마우스의 말단 H-반사 측정

생리학자 Paul Hoffmann의 이름을 딴 Hoffmann 반사(H-반사)는 동일한 근육에서 발생하고 동일한 근육으로 이어지는 감각 및 운동 뉴런의 축삭을 운반하는 말초 신경의 전기 자극에 의해 유발될 수 있습니다. 이것은 단시냅스 스트레치 반사의 전기적으로 유도된 유사체이며 동일한 경로¹을 공유합니다. 근육 스트레칭과 달리 H-반사는 전기 자극으로 인해 발생합니다. 말초 신경이 낮은 전류 강도에서 전기적으로 자극될 때, Ia 구심성 섬유는 일반적으로 큰 축삭 직경²로 인해 먼저 탈분극됩니다. 이들의 활동 전위는 척수의 알파 운동 뉴런(αMN)을 자극하고, 이는 차례로 αMN 축삭을 따라 근육으로 이동하는 활동 전위를 유도합니다(그림 1). 이 캐스케이드는 소위 H-파에 반영된 작은 진폭으로 근육 반응을 생성합니다. 자극 강도를 점진적으로 증가시킴으로써, H- 파의 진폭은 추가 운동 유닛의 모집으로 인해 증가한다. 특정 자극 강도에서 αMN의 더 얇은 축삭의 활동 전위가 직접 유도되며, 이는 M파로 기록됩니다. 이 M파는 H파보다 대기 시간이 짧습니다(그림 2). 자극 강도가 더 증가하면 더 많은 αMN 축삭의 모집으로 인해 M파의 진폭이 커지는 반면 H파는 점차 작아집니다. H-파는 αMN 축삭에서 활동 전위의 항드로믹 역전파로 인해 높은 자극 강도에서 억제될 수 있습니다. 이러한 유발 된 활동 전위는 Ia 자극의 활동 전위와 충돌하여 서로를 상쇄 할 수 있습니다. 극대 자극 강도에서 orthodromic(근육을 향한) 및 antidromic(척수를 향한) 활동 전위는 모든 MN 축삭에서 발생합니다. 전자는 최대 M-파 진폭(Mmax)을 발생시키는 반면, 후자는 H-반사³을 완전히 폐지합니다.

뇌졸중 후 경직(PSS) 또는 척수 손상(SCI)의 평가를 위해 H-반사를 사용하여 인간의 운동 및 경직의 신경 기초를 평가했습니다¹. 측정 사이와 피험자 사이의 H-반사 변화에 대한 개선된 정량화는 H-파와 M-파의 비율(H/M 비율)을 사용하여 달성됩니다. 대안적으로, 속도 의존적 우울증(RDD)은 일련의 상승 주파수(예를 들어, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0Hz)를 사용하여 측정된다. RDD는 뇌졸중 또는 SCI에 의해 방해받을 수 있는 억제 회로의 무결성을 반영합니다. 모든 신경 회로가 손상되지 않으면 H- 반사가 균일하고 주파수에 관계없이 억제됩니다. 그러나 뇌졸중이나 SCI의 결과로 신경 억제가 감소하면 자극 빈도가 증가함에 따라 H 반사의 억제가 감소한다⁴.

