Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

कुशल SARS-CoV-2 मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज पीसीआर लार नैदानिक रणनीति ओपन-सोर्स पिपेटिंग रोबोट का उपयोग कर

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63395
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 3, 4, *1,5,6, *1,2
1Center for Innovative Medical Devices and Sensors (REDDI Lab), Clemson University, 2Department of Bioengineering, Clemson University, 3Swann Medicine, 4Student Health Services, Clemson University, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Clemson University, 6Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल एक SARS-CoV-2 नैदानिक विधि का वर्णन करता है जो लार के नमूनों के RT-qPCR आणविक परीक्षण करने के लिए ओपन-सोर्स स्वचालन का उपयोग करता है। इस स्केलेबल दृष्टिकोण को नैदानिक सार्वजनिक स्वास्थ्य निगरानी के साथ-साथ छोटे विश्वविद्यालय प्रयोगशालाओं की क्षमता बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

हाल ही में सार्स-कोव -2 वैश्विक स्वास्थ्य संकट के उद्भव ने महामारी विज्ञान अनुसंधान और नैदानिक परीक्षण के लिए प्रमुख चुनौतियों को पेश किया। संचरण की उच्च दर और कम मृत्यु दर की विशेषता, कोविड -19 महामारी ने सटीक और कुशल नैदानिक परीक्षण की आवश्यकता थी, विशेष रूप से आवासीय विश्वविद्यालयों जैसी बंद आबादी में। न्यूक्लिक एसिड परीक्षण की प्रारंभिक उपलब्धता, जैसे नासोफरीन्जियल स्वैब, आपूर्ति श्रृंखला के दबाव के कारण सीमित थी, जिसने परीक्षण परिणामों की रिपोर्टिंग में भी देरी की। लार-आधारित रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) परीक्षण ने अन्य परीक्षण विधियों के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता में तुलनीय दिखाया है, और लार संग्रह प्रतिभागियों के लिए कम शारीरिक रूप से आक्रामक है। नतीजतन, हम Clemson विश्वविद्यालय और आसपास के समुदाय की जनसंख्या निगरानी के लिए एक मल्टीप्लेक्स आरटी-qPCR नैदानिक परख विकसित की. परख खुले स्रोत तरल हैंडलिंग रोबोट और thermocyclers जटिल नैदानिक स्वचालन प्रणालियों के बजाय वर्कफ़्लो और सिस्टम लचीलापन का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया. लार-आधारित आरटी-क्यूपीसीआर का स्वचालन बड़े और छोटे पैमाने पर परीक्षण मांगों दोनों के लिए वायरल आरएनए सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का तेजी से और सटीक पता लगाने में सक्षम बनाता है। स्वचालित प्रणाली के लिए औसत बदलाव 95% नमूनों के लिए 9 घंटे < और 99% नमूनों के लिए 24 घंटे < था। एक एकल परीक्षण के लिए लागत $ 2.80 थी जब सभी अभिकर्मकों को भारी मात्रा में खरीदा गया था।

Introduction

गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम से जुड़े कोरोनोवायरस -2 (सार्स-कोव -2), एक नॉवल कोरोनावायरस, 2019 के अंत में उभरा और तेजी से वैश्विक आबादी में फैल गया। सार्स-कोव -2 संक्रमण कोरोनोवायरस रोग 2019 (कोविड -19) का कारण बनता है, जो संभावित रूप से गंभीर श्वसन और भड़काऊ लक्षणों के साथ एक अत्यधिक संक्रामक बीमारी है। कम मृत्यु दर के साथ मिलकर उच्च ट्रांसमिसिबिलिटी ने संकेत दिया कि वायरस आबादी के माध्यम से तेजी से फैलेगा और नैदानिक परीक्षण 2,3 में वृद्धि की आवश्यकता होगी। सार्वजनिक स्वास्थ्य सिफारिशों ने मामलों को अलग करने और बाद में संचरण दरों को कम करने के लिए व्यापक पैमाने पर जनसंख्या स्क्रीनिंग को प्रोत्साहित किया 4,5,6। इसके अलावा, जनसंख्या निगरानी के मॉडल से पता चला कि परीक्षण आवृत्ति में वृद्धि और रिपोर्टिंग समय में कमी का परीक्षण संवेदनशीलता में वृद्धि की तुलना में संचरण को कम करने पर अधिक प्रभाव पड़ा। यह संभावना है क्योंकि संक्रमित व्यक्तियों को पहले संगरोध किया जा सकता है, जिससे संक्रमण की श्रृंखला टूट सकती है।

मूल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण (NAAT) मानक NASOPHARYNGEAL (NP) swabs RT-qPCR8 द्वारा संसाधित किया गया था। हालांकि, जटिलताएं बहुत बड़ी आबादी के लिए परीक्षण के इस रूप के साथ उत्पन्न होती हैं, जैसे कि सापेक्ष लागत में वृद्धि और बढ़ी हुई आपूर्ति श्रृंखला दबाव 9,10। इसके अलावा, आम NAAT विधियों के नमूना संग्रह और प्रसंस्करण दोनों (एनपी स्वैब, ऑरोफरीन्जियल स्वैब, मिड-टर्बिनेट स्वैब, और नाक स्वैब सहित) विशेष उपकरणों, अभिकर्मकों और चिकित्सा कर्मियों 9,10 पर निर्भर हैं।

एनपी स्वैब आरटी-क्यूपीसीआर परीक्षण के लिए एक पर्याप्त विकल्प लार-आधारित परीक्षण है, जो सार्स-कोव -2 का पता लगाने के लिए एक सटीक नैदानिक उपकरण है11,12,13,14। सीधे लार के नमूनों पर आरटी-क्यूपीसीआर प्रदर्शन एनपी swabs15 के रूप में समान संवेदनशीलता और विशिष्टता उपज. एनपी स्वाब परीक्षण पर लार परीक्षण का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह नमूनों के स्व-संग्रह के लिए अनुमति देता है16। यह चिकित्सा कर्मियों की आवश्यकता को कम करता है और एनपी स्वैब की तुलना में कम आक्रामक होने से रोगियों के लिए नमूना संग्रह में आसानी को अधिकतम करता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि लार के नमूनों को स्वाब से नमूने को हटाने के लिए बफर की आवश्यकता नहीं होती है (जैसा कि एनपी नमूनों के मामले में), लार-आधारित परीक्षण सीधे गर्मी-आधारित राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए) निष्कर्षण का उपयोग कर सकते हैं, जो अतिरिक्त बफर, परिवहन मीडिया और / या आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों की आवश्यकता को हटाकर परीक्षण लागत को कम करता है14,17।

Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) लैब की स्थापना कोविड-19 परीक्षण और निगरानी के लिए विश्वविद्यालय की जरूरतों को पूरा करने के लिए की गई थी। विश्वविद्यालयों सहित बंद आबादी में, सोशल डिस्टेंसिंग के साथ मिलकर लगातार निगरानी परीक्षण ने रोग प्रसार के महामारी विज्ञान मॉडल में सबसे अनुकूल परिणामों का उत्पादन किया। समेकित CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 और SalivaDirect14 प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था, और लागत को कम करने और टर्नअराउंड समय में सुधार करने के लिए नैदानिक वर्कफ़्लो में स्वचालन का उपयोग किया गया था। पिछले समूहों ने सार्स-कोव -2 आरएनए निष्कर्षण चरणों 20,21 के लिए ओपन-सोर्स लिक्विड हैंडलिंग रोबोट का उपयोग किया था, लेकिन हमने परीक्षण प्लेटों को तैयार करने और नमूनों को लोड करने के लिए रोबोट के उपयोग को अधिकतम किया। यहां, हम दिखाते हैं कि अनुकूलित प्रोटोकॉल और ओपन-सोर्स लिक्विड हैंडलिंग सिस्टम (चित्रा 1) का उपयोग त्वरित और सटीक लार-आधारित आरटी-क्यूपीसीआर के लिए अनुमति देता है और बड़े पैमाने पर सार्वजनिक स्वास्थ्य निगरानी के लिए एक प्रभावी रणनीति है।

