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방법 논문

박테리아 발현 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 정제

4.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63263

⸱

2022년 3월 30일

 ,  , 
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

그의 태그 정제, 투석 및 활성화는 박테리아에서 가용성, 활성 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인 단백질 발현의 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 단백질 분획은 SDS-PAGE 겔을 통해 분석된다.

초록

매트릭스 메탈로프로테이나제(MMPs)는 세포외 매트릭스(ECM) 분해 및 리모델링에서 중심적인 역할을 하는 메친신 프로테아제 패밀리에 속하며, 여러 성장 인자 및 사이토카인과의 상호작용에 속한다. 특정 MMPs의 과발현은 암, 신경 퇴행성 질환 및 심혈관 질환과 같은 여러 질병에 책임이 있다. MMPs는 MMP 과발현과 상관관계가 있는 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위한 표적으로서 최근 주목의 중심이 되고 있다.

용액 중의 MMP 메카니즘을 연구하기 위해, 활성, 가용성 MMPs의 생산을 위해 보다 용이하고 강력한 재조합 단백질 발현 및 정제 방법이 필요하다. 그러나, 대부분의 MMPs의 촉매 도메인은 번역 후 기계의 부족으로 인해 가용성 형태로 에스케리치아 콜라 이 (E. coli)에서 발현될 수 없는 반면, 포유동물 발현 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 수율이 낮다. MMP 봉입체는 광범위한 정제 및 재폴딩의 지루하고 힘든 과정을 거쳐야하며, 천연 입체 형태에서 MMP의 수율을 현저하게 감소시켜야합니다. 이 논문은 로제타2(DE3)pLysS(이하 R2DP로 지칭됨) 세포를 사용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인(MMP-3cd)을 생산하는 프로토콜을 제시하며, 이는 친화성 정제에 사용하기 위한 N 말단 His-태그에 이어 프로도메인(Hisx6-pro-MMP-3cd)을 함유한다. R2DP 세포는 박테리아 발현 시스템에서 일반적으로 희귀한 코돈을 함유하는 클로람페니콜 내성 플라스미드를 통해 진핵 단백질의 발현을 향상시킨다. 재조합 단백질 발현을 위해 선택된 전통적인 세포주 BL21(DE3)과 비교하여, 이 새로운 균주를 이용한 정제는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd의 수율을 향상시켰다. 활성화 및 탈염시, 프로 도메인은 N 말단 His-태그와 함께 절단되어, 무수한 시험관내 적용에서 즉시 사용하기 위한 활성 MMP-3cd를 제공한다. 이 방법은 고가의 장비나 복잡한 융합 단백질을 필요로 하지 않으며, 박테리아에서 재조합 인간 MMPs의 신속한 생산을 기술한다.

서론

대부분의 복잡한 진핵 단백질은 발현 후 정교한 번역 후 변형을 거치며, 고도로 보조된 단백질 폴딩 및 보조 인자가 기능적이어야 합니다1. 박테리아 숙주에서 다량의 가용성 인간 단백질을 생산하는 것은 소규모 실험실 실험에서도 높은 비용과 강력한 발현 및 정제 방법의 부족으로 인해 중요한 과제로 남아 있습니다2,3. MMPs, 큰 분자량을 가진 인간 endopeptidases는 일반적으로 대장균 에서 발현될 때 불용성 봉입체로서 발현된다. 가용성 인간 MMP의 추출은 종종 힘들고 시간이 많이 걸리는 가용화 및 재접힘 공정4으로 이어진다.

MMP는 생리적 및 병원성 과정 모두에서 중요한 역할을 한다. 인간 MMPs는 구조 및 기질 특이성에 의해 분류되고, 고도로 보존된 촉매 도메인5,6에도 불구하고 차등적으로 발현되는 23개의 아연 엔도펩티다제의 패밀리이다. MMPs는 비활성 효소원으로서 분비되고, 번역 후 활성화 및 이들의 내인성 억제제, 메탈로프로테이나제 (TIMPs)의 조직 억제제 7,8,9,10을 통해 조절된다. 처음에는 ECM 회전율에서 그들의 역할에 대해 인정되었지만, MMP는 또한 발달, 형태 형성, 조직 복구 및 리모델링에 연루되어 있습니다8. MMPs의 조절 장애는 다른 질병 중에서도 신경 퇴행성, 심장 혈관 및 섬유성 질환과 함께 암과 특히 관련이 있습니다5,7.

강력한 대규모 MMP 생산 방법의 개발은 생화학 및 세포 기반 분석을 통해 MMP 메커니즘에 대한 향후 연구의 성공을 보장하는 데 중요합니다. 다양한 MMP가 MMP 활성을 변경하지 않고 Hisx6-태그된 MMP를 포함하는 박테리아11에서 이전에 발현되었다12,13,14,15. 그러나 이러한 방법에는 복제하기 어려울 수 있는 지루하고 긴 단계가 포함됩니다.

