방법 논문

박테리아 발현 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 정제

DOI:

10.3791/63263

⸱

2022년 3월 30일

 ,  , 
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그의 태그 정제, 투석 및 활성화는 박테리아에서 가용성, 활성 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인 단백질 발현의 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 단백질 분획은 SDS-PAGE 겔을 통해 분석된다.

초록

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매트릭스 메탈로프로테이나제(MMPs)는 세포외 매트릭스(ECM) 분해 및 리모델링에서 중심적인 역할을 하는 메친신 프로테아제 패밀리에 속하며, 여러 성장 인자 및 사이토카인과의 상호작용에 속한다. 특정 MMPs의 과발현은 암, 신경 퇴행성 질환 및 심혈관 질환과 같은 여러 질병에 책임이 있다. MMPs는 MMP 과발현과 상관관계가 있는 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위한 표적으로서 최근 주목의 중심이 되고 있다.

용액 중의 MMP 메카니즘을 연구하기 위해, 활성, 가용성 MMPs의 생산을 위해 보다 용이하고 강력한 재조합 단백질 발현 및 정제 방법이 필요하다. 그러나, 대부분의 MMPs의 촉매 도메인은 번역 후 기계의 부족으로 인해 가용성 형태로 에스케리치아 콜라 이 (E. coli)에서 발현될 수 없는 반면, 포유동물 발현 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 수율이 낮다. MMP 봉입체는 광범위한 정제 및 재폴딩의 지루하고 힘든 과정을 거쳐야하며, 천연 입체 형태에서 MMP의 수율을 현저하게 감소시켜야합니다. 이 논문은 로제타2(DE3)pLysS(이하 R2DP로 지칭됨) 세포를 사용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인(MMP-3cd)을 생산하는 프로토콜을 제시하며, 이는 친화성 정제에 사용하기 위한 N 말단 His-태그에 이어 프로도메인(Hisx6-pro-MMP-3cd)을 함유한다. R2DP 세포는 박테리아 발현 시스템에서 일반적으로 희귀한 코돈을 함유하는 클로람페니콜 내성 플라스미드를 통해 진핵 단백질의 발현을 향상시킨다. 재조합 단백질 발현을 위해 선택된 전통적인 세포주 BL21(DE3)과 비교하여, 이 새로운 균주를 이용한 정제는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd의 수율을 향상시켰다. 활성화 및 탈염시, 프로 도메인은 N 말단 His-태그와 함께 절단되어, 무수한 시험관내 적용에서 즉시 사용하기 위한 활성 MMP-3cd를 제공한다. 이 방법은 고가의 장비나 복잡한 융합 단백질을 필요로 하지 않으며, 박테리아에서 재조합 인간 MMPs의 신속한 생산을 기술한다.

서론

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대부분의 복잡한 진핵 단백질은 발현 후 정교한 번역 후 변형을 거치며, 고도로 보조된 단백질 폴딩 및 보조 인자가 기능적이어야 합니다1. 박테리아 숙주에서 다량의 가용성 인간 단백질을 생산하는 것은 소규모 실험실 실험에서도 높은 비용과 강력한 발현 및 정제 방법의 부족으로 인해 중요한 과제로 남아 있습니다2,3. MMPs, 큰 분자량을 가진 인간 endopeptidases는 일반적으로 대장균 에서 발현될 때 불용성 봉입체로서 발현된다. 가용성 인간 MMP의 추출은 종종 힘들고 시간이 많이 걸리는 가용화 및 재접힘 공정4으로 이어진다.

MMP는 생리적 및 병원성 과정 모두에서 중요한 역할을 한다. 인간 MMPs는 구조 및 기질 특이성에 의해 분류되고, 고도로 보존된 촉매 도메인5,6에도 불구하고 차등적으로 발현되는 23개의 아연 엔도펩티다제의 패밀리이다. MMPs는 비활성 효소원으로서 분비되고, 번역 후 활성화 및 이들의 내인성 억제제....