Protocol

सभी शोध Clemson University और Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 जुलाई, 2020) के अनुपालन में किए गए थे।

1. ओपन-सोर्स तरल हैंडलिंग रोबोट का सेटअप

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक तरल हैंडलिंग रोबोट के शीर्ष पर उच्च दक्षता वाले पार्टिकुलेट एयर (HEPA) फ़िल्टर मॉड्यूल ( सामग्री की तालिका देखें) स्थापित करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार मास्टर मिक्स प्लेट तैयारी रोबोट (ओं) के बाएं माउंट पर एक 8-चैनल P20 पिपेट संलग्न करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूना लोडिंग रोबोट (ओं) के दाईं ओर एक P20 पिपेट संलग्न करें।
  4. उपयुक्त कंप्यूटरपर कस्टम पायथन स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2) डाउनलोड करें।
  5. खुला TigerSaliva पूर्ण 384 नमूना लोड हो रहा है रोबोट कंप्यूटर पर डेस्कटॉप अनुप्रयोग में Loading.py। कैलिब्रेट करें क्लिक करें और सॉफ़्टवेयर निर्देशों के अनुसार पिपेट और प्रोग्राम दोनों सेट अप करें.
  6. मास्टर मिश्रण रोबोट कंप्यूटर पर डेस्कटॉप अनुप्रयोग में 12 पूर्ण Plates.py खोलें। कैलिब्रेट करें क्लिक करें और सॉफ़्टवेयर निर्देशों के अनुसार पिपेट और प्रोग्राम दोनों सेट अप करें.
  7. एक कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (CAD) फ़ाइल (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363) का उपयोग करके एक फ्यूज्ड जमाव मॉडलिंग तीन-आयामी (3D) प्रिंटर के साथ कस्टम नमूना रैक मुद्रित करें. आठ रैक के दो सेट के लिए, नमूना लोडहोने रोबोट प्रति 16 रैक प्रिंट करें।

2. 20x मल्टीप्लेक्स N1 + P1 जांच / प्राइमर मिश्रण की तैयारी

  1. सिंथेटिक सार्स-कोव-2 आरएनए या रोगी के नमूनों से दूर एक बाँझ वातावरण में 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 20x मल्टीप्लेक्स N1 + P1 प्रोब / प्राइमर मिक्स (20 मिलीलीटर की कुल मात्रा, तालिका 1) का एक बैच तैयार करें।
  2. मिश्रण के एलीकोट 1.6 मिलीलीटर बाँझ 2.0 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके और उचित रूप से लेबल करें।
  3. उपयोग करने के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ऐलीकोट स्टोर करें।

3. सकारात्मक नियंत्रण मिश्रण की तैयारी

नोट: सकारात्मक नियंत्रण मिश्रण जांच / प्राइमर मिश्रण या अन्य मास्टर मिश्रण घटकों के रूप में एक ही बाँझ वातावरण में नहीं किया जाना चाहिए। न्यूक्लिएज मुक्त पानी के एक अलग कंटेनर का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. सार्स-कोव-2 सिंथेटिक आरएनए (एन 1) को 1,000,000 जीन प्रतियों / μL (cpμ) से 10,000 cpμ तक पतला करें, जो न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 990 μL में स्टॉक समाधान के 10 μL जोड़कर। 10,000 cpμ के 25 μL को बाँझ 0.2 mL ट्यूबों में और उचित रूप से लेबल में ऐलीकोट करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर अप्रयुक्त ऐलीकोट स्टोर करें।
    नोट: सिंथेटिक आरएनए को गिरावट को रोकने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  2. सिंथेटिक डीएनए (P1) Hs_RPP30 200,000 cpμ से 10,000 cpμ करने के लिए 950 μL न्यूक्लिएज मुक्त पानी के लिए स्टॉक समाधान के 50 μL जोड़कर पतला. 10,000 cpμ के 25 μL को बाँझ 0.2 mL ट्यूबों में और उचित रूप से लेबल में ऐलीकोट करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर अप्रयुक्त ऐलीकोट स्टोर करें।
  3. SARS-CoV-2 के 20 μL को जोड़कर प्रत्येक घटक को 200 cpμ की अंतिम सांद्रता में पतला करें और 10,000 cpμ स्टॉक को न्यूक्लिएज-मुक्त पानी के 960 μL में Hs_RPP30, कुल 1000 μL के लिए। एलीकोट 200 cpμ सकारात्मक नियंत्रण के मिश्रित 200 cpμ धनात्मक नियंत्रण को 0.2 mL ट्यूबों और लेबल में उचित रूप से लेबल करें। उपयोग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ऐलीकोट स्टोर करें।

4. मास्टर मिश्रण प्लेटों की तैयारी

नोट: सिंथेटिक SARS-CoV-2 आरएनए या रोगी के नमूनों से दूर एक बाँझ वातावरण में मास्टर मिश्रण बनाओ। मिश्रण में जोड़ने से पहले सभी घटकों को पूरी तरह से पिघलाया जाना चाहिए; उचित thawing के बिना, सांद्रता गलत हो सकता है. अपर्याप्त पिघलने को बर्फ की उपस्थिति या अभिकर्मकों के असमान रंग से इंगित किया जाता है। मिश्रण तैयार करते समय एक फ्रीजर ब्लॉक पर स्टोर करें।

  1. एक 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब में मल्टीप्लेक्स मास्टर मिक्स (48 एमएल की कुल मात्रा, तालिका 2) का एक बैच तैयार करें।
  2. 3x पर ट्यूब बारी से मिश्रण homogenize. ऊपर और नीचे या भंवर के रूप में यह एंजाइम को नुकसान पहुंचाएगा pipetting द्वारा मिश्रण मत करो.
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के 1.48 मिलीलीटर स्थानांतरित करके एक बाँझ 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से जलाशय के कॉलम 1-4 भरें। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार चार कॉलम भरता है, जो 12 प्लेटों के लिए पर्याप्त है।
  4. एक पन्नी सील के साथ गहरी अच्छी तरह से जलाशय को कवर और यह समर्पित मास्टर मिश्रण तरल हैंडलिंग रोबोट में जगह है। डेक 10 पर भरे हुए गहरे कुएं के जलाशय को रखें, डेक 1-6 पर छह खाली 384-अच्छी तरह से प्लेटें रखें, और डेक 11 पर P20 टिप बॉक्स रखें। गहरी अच्छी तरह से प्लेट और टिप बक्से को उजागर करें और रोबोट को बंद करें।
  5. रोबोट डेस्कटॉप अनुप्रयोग में प्रारंभ चलाएँ क्लिक करके कस्टम पायथन ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रारंभ करें।
  6. 40 मिनट के बाद, रन रुक जाएगा। भरे हुए 384 अच्छी तरह से प्लेटों को पन्नी मुहरों के साथ कवर करें, जबकि वे रोबोट में रहते हैं और पालन सुनिश्चित करने के लिए रोलर के साथ नीचे दबाते हैं। बैच पहचानकर्ता के साथ प्रत्येक प्लेट के किनारे को लेबल करें।
  7. डेक 1-6 पर छह नए खाली 384-अच्छी तरह से प्लेटें रखें और फिर से शुरू करें रन पर क्लिक करके ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करें। रन पूरा होने के बाद, पन्नी सील के साथ 384 अच्छी तरह से प्लेटों के अंतिम सेट को कवर करें।
  8. बैच गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक खाली 384-अच्छी तरह से प्लेट के कॉलम 1-3 और 22-24 में शेष मास्टर मिश्रण के पिपेट 2 μL। एक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट सील के साथ सील करें और थर्मोसाइकलर (अनुभाग 10.1-10.2) पर चलाएं। यदि किसी भी कुओं में N1 थ्रेशोल्ड चक्र (Ct) मान हैं या यदि 10 से अधिक कुओं में P1 Ct मान हैं, तो बैच दूषित है और इसका उपयोग नहीं किया जा सकता है।
  9. तैयार मास्टर मिक्स प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और तैयारी के 7 दिनों के भीतर उनका उपयोग करें।

