilsett forsiktig 500 μL av de 50 000 cellene/ml cellefjæringen i hver av de 24 brønnene på platen ved hjelp av en P1000 pipette ved å dispensere løsningen dråpevis over forskjellige posisjoner i brønnene.
- Etter cellesåing, la platen sitte ved romtemperatur i 1 time for å la cellene bosette seg direkte på mikropatternene uten å bli påvirket av mikrostrømmer generert av fordampning. Etter 1 time, plasser platen i en 37 °C inkubator over natten. Cellene vil selvmontere og spre seg over limmikropatternene i løpet av denne tiden og begynne å utøve basale sammentrekningsnivåer.
3. Dag 2: Tilsetning av testmedisin
MERK: Den endelige konsentrasjonen av dimetylsulfoksid (DMSO) i brønnene som inneholder tilhørende celler kan ikke overstige 1% og legemiddel / DMSO kan ikke tilsettes direkte til cellene, men bør først fortynnes og blandes i en mellomliggende løsning av cellemedium.
- Lag en seks-trinns, åtte ganger narkotikafortynning serien ved å overføre 30 μL av lager stoffet til påfølgende 210 μL volumer av DMSO og grundig blande mellom hvert overføring trinn. I dette arbeidet fremstilles en seks-trinns, åtte ganger fortynningsserie av blebbistatin i doser fra 40 μM til 1 nM, i DMSO.
- For hver lagermedisinløsning (fra trinn 3.1) blander du 30 μL legemiddel i 470 μL cellekulturmedium. Den mellomliggende løsningen gir en 16,7 ganger fortynning av DMSO.
- Overfør 200 μL av hver mellomliggende løsning til riktig brønn på 24 brønnplaten (som allerede inneholder 100 μL medium i hver brønn). Dette gir en ekstra seks ganger fortynning av DMSO.
- Trinn 3.2 og 3.3 gir samlet en 1% endelig konsentrasjon av DMSO i brønnene.
- Plasser den behandlede platen i en inkubator på 37 °C i riktig varighet. For dette eksperimentet brukes en 30 min inkubasjon.
- Umiddelbart før avbildning, tilsett Hoechst 33342 levende kjernefysisk flekkløsning til hver brønn (1:10,000 endelig fortynning). La det inkubere i ytterligere 15 minutter for å merke cellekjernene.
4. Dag 2: Bilde av brønnplaten
- Få tilgang til et mikroskop som er utstyrt for å avbilde kanalene for både cellekjerner (DAPI) og mikropatternene (TRITC).
- Først bilde cellene med DMSO bare.
- Fokuser deretter på og bilde både mikropatternene og de merkede cellekjernene for å identifisere enkeltceller og sikre at begge kanalene er perfekt justert for å muliggjøre automatisert bildeanalyse.
- Gjenta ved flere posisjoner i hver av de 24 brønnene på platen. Bilder kan tas med 4x objektiv (eller eventuelt høyere for å fremskynde bildebehandling og skaffe seg maksimale datapunkter per bilde).
- Eksporter bildene som TIF-filer og åpne dem på en web-tilkoblet datamaskin med ImageJ for å analysere dataene.
5. Ettereksperiment: Bildeanalyse
MERK: Bildeanalyse ble utført ved hjelp av Biodock.ai portal- og bildebehandlingsprogramvare.
- Last opp de oppkjøpte bildene til en datamaskin.
- Forsikre deg om at tilsvarende par mikropattern- og kjernefysiske bilder er riktig navngitt.
- Kontroller at alle mikropatternbildenavn har formatet sharedCoreName_pt.tif.
- Kontroller at alle nukleibildenavnene har formatet sharedCoreName_dapi.tif.
- Konverter bilder fra TIF til PNG ved hjelp av ImageJ.
- Når ImageJ er åpnet, laster du inn i én kanal om gangen. For dette eksperimentet må du først laste inn mikropatternbilder som en stakk i ImageJ.
- Bruk bilde > Juster lysstyrke/kontrast >, juster lysstyrken i bildet for å fremheve mikropatternene og redusere bakgrunnen til svart. I tillegg til dette, glatt ut bildene.
- Bruk bilde > Skriv inn > 8-biters, og konverter bildene til 8-biters.
- Eksporter deretter bildet til PNG-type, og merk av for stykkenivået for boksen som filnavn. Nå oppretter du en ny mappe PNG og lagrer PNG-filene der med samme navn.
- Gjenta denne prosessen for kjerner.