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프로토콜

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1. MMP 발현

  1. pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd를 R2DP 세포로의 클로닝 및 형질전환
    1. pET-3a 플라스미드 (물질의 표 참조)를 다이제스트 버퍼에서 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 소화한다 (물질의 표 참조). 총 반응 부피 40μL에 다이제스트 버퍼 4μL, 100ng/μL 플라스미드 33μL 및 각 제한 효소 1.5μL를 첨가하고 37°C에서 완료될 때까지 ~2시간 동안 반응을 진행시킨다.
    2. MMP-3cd 서열에 대해 PCR 반응을 수행하여 N 말단 His-tag를 삽입한다. 25μL의 PCR 믹스( 물질 표 참조), 2.5μL의 10μM 프라이머(보충 그림 S1) 및 100ng/μL 삽입 서열 1.25μL를 사용합니다. 멸균수를 50 μL의 최종 반응 부피에 첨가한다.
    3. PCR 산물을 실행하고 1% 아가로스 겔 상에서 벡터를 소화시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 젤 회수 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 젤 밴드를 정제합니다.
    4. 증폭된 PCR 산물을 DNA 어셈블리 믹스를 사용하여 NdeI 및 Bam....

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결과

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SDS-PAGE에서 샘플을 실행할 때, 단백질이 불용성 봉입체의 형태로 발현되기 때문에, 용해 및 초음파 처리된 분획은 단백질이 아직 요소에서 재용해되지 않았기 때문에 Hisx6-pro-MMP-3cd 추출물을 거의 또는 전혀 함유하지 않아야 한다. 도 3 은 BL21(DE3) 세포 및 R2DP 세포로부터의 Hisx6-pro-MMP-3cd의 His-태그 정제 용출 분획을 비교한다. 용출 분획은 투석 전에 BL21(DE3) 및 R2DP 세포 둘 다에 대해 개별적으로 풀링되었다. 각 단계로부터의 분획은 단백질이 탈염된 후에 실행되었다(도 4). 모든 Hisx6-pro-MMP-3cd 샘플은 대략 30 kDa에서 밴드를 표시하고, 활성 MMP-3cd는 His-태그 및 프로 도메인의 제거시 대략 20 kDa에서 밴드를 표시한다(도 4 및 보충 도 S1.......

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토론

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가용성, 인간, 재조합 MMP의 대규모 생산은 여전히 어려운 과제입니다. 포유동물 세포는 높은 비용과 긴 대기 시간으로 기능적 MMP를 발현할 수 있는 반면, 대장균은 정제되고 재접혀져야 하는 다량의 MMP 봉입체를 빠르게 생산한다11,16. R2DP 세포는 MMP 봉입체의 수율을 상당히 증가시켜, 보다 비용 효율적이고 생산적인 MMP 리폴딩 공정을 가능하게 한다. 그러나 대장균은 MMP를 접는 데 필요한 번역 후 기계가 부족하며, 조작된 균주가 크게 향상된 발현 수준을 보여 주지만, 변성제 제거시 일부 중간체 만 적절하게 접힙니다4. 결과적으로, MMPs의 가끔 침전은 리폴딩 및 활성화 동안 여전히 예상된다. 이들 결과는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd 수율의 상당 부분이 재폴딩, 활성화 및 탈염 후에 손실된다는 것을 보여준다.

