Summary
Wir präsentieren ein Modell der neonatalen intraventrikulären Blutung mit Rattenwelpen, das die Pathologie beim Menschen nachahmt.
Abstract
Die intraventrikuläre Tumorblutung (IVH) ist eine häufige Folge einer Frühgeburt und führt zu Hirnverletzungen, poshämorrhagischem Hydrozephalus (PHH) und lebenslangen neurologischen Ausfällen. Während PHH durch temporäre und permanente Zerebrospinalflüssigkeit (Liquor) Diversionsverfahren (ventrikuläres Reservoir bzw. ventrikuloperitonealer Shunt) behandelt werden kann, gibt es keine pharmakologischen Strategien zur Vorbeugung oder Behandlung von IVH-induzierten Hirnverletzungen und Hydrocephalus. Tiermodelle werden benötigt, um die Pathophysiologie der IVH besser zu verstehen und pharmakologische Behandlungen zu testen. Während es existierende Modelle der neonatalen IVH gibt, sind diejenigen, die zuverlässig zu Hydrocephalus führen, oft durch die Notwendigkeit großvolumiger Injektionen eingeschränkt, was die Modellierung der Pathologie erschweren oder Variabilität im beobachteten klinischen Phänotyp einführen kann.
Neuere klinische Studien haben Hämoglobin und Ferritin mit der Verursachung einer ventrikulären Vergrößerung nach IVH in Verbindung gebracht. Hier entwickeln wir ein einfaches Tiermodell, das den klinischen Phänotyp von PHH nachahmt, indem wir kleinvolumige intraventrikuläre Injektionen des Blutabbauprodukts Hämoglobin verwenden. Neben der zuverlässigen Induktion von ventrikulärer Vergrößerung und Hydrozephalus führt dieses Modell zu Verletzungen der weißen Substanz, Entzündungen und Immunzellinfiltrationen in periventrikulären und weißen Substanzregionen. Dieser Artikel beschreibt diese klinisch relevante, einfache Methode zur Modellierung von IVH-PHH bei neonatalen Ratten mittels intraventrikulärer Injektion und stellt Methoden zur Quantifizierung der Ventrikelgröße nach der Injektion vor.
Introduction
Neugeborene IVH stammt aus der Keimmatrix, einem Ort der schnellen Zellteilung, der an die lateralen Ventrikel des sich entwickelnden Gehirns angrenzt. Diese stark vaskuläre Struktur ist anfällig für hämodynamische Instabilität im Zusammenhang mit Frühgeburten. Blut wird bei der Keimmatrixblutung (GMH)-IVH in die lateralen Ventrikel freigesetzt, wenn zerbrechliche Blutgefäße innerhalb der Keimmatrix reißen. Bei IVH Grad IV kann auch ein periventrikulärer hämorrhagischer Infarkt zur Freisetzung von Blutprodukten im Gehirn beitragen. 1 Die Kombination von GMH-IVH kann PHH verursachen, insbesondere nach hochgradigen Blutungen (Grad III und IV)1. PHH kann mit der Platzierung eines ventrikuloperitonealen Shunts behandelt werden, aber die Shunt-Platzierung macht die Hirnverletzung, die durch IVH auftreten kann, nicht rückgängig. Obwohl die moderne neonatale Intensivmedizin die IVH-Raten gesenkt hat2, 3, gibt es keine spezifischen Behandlungen für die Hirnverletzung oder den Hydrozephalus, die durch IVH verursacht werden, sobald sie aufgetreten ist. Eine signifikante Einschränkung bei der Entwicklung präventiver Behandlungen für IVH-induzierte Hirnverletzungen und PHH ist das unvollständige Verständnis der IVH-Pathophysiologie.
Kürzlich wurde gezeigt, dass frühe Liquorspiegel des wichtigsten Blutabbauprodukts Hämoglobin mit der späteren Entwicklung von PHH bei Neugeborenen mit hochgradigem IVH4 assoziiert sind. Darüber hinaus sind die Liquorspiegel von Eisen-Handling-Signalweg-Proteinen - Hämoglobin, Ferritin und Bilirubin - mit der Ventrikelgröße bei neonataler IVH assoziiert. Dies zeigte sich auch in einer multizentrischen Kohorte von Säuglingen mit vorzeitiger PHH, bei der höhere ventrikuläre Liquorspiegel von Ferritin mit einer größeren Ventrikelgröße5 assoziiert waren.