- Last opp PNG-bildepar til bildebehandlingsprogramvaren for analysen.
- Opprett og valider kontoen. Forfatterne har en konto for å muliggjøre åpen tilgang til akademiske brukere.
- Valider forretningsforbindelsen ved å kontakte forfatterne.
- Logg inn på programvaren.
- Klikk Last opp bunke på Data-fanen til venstre.
- Importer bildene ved å dra og slippe bildepar i vinduet som dukker opp og navngir batchen. Klikk OK.
- Merk av i boksen ved siden av bunkenavnet, og klikk Analyser.
- I neste skjermbilde blar du ned og merker av i boksen ved siden av Kontraktilitetsanalyse og klikker på Velg. Lenger nede på siden velger du 10x som forstørrelsen som ble brukt til avbildning fra en rullegardinmeny.
- Klikk Send. Når dataanalysen er fullført, klikker du på batchnavnet. På neste skjermbilde klikker du på Last ned data til høyre på siden.
MERK: De nedlastede filene vil inneholde bilder som ble analysert, sammendragsresultater som rapporterer gjennomsnittlig sammentrekning i hvert bilde, og en detaljert analyse av hvert mikropattern som ble oppdaget i et hvilket som helst bilde, rapporterer størrelser, posisjoner, antall celler som følges og sammentrekning. - Plott sammentrekningsverdier mot legemiddelkonsentrasjoner for å generere en konsentrasjonsresponskurve og bestemme de relative potensene til forskjellige behandlinger.
- Klikk Send. Når dataanalysen er fullført, klikker du på batchnavnet. På neste skjermbilde klikker du på Last ned data til høyre på siden.
Representative Results
Områder av bildene som er anskaffet fra brønner som bare ble behandlet med DMSO, og de som ble behandlet med 40 μM blebbistatin, vises side om side i figur 3. Det kan tydelig observeres at DMSO-bare behandlede celler viser et betydelig sammentrekningsnivå basert på de svært fremtredende deformasjonene til mikropatternene som følges av blære glatte muskelceller (BSMCs) i den brønnen. Omvendt, i bildet av brønnen behandlet med 40 μM blebbistatin, observeres betydelig celleavslapping7 da mikropatternene som følges av BSMCer, nesten ikke skiller seg i størrelse fra mikropatternene som ikke følges av celler, noe som indikerer minimal sammentrekning. Disse bildene demonstrerer den intuitive og klare visuelle representasjonen av encellet kontraktilitet som tilbys av fluorescerende mikropatterningsmetoden. I motsetning til TFM-baserte metoder, hvor omnidireksjonell bevegelse av mange fluorescerende partikler tilfeldig fordelt under et tett cellemonolayer er ment å formidle relativ kontraktil kraft, her gir mikropatternenes ensartede og markerte sammentrukne geometrier umiddelbar og lett fortolkende kvalitativ informasjon om sammentrekning av individuelle celler. Disse kan kvantifiseres direkte ved å bruke standard binære objektoperasjoner på bildene.
Figur 3: Side-ved-side sammenligninger av bilder tatt av brønner som inneholder enten bare 1% DMSO-behandling (venstre) eller inneholder 40 μM blebbistatin (høyre). Det kan tydelig observeres at behandling med blebbistatin reduserer kontraktiliteten til enkeltcellene betydelig som angitt av de større, ikke-kontraherte mikropatternene. Blå kjerner indikerer hvilke mikropatterner som er bundet av celler. Skalalinje = 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved å bruke den nettleserbaserte analysemodulen til å analysere de oppkjøpte bildeparene mikropatterns og cellekjerner, oppnås encellede kontraktilitetsfordelinger for hver populasjon som vist i figur 4. Analysen er beskrevet i detalj i en tidligere rapport om FLECS-metodikken15, og fungerer ved å finne posisjonene og orienteringene til hver "X" formet mikropattern, telle antall kjerner som følges direkte over midten av hver mikropattern, beregne gjennomsnittslengden på hver mikropattern og beregne pikselavstanden til sammentrekningen av hver mikropattern med hensyn til gjennomsnittlig lengde på tomme mikropatterner (null sammentrekningsreferanse). Derfor tjener de tomme mikropatternene et viktig formål for å normalisere sammentrekningsdataene. Det er viktig at celler som ikke binder seg til mikropatternene, akkumuleres på brønngrensene på grunn av mikrostrømmer der de ikke vil påvirke bildeanalysen. Som vist i disse plottene, spenner den uforstyrrede kontraktiliteten til cellepopulasjonen som bare behandles med DMSO-kontroller, over et stort område så høyt som 20 piksler, med et senter som finnes på rundt 10 piksler. I mellomtiden, celler behandlet med blebbistatin kontrakt betydelig mindre og deres distribusjon er presset ned til et senter på litt over 6 piksler. Viktigst, hver eneste mikropattern som finnes i bildet som binder nøyaktig på celle, er representert i disse distribusjonene. Dette viser metodens evne til å formidle differensial cellulære responser på narkotikabehandlinger.