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공개 사항

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저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 플로리다 주 잭슨빌의 메이요 클리닉에서 에베트 라디스키 박사와 알렉산드라 호클라 박사가 Hisx6pro-MMP-3cd 유전자를 복제하기 위한 주형으로 pET-3a-pro-MMP-3cd 플라스미드를 제공한 것에 대해 인정하고 싶고, 그들의 의견은 리노의 네바다 대학의 네바다 유전체학 센터의 폴 하틀리 박사와 함께 DNA 시퀀싱을 위해 제시하고 싶다. 저자는 또한 단백질 발현의 일부를 도와 준 카산드라 헤르겐라더에게 감사하고 싶습니다. M.R.-S. NIH-P20 GM103650-COBRE 통합 신경 과학 보조금과 UNR R & D mICRO SEED Grant Award에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 멸균 필터Sigma AldrichSLGP033RS정제 전에 단백질 추출물에서 일부 오염 물질을 제거하고 Ni-NTA 컬럼이 막히는 것을 방지하는 데 사용됩니다
1L 삼각 플라스크Thermo Fisher ScientificS76106Fn/a
1L 유리병Thermo Fisher Scientific06-414-1Dn/a
1.5mL 마이크로퓨지 튜브Thermo Fisher Scientific02-682-002해당 없음
15 mL 코니컬 튜브Thermo Fisher Scientific339650n/a
18 G, 1-in. beveled needleAmazonB07S7VBHM2투석 케이스
2 mL 탈염 컬럼Thermo Fisher Scientific89890활성화 후 APMA 제거
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Thermo Fisher ScientificAAA1610422n/a
250mL 원뿔형 병 쿠션Thermo Fisher Scientific05-538-53A대용량 원심분리 시 원뿔형 병 안정화
250mL 원뿔형 병Thermo Fisher Scientific05-538-53n/a
400mL 교반 셀Sigma AldrichUFSC40001원심 필터 장치보다 훨씬 더 많은 부피를 다시 농축합니다. Rosetta2(DE3)pLysS 세포는 원심 필터 장치
4-아미노페닐머큐어 아세테이트(APMA)Sigma AldrichA9563-5G프로펩타이드 5mL 주사기를 절단하여 MMP-3 활성화
Thermo Fisher ScientificNC0829167투석 케이스
50mL 코니컬 튜브Thermo Fisher Scientific339650다양한 정제 단계에서 보관에 사용
50mL 재농축 튜브Sigma AldrichUFC901024D투석 후 단백질 시료를 재농축하거나 오염 물질을 제거하는 데 사용
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-500냉각 시 오토클레이브 LB 매체를 응고시키는 완충액
성분 AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25pET3a 벡터와 함께 사용되는 항생제; 100 µ에서 사용; g/mL in LB media
BamHINEBR3136SpET3a 벡터와 함께 사용되는 제한 효소
염화칼슘(CaCl2)Thermo Fisher Scientific600-30-23칼슘 이온은 MMP 구조를 안정화합니다
세포 스프레더Thermo Fisher Scientific50-189-7544형질전환 후 페트리 접시를 가로질러 세포를 퍼뜨리는 데 사용할 수 있습니다.
ChloramphenicolThermo Fisher Scientific22-055-125GMpET3a 벡터와 함께 사용되는 항생제; 34 µ에서 사용; LB 매체
투석 완충액 1n / a/ a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µ M ZnCl2, 4M 요소.
투석 버퍼 2n / a/ a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µ M ZnCl2, 2M 요소.
투석 버퍼 3n / a/ a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µ M ZnCl2입니다.
투석 클립Thermo Fisher Scientific68011뱀 피부 투석 튜빙과 함께 사용
튜빙Thermo Fisher Scientific88243훨씬 더 많은 시료를 보유하지만 샘플 손실 위험이 더 높은 대체 투석 방법
분해 버퍼NEBB7204SpET3a 벡터
일회용 큐벳Thermo Fisher Scientific21-200-257성장 및 발현 중 박테리아 배양 OD를 측정하는 데 사용됨
디티오트레이톨(DTT)Thermo Fisher ScientificD107125G이황화 결합을 줄여 단백질 변성 지원
DNA 어셈블리 믹스NEBE2621SHisx6-pro-MMP-3cd PCR 산물 및 분해된 pET3a 벡터
DNase INEBM0303S를 접합하는 데 사용됨나중에 단백질 정제에 영향을 미칠 수 있는 바람직하지 않은 DNA 오염 물질을 분해하기 위한 엔도뉴클레아제
EthanolThermo Fisher ScientificA995-4n/a
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)Thermo Fisher ScientificJ15694-AE변성에 사용됩니다. 이황화 결합의 산화 및 후속 형성을 방지합니다
겔 회수 키트PromegaA9281아가로스 겔에서 DNA를 분리 및 정제합니다
글리세롤Thermo Fisher ScientificG33-500-80 °에서 동결된 글리세롤 스톡을 만드는 데 사용됩니다. C
중력 플로우 컬럼BioRad7321010재조합 His-태그 단백질의 Ni-NTA 정제에 사용됨
고형질전환 효율 셀NEBC2987N-말단 His-태그를 pET3a-pro-MMP-3cd 구조로 클로닝할 수 있는 성공 가능성이 더 높은 고형질전환 효율 셀