포유동물 세포는 또한 적절한 번역 후 변형을 보장하면서 많은 상이한 인간 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다16. 포유동물 발현 시스템이 적절한 번역 후 변형을 갖는 재조합 인간 단백질을 생산하기 위한 이상적인 선택이지만, 이 방법의 주요 단점은 초기 낮은 수율, 값비싼 성장 배지 및 시약, 안정적인 발현 라인에 도달하기 위한 긴 타임라인, 진균 또는 박테리아와 같은 다른 종과의 오염 위험이다2,11 . 더욱이, 포유동물 세포주에서의 MMP 생산은 TIMPs 또는 피브로넥틴11과 같은 관련 세포 단백질로부터의 불순물을 산출한다. 포유류 세포에서 관찰되는 느린 세포 성장과는 달리, 박테리아 발현 시스템은 더 간단한 배지 및 성장 요건과 함께 단기간에 대규모 단백질 생산을 제공합니다. 그러나, 박테리아 발현 시스템에서 다른 관련 세포 단백질(즉, TIMPs)의 부족으로 인해, 더 높은 농도에서의 활성 MMP는 자가단백질 분해를 통해 분해될 수 있고, 결과적으로 불량한 MMP 수율17을 초래한다.

이 논문은 MMPs2,3,18의 더 높은 수율을 생산하는데 있어서 경제성, 단순성 및 성공으로 인해 대장균을 발현 숙주로 사용하는 재조합 Hisx6-pro-MMP-3cd의 박테리아 발현, 정제 및 활성화를 위한 상세한 방법을 기술한다. 대장균은 재조합 MMP 및 기타 복잡한 단백질에 필요한 단백질 폴딩 기계 및 번역 후 처리가 부족하기 때문에 많은 대장균 균주가 이러한 한계를 극복하도록 설계되어 대장균을 재조합 인간 MMP-3cd,19,20의 발현에 더 적합한 숙주로 만들었습니다. . 예를 들어, 본 연구에 사용된 R2DP 균주는 대장균에서 거의 사용되지 않는 코돈을 함유하는 클로람페니콜 내성 플라스미드를 공급함으로써 진핵 발현을 향상시킨다.

이 프로토콜에 기재된 바와 같이, R2DP 세포에서 pET-3a 벡터 (도 1)로부터 비교적 순수한 봉입체를 과발현시킨 후, Hisx6-pro-MMP-3 촉매 도메인 (MMP-3cd) 단백질이 추출되고 변성된다4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19는 친화성 태그 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 재접힘 및 투석시에, 프로-MMP-3cd (자이모겐)를 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트 (APMA)에 의해 활성화시키고, SDS-PAGE 분석은 수율 및 추가 정제의 필요성을 평가하기 위해 사용된다5,21. 이러한 프로토콜은 가용성 MMP-3cd의 발현, 정제 및 활성화를 예로 들어 설명한다. 그러나, 유사한 발현 및 활성화 메카니즘을 갖는 다른 MMPs 및 인간 프로테아제의 발현을 위한 가이드로서 또한 사용될 수 있다(도 2). MMP-3cd 이외의 다른 단백질의 경우, 독자는 이 프로토콜을 시도하기 전에 그들의 표적 단백질에 대한 최적의 완충액 조성물 및 방법을 결정하는 것이 권고된다.

figure-introduction-1
도 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 플라스미드의 플라스미드 맵. pET-3a 벡터는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. N 말단 Hisx6-태그 서열은 프로-MMP-3cd를 포함하는 pET-3a 기반 벡터 내로 클로닝되어, BamHI 및 NdeI 제한 부위 사이의 T7 프로모터의 제어 하에 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 구축물을 수득한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 2: 프로-MMP-3cd의 박테리아 발현, 정제, 리폴딩 및 활성화. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 플라스미드를 BL21(DE3) 또는 R2DP 세포로 형질전환시켰다. 1.2: 프로-MMP-3cd 단백질 발현은 IPTG를 사용하여 유도하였다. 1.3 : 화학적 용해 및 초음파 처리는 주로 불용성이며 봉입체에서 발견되는 Hisx6-pro-MMP-3cd 단백질을 추출하는 데 사용됩니다. 우레아는 봉입체로부터 단백질을 변성시키고 가용화하는데 사용되었다. 2.1. 변성된 Hisx6-pro-MMP-3cd 단백질을 친화성 크로마토그래피 정제를 통해 정제하였다. 3. 용출된 Hisx6-pro-MMP-3cd를 완충제로부터 요소들의 점진적인 제거를 통해 투석 동안 천천히 재접었다. 4. 마지막으로, 재접힌 MMP-3cd 단백질은 N 말단 프로펩타이드 도메인을 제거함으로써 APMA를 사용하여 활성화시켰다. APMA는 나중에 탈염을 통해 용액에서 제거됩니다. 숫자는 이러한 단계를 설명하는 프로토콜 섹션에 해당합니다. 약어: MMP-3cd = 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인; APMA = 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