표면 전극을 이용한 정확한 전기생리학적 기록은 어려울 수 있으며, 운동 작업, 억제 메커니즘 및 αMN 흥분성의 영향을 받을 수 있다⁵. 설치류의 경피적 기록에서 자극 전극은 경골 신경 근처에 배치되고 기록 전극은 앞발의 관련 근육 근처에 배치됩니다. 그러나 우리의 경험에 따르면 경피적 전극의 올바른 배치(그림 1A)는 인간의 표면 전극 배치보다 설치류에서 훨씬 더 복잡하고 가변적입니다. 이것은 H-반사를 이끌어내는 데 필요한 길이, 빈도 및 자극 강도의 차이로 이어질 수 있습니다. 이러한 방법론적 도전은 왜 매우 제한된 수의 H-반사 측정 연구(예: 실험 뇌졸중 모델 ^3,4 및 기타 경직 모델⁶)만 있는지 설명할 수 있습니다. 개별 신경에 대한 H-반사의 정확한 (장기) 자극 및 기록은 원칙적으로 표적 신경을 둘러싸고 있는 이식 가능한 전극을 사용하여 달성될 수 있습니다^(7,8). 동물에 대한 잠재적인 부작용과 프로브의 잠재적인 불안정성이 있는 까다로운 수술로 인해 이 접근 방식은 현장에서 표준이 되지 못했습니다. 여기에 제시된 방법에는 약간의 외과적 전문 지식도 필요합니다. 그러나 낮은 자극 강도를 사용하여 생체 내에서 고립된 신경을 새롭고 정확하게 자극하고 기록할 수 있어 인접 신경의 동시 자극을 피할 수 있습니다.

모든 실험은 유럽 및 국가 동물 보호법과 제도적 지침에 따라 수행되었으며 Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz North Rhine-Westphalia(Az: 81-02.04.2019.A309)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 성인 마우스(약 8-16주령 C57Bl/6J 마우스) 및 앞다리 기록에 최적화되어 있습니다. 뒷다리의 각 신경을 자극하고 뒷발 근육을 기록하여 쉽게 적응할 수 있습니다(그림 1B). 기록 및 자극 전극에 대한 설명은 재료 표에 추가됩니다. 프로토콜은 터미널 측정에만 사용됩니다.

1. 준비

1. 동물의 체중을 측정 하고 i.p . 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물을 주입합니다.
2. 수술 내성에 도달할 때까지 마우스를 보온 상자에 보관하십시오. 마우스가 진정되고 호흡이 안정되고 반사 신경이 없을 때까지 몇 분 정도 기다리십시오. 발가락 핀치에 대한 반응 부족을 측정하여 마취 깊이를 확인하십시오.
3. 마우스를 뒤로 돌리고 가열 패드에 놓습니다(직장 온도 프로브를 사용한 피드백 제어 가열이 최적임). 앞발을 테이프로 고정하십시오. 여기에서 측정 전극이 앞발에 쉽게 삽입되는 방식으로 테이프를 배치해야 합니다.
4. 직장 프로브를 삽입하여 동물의 온도를 측정하고 테이프로 고정하십시오. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오.

2. 수술

참고: 마취된 동물의 안정적인 상태, 즉 호흡, 체온 및 반사 상실은 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 모니터링해야 합니다. 앞발의 요골/척골/정중 신경에 대한 직접 신경 H-파 측정 절차가 표시됩니다(그림 3A). 측정은 수정을 통해 뒷발(좌골/경골 신경)에도 적용할 수 있습니다.

1. 수술 부위를 더 잘 살펴보려면 미리 별도의 장소에서 전기 면도기 또는 가위로 머리카락을 제거하십시오. 경험이 많은 외과의의 경우 이것은 선택 사항일 뿐입니다.
   알림: 이것은 최종 실험이므로 여기서는 소독이 필요하지 않습니다. 동물은 나중에 안락사됩니다.
2. 핀셋으로 피부를 들어 올리고 앞발의 복후축(겨드랑이와 흉부 위 영역)을 따라 가늘고 둥근 가위로 피부를 약 1cm 절개합니다.
3. 조심스럽게 결합 조직을 제거하고 그 아래의 근육과 신경을 노출시킵니다. 정중 신경에 접근하기 위해 집게를 사용하여 노출된 대흉근을 제거합니다(그림 3E,F). 연조직으로 소량의 혈액과 조직액을 제거하십시오.
4. 다음 단계에서는 유방이나 겨드랑이 근육을 위에서 아래로 조심스럽게 잘라 아래의 신경 다발을 노출시킵니다. 약 1.5cm 길이에 걸쳐 결합 및 근육 조직에서 신경 다발을 제거합니다.
   참고: 여기서 정중 신경과 평행하게 흐르는 혈관이 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. 조직을 절단할 때는 항상 신경을 따라 절단하여 부상을 입지 않도록 합니다. 이런 일이 발생하면 면봉으로 누출 된 액체와 혈액을 제거하십시오. Astereo 현미경은 전체 실험에 필요하지 않지만 신경 준비에 유용 할 수 있습니다.
5. 구부러진 유리 피펫을 사용하여 앞발의 척골과 정중 신경을 조심스럽게 분리합니다(그림 3E). 두 신경 중 위쪽은 척골 신경이고 아래쪽은 정중 신경입니다.
   알림: 신경을 서로 분리할 때 아래 혈관이 손상되지 않았는지 확인하십시오.