HT 용리 버퍼n/an/a20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M 요소, 250 mM 이미다졸. pH를 7.4
HT 평형 버퍼n/an/a20mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 6M 요소로 조정합니다. pH를 7.4
HT 재생 완충액n/an/a20 mM MES, 0.1 M NaCl로 조정합니다. pH를 5.0
HT 세척 버퍼n/a/a20mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 6M 요소, 25mM 이미다졸로 조정합니다. pH를 7.4로 조정
염산(HCl)Thermo Fisher ScientificA144C-212pH 완충에 사용
Thermo Fisher ScientificAAA1022122히스티딘 측기를 모방합니다. 그의 태그가 지정된 표적 단백질
포함 바디 버퍼n/a/a20mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl, 5mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5M 요소에서 비특이적으로 결합 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. pH를 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher ScientificFERR0392pET3a에서 표적 유전자 발현을 유도하는 시약입니다. 0.5 mL 1 M 분취액을 만들고, 필터는 멸균 및 -20 °C에서 보관합니다. C
LB Amp CamR 미디어해당 없음1L 병 또는 1L 플라스크에 붓습니다. 1L의 경우 LB 육수 25g을 추가합니다. 오토클레이빙으로 살균하십시오. 일단 50 ° 이하로 냉각되면; C, 100 µ에 암피실린을 추가하십시오. g/mL 및 클로람페니콜을 34 &마이크로로; g/mL
LB Amp CamR 플레이트n/a없음멸균 페트리 접시에 붓습니다. 페트리 접시 뚜껑이 완전히 덮일 때까지 붓습니다. 1L의 매체는 40-60개의 플레이트를 생성합니다. 1L: LB 육수 25g, 한천 16g. 오토클레이빙으로 살균하십시오. 일단 50 ° 이하로 냉각되면; C, 100 µ에 암피실린을 추가하십시오. g/mL 및 클로람페니콜을 34 &마이크로로; g/mL
LB 육수Thermo Fisher ScientificBP1426-2트립톤, 효모 추출물 및 염화나트륨과 사전 혼합
용해 버퍼n/a/a50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.133g/mL 라이소자임, 0.49% v/v Triton X-100. pH를 8.0으로 조정
라이소자임MP Biomedicals195303단백질 추출에 사용됩니다. 박테리아 세포벽을 용해하는 효소
Miniprep kitPromegaA1330pET3a-pro-MMP-3cd 구조체
를
Thermo Fisher ScientificPI88221재조합 his 태그가 지정된 단백질을 결합하는 데 사용됩니다. 이러한 강력한 상호 작용은 MMP 응집을 방지하기 위해 더 높은 농도의 이미다졸
비이온 계면활성제인 Thermo Fisher ScientificPI28316. 촉매 활성을 방해하지 않고 MMP 표면의 소수성 잔류물과 물 분자 간의 상호 작용을 최소화합니다.
PCR mixNEBM0492SPET-3a-pro-MMP-3cd 벡터 pET 플라스미드에 N-말단 his-tag를 삽입하기 위한 PCR 시약
Addgene n/apET3a 벡터는 암피실린 저항성, 표적 유전자의 유도성 발현 및 T7 프라이머로 염기서열분석을 제공합니다
Petri dish VWR25384-342에 형질전환체를 도금하는 데 사용됩니다
714033진핵 단백질의 발현이 향상된 BL21 유도체. 대장균에서 희귀한 것으로 밝혀진 코돈의 tRNA 함유
SOC 성장 배지NEBB9020S형질전환 중 빠른 성장을 위한 비선택적 성장 배지
염화나트륨(NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1완충액에 사용되며 단백질 안정성에 도움
데옥시콜산나트륨Thermo Fisher ScientificPI89905단백질 추출에 사용되는 세제. 용해 세포
가용화 완충액n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. pH를 8.0
Tris baseThermo Fisher ScientificBP152-1생리학적 pH 범위에서 사용되는 공통 완충액. 세포
용해에 사용되는Triton X-100Thermo Fisher ScientificM1122980101
세제 요소 ThermoFisher ScientificAAJ75826A7단백질 2차 구조 파괴를 위한 최초의 카오트로픽제
염화아연(ZnCl2)Thermo Fisher ScientificAAA162810EMMP 구조를 안정화합니다. 아연 이온은 MMP-3의 촉매 부위에서 발견
과 함께 사용 의 15mL 한도를 초과할 수 있는 단백질을 대량으로 생성합니다. 와 함께 사용 n n n 투석 분해에 사용되는 버퍼 n 이미다졸 는 n로 조정 해당 n하십시오. 성공할 경우, pET3a 벡터 Ni-NTA 수지와 함께 사용할 형질전환체 NdeI NEB R0111S Restriction enzyme에서 추출합니다 Storage detergent로 대체될 수 있습니다 LB 한천 배지 R2DP 세포 Novagen.벽 로 조정 온도에 민감한인 됩니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).
  2. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A.

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E ColiHis TagSDS PAGER2DP

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