5. नमूना संग्रह, सेवन, और गर्मी उपचार

  1. प्रतिभागियों को लार संग्रह से 30 मिनट पहले खाने, पीने, धूम्रपान करने या दंत स्वच्छता का संचालन करने से बचने के लिए निर्देश दें। प्रतिभागियों को कम से कम 1 मिलीलीटर लार इकट्ठा करने का निर्देश दें जो स्वाभाविक रूप से मुंह में पूल करता है और इसे परिरक्षकों के बिना एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जमा करता है, फिर ट्यूब को कैप करता है (पूरक फ़ाइल 3)।
  2. 70% इथेनॉल या कीटाणुरहित पोंछे के साथ लार संग्रह ट्यूबों के बाहर decontaminate और उन्हें परीक्षण के लिए प्रयोगशाला में स्थानांतरित.
  3. दैनिक सेवन स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल 4) में प्रत्येक नमूना बारकोड स्कैन करके नमूना आगमन रिकॉर्ड करें।
  4. गर्मी एक 95 डिग्री सेल्सियस ओवन में 30 मिनट के लिए स्कैन किए गए नमूनों का इलाज. गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने पहनते समय नमूनों को हटा दें।
    नोट: अनुपचारित नमूने कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर 72 घंटे तक स्थिर होते हैं। एक बार गर्मी का इलाज करने के बाद, नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, यदि तुरंत संसाधित नहीं किया जा रहा है।

6. नमूना असाइनमेंट

  1. नमूना असाइनमेंट स्टेशन पर कंप्यूटर पर प्रत्येक नमूना लोडहो रहा है रोबोट (पूरक फ़ाइल 5) के लिए दैनिक नमूना लोड हो रहा है स्प्रेडशीट खोलें।
  2. प्रत्येक 384-वेल प्लेट को 188 नमूने असाइन करें: नमूने 1-48 को तिमाही 1 माना जाता है, नमूने 49-96 को तिमाही 2 माना जाता है, नमूने 97-144 को तिमाही 3 माना जाता है, और नमूने 145-188 को तिमाही 4 माना जाता है। नमूने का विश्लेषण डुप्लिकेट में किया जाता है।
  3. प्लेट नाम, दिनांक, और तिमाही संख्या के साथ लेबल ट्रे. नमूना लोड हो रहा है स्प्रेडशीट में क्रम में नमूने स्कैन करें।
    नोट:: पहले प्लेटों से नमूने मैन्युअल रूप से चलाने की आवश्यकता हो सकती है, जैसा कि चित्र 3 में परिभाषित किया गया है। मैन्युअल नमूना असाइनमेंट और लोड िंग निर्देशों के लिए अनुभाग 8.1-8.3 देखें।

7. ऑपरेटिंग नमूना लोड हो रहा है रोबोट

  1. नमूना लोडिंग स्टेशन पर, रोबोट में डेक प्लेसमेंट के अनुरूप आठ 3 डी मुद्रित रैक के दो पूर्ण सेट ों को लाइन करें।
  2. Uncap तिमाही 1 ट्यूबों और 3 डी मुद्रित रैक में जगह, रैक 1 में स्थिति A1 के साथ शुरू. प्रत्येक रैक को बाएं से दाएं और ऊपर से नीचे तक भरें। रैक 2 में इस लोडिंग पैटर्न को जारी रखें, फिर रैक 4 और 5 पर आगे बढ़ें ( चित्रा 2 सी देखें)।
    नोट:: रैक रोबोट प्रोग्राम पैरामीटर के कारण लगातार गिने नहीं जाते हैं।
  3. डेक 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 पर भरी हुई तिमाही 1 नमूना रैक रखें। डेक 3 और 9 पर P20 युक्तियाँ प्लेस. सेट-अप प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए, रोबोट में पीछे से सामने तक सामग्री लोड करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस से एक पूर्वनिर्मित मास्टर मिक्स प्लेट लें, इसे प्लेट नाम के साथ लेबल करें और नियंत्रण कुओं (N23/24, O23/24, और P23/24) के चारों ओर पन्नी में एक रेखा काटने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग करें।
  5. डेक 6 पर मास्टर मिक्स प्लेट रखें और पन्नी कवर को छील लें, नियंत्रण कुओं को कवर करने वाले छोटे आयत को पीछे छोड़ दें। टिप बक्से को उजागर करें और रोबोट को बंद करें।
  6. रोबोट डेस्कटॉप अनुप्रयोग के माध्यम से प्रारंभ चलाएँ क्लिक करके कस्टम पायथन ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रारंभ करें। प्रत्येक तिमाही को प्लेट पर लोड करने में 24.5 मिनट लगते हैं; अनुस्मारक के रूप में टाइमर सेट करें.
  7. जबकि रोबोट चल रहा है, अनकैप और लोड क्वार्टर 2 नमूना ट्यूबों को 3 डी मुद्रित रैक के दूसरे सेट में जैसा कि अनुभाग 7.2 में वर्णित है।
  8. जब रोबोट रुकता है, तो क्वार्टर 1 रैक को हटा दें, और उन्हें क्वार्टर 2 रैक के साथ बदलें। क्लिक करें,चलाएँडेस्कटॉप अनुप्रयोग में चलाएँ पुनरारंभ करें .
  9. Recap तिमाही 1 नमूना ट्यूबों और उन्हें एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करते हुए, जबकि परिणामों की प्रतीक्षा कर रहा है.
    तिमाहियों 3 और 4 के लिए इस लोडिंग प्रक्रिया को दोहराएँ।
  10. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए भरी हुई प्लेट स्थानांतरित करें। संदूषण को कम करने के लिए, स्थानांतरण के दौरान प्लेट को कवर रखें।

8. मैनुअल नमूना लोड हो रहा है

नोट:: अपर्याप्त रोबोट लोडिंग के मामले में दोहराने वाले नमूनों (N1 Rerun या Rerun, चित्रा 3 देखें) पर एक एकल मैन्युअल रन निष्पादित करें।

  1. किसी भी दोहराए जाने वाले नमूनों को इकट्ठा करें और उन्हें तिमाही 4 में अंतिम नमूनों के रूप में असाइन करें (अनुभाग 6.2 देखें)। नमूने संख्या, बारकोड स्कैन करें, और मूल नमूना स्थान दर्ज करें और नमूना लोड हो रहा है स्प्रेडशीट में परिणाम।
  2. Biosafety कैबिनेट के लिए दोहराने के नमूने स्थानांतरण. रोबोट लोड रैक में दोहराने नमूना ट्यूब लोड न करें।
  3. प्लेट लेआउट आरेख (पूरक फ़ाइल 6) के बाद सही कुओं के लिए प्रत्येक दोहराने के नमूने के पिपेट 2 μL। रोगी के नमूने जोड़ने के लिए एक निर्दिष्ट पिपेट का उपयोग करें। संदूषण को कम करने के लिए नमूने जोड़ते समय पन्नी के साथ कवर किए गए नियंत्रण कुओं को रखें।

9. परीक्षण प्लेटों के लिए नियंत्रण के अलावा

  1. संदंश का उपयोग करके नियंत्रण कुओं पर दूर पन्नी कवर छील.
  2. न्यूक्लिएज मुक्त पानी के पिपेट 2 μL (कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं) कुओं N23-N24 और 200 cpμ मिश्रित सकारात्मक नियंत्रण के 2 μL (अनुभाग 3 को देखें) कुओं O23-O24 के लिए। पिपेट 2 एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में कुओं M23-M24 में एक पुष्टि की सकारात्मक रोगी नमूना नियंत्रण के 2 μL. मास्टर मिश्रण बैच की गुणवत्ता की निगरानी करने के लिए कुओं P23-P24 खाली छोड़ दें।
  3. प्लेट को ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट सील के साथ कवर करें और सभी कुओं को सील का पालन करने के लिए एप्लिकेटर रोलर का उपयोग करें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 30 सेकंड के लिए 2500 आरपीएम पर प्लेट को भंवर करें। 1 मिनट के लिए 500 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।