3. 전극 배치

1. 자극 후크 전극을 0.5-1.0mm의 거리에서 평행하게 배열하고 미세 매니퓰레이터를 사용하여 이중 후크를 신경에 가깝게 배치합니다.
2. 유리 후크를 도구로 사용하여 척골 신경을 자극 후크 전극으로 들어 올립니다. 신경이 있는 전극을 뒤로 당기고 미세 매니퓰레이터를 사용하여 다른 신경과 약 1-2mm 분리합니다(그림 3D,F).
3. 근육 사이의 누화를 줄이기 위해 발의 장축을 따라 전극을 배치하십시오.
   참고: 전극의 배치는 매우 중요하지만 개별 해부학적 구조로 인해 표준화하기 어렵습니다. 전극을 올바르게 배치하려면 숙련된 외과의가 필요합니다. 신호 진폭이 만족스럽지 않은 경우 전선을 재배치할 수도 있습니다.
4. 신경에 부착 된 전극 후크를 표면적으로 건조시키고 주사기를 사용하여 바셀린을 적용하여 인접 조직으로부터 전기 절연을 제공합니다.
   알림: 전기 절연을 보장하고 신경이 건조해지는 것을 방지하기 위해 전극과 두 후크 사이에 충분한 바셀린을 바르도록 주의해야 합니다.

4. 기록 및 기준 전극의 배치

1. H-반사를 측정하려면 EMG 전극을 앞발에 근육 주사로 배치합니다. 또한 기준 전극을 뒷다리에 피하로 배치하고(예: 미세 핀 사용) 미니어처 악어 클립으로 고정합니다(그림 3B).
2. 자극기가 켜지면 앞발의 작은 경련으로 성공적인 자극을 관찰하십시오. 앞발에서 M파와 눈에 보이는 작은 경련을 유도하기 위한 최소 자극 전류는 10-50μA 범위에 있어야 합니다.
   알림: 50μA에서 경련이 보이지 않으면 자극 전극을 조정하고 바셀린을 다시 바르십시오. 또한 마우스에서 M파가 H파보다 낮은 자극 강도로 나타나는 것은 드문 일이 아닙니다⁵.

5. 측정

1. 각각 0.2ms의 긴 펄스로 신경 자극을 15회 반복합니다. 자극 세트 사이에 2분 동안 일시 중지하면 주파수가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0에서 5Hz로 증가합니다.
   알림: 이 주파수는 나중에 RDD를 계산할 때 필요합니다. 모든 EMG 데이터는 Spike2 소프트웨어(CED, 버전 7.19)와 같은 소프트웨어를 사용하여 기록, 디지털화 및 분석됩니다. 가장 큰 H파 진폭은 0.1Hz에서 예상됩니다. 주파수가 높을수록 RDD로 인해 H파의 진폭이 작아집니다.
2. 실험 후, 연구소의 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 희생시킨다. 본 실험에서는 심부마취 하에 PBS 및 4% PFA를 사용하여 마우스 심근 관류를 수행하였다.