Figur 4: Histogrammer som viser encellede kontraktilitetsdata hentet fra analysen av bilder tatt av brønner som bare inneholder 1% DMSO (blå) eller 40μM blebbistatin. Fordelingen av DMSO-behandlede celler er bred og sentrert med en mye større sammentrekningsverdi (~ 10 piksler) enn den blebbistatinbehandlede fordelingen, noe som demonstrerer de kvantitative effektene av behandling av celler med blebbistatin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved å utnytte alle brønnene på en enkelt 24-brønns plate og bildebehandling minst 3 steder per brønn, genereres sekspunkts doseresponskurver samtidig for to legemiddelforbindelser. Figur 5 viser konsentrasjonsresponsdataene for BSMCer behandlet med samme utvalg av doser blebbistatin eller cytochalasin D (begge kjente kontraktilitetshemmere). Som det fremgår av konsentrasjonsresponsprofilene, er cytochalasin D den mer potente hemmeren av tonic sammentrekning i disse cellene. Ved å tilpasse en sigmoidal kurve til datapunktene, kan IC50-verdier beregnes for hvert legemiddel. Våre eksperimenter indikerer at IC50 er henholdsvis 7,9 μM og 100 nM for blebbistatin og cytochalasin D, etter ~ 30 min eksponering for stoffene. Samlet sett er disse verdiene i samsvar med tidligere rapporter, og validerer den kvantitative nøyaktigheten av metoden for å bestemme styrken til sammentrekningshemmere7,21.
Figur 5: Konsentrasjonsresponskurver som viser effekten av blebbistatin og cytochalasin D på cellulær kontraktilitet i enkeltceller. Hvert datapunkt består av tre bilder for denne betingelsen. En sigmoidal kurve passet til hvert datasett. Resultatene indikerer at cytochalasin D er mer potent, med en lavere IC50-verdi . Disse dataene kan samles inn fra en enkelt 24-brønns FLECS-plate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne forenklede metoden for kvantitativt å måle sammentrekning i hundretusenvis av celler om gangen under ulike behandlingsforhold og bruk av bare standard mikroskopiinstrumenter gir et tilgjengelig alternativ til tradisjonell TFM for forskere å studere cellulær kraftbiologi. Fordi den presenterte teknologien gir en visuell visning av cellekontraksjon ved å analysere endringer i regelmessig formede fluorescerende mikropatterner, er størrelsen på sammentrekningen produsert av en gitt celle intuitivt forstått - jo mindre mikropattern, desto større er kontraktilkraften som utøves av cellen.
Spesielt ved å tilby kontroll over faktorer som form, spredningsområde og vedheftsmolekyl som består av mikropatternene (alle faktorer som er kjent for å regulere cellekontraktilitet22,23,24), eliminerer den presenterte teknologien systematisk ytterligere variabler som kan forvirre tolkninger av cellekontraksjonsstudier.
I dette eksperimentet ble 10 kPa stivhet brukt i gelen og en 70 μm (diagonal lengde) mikropattern ble brukt bestående av type IV kollagen. I tillegg til disse parametrene kan limmolekylet erstattes med ulike kollagener, fibronektin, gelatin og annen ekstracellulær matrise (ECM). Gelens stivhet kan stilles ned til 0,1 kPa, og opp i MPa-serien. Mikropatterngeometrien kan utformes de novo til å være en hvilken som helst form med minimal funksjonsstørrelse på ~ 5 μm. Disse parametrene er frakoplet og kan optimaliseres uavhengig for en bestemt biologisk kontekst.