10. आरटी-qPCR प्रदर्शन

  1. वर्णित शर्तों के अनुसार थर्मोसाइकलर सॉफ़्टवेयर में एक प्रोटोकॉल प्रोग्राम बनाएँ (तालिका 3). भविष्य की प्लेटों के लिए प्रोटोकॉल सहेजें। सील की गई प्लेट को थर्मोसाइकलर में रखें और प्रोटोकॉल चलाएं।
  2. किसी .xslx फ़ाइल के रूप में Ct मान निर्यात करें और नमूना लोड हो रहा स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल 5) में मानों की प्रतिलिपि बनाएँ।
    नोट:: ये पत्रक कस्टम-निर्माता सॉफ़्टवेयर से Ct आउटपुट फ़ाइलों के लिए डिज़ाइन किए गए थे और अन्य स्वरूपों को स्वीकार करने के लिए संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।

11. प्लेट वैधता का निर्धारण

  1. प्लेट परिणामों को मान्य मानने के लिए सकारात्मक नियंत्रण और / या ज्ञात सकारात्मक नमूनों और नकारात्मक नियंत्रण दोनों को मान्य करें। निम्नलिखित मानदंडों के साथ नियंत्रण कुओं का आकलन करें।
    1. सकारात्मक नियंत्रण के लिए, जांचें कि क्या कम से कम एक सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से (O23 / O24) P1 और N1 जांच दोनों के लिए 22-28 के बीच सीटी मान पैदा करता है। वैकल्पिक रूप से, ज्ञात सकारात्मक नमूना कुओं (M23 / M24) P1 और N1 जांच पर P1 और N1 Ct मान <33 का उत्पादन करते हैं।
    2. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, जाँचें कि दो नकारात्मक नियंत्रणों में से किसी में कोई N1 या P1 Ct मान नहीं हैं अच्छी तरह से (N23/N24). पुष्टि करें कि प्लेट को अमान्य करने से पहले Ct मानों में मान्य प्रवर्धन वक्र हैं.

12. नमूना परिणामों की व्याख्या

  1. आरेख (चित्र 3) के बाद रोगी परिणाम निर्धारित करें और हल किए गए नमूनों की रिपोर्ट करें।
    1. मान्य या अमान्य के रूप में P1 परिणाम का आकलन करें। यदि P1 Ct <33 का परिणाम उत्पन्न करता है, तो अच्छी तरह से मान्य पर विचार करें और N1 से परिणाम के लिए आगे बढ़ें। यदि P1 Ct > = 33 या कोई Ct मान का परिणाम उत्पन्न करता है, तो अच्छी तरह से अमान्य पर विचार करें।
      1. हाँ, नहीं, या नहीं * के रूप में N1 परिणाम का आकलन करें। यदि N1 Ct <33 का परिणाम उत्पन्न करता है, तो कुआँ हाँ है। यदि N1 एक सीटी मूल्य का उत्पादन नहीं करता है, तो अच्छी तरह से नहीं है। यदि N1 एक सीटी > = 33 का उत्पादन करता है, तो अच्छी तरह से NO * है। पुष्टि करें कि सभी N1 Ct मान एक वास्तविक प्रवर्धन वक्र के साथ जुड़े हुए हैं। यदि N1 के लिए एक सीटी मान में कोई प्रवर्धन वक्र नहीं है, तो अच्छी तरह से नहीं है।
      2. दोहराए जाने वाले नमूनों (N1 Rerun या Rerun) की पहचान करें, उन्हें एक आंतरिक नमूना संख्या और नमूना प्रकार के साथ लेबल करें और उन्हें लोड हो रहे वर्कफ़्लो (अनुभाग 8.1-8.3) पर वापस करें.

13. प्रयोगशाला सफाई

  1. तरल हैंडलिंग रोबोट
    1. मध्यवर्ती स्तर कीटाणुनाशक के साथ सभी पक्षों को साफ करें। इथेनॉल का उपयोग न करें क्योंकि यह प्लास्टिक को नीचा दिखाएगा।
    2. धीरे से एक शराब (70% इथेनॉल या 100% isopropanol) पोंछने के साथ पिपेट टिप अंत और अपशिष्ट बिन पोंछें। कुंजीपटल और माउस को पोंछें।
  2. जैव सुरक्षा कैबिनेट
    1. मध्यवर्ती स्तर कीटाणुनाशक के साथ सभी सतहों को साफ करें। 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश को चालू करें।

Representative Results

हमने सार्स-कोव -2 (एन 1) और Hs_RPP30 (पी 1) दोनों के लिए सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड सामग्री के लिए आरटी-क्यूपीसीआर जांच और प्राइमरों के लिए पता लगाने की सीमा निर्धारित की। संयुक्त सिंथेटिक सार्स-कोव-2 आरएनए और पानी में सिंथेटिक Hs_RPP30 डीएनए की ज्ञात सांद्रता का 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने का कार्य किया गया था। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग आणविक भार को जीन प्रतिलिपि संख्या में परिवर्तित करने के लिए किया गया था

जीन प्रतिलिपि संख्या = (ng * 6.0221 x 1023)/((आधार जोड़े में लंबाई *660 g/mole) *1 x 109 ng/g)

और RT-qPCR किया गया था। RT-qPCR को पूरा करने के बाद, N1 का पता लगाने (चित्रा 4A) और P1 का पता लगाने (चित्रा 4B) के लिए रैखिक वक्रों ने जीन कॉपी सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में अच्छे सहसंबंध गुणांक दिखाए (R2 = 0.9975 और R2 = 0.9884, क्रमशः)। यह परिणाम इंगित करता है कि प्राइमर और प्रोब सेट का संयोजन निरोधात्मक नहीं है और एक जीन कॉपी / μL (Cq = 33) पर SARS-CoV-2 RNA का सटीक रूप से पता लगा सकता है। एक जीन कॉपी मोटे तौर पर एक वायरल कॉपी के बराबर है; हालांकि, हमने आरटी-क्यूपीसीआर की अर्ध-मात्रात्मक प्रकृति के कारण लार में मात्रात्मक वायरल कॉपी संख्या निर्धारित नहीं की। हमने वायरस-मुक्त लार (गर्मी-उपचारित और गैर-गर्मी का इलाज दोनों) में ज्ञात सांद्रता के सिंथेटिक सार्स-कोव-2 आरएनए को स्पाइक करके सकारात्मक लार के नमूनों का अनुकरण करने का प्रयास किया, लेकिन आरएनए की कम सांद्रता में एन 1 प्रवर्धन का उत्पादन करने में असमर्थ थे (डेटा नहीं दिखाया गया है)। यह RNase गिरावट या अन्य confounding कारकों के कारण हो सकता है।

स्वचालित और मैनुअल नमूना लोडिंग विधियों के बीच अंतर और अंतर-परख परिवर्तनशीलता का भी मूल्यांकन किया गया था। अंतर-परख परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, 20 अद्वितीय सकारात्मक नमूनों को मैनुअल (अनुभाग 8.1-8.3 में वर्णित) और स्वचालित (अनुभाग 7.1-7.11 में वर्णित) विधियों का उपयोग करके लोड किया गया था। N1 Ct मानों की तुलना यह निर्धारित करने के लिए की गई थी कि क्या तरल हैंडलिंग रोबोट और मैन्युअल नमूना लोडिंग ने समकक्ष परिणाम उत्पन्न किए (चित्रा 5A)। मैनुअल और स्वचालित विधियों के बीच रैखिक संबंध ने एक उच्च सहसंबंध गुणांक (R2 = 0.9088) का उत्पादन किया, यह दर्शाता है कि दोनों विधियां कार्यात्मक रूप से बराबर हैं। जैसे-जैसे N1 Ct मानों में वृद्धि हुई, Ct मानों की परिवर्तनशीलता में भी वृद्धि हुई। यह प्रवृत्ति लार के भीतर वायरल कणों के विषम वितरण के कारण होने की संभावना है, जो कम कणों के मौजूद होने पर अधिक स्पष्ट होती है। इंट्रा-परख परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, नमूना लोडिंग के दोनों तरीकों का उपयोग करके अद्वितीय लार नमूनों के कुओं को दोहराने से N1 सीटी मूल्यों के बीच एक तुलना की गई थी (चित्रा 5 बी)। स्वचालित नमूना लोडिंग (R2 = 0.9622) की प्रतिकृतियों के बीच रैखिक संबंध ने मैन्युअल लोडिंग (R2 = 0.9589) की तुलना में थोड़ा अधिक सहसंबंध गुणांक का उत्पादन किया, जो दोनों लोडिंग विधियों के लिए SARS-CoV-2 का पता लगाने की उच्च पुनरुत्पादन क्षमता का संकेत देता है।