1. MMP 발현

  1. pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd를 R2DP 세포로의 클로닝 및 형질전환
    1. pET-3a 플라스미드 (물질의 표 참조)를 다이제스트 버퍼에서 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 소화한다 (물질의 표 참조). 총 반응 부피 40μL에 다이제스트 버퍼 4μL, 100ng/μL 플라스미드 33μL 및 각 제한 효소 1.5μL를 첨가하고 37°C에서 완료될 때까지 ~2시간 동안 반응을 진행시킨다.
    2. MMP-3cd 서열에 대해 PCR 반응을 수행하여 N 말단 His-tag를 삽입한다. 25μL의 PCR 믹스( 물질 표 참조), 2.5μL의 10μM 프라이머(보충 그림 S1) 및 100ng/μL 삽입 서열 1.25μL를 사용합니다. 멸균수를 50 μL의 최종 반응 부피에 첨가한다.
    3. PCR 산물을 실행하고 1% 아가로스 겔 상에서 벡터를 소화시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 젤 회수 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 젤 밴드를 정제합니다.
    4. 증폭된 PCR 산물을 DNA 어셈블리 믹스를 사용하여 NdeI 및 BamHI 제한 부위 사이의 소화된 벡터 내로 복제 한다(표 참조). 온라인 도구를 사용하여 15 μL의 총 반응 부피에 대해 삽입 및 절단 벡터의 필요한 부피를 결정하십시오.
    5. 해동될 때까지 얼음 상에서 50 μL 분취량의 고형질전환 효율 세포(물질 표 참조)를 해동시킨다. SOC 성장 배지(표 참조)를 37°C로 예열하고 LB-암피실린(LB Amp) 플레이트(재료 표 참조).
    6. 1-2 μL의 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 조립 반응을 50 μL 분취량에 첨가한다. 얼음 위에서 30 분 동안 배양하십시오.
    7. 세포를 42°C에서 30초 동안 인큐베이션함으로써 열충격시킨다. 얼음 위에서 2 분 동안 배양하십시오.
    8. 950 μL의 SOC 성장 배지를 각각의 형질전환체 혼합물에 첨가한다. 250 rpm 및 37°C에서 1시간 동안 진탕한다.
    9. 형질전환체 100 μL를 LB Amp 플레이트 상에 플레이트하고 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
    10. 각각의 단리된 콜로니를 LB Amp 배지 10 mL에 접종한다. 250 rpm 및 37°C에서 밤새 진탕한다.
    11. 미니프렙 키트에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 추출 한다(표 참조). T7 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 구축물의 서열을 확인하였다(보충도 S1).
      참고: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 구축물 DNA는 -20°C에서 저장될 수 있다. 준비가 되면 R2DP 세포로의 형질전환을 진행한다.
    12. R2DP 세포의 20 μL 분취량 하나를 얼음 상에서 2-5분 동안 해동시킨다( 물질 표 참조). SOC 성장 배지를 실온으로 예열하고 LB Amp CamR 플레이트를 37°C로 예열 한다(재료 표 참조).
    13. 50 μL 분취량에 100 ng/μL 서열-확인된 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 중 1 μL를 첨가한다. 부드럽게 저어 튜브를 섞어서 얼음으로 되돌립니다.
    14. 튜브를 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션하십시오.
    15. 세포를 정확히 30초 동안 42°C에서 인큐베이션함으로써 열충격시킨다. 흔들리지 마십시오.
    16. 세포를 얼음 위에 2 분 동안 놓습니다.
    17. 80 μL의 실온 SOC 배지를 형질전환체 혼합물에 첨가한다. 250 rpm 및 37°C에서 1시간 동안 진탕한다.
    18. 형질전환체를 LB Amp CamR 플레이트 상에 플레이트화하고 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
  2. 성장과 유도
    1. LB Amp CamR 플레이트로부터 R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 형질전환체의 단일, 단리된 콜로니를 10 mL의 LB Amp CamR 배지에 37°C에서 접종한다. 하룻밤 동안 250 rpm (~ 16 h)에서 흔들어주십시오. 각 배양물에서 분취량을 저장하고 원하는 경우 40 % (v / v) 글리세롤 (재료 표 참조) 주식을 준비하십시오.
    2. 하룻밤 배양 당에, 500 mL의 LB Amp CamR 배지를 함유하는 1 L 플라스크를 0.05-0.1의 광학 밀도 (OD600)에서 600 nm (OD600)로 접종한다.
      참고: 이렇게 하면 세포가 대수 성장으로 되돌아갑니다.
    3. OD600은 0.4와 0.6 사이에 떨어질 때까지 일반적으로 3-4 시간 동안 여러 시점에서 측정하십시오.
    4. 유도 전에, 배양물의 분획을 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 ( 물질의 표 참조)에 분취하고, 이를 비유도 분획으로 라벨링한다. 겔 분석을 위해 -80°C에 보관한다. SDS-PAGE 젤을 실행하지 않는 경우 이 단계를 건너뛰고 1.2.5단계로 진행하십시오.