In dieser Studie entwickelten wir ein klinisch relevantes Modell für IVH-induzierte Hirnverletzungen und Hydrozephalus unter Verwendung von Hämoglobininjektion in die Hirnventrikel, was die Quantifizierung von Hirnverletzungen und PHH und das Testen neuer therapeutischer Strategien ermöglicht (Abbildung 1)6, 7. Dieses IVH-Modell verwendet neonatale Rattenwelpen, die für die Dauer des Eingriffs unter Vollnarkose gestellt werden. Ein Mittellinienschnitt wird auf der Kopfhaut gemacht, und Koordinaten, die von Schädellandmarken - dem Bregma oder Lambda - abgeleitet werden, werden verwendet, um die lateralen Ventrikel für die Injektion zu erreichen. Eine langsame Injektion mit einer Infusionspumpe liefert Hämoglobin in den Ventrikel. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen, vielseitig und kann verschiedene Komponenten von IVH modellieren, die zu PHH führen.
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Protocol
HINWEIS: Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der Institutionen genehmigt. Weitere Informationen zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Herstellung von Hämoglobin- und Liquorlösungen
- Bereiten Sie eine sterile künstliche Liquorlösung (aCSF) vor, indem Sie 500 μL der aCSF-Lösung in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen geben und auf Eis lagern.
- Bereiten Sie eine sterile 150 mg / ml Hämoglobinlösung vor, indem Sie 75 mg Hämoglobin zu 500 μL aCSF in einem 1,5 ml Mikroröhrchen hinzufügen und auf Eis lagern.
2. Vorbereitung des Tieres zur Injektion
- Drehen Sie das Heizkissen auf die mittlere Einstellung, um die Körpertemperatur der Ratte aufrechtzuerhalten.
- Anästhesieren Sie postnatale Tag 4 (P4) Ratten in einer Induktionskammer, die mit 3% Isofluran gefüllt ist.
HINWEIS: Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie mit der Zehen- / Schwanzklemmreaktion alle 15 Minuten. Überwachen Sie die Anästhesie mit visueller Beobachtung von Gewebefarbe, Körpertemperatur und Atemfrequenz. - Schmerzlinderung mit einer subkutanen Carprofen-Injektion von 5 mg/kg an die anästhesierte Ratte verabreichen.
- Legen Sie die anästhesierte Ratte anfällig in das stereotaktische Gerät mit der Nase im Anästhesieadapter mit einem konstanten Fluss von 1,5% Isofluran.
- Ziehen Sie die nicht reißenden Ohrstangen am äußeren Gehörgang fest, um den Kopf zu sichern.
HINWEIS: Tragen Sie Tiersalbe auf, um die Augen mit Feuchtigkeit zu versorgen, wenn die Augen im Alter der Injektion geöffnet sind. - Reinigen Sie den Kopf abwechselnd mit sterilen Applikatoren mit Baumwollbestückung, die mit Betadin und 70% Ethanol getränkt sind.
- Berühren Sie den Betadin-getränkten Applikator in der Mitte der Kopfhaut und verteilen Sie das Betadin in Kreisen, bewegen Sie sich nach außen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6.1.1 mit dem mit Ethanol getränkten Applikator.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6.1.1 und Schritt 2.6.1.2 3x.
- Tragen Sie einen sterilen chirurgischen Tuch auf, um das Operationsfeld zu schützen.
- Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 0,3 cm langen Schnitt senkrecht in der Mitte des Kopfes, um das Bregma des Schädels freizulegen.
HINWEIS: Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, legen Sie das Lambda des Schädels anstelle des Bregma frei. - Verwenden Sie einen sterilen Baumwollapplikator, um den Bereich zu trocknen.
3. Einrichten des stereotaktischen Injektors
- Ziehen Sie die in Schritt 1.2 vorbereitete Hämoglobinlösung mit einer 30G-Nadel in eine sterile 0,3-ml-Spritze und legen Sie die Spritze in das stereotaktische Injektorsystem.