अंत में, गर्मी उपचार विधियों के संबंध में लार चिपचिपाहट में कमी का मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 6)। नमूना परिवर्तनशीलता को समाप्त करने के लिए लार को एक एकल स्रोत से प्राप्त किया गया था। एक गर्मी उपचार विधि के भीतर पी 1 सीटी मूल्यों में अधिक परिवर्तनशीलता उच्च नमूना चिपचिपाहट का संकेत हो सकती है क्योंकि चिपचिपा लार को एस्पिरेटेड नहीं किया जा सकता है और ठीक से वितरित नहीं किया जा सकता है। दोनों 30 मिनट और 60 मिनट गर्मी उपचार विधियों का उत्पादन काफी कम नमूना परिवर्तनशीलता जब कोई उपचार नियंत्रण (पी = 0.0006 और पी = 0.0429, क्रमशः) की तुलना में। 30 मिनट और 60 मिनट के उपचार के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (पी = 0.2245); इसलिए, प्रसंस्करण समय को कम करने के लिए 30 मिनट की गर्मी उपचार विधि को लागू किया गया था।

Figure 1
चित्र 1: लार-आधारित RT-qPCR नैदानिक प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रयोगशाला वर्कफ़्लो. (A) नमूने एकत्र किए जाते हैं और 30 मिनट के लिए 95 °C पर गर्मी का इलाज किया जाता है। उपचारित नमूनों को इन-हाउस स्प्रेडशीट सिस्टम के माध्यम से रोगी की जानकारी के साथ क्रमबद्ध और ट्रैक किया जाता है। एक तरल हैंडलिंग रोबोट तैयार मास्टर मिक्स प्लेटों के डुप्लिकेट कुओं में नमूनों को लोड करता है। एक तकनीशियन मैन्युअल रूप से नियंत्रण लोड करता है, प्लेट को सील करता है, और प्लेट को प्रसंस्करण के लिए थर्मोसाइकिलर में रखता है। परिणामों का विश्लेषण एक स्वचालित कंप्यूटर सिस्टम के माध्यम से किया जाता है और एक तकनीशियन द्वारा सत्यापित किया जाता है। (बी) एक तकनीशियन मास्टर मिश्रण के लिए अभिकर्मकों को तैयार करता है जो एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक गहरे कुएं के जलाशय में जोड़ा जाता है। भरा हुआ गहरा अच्छी तरह से जलाशयों को एक समर्पित तरल हैंडलिंग रोबोट में लोड किया जाता है। पूर्ण प्लेटों को पन्नी के साथ सील किया जाता है, लेबल किया जाता है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: तरल हैंडलिंग रोबोट के लिए उपयोग किए जाने वाले लेआउट। (ए) मास्टर मिक्स प्लेट तैयारी रोबोट (ओं) के लिए डेक लेआउट। एक आठ-चैनल पिपेट के साथ, रोबोट को पिपेट युक्तियों को लेने के लिए प्रोग्राम किया गया है, 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से जलाशय से एस्पिरेट मास्टर मिश्रण, खाली 384-अच्छी तरह से प्लेटों में मास्टर मिश्रण वितरित करें, और पिपेट युक्तियों को एक अपशिष्ट बिन में बाहर निकालें। यह प्रति रन छह प्लेटों के लिए दोहराया जाता है। (बी) नमूना लोड िंग रोबोट (ओं) के लिए डेक सेटअप। एक एकल-चैनल पिपेट के साथ, रोबोट को एक पिपेट टिप लेने के लिए प्रोग्राम किया जाता है, एक लार के नमूने को एस्पिरेट किया जाता है, एक लार के नमूने को 384-अच्छी तरह से मास्टर मिक्स प्लेट के डुप्लिकेट कुओं में वितरित किया जाता है, और पिपेट टिप को एक अपशिष्ट बिन में बाहर निकाल दिया जाता है। यह प्रति रन 48 नमूनों के लिए दोहराया जाता है। (सी) 3 डी मुद्रित रैक के लिए नमूना ट्यूब लोडिंग आदेश। लाल तीर एक रैक के भीतर लोडिंग ऑर्डर को इंगित करते हैं, और सफेद बॉक्स्ड नंबर रैक के पूरे सेट के लोडिंग ऑर्डर को इंगित करते हैं। पूरा सेटअप 384-वेल प्लेट में डुप्लिकेट में 188 नमूने लोड करेगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नमूना जिसके परिणामस्वरूप फ़्लोचार्ट. वैध पी 1 और सकारात्मक एन 1 के साथ नमूनों को सार्स-कोव -2 के लिए मानव लार के नमूने सकारात्मक होने के लिए निर्धारित किया गया था। वैध और सकारात्मक / नकारात्मक नमूना परिणामों को निर्णायक माना जाता था। जिन नमूनों ने पहले रन में निर्णायक परिणाम उत्पन्न नहीं किए थे, उन्हें रीरन (आरआर को निरूपित) या एन 1 रीरन (एन 1 आरआर को निरूपित) के रूप में वर्गीकृत किया गया था। Rerun नमूनों में कोई मान्य P1 प्रवर्धन नहीं था, और N1 Rerun नमूनों में एक एकल प्रतिकृति में सकारात्मक N1 प्रवर्धन था। यदि बाद के मैन्युअल रन द्वारा कोई मान्य P1 प्रवर्धन उत्पन्न नहीं किया जा सकता है, या दोनों प्रतिकृतियों में सकारात्मक थ्रेशोल्ड (Ct >33) के ऊपर N1 Ct मान थे, तो नमूना परिणाम अनिर्णायक माने जाते थे। नैदानिक उद्देश्यों के लिए, रोगी के नमूने जो प्रयोगशाला में नहीं पहुंचे थे, पिपेट को लार की अपर्याप्त मात्रा थी या क्षतिग्रस्त हो गए थे, उन्हें अमान्य माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: N1 (SARS-CoV-2) सिंथेटिक आरएनए और P1 (Hs_RPP 30) सिंथेटिक डीएनए का आरटी-क्यूपीसीआर डिटेक्शन। मानक वक्रों को इस जांच /प्राइमर संयोजन का उपयोग करके सटीक पहचान की सीमा निर्धारित करने के लिए मानक विचलन के साथ प्लॉट किया गया था। (ए) संबंधित कमजोर पड़ने में प्राप्त माध्य सीटी मान (एन = 4) सिंथेटिक आरएनए की अनुमानित मात्रा (आरटी-क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के 10 μL में 1x100 से 1x104 आरएनए प्रतियां) के खिलाफ प्लॉट किए गए थे। (बी) संबंधित dilutions में प्राप्त माध्य Ct मान (n = 3) सिंथेटिक डीएनए की अनुमानित मात्रा (RT-qPCR प्रतिक्रिया के 10 μL में 1 x 100 से 1 x 104 जीन प्रतियां) के खिलाफ प्लॉट किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मैनुअल और स्वचालित लार स्थानांतरण SARS-CoV-2 (N1) सीटी मूल्यों के बीच तुलना। ज्ञात SARS-CoV-2 सकारात्मक लार के नमूने (n = 20) को एक तरल हैंडलिंग रोबोट द्वारा एक RT-qPCR मास्टर मिक्स प्लेट में डुप्लिकेट में लोड किया गया था। नमूनों में N1 के लिए 18-32 तक का सीटी मान होता है। एक ही नमूने तब मैन्युअल रूप से एक अलग प्लेट स्थान में डुप्लिकेट कुओं में लोड किए गए थे। (ए) रोबोट और मैनुअल नमूना लोडिंग दोनों का उपयोग करके अद्वितीय नमूनों से प्राप्त एन 1 सीटी मूल्यों को मैनुअल और रोबोट लोडिंग के बीच अंतर-परख परिवर्तनशीलता निर्धारित करने के लिए स्थानांतरित किया गया था। (बी) इंट्रा परख परिवर्तनशीलता भी रोबोट और मैनुअल नमूना लोडिंग दोनों से प्राप्त N1 सीटी मूल्यों के transposed प्रतिकृति का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: लार में चिपचिपाहट में कमी के लिए गर्मी उपचार विधियों का मूल्यांकन। सार्स-कोव -2 नकारात्मक लार को एक ही स्रोत से एकत्र किया गया था और एलीकोट को 95 डिग्री सेल्सियस पर 0 मिनट, 30 मिनट या 60 मिनट के लिए गर्मी का इलाज किया गया था। प्रत्येक स्थिति के तकनीकी प्रतिकृतियों (एन = 12) से पी 1 सीटी मानों को उपचार विधियों के बीच परिवर्तनशीलता निर्धारित करने के लिए प्लॉट किया गया था। समूहों के बीच pairwise तुलना एक unpaired t-परीक्षण के साथ मूल्यांकन किया गया था (*** p <0.001 इंगित करता है, * इंगित करता है p <0.05). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: कम P1 सीटी लार नमूनों में N1 सीटी की तुलना। कम P1 Ct के साथ सकारात्मक नमूनों का चयन किया गया था और N1 Ct (n = 106) के साथ तुलना की गई थी। N1 सीटी मूल्यों 14-33 से लेकर, परख संकेत लार के नमूनों में एक गतिशील रेंज है कि मानक वक्र के लिए तुलनीय है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