    5. 배양물을 1 M 이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 스톡을 사용하여 1 mM의 최종 농도로 유도하였다 ( 물질의 표 참조). 추가의 3-4 h 동안 37°C 진탕기에서 계속 인큐베이션한다.
      참고: 표현식 중에 리더는 유도 시 최적의 OD600과 IPTG 농도를 결정해야 합니다. 정제 후 수율이 실질적으로 떨어지면, 정제 완충액 중의 이미다졸 농도는 조정이 필요할 수 있거나, 세포 펠릿을 추가로 초음파 처리해야 할 수도 있다.
    6. 배양물을 원심분리하기 전에, 배양물의 분획을 분취하여 초분리기 1.5 mL 마이크로분리 튜브에 넣고 이를 유도 분획으로 라벨링한다. 겔 분석을 위해 -80°C에 보관한다. SDS-PAGE 젤을 실행하지 않는 경우 이 단계를 건너뛰고 1.2.7단계로 진행하십시오.
    7. 세포 배양물을 250 mL 원뿔형 병( 물질 표 참조)에서 최대 속도 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
    8. 배양물이 완전히 펠릿화될 때까지 단계 1.2.7을 반복한다.
      참고: PAUSE: 세포 펠릿은 -80°C에서 동결되고 추가 처리를 위해 나중에 해동될 수 있다. 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고 1.3.1단계로 진행합니다.
  3. 봉입체 추출 및 가용화
    참고: 신선한 10 M 우레아를 하루 전에 준비하고, 완전히 용해 될 때까지 완전히 저어줍니다. 요소나 오토클레이브 요소를 가열하지 마십시오; 실온에서 보관하십시오.
    1. 펠릿을 용해 완충액 (단계 1.2.8로부터)에 재현탁 시킨다 (물질의 표 참조). 펠릿 그램 당 용해 완충액 3mL를 넣고 볼텍싱 또는 피펫팅으로 재현탁하십시오. 4°C에서 하룻밤 동안 진탕한다.
    2. 배양 1 L 당 1.25 mL의 10% (w/v) 소듐 데옥시콜레이트 ( 물질 표 참조)를 첨가한다. 실온에서 150 rpm으로 30분 동안 흔들어 주십시오.
    3. 배양물 1 L 당 10 μL의 DNase I ( 물질 표 참조)를 첨가한다. 실온에서 150 rpm으로 30분 동안 흔들어 주십시오.
    4. 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
    5. 겔 분석을 위해 용해된 MMP 의 분획을 따로 설정한다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 1.3.6 단계로 진행하십시오.
      참고 : 원심 분리 후 펠렛은 끈끈하고 컴팩트하게 포장되지 않아 상층액을 버리는 것이 위험합니다. 이 경우 1.3.6단계를 건너뛰고 1.3.7단계로 진행합니다.
    6. 원심분리된 샘플로부터 상층액을 버린다.
      참고: 프로토콜은 이 시점에서 일시 중지되고 세포 펠릿은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다. 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고 1.3.7단계로 진행합니다.
    7. 펠렛을 100 mL/L 봉입체 완충액 배양물( 재료 표 참조)에 재현탁하여 위아래로 피펫팅합니다.
    8. 초음파 처리 중에는 과열을 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 각 샘플을 15초의 6사이클 동안 초음파 처리하고, 5회 및 50% 펄스를 출력합니다. 사이클 사이의 냉각을 위해 15초의 휴식 기간을 허용하십시오.
      참고: 필요한 경우 추가 원심분리를 위해 샘플을 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
    9. 겔 분석을 위해 초음파 처리된 MMP 의 분획을 따로 떼어놓는다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 1.3.11 단계로 진행하십시오.
    10. 펠릿을 확인하십시오. 문자열이 있는 경우 1.3.8-1.3.10단계를 반복합니다. 펠렛이 콤팩트한 경우, 상청액을 버리고 단계 1.3.12로 진행한다.
      참고: 봉입체 버퍼의 초음파 처리는 용해된 세포 파편으로부터 더 많은 단백질을 회수하기 위해 반복될 수 있습니다. 그러나 너무 많은 초음파 처리는 전단을 일으킬 수 있으며 이는 MMP 수율에 해를 끼칩니다. 프로토콜은 이 단계에서 일시 중지될 수 있고, 세포 펠릿은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다.
    11. 1 L 배양물로부터의 각 펠렛을 5 mL의 가용화 완충액 (표 참조) 에 피펫팅하여 재현탁시킨다. 단백질이 가용화될 수 있도록 얼음 위에서 적어도 30분 동안 인큐베이션한다.
    12. 겔 분석을 위해 가용화된 MMP 의 분획을 따로 설정한다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 1.3.14 단계로 진행하십시오.
    13. 세포를 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 상청액을 버리지 않는다.
    14. 원심분리 후 펠렛이 형성되거나 남아 있으면 상층액을 별도의 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다. 펠렛을 또 다른 5 mL의 가용화 완충액 (배양액 1 L 당)에 재현탁시켜 위아래로 피펫팅한다.
    15. 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 버리지 않는다.
    16. 원심분리 후 펠릿이 약간 또는 전혀 형성되지 않거나 회색 침전물만 남을 때까지 1.3.13 및 1.3.14 단계를 반복한다. 상청액을 풀링하십시오. 펠렛을 폐기하거나 추가 초음파 처리를 위해 -80°C에서 보관하십시오.