HINWEIS: Wenn Sie Kontrollbedingungen erzeugen, ziehen Sie eine in Schritt 1.1 vorbereitete CSF-Lösung in eine 0,3-ml-sterile Spritze und fahren Sie mit dem Protokoll fort. - Schalten Sie die stereotaktische Injektorschnittstelle ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Konfiguration , um die Einstellungen für die Einspritzlautstärke und -rate einzugeben.
- Klicken Sie auf Volume und stellen Sie die Lautstärke auf 20.000 nL (20 μL) ein.
- Klicken Sie auf Infusionsrate und stellen Sie die Rate auf 8.000 nL /min (8 μL/min) ein.
- Beenden Sie die Konfiguration, indem Sie auf die Schaltfläche Reset Pos klicken.
- Spülen Sie die Nadelspitze, indem Sie auf die Schaltfläche Infuse klicken, bis eine kleine Perle Hämoglobinlösung an der Nadelspitze austritt.
- Leiten Sie die Hämoglobinlösung vorsichtig mit einem sterilen Baumwollapplikator von der Nadelspitze ab.
4. Tierinjektion
- Stellen Sie das Bregma auf dem stereotaktischen Injektorsystem auf Null ein, indem Sie die mediolateralen und anteroposterioren Positionen der Spritze anpassen, bevor Sie die Spitze der gespülten Spritzennadel absenken, um den Schädel am Bregma sanft zu berühren.
HINWEIS: Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, setzen Sie Lambda auf Null. - Identifizieren Sie die Koordinaten Ihrer Wahl.
- Wenn Sie aus dem Bregma injizieren, verwenden Sie bei P4-Ratten , wie hier beschrieben, 1,5 mm seitlich, 0,4 mm vorn und 2,0 mm tief von Bregma.
- Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, verwenden Sie die folgenden Koordinaten für P4-Ratten: 1,1 mm seitlich, 4,6 mm vorn und 3,3 mm tief von Lambda.
- Heben Sie die Spritzennadel 1 cm über den Schädel, um die Kopfhaut zu reinigen. Wenn die Spritze angehoben wird, stellen Sie die mediolateralen und anteroposterioren Koordinaten ein.
- Senken Sie die Spritzennadel, um den Schädel vorsichtig zu berühren. Überprüfen Sie, ob die Nadel den Schädel berührt.
- Stellen Sie die dorsoventrale Koordinate über einen Zeitraum von 30 s ein.
HINWEIS: Beim Einstellen der dorsoventralen Koordinate durchsticht die Nadel den Schädel. Es muss darauf geachtet werden, dass die Spritze den Schädel passiert, ohne den Schädel zu verformen. Eine Schädelverformung wird vermieden, indem die Nadel bei einer Verformung langsam entlang der dorsoventralen Koordinate zurückgezogen und die Nadel dann wieder entlang der gleichen Flugbahn platziert wird. Dadurch kann die Nadel das Loch im Schädel mit weniger Kraft und ohne Verformung passieren. - Klicken Sie auf der stereotaktischen Injektorschnittstelle auf die Schaltfläche Ausführen , um die Injektion zu starten.
- Nachdem die Injektion beendet ist, lassen Sie die Spritzennadel 2 min an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung zu minimieren.
- Ziehen Sie die Spritze langsam entlang der dorsoventralen Koordinate über 2 min zurück, bis sich die Nadelspitze 2 cm über der Kopfhaut befindet.
- Drehen Sie den stereotaktischen Injektorarm vom Operationsfeld weg.
5. Nachsorge
- Verschließen Sie die Kopfhaut mit einer 6-0-Monofilament-Naht. Machen Sie eine einfache unterbrochene Naht in der Mitte des 0,3 cm langen Einschnitts.
- Entfernen Sie den Welpen aus der Narkose und legen Sie ihn auf eine sichere Stelle auf dem Heizkissen.
- Bringen Sie das Nagetier in den heimischen Käfig zurück, um sich von der Anästhesie unter der Obhut seines Muttertiers zu erholen.
HINWEIS: Die rechtzeitige Rückkehr in die Pflege des Muttertiers reduziert die frühe postoperative Mortalität. - Überwachen Sie die Tiere auf Anästhesie durch Verlust des aufrichtenden Reflexes stündlich nach der Operation für 3 h.