Denne teknologien har blitt grundig validert for å være kompatibel med svært klebende og kontraktile celletyper av en mesenchymal fenotype, inkludert ulike glatte muskelcelletyper (primær menneskelig blære, tarm-, trakeal-, bronkial-, livmor-, aorta- og arteriell), mesenchymale stamceller og deres differensierte avkom, ulike fibroblaster (lunge-, dermal- og hjerte-), myofibroblaster og endotelceller. I tillegg vil monocytt-avledede makrofager også produsere stor målbar fagocytisk kraft på mikropatternene, spesielt hvis mikropattern består av et kjent opsonin. Ulike kreftlinjer kan også analyses ved hjelp av metoden.
Metoden kan utgjøre noen utfordringer for bruk med celler som enten er relativt små som T-celler og nøytrofiler, eller celletyper med en overveiende epitel fenotype. Hovedårsaken til dette er at metoden er avhengig av sterk vedheft og fullstendig spredning av celler over mikropatternet for å generere det målbare kontraktilsignalet. Celler som binder seg svakt, binder seg til hverandre eller ikke sprer seg helt, vil ikke produsere målbare kontraktilsignaler. Disse atferdene, som er relativt sjeldne, kan reduseres ved å justere mikropatternstørrelsen for å være mindre, eller ved å bruke alternative limmolekyler i mikropatternene som bedre vil fremme vedheft og spredning i disse cellene.
Brukere av teknologien må nøye vurdere forskjellige mulige cellekulturelle middels formuleringer for deres spesielle celletype, da forskjellige komponenter, vekstfaktorer, serumnivåer og pH-følsomheter kan drive variabel oppførsel i forskjellige celler. Optimalisering av protokollen bør komme før skalering av eksperimentelle arbeidsflyter, og mediekomponenter bør alltid være friske, sterile og i samsvar med tidligere grupper.
Til syvende og sist, hvis encellet oppløsning ikke er nødvendig for en brukers mål, eller hvis målcelletypen har minimal spredningskapasitet, kan tradisjonell TFM være like eller mer egnet for slike eksperimenter. Forfatternes mål og håp er at dette verktøyet gir en ekstra mulighet for cellebiologer til å studere cellulær sammentrekning, spesielt i sammenheng med automatiserte høygjennomstrømning fenotypiske narkotikaskjermer.
Høyere gjennomstrømningsplater som en 384-brønns FLECS-plate kan brukes spesielt for fremtidig bruk i legemiddelskjermer. I slike plater kan 4x mål på mange mikroskoper fange en hel brønn i sitt synsfelt, og sikre at alle cellulære kontraktilresponser fanges opp. Ved å bruke et bildesystem med høy gjennomstrømning kan en hel 384-brønnsplate avbildes på ca. 5 minutter, noe som gjør dette systemet dramatisk raskere enn andre alternativer, og derfor egnet for høygjennomstrømning fenotypisk legemiddeloppdagelse. Faktisk kjører forfatterne rutinemessig ukentlige narkotikaskjermer på ~ 50 384 brønnplater (totalt mer enn 19.000 brønner) ved hjelp av automatisering.
Disclosures
I.P. er en oppfinner på en utstedt patentfamilie som beskytter metodene og systemene til FLECS-teknologi. I.P., Y.W., J.Z., E.C., og R.H. er alle ansatte i Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. er professor ved UCLA og medstifter av Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z., og R.D. har økonomiske interesser i Forcyte Biotechnologies, Inc., som er den eksklusive rettighetshaveren av de ovennevnte patentene og kommersialiserer FLECS Technology.
Acknowledgments
Laboratoriearbeidet ble utført med støtte fra UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR) hvor Forcyte sponser forskningsaktiviteter, og Magnify Incubator ved California NanoSystems Institute (CNSI), hvor Forcyte Biotechnologies, Inc. er et hjemmehørende selskap. Forfatterne vil gi tilgang til Biodock.ai FLECS analysemodul til alle akademiske forskere på forespørsel. L.H. og I.P. bidro likt til dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
References
- Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced. Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).
- Peyronnet, B., et al. A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment. European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).
- Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance. Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).
- Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity. Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).
- Brozovich, F. V., et al. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Rokhzan, R., et al. high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function. Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).
- Park, C. Y., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces. Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).
- Huang, Y., et al. Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells. Scientific Reports. 9, 539 (2019).
- Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLOS ONE. 6, 17833 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Pushkarsky, I. FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).
- Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).
- Orfanos, S., et al. Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).
- Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers. PLOS ONE. 9, 106091 (2014).
- Yoo, E. J., et al. Gα12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).
- MacGlashan, D., Vilariño, N. Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).
- Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization. Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Wang, N. Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading. Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).
- Ye, G. J. C., et al. The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent. Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).