2. MMP 정제 및 재접힘

  1. 그의 태그 (HT) 친화성 정제
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 중력 흐름 컬럼 (재료 표 참조)을 잘 혼합 된 Ni-NTA 수지 (재료 표 참조)로 채 웁니다. 수지가 침전되고 저장 버퍼로부터 분리되어 두 층 사이에 별개의 선이 형성되도록하십시오.
      참고: 공기가 수지에 침투하여 단백질 수율을 해칠 수 있으므로 수지가 건조되도록 허용하지 마십시오. 사용 사이에, 섹션 2.2에 기재된 수지 재생 절차를 수행하십시오.
    2. 저장소 버퍼가 드레인되도록 합니다. 컬럼을 HT 평형 버퍼의 두 개의 수지 베드 볼륨으로 채 웁니다.
    3. HT 평형 버퍼를 배수하고 버립니다. 컬럼이 배수되면서, 단백질 추출물을 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하고, 필터-0.22 μm 필터를 사용하여 멸균한다( 표 참조).
    4. 폐기물 용기를 HT Flowthrough라고 표시된 50mL 원뿔형 튜브로 바꿉니다. 제조된 단백질 추출물을 컬럼에 첨가한다.
    5. 흐름선을 다시 적용하여 바인딩을 최대화합니다.
    6. 겔 분석을 위해 Flowthrough 분획의 일부분을 따로 보관하십시오. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 단계 2.1.7로 진행하십시오.
    7. 즉시 수지를 15 mL의 HT 세척 완충액으로 세척 한다(물자의 표 참조). HT 워시로 라벨링된 15 mL 원뿔형 튜브 ( 물질 표 참조)에 유동관을 수집 한다.
      참고: 분광광도측정법을 통해 280nm(A280)의 흡광도 값을 얻었으며 단백질 농도를 추정하기 위해 분자량 및 흡광 계수(ε)와 함께 사용했습니다. 변성된 Hisx6-pro-MMP-3cd의 경우, 분자량은 29.86 kDa이고, ε는 34.38 M-1 cm-1이다.
    8. HT 세척 버퍼에 대한 블랭킹, A280을 측정하고 기록하십시오. 추가 세척 분획으로 단계 2.1.7 및 2.1.8을 반복하십시오. A280이 기준선에 접근하고 불순물이 최소화되면 2.1.9단계로 진행하십시오.
    9. 겔 분석을 위해 세척 분획의 일부분을 따로 보관하십시오. 여러 세척 분수에 대해 반복하십시오. 분획을 -80°C에서 저장한다. 겔 분석을 수행하지 않으면 단계 2.1.10으로 진행하십시오.
    10. 즉시 5 mL의 HT 용출 완충액을 첨가하여 His-tagged 단백질을 용출시킨다( 표 참조). 유동을 HT 용출로 표지된 마이크로퍼지 튜브에서 0.5-1 mL 분획으로서 수집한다.
    11. 겔 분석을 위해 용출 분획의 분율을 따로 두십시오. 여러 용출 분획에 대해 반복하십시오. 분획을 -80°C에서 저장한다. 겔 분석을 수행하지 않으면 단계 2.1.12로 진행하십시오.
    12. A280이 >0.3 mg/mL인 경우, HT 평형 완충액으로 분획을 희석 한다(물자 표 참조).
      참고: 용출된 분획은 투석 중 침전을 방지하기 위해 0.3mg/mL 이하의 A280으로 희석해야 합니다. 상기 프로토콜은 여기서 일시 중지되고 풀링된 분획을 -80°C에서 동결시키고 나중에 해동시킬 수 있다. 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고 2.2.1단계로 진행합니다.
  2. 수지 재생
    1. HT 재생 버퍼 ( 재료 표 참조)의 열 개의 수지 베드 볼륨과 열 개의 수지 베드 부피의 멸균수로 수지를 씻으십시오.
    2. 수지를 50% 슬러리로 물에 20%(v/v) 에탄올에 보관합니다.

3. 단백질 리폴딩

참고: 더 작은 부피의 경우, 투석 카세트는 시료 손실의 위험이 낮은 상태에서 사용할 수 있습니다. 더 많은 양을 사용하는 경우 투석 튜브가 필요합니다 ( 재료 표 참조).

  1. 투 석
    참고 : 투석을위한 최적의 단백질 농도는 ~ 0.3 mg / mL입니다. 투석 중에 상당한 침전이 발생하는 경우, 단계적 투석 방법을 사용하여 각 투석 사이의 요소 농도 구배를 감소시키고 더 많은 중간 단계를 추가합니다 (예를 들어, 6 M 내지 5 M, 그리고 이어서 5 M 내지 4 M, 5 M 단계를 건너 뛰는 것보다는). 동결 해동 사이클은 세포 및 단백질 구조를 손상시키기 때문에 프로토콜의 일시 중지를 최소화하는 것이 중요합니다.
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 용출 분획 샘플의 양에 따라 적절한 양의 투석 튜브를 사용하십시오.
    2. 용출된 MMP 분획을 투석 튜브 중의 1 L의 투석 완충액 1에 잠입 시킨다(표 참조). 튜빙 및 그의 내용물을 4°C에서 8 h 이상 자석 교반기 상에서 교반한다.
    3. 투석 완충액 2 1 L로 옮긴다( 표 참조). 튜빙 및 그의 내용물을 4°C에서 8 h 이상 자석 교반기 상에서 교반한다.
    4. 투석 완충액 3 1 L로 옮긴다( 재료 표 참조). 튜빙 및 그의 내용물을 4°C에서 8 h 이상 자석 교반기 상에서 교반한다.
    5. 샘플을 새로운 50 mL 코니컬 튜브로 옮기고 투석된 MMP로 라벨링합니다.
    6. 튜브에 침전물이 있는지 검사하십시오. 침전물이 형성된 경우, 샘플을 13,000 × g 및 4°C에서 1분 동안 원심분리한다.
    7. 상청액을 새로운 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 리폴딩된 MMP로 라벨링한다.
    8. 겔 분석을 위해 분수를 따로 놓고 리폴딩된 MMP로 라벨링하십시오. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 3.1.9 단계로 진행하십시오.
      참고: 수율이 낮으면, 침전물을 HT 평형 완충액에 용해시킬 수 있고, 섹션 3.1의 단계를 투석 튜브로 반복할 수 있다. 겔 분석을 수행하지 않거나 프로토콜이 여기에서 일시 중지되어야하는 경우 -80 °C에서 샘플을 동결시키고 나중에 해동하십시오. 수율이 원하는 범위에 있으면 3.2.1단계로 진행하십시오.
  2. 재집중
    참고: 재접히고 변성된 Hisx6-pro-MMP-3cd에 대한 소멸 계수는 동일할 것으로 예상된다; 따라서 A280 계산은 영향을 받지 않습니다.
    1. 샘플을 최대 0.5 mg/mL까지 재농축합니다. 400 mL 교반 셀( 표 참조)을 사용하여 샘플을 15 mL로 농축하였다. 거품을 방지하려면 필요한 경우 50mL 재농축 튜브를 사용하여 추가로 농축하십시오.
      참고: 침전물이 형성되면, HT 평형 완충액에 펠릿화되고 용해될 수 있다. 그런 다음 섹션 3.1과 3.2.1단계를 반복합니다. 그렇지 않으면 3.2.2단계를 계속 진행하십시오.
    2. 겔 분석을 위해 분획을 따로 놓고 농축 MMP로 라벨링하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 샘플은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다.