- Überwachen Sie die Tiere täglich für 7 Tage auf normale Aktivität, Nahrungsaufnahme und Gewichtszunahme. Überwachen Sie die Inzisionsstelle auf Wundheilung, Verschluss und Wiederauftreten von Fell an der Operationsstelle.
HINWEIS: In dem seltenen Fall, dass neurologische Veränderungen wie Krampfanfälle, zentrale Depression oder verminderter Appetit während der Überwachung beobachtet werden, wird das Tier unter intravaskulärer Perfusion oder zervikaler Dislokation unter Narkose eingeschläfert. - Um eine Infektion zu verhindern, sobald die Naht geschlossen ist und die Wunde heilt, wenden Sie ein topisches Dreifachantibiotikum an der Inzisionsstelle an.
6. MRT-Erfassung und Quantifizierung
- Führen Sie eine MRT auf einem 4,7T- oder 9,4T-Kleintierscanner durch.
- Drehen Sie das Heizkissen auf die mittlere Einstellung, um die Körpertemperatur der Ratte aufrechtzuerhalten.
- Induktion der Anästhesie in einer Kammer mit 3% Isofluran.
HINWEIS: Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie mit der Zehen- / Schwanzklemmreaktion alle 15 Minuten. Überwachen Sie die Anästhesie mit visueller Beobachtung von Gewebefarbe, Körpertemperatur und Atemfrequenz. - Legen Sie die anästhesierte Ratte anfällig in das MRT, wobei die Nase im Anästhesieadapter mit einem konstanten Fluss von 1,5% Isofluran positioniert ist.
- Führen Sie eine T2-gewichtete Bildgebung durch, indem Sie eine T2-gewichtete schnelle Spin-Echosequenz auswählen.
- Wenn Sie einen 4,7T-MRT-Scanner verwenden, geben Sie die folgenden Parameter in die MRT-Software ein: Wiederholzeit = 3.000 ms, Echozeit = 27,50 ms, Anzahl der Mittelwerte = 3, Sichtfeld = 18,0 mm x 18,0 mm, Matrix = 128 x 128, Anzahl axialer Scheiben = 24, Dicke = 0,50 mm.
- Wenn Sie einen 9,4T-MRT-Scanner verwenden, geben Sie die folgenden Parameter in die MRT-Software ein: Wiederholzeit = 5.000 ms, Echozeit = 66,00 ms, Echoabstand = 16,50 ms, Anzahl der Mittelwerte = 2, Wiederholungen = 1, seltener Faktor = 8, Sichtfeld = 16,0 mm x 16,0 mm, Matrix = 256 x 256, Anzahl axialer Scheiben = 32, Dicke = 0,50 mm.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um die Sequenz zu starten.
7. Bildverarbeitung und Analyse
- Verwenden Sie native T2-gewichtete Daten, um das Gehirnvolumen zu analysieren. Verwenden Sie eine Segmentierungssoftware, um die lateralen Ventrikel manuell abzugrenzen6. Klicken Sie auf Pinselmodus und wählen Sie den quadratischen Pinselstil. Stellen Sie die Pinselgröße auf 1 ein. Klicken Sie auf das Informationsfenster "Layout" und wählen Sie die axiale Ansicht. Klicken Sie auf Zoom, um ihn anzupassen. Platzieren Sie den Cursor auf dem Bild; Verfolgen und füllen Sie den lateralen Ventrikelraum.
- Klicken Sie in der Symbolleiste auf Segmentierung | Volumen und Statistiken, um die segmentierten Volumes anzuzeigen.