자극 빈도 및 발당 n = 15개의 자극 시도에서 분석을 위해 최소 n = 10개의 성공적인 기록을 선택합니다. 측정 오류(예: M파 누락)가 있는 시험은 분석에서 제외됩니다. 각 시행을 개별적으로 분석하고 나중에 그룹/시간 비교를 위한 평균을 생성합니다. M파와 H파의 자극과 출현 사이의 잠복기는 각 시도에 대해 기록됩니다. 우리의 경험에 따르면 M파는 척수를 통과하는 더 긴 통과 시간으로 인해 자극 후 약 2ms, H파는 6-8ms 후에 발생합니다(그림 1A 및 그림 2B). M파와 H파의 진폭을 피크 대 피크로 측정합니다.

척수 손상 또는 뇌졸중에서 발생하는 생리학적 변화를 평가하기 위해 H파와 M파 진폭 사이의 비율(H/M 비율, 그림 2)은 예를 들어 진폭 차이에 반영되는 실험적 변동성에 덜 취약합니다. 따라서 이 비율은 질병 관련 전기생리학적 변화에 대한 보다 신뢰할 수 있는 평가를 제공합니다. 예를 들어, 1차 및 2차 운동 피질에 뇌졸중이 있는 마우스에서 H파는 증가한 반면 M파는 변하지 않은 상태로 유지되며(그림 2), 이는 αMN의 흥분성이 증가함을 시사합니다. 또한, 감소된 RDD(즉, 자극 빈도가 증가함에 따라 H-파의 억제가 감소함)가 있습니다. 감소된 RDD는 척수 억제 감소의 결과이다4. 따라서 RDD는 척추 억제 회로의 활성화를 검증할 수 있으며, 그 중단은 경련을 유발할 수 있습니다. H-반사의 RDD를 계산하기 위해서는 Lee et al.이 기술한 방법을 사용하는 것이 좋다4. 간단히 말해서, 0.1Hz에서의 H-반사 자극은 평균화되고 100%로 설정됩니다. 다른 자극 주파수에 대해 얻은 H-반사는 0.1Hz에 대한 상대 값으로 표현됩니다. 각 자극 트레인에서 처음 세 개의 자극은 버려집니다.

그림 1: 호프만 반사(H-반사) 및 근육 반응(M-파)을 측정하기 위한 기록 설정 및 경로의 그림. (A) H-반사는 척수에서 해당 알파 운동 뉴런을 활성화하고 이후에 신경 분포된 앞발 근육에서 근육 수축을 유발하는 Ia 구심성의 자극에 의해 유도됩니다. (B) 앞발의 전기 자극 요골/척골/정중 신경과 뒷발의 좌골/경골 신경의 위치. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 개략도 및 대표적인 전기 기록 결과. (A) 기록의 개략도. 자극 및 각각의 자극 아티팩트는 0ms로 설정되며, 그 다음에는 직접 근육 반응(M파)과 H파를 나타내는 더 작은 피크가 뒤따릅니다. 경직 모델에서 H-반사는 건강한 대조군에 비해 더 클 것입니다. (B) 자극 아티팩트(하단 트레이스)가 있는 원본 데이터와 M파의 단독 출현 대 기록에서 M파와 H파가 모두 보이는 예(각각 상단 트레이스, 중간 및 오른쪽 패널)를 보여주는 소프트웨어를 사용한 대표 녹음의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 말단 전기생리학적 측정을 위한 전극의 위치 지정. (ᄀ,ᄂ) 후크 자극 전극, 앞발 내의 기록 전극 및 뒷다리에 삽입된 기준 전극을 사용한 터미널 H-반사 측정의 개요. (씨, 디) 뒷다리에서는 피부와 근육을 제거한 후 좌골 신경이 보이게되며 좌골 신경과 경골 신경으로 나눌 수 있습니다. (E) 앞다리에서 요골 신경, 정중 신경 및 척골 신경이 보입니다. (F) 척골 신경은 인접 신경의 자극 없이 후크 전극으로 자극될 수 있습니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.