4. 활성화

  1. 4- 아미노페닐 수은 아세테이트 (APMA) 활성화
    참고: APMA는 독성이 강합니다. 활성화하기 전에 20 mM APMA의 신선한 원액을 만들고 APMA를 사용할 때 항상 흄 후드 아래에서 작업하십시오. APMA 폐기물을 컨테이너에 버리십시오.
    1. MMP (1 mg/mL)의 1 mL 분취량당 50 μL의 20 mM APMA ( 물질 표 참조)를 첨가하여 1 mM의 최종 APMA 농도에 도달한다. 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
    2. 침전물이 형성되면, 이를 4°C에서 10분 동안 최대 속도로 원심분리한다. 상청액을 활성화된 MMP로 표지된 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에 보관한다. 침전물을 APMA 폐기물로 표시된 용기에 버리십시오.
    3. 겔 분석을 위해 분획을 따로 놓고 활성화된 MMP라고 라벨링한다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 샘플은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다. 겔 분석을 수행하지 않으면 4.2.1 단계로 진행하십시오. 활성화 후, MMP-3cd의 분자량 및 흡광 계수는 각각 19.40 kDa 및 28.42 M-1 cm-1이다.
  2. 탈염
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 2 mL 탈염 컬럼( 재료 표 참조)으로 활성화된 MMP-3cd 샘플에서 APMA를 제거합니다.
    2. 겔 분석을 위해 분획을 따 로 놓고 탈염 MMP에 라벨을 붙입니다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 나머지 샘플과 함께 섹션 4.3으로 진행하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 샘플은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다.
  3. SDS-PAGE 젤 실행
    1. SDS-PAGE 겔에서 모든 단백질 분획을 실행: 비유도 분획, 유도 분획, 용해된 MMP, 초음파 처리된 MMP, 가용화된 MMP, 플로스루 분획, 세척 분획, 용출 분획, 리폴딩된 MMP, 농축된 MMP, 활성화된 MMP 및 탈염된 MMP.
  4. MMP-3의 장기 저장
    1. 탈염된 MMP-3cd 샘플에 0.05%(v/v) 비이온성 계면활성제( 표 참조)를 첨가하고 -80°C에 보관한다.

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결과

SDS-PAGE에서 샘플을 실행할 때, 단백질이 불용성 봉입체의 형태로 발현되기 때문에, 용해 및 초음파 처리된 분획은 단백질이 아직 요소에서 재용해되지 않았기 때문에 Hisx6-pro-MMP-3cd 추출물을 거의 또는 전혀 함유하지 않아야 한다. 도 3 은 BL21(DE3) 세포 및 R2DP 세포로부터의 Hisx6-pro-MMP-3cd의 His-태그 정제 용출 분획을 비교한다. 용출 분획은 투석 전에 BL21(DE3) 및 R2DP 세포 둘 다에 대해 개별적으로 풀링되었다. 각 단계로부터의 분획은 단백질이 탈염된 후에 실행되었다(도 4). 모든 Hisx6-pro-MMP-3cd 샘플은 대략 30 kDa에서 밴드를 표시하고, 활성 MMP-3cd는 His-태그 및 프로 도메인의 제거시 대략 20 kDa에서 밴드를 표시한다(도 4 및 보충 도 S1...

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토론

가용성, 인간, 재조합 MMP의 대규모 생산은 여전히 어려운 과제입니다. 포유동물 세포는 높은 비용과 긴 대기 시간으로 기능적 MMP를 발현할 수 있는 반면, 대장균은 정제되고 재접혀져야 하는 다량의 MMP 봉입체를 빠르게 생산한다11,16. R2DP 세포는 MMP 봉입체의 수율을 상당히 증가시켜, 보다 비용 효율적이고 생산적인 MMP 리폴딩 공정을 가능하게 한다. 그러나 대장균은 MMP를 접는 데 필요한 번역 후 기계가 부족하며, 조작된 균주가 크게 향상된 발현 수준을 보여 주지만, 변성제 제거시 일부 중간체 만 적절하게 접힙니다4. 결과적으로, MMPs의 가끔 침전은 리폴딩 및 활성화 동안 여전히 예상된다. 이들 결과는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd 수율의 상당 부분이 재폴딩, 활성화 및 탈염 후에 손실된다는 것을 보여준다.