घटक अनुक्रम (5'→3') स्टॉक एकाग्रता आयतन
2019-nCoV-N1 जांच /5FAM/ACCCCGCAT/ZEN/TACGTTTGGTGGGACC/3IABkFQ 50 μM 500 μL
2019-nCoV-N1-के लिए GACCCCAAAAAATCAGCGAAAT 100 μM 2000 μL
2019-nCoV-N1-Rev TCTGGTTACTGCCCCAGTTGAATCTG 100 μM 2000 μL
Hs RPP30 Cy5 जांच /5Cy5/TTCTGACCT/ZEN/GAAGGCTCTGCGCG/3IABkFQ 50 μM 500 μL
Hs-RPP30-के लिए AGATTTGGACCTGCGAGCG 100 μM 2000 μL
Hs-RPP30-Rev GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 100 μM 2000 μL
पानी - - 11000 μL

तालिका 1: N1 + P1 जांच / प्राइमर मिश्रण के घटक।

घटक स्टॉक एकाग्रता प्रति अभिक्रिया आयतन अंतिम एकाग्रता बैच वॉल्यूम
लूना WarmStart आरटी एंजाइम मिश्रण 20X 0.5 μL 1X 3 mL
लूना बफर प्रतिक्रिया मिश्रण 2X 5.0 μL 1X 30 mL
N1+ P1 प्राइमर/ nCoV N1 F: 10 μM 0.5 μL 500 nM 3 mL
nCoV N1 R: 10 μM 500 nM
जांच nCoV N1: 2.5 μM 125 nM
RPP_30 P1 F: 10 μM 500 nM
RPP_30 P1 R: 10 μM 500 nM
P1 RPP_30 जांच: 2.5 μM 125 nM
न्यूक्लिएज मुक्त जल --- 2 μL --- 12 mL
उपयोग --- 8 μL --- 48 mL
साँचा 2 μL

तालिका 2: मल्टीप्लेक्स SARS-CoV-2 मास्टर मिश्रण के घटक।

मंच तापमान (°C) अवधि चक्रों की संख्या
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन 55 10 मिनट 1
प्रारंभिक विकृतीकरण 95 1 मिनट 1
टचडाउन 95 10 सेकंड 3
72 30 सेकंड
95 10 सेकंड 3
69 30 सेकंड
95 10 सेकंड 3
66 30 सेकंड
मुख्य प्रवर्धन 95 10 सेकंड 40
65 30 सेकंड

तालिका 3: टचडाउन RT-qPCR प्रोटोकॉल। एक कदम आरटी-qPCR सार्स-CoV-2 नैदानिक परख के लिए thermocycling शर्तों.

टचडाउन चरण कोई टचडाउन चरण नहीं
माध्य N1 Ct मतलब P1 Ct माध्य N1 Ct मतलब P1 Ct
नमूना 1 19.65 22.7 27.8 28.3
नमूना 2 22.24 24.9 28.77 30.5
नमूना 3 18.85 19.2 24.65 25.9
नमूना 4 25.56 22.8 31.93 29.2
नमूना 5 22.34 24.8 38.48 40.0 (खोज में विफल)

तालिका 4: कोई touchdown सीटी मानों के खिलाफ पांच सकारात्मक नमूनों के लिए touchdown सीटी मूल्यों की तुलना.

नमूना TigerSaliva व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लार आधारित सार्स-CoV-2 परख
N1 Ct P1 Ct कोविद -19 मूल्य RNaseP मान
D11 16.4 18.1 20.86 23.4
E11 18.9 19.1 25.6 21.2
F11 19.5 18.4 22.8 22.2
G11 22.2 19.1 23.7 22.9
H11 26.4 21.3 32.2 26.7
A12 14.8 16.5 29.15 19
B12 24 19.6 31.05 21.35
C12 14.9 17.5 20.84 18.9

तालिका 5: TigerSaliva सीटी परिणामों की तुलना और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लार आधारित सार्स-CoV-2 परख परिणाम. दोनों assays एक ही लार के नमूनों (एन = 8) पर प्रदर्शन किया गया था।

पूरक फ़ाइल 1: रोबोट मास्टर मिक्स प्लेट निर्माण के लिए कस्टम स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: नमूना लोड िंग रोबोट पर लार प्रसंस्करण के लिए कस्टम स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 3: प्रतिभागियों से उच्च गुणवत्ता वाले लार के नमूनों के स्व-संग्रह के लिए निर्देश। https://www.clemson.edu/centers-institutes/reddilab/index.html पर उपलब्ध परीक्षण प्रक्रिया के संक्षिप्त वीडियो विवरण में अधिक विवरण पाया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 4: नमूना सेवन स्प्रेडशीट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 5: नमूना स्प्रेडशीट लोड हो रहा है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 6: नमूना 384-अच्छी तरह से प्लेट लेआउट आरेख। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल में वर्णित परख एक स्वतंत्र सत्यापन अध्ययन द्वारा मूल्यांकन किया गया था। यह पाया गया कि परख में 98.9% विशिष्टता (1.1% झूठी सकारात्मक) और 90.0% संवेदनशीलता (10.0% झूठी नकारात्मक) थी, जब एक ही समय में लिए गए युग्मित नासोफरीन्जियल स्वैब के खिलाफ मूल्यांकन किया गया था (एन = 837; 817 नकारात्मक, 20 सकारात्मक)। महत्वपूर्ण रूप से, तीन प्रतिभागियों ने टाइगरसालिवा के साथ सकारात्मक परीक्षण किया और नासोफरीन्जियल स्वाब के साथ नकारात्मक परीक्षण किया, उन्हें 48 घंटे बाद स्वैब के साथ फिर से परीक्षण किया गया और सकारात्मक परिणाम लौटाए गए, यह दर्शाता है कि टाइगरसालिवा बीमारी के दौरान पहले सार्स-कोव -2 संक्रमण का पता लगाने में सक्षम हो सकता है।