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Representative Results
Der Erfolg der Injektion wurde radiologisch und immunhistochemisch bestätigt. Tiere, die einer Hämoglobininjektion unterzogen wurden, entwickelten eine moderate akute Ventrikulomegalie bei MRT-Beurteilung (Abbildung 2A), mit signifikant größeren lateralen Ventrikeln nach 24 h und 72 h nach Hämoglobininjektion im Vergleich zu aCSF-injizierten Tieren (Abbildung 2B,C). Obwohl es 38 Tage nach der Injektion keinen signifikanten Unterschied im lateralen Ventrikelvolumen zwischen Hämoglobin-injizierten und aCSF-injizierten Tieren gab (Abbildung 2D), ist es wichtig zu beachten, dass 44% (4/9) der Tiere in der Hämoglobin-injizierten Gruppe, die bis 38 Tage nach der Injektion beobachtet wurden, zu diesem Zeitpunkt eine ungelöste Ventrikulomegalie aufwiesen (Abbildung 2D ). Diese weite Verteilung der Ventrikelgrößen ist ein Muster, das mit dem klinischen Verlauf der IVH-PHH übereinstimmt. Darüber hinaus wurde das Volumen der weißen Substanz 38 Tage nach der Injektion quantifiziert (Abbildung 3) und war in der Hämoglobin-injizierten Gruppe im Vergleich zur aCSF-injizierten Gruppe signifikant erniedrigt (Abbildung 3B).
Wir haben zuvor eine Studie veröffentlicht, in der die akute Entzündungsreaktion nach Hämoglobininjektion beschriebenwird 9. In dieser vorliegenden Studie wurden proinflammatorische Zytokine auf die Produktion von Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα) in vivo untersucht (Abbildung 4), und die Infiltration von Immunzellen in die periventrikulären Bereiche und die weiße Substanz wurden unter Verwendung der Immunfluoreszenz des Gliafibrillensäureproteins (GFAP) bewertet (Abbildung 5). Die Injektion von 15 μL Hämoglobin, Vollblut oder Kochsalzlösung in den lateralen Ventrikel postnataler Ratten am Tag 5 führte zu höheren Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins TNFα 3 h nach Hämoglobininjektion im Vergleich zu Vollblut und Kochsalzlösung (Abbildung 4). Es gab signifikant mehr reaktive Astrozyten im Corpus callosum von Hämoglobin-injizierten Tieren im Vergleich zu aCSF-injizierten Tieren (Abbildung 5). Schließlich wurden andere Blutabbauprodukte auf diese Weise verwendet, einschließlich Eisen und Ferritin, um zuverlässig zu Ventrikulomegalie und Hydrocephalus 6,7 zu führen.
Abbildung 1: Experimentelle Zeitleiste und schematische Darstellung des IVH-Modells für neonatale Ratten . (A) Schematische Darstellung der Hämoglobininjektion und MRT-Zeitachse, die für die in dieser Studie generierten Daten verwendet wurde. (B) Schematische Darstellung des stereotaktischen Aufbaus für die Injektion (links) und den Ort der Hämoglobininjektion in den rechten lateralen Ventrikel (rechts). Abkürzungen: IVH = intraventrikuläre Blutung; MRT = Magnetresonanztomographie; PN = postnataler Tag N. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Laterale Ventrikelvolumina im intraventrikulären Blutungsmodell der Ratte. (A) Repräsentative in vivo T2 koronale MRT-Bilder von Rattengehirnen 24 h, 72 h und 38 Tage nach intraventrikulärer Injektion von aCSF (links) oder 150 mg/ml Hb (rechts) in den rechten lateralen Ventrikel am postnatalen Tag 4. Maßstabsbalken = 1 mm. (B-D) Quantifizierung der lateralen Ventrikelvolumina (B) 24 h, (C) 72 h und (D) 38 Tage nach aCSF- oder Hb-Injektion. Hb-injizierte Tiere hatten nach 24 h und 72 h signifikant größere Ventrikel. Die Daten in B und C sind Mittelwert ± s.e.m., n = 13 pro Gruppe, ungepaarter zweiseitiger t-Test. Die Daten in D sind Mittelwert ± REM, n = 3 in aCSF-Gruppe und n = 9 in Hb-Gruppe, ungepaarter zweiseitiger t-Test. Abkürzungen: MRT = Magnetresonanztomographie; PN = postnataler Tag N; aCSF = künstliche Zerebrospinalflüssigkeit; Hb = Hämoglobin; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Verletzung der weißen Substanz im Modell der intraventrikulären Blutung an Ratten . (A) Repräsentative in vivo T2 koronale MRT-Bilder von Rattengehirnen 38 Tage nach intraventrikulärer Injektion von aCSF (links) oder 150 mg/ml Hb (rechts) in den rechten lateralen Ventrikel am postnatalen Tag 4. Die weiße Substanz ist rot umrandet. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Quantifizierung des Volumens der weißen Substanz 38 Tage nach aCSF- oder Hb-Injektion. Hb-injizierte Tiere hatten ein verringertes Volumen der weißen Substanz. Die Daten in B sind Mittelwert ± SEM, n = 3 in der aCSF-Gruppe, n = 9 in der Hb-Gruppe. Ungepaarter zweiseitiger t-Test. Abkürzungen: MRT = Magnetresonanztomographie; PN = postnataler Tag N; aCSF = künstliche Zerebrospinalflüssigkeit; Hb = Hämoglobin; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Hämoglobin induziert mehr TNFα-Produktion als Vollblut in vivo. Die Verabreichung von 15 μL Hämoglobin, Vollblut oder Kochsalzlösung in den lateralen Ventrikel von postnatalen Ratten am Tag 5 führte zu höheren Spiegeln des proinflammatorischen Zytokins TNFα 3 h nach Hämoglobininjektion im Vergleich zu Vollblut und Kochsalzlösung. Die Daten sind Mittelwert ± SEM, n = 4 in allen Gruppen, Einweg-ANOVA mit post-hoc Tukey-Test. Abkürzungen: Hb = Hämoglobin; TNFα = Tumornekrosefaktor-alpha; WB = Vollblut; ANOVA = Varianzanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Astrozytenaktivierung im Corpus callosum nach Hämoglobininjektion in den lateralen Ventrikel. (A) Die GFAP-Immunfärbung zeigt, dass die Hämoglobininjektion in den lateralen Ventrikel von postnatalen Nagetieren am Tag 4 72 h nach der Injektion zu einer Astrozytenaktivierung im Corpus callosum und in der subventrikulären Zone führte. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Die Anzahl der reaktiven Astrozyten war bei Hämoglobin-injizierten Tieren im Vergleich zu aCSF-injizierten Tieren signifikant erhöht. Die Daten sind Mittelwert ± REM, n = 3 in aCSF-Gruppe, n = 4 in Hb-Gruppe, ungepaarter zweiseitiger t-Test. Abkürzungen: GFAP = glial fibrillary acidic protein; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; LV = lateraler Ventrikel; SVZ = subventrikuläre Zone; cc = Corpus callosum; aCSF = künstliche Zerebrospinalflüssigkeit; Hb = Hämoglobin; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Vergleich der 4,7T- und 9,4T-MRT-Bildqualität. (A) 4,7T- und 9,4T-T2-gewichtete MRT, die 72 Stunden nach Hämoglobininjektion in den rechten lateralen Ventrikel von postnatalen Ratten am 4. Tag durchgeführt wurde. Maßstabsbalken = 1 mm. Abkürzung: MRT = Magnetresonanztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses IVH-Modell, das Hämoglobininjektion verwendet, ermöglicht die Untersuchung der Pathologie von IVH, die spezifisch durch Hämoglobin vermittelt wird. Für ergänzende Studien kann Hämoglobin auch leicht in vitro verabreicht werden und verwirrt nicht biochemische Assays für Proteine, die von Mikroglia / Makrophagen hergestellt werden, die im Vollblut vorhanden sind.
Die führenden Theorien der IVH-PHH umfassen die mechanische Obstruktion der Liquorzirkulation, die Störung von Zilien, die die Ependymwände auskleiden, Entzündungen, Fibrose und Eisentoxizität10. Bestehende Tiermodelle für IVH wie das Kollagenase-induzierte Ratten-Welpenmodell induzieren IVH durch direkte Verletzung und Störung der extrazellulären Matrix11, während andere wie das Glycerin-induzierte Kaninchen-Welpenmodell IVH als Effekt der intrakraniellen Hypotonieinduzieren 12. Weitere Modelle verwenden autologes und Spenderblut von Ratten in die lateralen Ventrikel13, 14. Während diese und andere bestehende Modelle wichtige Merkmale für die Untersuchung von IVH-PHH darstellen, konzentrieren sie sich auf den Einfluss von Blut im Ventrikel, ohne die Rolle spezifischer Bestandteile des Blutes, die während Blutungen freigesetzt werden, auf die Entwicklung neurologischer Folgeerkrankungen nach IVH zu berücksichtigen.