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공개 사항

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

저자들은 플로리다 주 잭슨빌의 메이요 클리닉에서 에베트 라디스키 박사와 알렉산드라 호클라 박사가 Hisx6pro-MMP-3cd 유전자를 복제하기 위한 주형으로 pET-3a-pro-MMP-3cd 플라스미드를 제공한 것에 대해 인정하고 싶고, 그들의 의견은 리노의 네바다 대학의 네바다 유전체학 센터의 폴 하틀리 박사와 함께 DNA 시퀀싱을 위해 제시하고 싶다. 저자는 또한 단백질 발현의 일부를 도와 준 카산드라 헤르겐라더에게 감사하고 싶습니다. M.R.-S. NIH-P20 GM103650-COBRE 통합 신경 과학 보조금과 UNR R & D mICRO SEED Grant Award에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 멸균 필터Sigma AldrichSLGP033RS정제 전에 단백질 추출물에서 일부 오염 물질을 제거하고 Ni-NTA 컬럼이 막히는 것을 방지하는 데 사용됩니다
1L 삼각 플라스크Thermo Fisher ScientificS76106Fn/a
1L 유리병Thermo Fisher Scientific06-414-1Dn/a
1.5mL 마이크로퓨지 튜브Thermo Fisher Scientific02-682-002해당 없음
15 mL 코니컬 튜브Thermo Fisher Scientific339650n/a
18 G, 1-in. beveled needleAmazonB07S7VBHM2투석 케이스
2 mL 탈염 컬럼Thermo Fisher Scientific89890활성화 후 APMA 제거
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Thermo Fisher ScientificAAA1610422n/a
250mL 원뿔형 병 쿠션Thermo Fisher Scientific05-538-53A대용량 원심분리 시 원뿔형 병 안정화
250mL 원뿔형 병Thermo Fisher Scientific05-538-53n/a
400mL 교반 셀Sigma AldrichUFSC40001원심 필터 장치보다 훨씬 더 많은 부피를 다시 농축합니다. Rosetta2(DE3)pLysS 세포는 원심 필터 장치
4-아미노페닐머큐어 아세테이트(APMA)Sigma AldrichA9563-5G프로펩타이드 5mL 주사기를 절단하여 MMP-3 활성화
Thermo Fisher ScientificNC0829167투석 케이스
50mL 코니컬 튜브Thermo Fisher Scientific339650다양한 정제 단계에서 보관에 사용
50mL 재농축 튜브Sigma AldrichUFC901024D투석 후 단백질 시료를 재농축하거나 오염 물질을 제거하는 데 사용
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-500냉각 시 오토클레이브 LB 매체를 응고시키는 완충액
성분 AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25pET3a 벡터와 함께 사용되는 항생제; 100 µ에서 사용; g/mL in LB media
BamHINEBR3136SpET3a 벡터와 함께 사용되는 제한 효소
염화칼슘(CaCl2)Thermo Fisher Scientific600-30-23칼슘 이온은 MMP 구조를 안정화합니다
세포 스프레더Thermo Fisher Scientific50-189-7544형질전환 후 페트리 접시를 가로질러 세포를 퍼뜨리는 데 사용할 수 있습니다.
ChloramphenicolThermo Fisher Scientific22-055-125GMpET3a 벡터와 함께 사용되는 항생제; 34 µ에서 사용; LB 매체
투석 완충액 1n / a/ a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µ M ZnCl2, 4M 요소.
투석 버퍼 2n / a/ a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µ M ZnCl2, 2M 요소.
투석 버퍼 3n / a/ a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µ M ZnCl2입니다.
투석 클립Thermo Fisher Scientific68011뱀 피부 투석 튜빙과 함께 사용
튜빙Thermo Fisher Scientific88243훨씬 더 많은 시료를 보유하지만 샘플 손실 위험이 더 높은 대체 투석 방법
분해 버퍼NEBB7204SpET3a 벡터
일회용 큐벳Thermo Fisher Scientific21-200-257성장 및 발현 중 박테리아 배양 OD를 측정하는 데 사용됨
디티오트레이톨(DTT)Thermo Fisher ScientificD107125G이황화 결합을 줄여 단백질 변성 지원
DNA 어셈블리 믹스NEBE2621SHisx6-pro-MMP-3cd PCR 산물 및 분해된 pET3a 벡터
DNase INEBM0303S를 접합하는 데 사용됨나중에 단백질 정제에 영향을 미칠 수 있는 바람직하지 않은 DNA 오염 물질을 분해하기 위한 엔도뉴클레아제
EthanolThermo Fisher ScientificA995-4n/a
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)Thermo Fisher ScientificJ15694-AE변성에 사용됩니다. 이황화 결합의 산화 및 후속 형성을 방지합니다
겔 회수 키트PromegaA9281아가로스 겔에서 DNA를 분리 및 정제합니다
글리세롤Thermo Fisher ScientificG33-500-80 °에서 동결된 글리세롤 스톡을 만드는 데 사용됩니다. C
중력 플로우 컬럼BioRad7321010재조합 His-태그 단백질의 Ni-NTA 정제에 사용됨