हमने सार्स-कोव -2 सिंथेटिक आरएनए की ज्ञात सांद्रता के साथ वायरस-मुक्त लार (गर्मी-उपचारित और गैर-गर्मी दोनों का इलाज) स्पाइकिंग करके सकारात्मक लार के नमूनों का अनुकरण किया और लार में सीटी सीमा निर्धारित करने के लिए 10 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन किया। एन 1 जीन नकली सकारात्मक नमूनों में 10,000 जीन प्रतियों (लगभग सीटी = 28) से नीचे पता लगाने योग्य नहीं था। हमें संदेह है कि यह RNase गिरावट या अन्य confounding कारकों के कारण है। हालांकि, नग्न सिंथेटिक आरएनए के साथ लार RNases की बातचीत संभवतः वायरल कणों के साथ बातचीत से अलग है, यहां तक कि वे गर्मी से विकृत होने के बाद भी। सीटी >30 के साथ सकारात्मक लार के नमूनों की पहचान की गई है और बाहरी प्रयोगशालाओं ने इन नमूनों से सार्स-कोव -2 आनुवंशिक अनुक्रम डेटा प्राप्त किया है। हम अनुमान लगाते हैं कि वायरल प्रोटीन रोगी लार के नमूनों में आरएनए गिरावट से सुरक्षा प्रदान करते हैं।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम मास्टर मिक्स तैयारी और लार नमूना प्रसंस्करण (क्रमशः अनुभाग 4 और 7) के लिए स्वचालन का कार्यान्वयन है। यह कार्य प्रक्रियाओं को ओवरलैप करने की अनुमति देता है, जो टर्नअराउंड समय को काफी कम कर देता है। एक और महत्वपूर्ण कदम नैदानिक परिणाम व्याख्या (अनुभाग 11 और 12) है। मध्यवर्ती परिणाम श्रेणियों (Rerun और N1 Rerun) की स्थापना ने भी अनिर्णायक परीक्षण परिणामों की घटना को कम कर दिया।

हमने प्रदर्शित किया कि मैनुअल और स्वचालित लार नमूना लोडिंग विधियों के बीच भिन्नता नगण्य है (चित्रा 5 ए) और यह कि स्वचालन सार्स-कोव -2 डिटेक्शन (चित्रा 5 बी) की पुनरुत्पादकता में सुधार कर सकता है। नैदानिक प्रयोगशालाओं को डिजाइन और विस्तारित करते समय परीक्षण की सुविधा के लिए स्वचालन का पक्ष लिया जाना चाहिए25। प्रयोगशाला वर्कफ़्लो रोबोट-स्वचालित कार्यों के कार्यान्वयन के साथ बेहतर है26. तरल हैंडलिंग रोबोट की ओपन-सोर्स क्षमताएं प्रोटोकॉल डिजाइन के लिए कस्टम स्क्रिप्टिंग के कार्यान्वयन के लिए अनुमति देती हैं। यह पारंपरिक नैदानिक स्वचालन विधियों की तुलना में तरल हैंडलिंग रोबोट को एक सस्ती और अत्यधिक परिवर्तनीय प्रणाली बनाता है। यह अत्यधिक दोहराए जाने वाले प्रयोगशाला कार्यों को निष्पादित करने के लिए एक आदर्श रणनीति भी है। सिस्टम की अनुकूलन क्षमता का उच्च स्तर कमी के मामले में लैबवेयर (जैसे, संग्रह ट्यूब, पिपेट टिप्स, या 384-वेल प्लेट्स) को बदलने की स्वतंत्रता का अनुवाद करता है। इसलिए, तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके स्वचालन बड़े पैमाने पर और छोटे पैमाने पर निगरानी और अनुसंधान दोनों के लिए व्यवहार्य है।

इस परीक्षण रणनीति का एक बड़ा लाभ अन्य नैदानिक प्रयोगशालाओं के सापेक्ष बहुत कम टर्नअराउंड समय है। स्वचालित तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग टर्नअराउंड समय को कम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन रोबोट और थर्मोसाइकिलर्स का समवर्ती उपयोग भी परीक्षण दक्षता को अधिकतम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक रोबोट और थर्मोसाइकिलर को एक जोड़ी के रूप में संचालित किया जाना चाहिए, जहां दोनों मशीनों का उपयोग निर्बाध नमूना लोडिंग और नमूना परिणाम विश्लेषण के लिए अग्रानुक्रम में किया जाता है। एक बार असाइन किए गए नमूनों का एक स्थिर प्रवाह स्थापित होने के बाद, सभी मशीन जोड़े को एक साथ संचालित किया जा सकता है। रोबोट और थर्मोसाइकिलर्स के निरंतर समवर्ती उपयोग से परीक्षण क्षमता और दक्षता में काफी वृद्धि होती है, जो उच्च परीक्षण मात्रा को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

अन्य स्थापित SARS-CoV-2 RT-qPCR प्रोटोकॉल के विपरीत, हमने थर्मोसाइकिलर प्रोटोकॉल में एक टचडाउन चरण शामिल किया ताकि जांच की एनीलिंग में सुधार हो सके और लक्ष्य जीन 27 के लिए प्राइमर सेट किया जा सके, जिससे असफल प्रवर्धन का खतरा कम हो सके। परिणामों से पता चला है कि टचडाउन ने विशिष्ट प्राइमर बाइंडिंग (तालिका 4) के नुकसान को जोखिम में डाले बिना सकारात्मक नमूनों का पता लगाने में सुधार किया। हमने निर्धारित किया कि सार्स-कोव-2 आरएनए प्रतियों (चित्रा 4 ए) और Hs_RPP30 डीएनए प्रतियों (चित्रा 4 बी) दोनों की एक विस्तृत श्रृंखला को आरटी-क्यूपीसीआर परख द्वारा एक साथ पता लगाया जा सकता है।

तरल हैंडलिंग रोबोट की एक सीमा लार हस्तांतरण के दौरान सकारात्मक नमूनों से क्रॉस-संदूषण की संभावना है। लार एक विस्कोइलिस्टिक द्रव 28 है और पिपेट टिप से वितरित होने के बाद आसन्न कुओं में स्ट्रिंग हो सकती है। इसके अलावा, लार 29 की विषमता पूरे नमूने में वायरल कणों के असमान वितरण का कारण बन सकती है। यह झूठी सकारात्मक और नकारात्मक दोनों की संभावना को बढ़ाता है, जिससे एन 1 रीरन और रीरन नमूनों के पदनाम की आवश्यकता होती है। हालांकि, शुरू में एन 1 रीरन के रूप में नामित 14.1% नमूनों को सार्स-कोव -2 के लिए सकारात्मक के रूप में हल किया गया था और पुन: परीक्षण के बाद सकारात्मक के रूप में हल करने के लिए रीरन नमूनों की तुलना में 30 गुना अधिक संभावना थी। नतीजतन, N1 Rerun (चित्रा 3) से Rerun को अलग करना संभावित सकारात्मक नमूनों के अधिक सटीक अलगाव के लिए अनुमति दी गई, जिससे हमारे नैदानिक परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता बढ़ गई। नैदानिक लार परीक्षण के लिए अन्य परिणामी मापदंडों ने इस अंतर को 12,14,24,30,31 नहीं बनाया।