Es wurde gezeigt, dass frühe Liquolspiegel von Hämoglobin nach IVH mit PHH assoziiert sind, und Liquorspiegel von Eisenstoffwechselwegproteinen - Hämoglobin, Ferritin und Bilirubin - sind mit der Ventrikelgröße nach IVH4 assoziiert. Dies deutet darauf hin, dass die Pathogenese von PHH spezifisch mit den Hämoglobin- und Eisenbestandteilen des Blutes assoziiert sein kann, die während der IVH in die Ventrikel freigesetzt werden. Somit stellt dieses Modell einen wichtigen Weg für eine gezielte Untersuchung der Rolle von Hämoglobin auf die PHH-Entwicklung dar und ermöglicht weitere Studien zu Therapeutika, die auf Hämoglobin- und Eisenstoffwechselwege nach IVH abzielen.
Eine ventrikuläre Vergrößerung nach IVH beim Menschen kann auf einen parenchymalen Verlust des Gehirns (manchmal auch als Hydrocephalus ex vacuo bezeichnet) oder Hydrocephalus zurückzuführen sein, was auf einen erhöhten Liquordruck hinweist. Diese Prozesse können zusammen auftreten15 und es kann schwierig sein zu bestimmen, inwieweit ventrikuläre Veränderungen auf erhöhten Liquordruck gegenüber Volumenverlust ohne invasive Verfahren zurückzuführen sind. Dieses Modell, das sowohl die radiologische Beurteilung der ventrikulären Größe bei lebenden Tieren als auch die Beurteilung von Gewebeverletzungen mittels Histologie ermöglicht, kann Forschern helfen, die Beziehung zwischen den beiden zu verstehen und, was noch wichtiger ist, zu beurteilen, inwieweit potenzielle Therapien Hirnverletzungen umkehren.
Traditionell stützten sich Vergleiche der Gehirnentwicklung zwischen den Arten hauptsächlich auf die postmortale Gehirnmasse. Eine bahnbrechende Studie von Dobbing und Sands, die mit dieser Methode durchgeführt wurde, schätzte, dass P7 eine wichtige Periode des Gehirnwachstums bei Nagetieren ist, vergleichbar mit den Veränderungen, die bei menschlichen Neugeborenen beobachtet wurden, die bei16 geboren wurden. In jüngerer Zeit haben Studien, die Entwicklungsmeilensteine wie die Oligodendrozytenreifung und die Etablierung der Blut-Hirn-Schranke vergleichen, P1-P3 bei Nagetieren als analog zur 23-32. Schwangerschaftswoche bei menschlichen Neugeborenen definiert 17,18,19,20,21. Darüber hinaus involutiert die Keimmatrix erst bei P7 bei Ratten22. Daher entsprechen die in diesem Modell verwendeten P4-Ratten einer Periode der Gehirnreifung, in der die Keimmatrix vorhanden ist, mit Eigenschaften, von denen wir glauben, dass sie repräsentativ für die menschliche Bevölkerung sind, die für IVH-PHH gefährdet ist. Darüber hinaus ist die Rate der ungelösten Ventrikulomegalie 38 Tage nach Hämoglobininjektion in dieser Studie (44%) vergleichbar mit den klinischen Raten von PHH nach IVH (30%)23.
Zu den Einschränkungen unseres postnatalen IVH-Modells für Ratten gehören die Verwendung eines lissenzephalen Tieres und das Fehlen einer direkten Verletzung der Keimmatrix und/oder des periventrikulären Parenchyms. Dieses Modell hat jedoch mehrere Vorteile, darunter gute Reproduzierbarkeit, niedrige Kosten und Vielseitigkeit, die die Verwendung verschiedener alter Tiere und radiologischer (Abbildung 6), biochemischer und histologischer Analysen ermöglicht. Zukünftige Laborarbeiten zur Pathophysiologie der IVH könnten zu besseren Behandlungen für diesen Zustand führen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
JMS erhielt Mittel von NIH / NINDS R01 NS110793 und K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM erhielt Mittel von NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award und einen Hydrocephalus Association Innovator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
References
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php (2022).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