고형질전환 효율 셀NEBC2987N-말단 His-태그를 pET3a-pro-MMP-3cd 구조로 클로닝할 수 있는 성공 가능성이 더 높은 고형질전환 효율 셀
HT 용리 버퍼n/an/a20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M 요소, 250 mM 이미다졸. pH를 7.4
HT 평형 버퍼n/an/a20mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 6M 요소로 조정합니다. pH를 7.4
HT 재생 완충액n/an/a20 mM MES, 0.1 M NaCl로 조정합니다. pH를 5.0
HT 세척 버퍼n/a/a20mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 6M 요소, 25mM 이미다졸로 조정합니다. pH를 7.4로 조정
염산(HCl)Thermo Fisher ScientificA144C-212pH 완충에 사용
Thermo Fisher ScientificAAA1022122히스티딘 측기를 모방합니다. 그의 태그가 지정된 표적 단백질
포함 바디 버퍼n/a/a20mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl, 5mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5M 요소에서 비특이적으로 결합 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. pH를 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher ScientificFERR0392pET3a에서 표적 유전자 발현을 유도하는 시약입니다. 0.5 mL 1 M 분취액을 만들고, 필터는 멸균 및 -20 °C에서 보관합니다. C
LB Amp CamR 미디어해당 없음1L 병 또는 1L 플라스크에 붓습니다. 1L의 경우 LB 육수 25g을 추가합니다. 오토클레이빙으로 살균하십시오. 일단 50 ° 이하로 냉각되면; C, 100 µ에 암피실린을 추가하십시오. g/mL 및 클로람페니콜을 34 &마이크로로; g/mL
LB Amp CamR 플레이트n/a없음멸균 페트리 접시에 붓습니다. 페트리 접시 뚜껑이 완전히 덮일 때까지 붓습니다. 1L의 매체는 40-60개의 플레이트를 생성합니다. 1L: LB 육수 25g, 한천 16g. 오토클레이빙으로 살균하십시오. 일단 50 ° 이하로 냉각되면; C, 100 µ에 암피실린을 추가하십시오. g/mL 및 클로람페니콜을 34 &마이크로로; g/mL
LB 육수Thermo Fisher ScientificBP1426-2트립톤, 효모 추출물 및 염화나트륨과 사전 혼합
용해 버퍼n/a/a50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.133g/mL 라이소자임, 0.49% v/v Triton X-100. pH를 8.0으로 조정
라이소자임MP Biomedicals195303단백질 추출에 사용됩니다. 박테리아 세포벽을 용해하는 효소
Miniprep kitPromegaA1330pET3a-pro-MMP-3cd 구조체
를
Thermo Fisher ScientificPI88221재조합 his 태그가 지정된 단백질을 결합하는 데 사용됩니다. 이러한 강력한 상호 작용은 MMP 응집을 방지하기 위해 더 높은 농도의 이미다졸
비이온 계면활성제인 Thermo Fisher ScientificPI28316. 촉매 활성을 방해하지 않고 MMP 표면의 소수성 잔류물과 물 분자 간의 상호 작용을 최소화합니다.
PCR mixNEBM0492SPET-3a-pro-MMP-3cd 벡터 pET 플라스미드에 N-말단 his-tag를 삽입하기 위한 PCR 시약
Addgene n/apET3a 벡터는 암피실린 저항성, 표적 유전자의 유도성 발현 및 T7 프라이머로 염기서열분석을 제공합니다
Petri dish VWR25384-342에 형질전환체를 도금하는 데 사용됩니다
714033진핵 단백질의 발현이 향상된 BL21 유도체. 대장균에서 희귀한 것으로 밝혀진 코돈의 tRNA 함유
SOC 성장 배지NEBB9020S형질전환 중 빠른 성장을 위한 비선택적 성장 배지
염화나트륨(NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1완충액에 사용되며 단백질 안정성에 도움
데옥시콜산나트륨Thermo Fisher ScientificPI89905단백질 추출에 사용되는 세제. 용해 세포
가용화 완충액n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. pH를 8.0
Tris baseThermo Fisher ScientificBP152-1생리학적 pH 범위에서 사용되는 공통 완충액. 세포
용해에 사용되는Triton X-100Thermo Fisher ScientificM1122980101
세제 요소 ThermoFisher ScientificAAJ75826A7단백질 2차 구조 파괴를 위한 최초의 카오트로픽제
염화아연(ZnCl2)Thermo Fisher ScientificAAA162810EMMP 구조를 안정화합니다. 아연 이온은 MMP-3의 촉매 부위에서 발견
과 함께 사용 의 15mL 한도를 초과할 수 있는 단백질을 대량으로 생성합니다. 와 함께 사용 n n n 투석 분해에 사용되는 버퍼 n 이미다졸 는 n로 조정 해당 n하십시오. 성공할 경우, pET3a 벡터 Ni-NTA 수지와 함께 사용할 형질전환체 NdeI NEB R0111S Restriction enzyme에서 추출합니다 Storage detergent로 대체될 수 있습니다 LB 한천 배지 R2DP 세포 Novagen.벽 로 조정 온도에 민감한인 됩니다.

참고문헌

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