लार के नमूनों को विषमता और चिपचिपाहट 32 के कारण पिपेट करना मुश्किल हो सकता है। गर्मी उपचार लार बायोमैट्रिक्स में प्रोटीन को पर्याप्त रूप से विकृत करता है, चिपचिपाहट को कम करता है और आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों 9 की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो महामारी 10 के शुरुआती चरणों के दौरान दुर्लभ थे। विस्तारित गर्मी उपचार भी वर्तमान वायरस 33 को निष्क्रिय करता है जो कम जैव सुरक्षा स्तरों पर प्रयोगशाला प्रसंस्करण की अनुमति देता है। नतीजतन, एक गर्मी-आधारित आरएनए निष्कर्षण (धारा 5.4 में वर्णित) को प्रोटीन विकृतीकरण (चित्रा 6) के माध्यम से चिपचिपाहट को कम करने के लिए लागू किया गया था। परिणामों के आधार पर, हम मानते हैं कि गर्मी उपचार प्रोटीन बायोमैट्रिक्स को विकृत करने के अलावा लार के नमूनों को भी homogenize कर सकता है। अन्य समूहों ने समरूपता को बढ़ाने के लिए गर्मी उपचार और प्रोटीनेज के उपचार को जोड़ा9,14,34। हमने इस कदम को लागू नहीं करने का फैसला किया क्योंकि यह एक दर पर virion प्रोटीन को डीनेचर कर सकता है जो वायरल आरएनए को गर्मी क्षरण 35 के संपर्क में छोड़ देता है। इसके अलावा, प्रोटीनेज के साथ नमूना कमजोर पड़ने से सकारात्मक नमूनों को मास्क किया जा सकता है जिसमें कम वायरल कण होते हैं, जिससे संवेदनशीलता कम हो जाती है। इसके अलावा, परख परिणामों की तुलना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लार-आधारित सार्स-कोव-2 परख (Logix Smart COVID-19) से की गई थी जो चुंबकीय मनका आरएनए निष्कर्षण (तालिका 5) का उपयोग करता है। यह पाया गया कि वर्तमान परख व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख की तुलना में कमजोर सकारात्मक नमूनों का पता लगाने में बेहतर अनुकूल था।

केवल आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके लार में वायरस कॉपी नंबर को मापना मुश्किल है, क्योंकि क्यूपीसीआर अर्ध-मात्रात्मक है। सीटी मानों के बीच अंतर्निहित भिन्नता है जो तकनीकी सीमाओं से उत्पन्न होती है। जीन कॉपी संख्या को सीटी मानों (चित्रा 4) से निर्धारित किया जा सकता है और यह लगभग वायरल कॉपी संख्या के बराबर है। लार के नमूनों में वायरल कॉपी संख्या निर्धारित करने के लिए एक संभावित समाधान ddPCR है, जो प्रतिक्रिया में जीन प्रतियों का कठिन परिमाणीकरण प्रदान करता है। हालांकि, हमारा मानना है कि चिकित्सकों को गुणात्मक परिणाम प्रदान करने के लिए पर्याप्त है और सापेक्ष वायरल सामग्री की तुलना हमारे तरीकों से संसाधित नमूनों में की जा सकती है।

लार का उपयोग करते समय उत्पन्न होने वाली कुछ सीमाओं के बावजूद, लार-आधारित आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सार्स-कोव -2 परख परीक्षण के किसी भी पैमाने पर त्वरित और विश्वसनीय वायरल आरएनए का पता लगाने के लिए एक प्रभावी तरीका साबित होता है। यह विशेष रूप से सच है जब ओपन-सोर्स तरल हैंडलिंग सिस्टम के उपयोग के साथ युग्मित होता है। इस परीक्षण दृष्टिकोण को निदान के लिए प्रासंगिक अन्य न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसे कि संक्रामक रोग एजेंट, रोग मार्कर, या अन्य वायरस। यह परख दोनों नैदानिक और अनुसंधान नैदानिक प्रयासों के लिए लागू बनाता है.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है। प्रोटोकॉल में वर्णित परख सार्वजनिक स्वास्थ्य के येल स्कूल द्वारा दायर SalivaDirect EUA के तहत आता है.

Acknowledgments

लेखकों ने रेडडीआई लैब में क्लेमसन के प्रशासन, चिकित्सा कर्मचारियों और नैदानिक प्रयोगशाला कर्मचारियों को धन्यवाद दिया, जिन्होंने सार्स-कोव -2 परीक्षण को लागू करने और प्रबंधित करने में मदद की। हम डॉ फिलिप Buckhaults और डॉ कैरोलिन Bannister दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय से प्रारंभिक परियोजना परामर्श और उपकरण खरीद के लिए उद्योग संपर्कों के लिए धन्यवाद. हम नमूना संग्रह में उनकी सहायता के लिए कई छात्रों, प्रोफेसरों और कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। मानक वक्र डेटा संग्रह के लिए क्रिएटिव इंक्वायरी छात्रों को धन्यवाद। इस अध्ययन के लिए वित्त पोषण राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान P20GM121342 (डीडी और एलजीपी को सम्मानित), क्लेमसन एथलेटिक विभाग, क्लेमसन विश्वविद्यालय के अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष, और दक्षिण कैरोलिना गवर्नर और संयुक्त बॉन्ड समीक्षा समिति से प्राप्त किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% EtOH Fisher scientific 22-032-601
20 uL Filtered Pipette Tips Opentrons 20uL tips
2mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 14-666-313 Alternate product may be used
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells Thermo Scientific AB3384 Alternate product may be used
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates Fisher Scientific 50-828-743 For mastermix preparation
Clear PCR Sealing Sheets Thermo Scientific AB0558 Alternate product may be used
DPEC Treated Water Ambion (Thermo Scientific) AM9916
Flip Cap 50 mL Conical Tubes VWR 75845-210 For sample collection
Foil PCR Sealing Sheets Thermo Scientific AB0626 For storage of mastermix plates, Alternate product may be used
HS_RPP30 Synthetic DNA Integrated DNA Technologies 299788131 P1 positive control
Luna Buffer Probe One-Step Reaction New England Biolabs M3006B
Luna WarmStart RT Enzyme Mix New England Biolabs M3002B
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006830
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol Integrated DNA Technologies 10006832 Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006831
Opentron HEPA Filter Module Opentrons N/A Not required, but useful to reduce contamination
Opentron Multichannel Attachment, P20 Opentrons 999-00005 For mastermix preparation
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot Opentrons OT-2
Opentron Pipette Attachment, P20 Opentrons 999-0000215 For sample loading
Oven Memmert UF450 PLUS 208V-3PH
PCR Tubes (rnase, dnase free) Fisher Scientific 14-230-225 For aliquots of positive and neg controls
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes) VWR 10808-952
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes) VWR 10808-956
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol Integrated DNA Technologies 10007062 Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore
RNAse P Forward Primer, 100nmol Integrated DNA Technologies 10006836
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006837
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2 Twist Biosciences 102024 / 103907 / 103909 N1 Positive Control
Scanners Code CR1500 Only required when scaling up
Small HEPA Filtered Hood Erlab Captair Bio 321 For mastermix preparation
Thermocycler CFX384 Touch Biorad CFX384 Touch Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus
X-acto Knife Set Staples N/A To cut foil for keeping control wells covered

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, N., et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).
  2. Chen, J. Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses. Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).
  3. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  4. Honein, M. A., et al. Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).
  5. World Health Organization. Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051 (2020).
  6. Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance (2020).
  7. Larremore, D. B., et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).
  8. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  9. Chu, A. W., et al. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).
  10. Guan, D., et al. Global supply-chain effects of COVID-19 control measures. Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).
  11. Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).
  12. Pasomsub, E., et al. Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).
  13. To, K. K., et al. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).
  14. Vogels, C. B., et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).
  15. Griesemer, S. B., et al. Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing. Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).
  16. Wehrhahn, M. C., et al. Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).
  17. Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).
  18. Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).
  19. Centers for Disease Control. 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html (2020).
  20. Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2. Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).
  21. Villanueva-Cañas, J. L., et al. Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR. PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).
  22. Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy. , Available from: https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php (2020).
  23. Matic, N., et al. Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).
  24. Sahajpal, N. S., et al. SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance. Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904 (2021).
  25. Genzen, J. R., et al. Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).
  26. Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. Clinical Laboratory Automation: A Case Study. Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).
  27. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).
  28. Bhat, P. P., et al. Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments. Nature Physics. 6, 625-631 (2010).
  29. Miller, C. S., et al. Current developments in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).
  30. Moreno-Contreras, J., et al. Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).
  31. Wang, W., et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).
  32. Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).
  33. Lista, M. J., et al. Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation. PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).
  34. Brotons, P., et al. Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).
  35. Batéjat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 180
कुशल SARS-CoV-2 मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज पीसीआर लार नैदानिक रणनीति ओपन-सोर्स पिपेटिंग रोबोट का उपयोग कर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ham, R. E., Smothers, A. R., King,… More

Ham, R. E., Smothers, A. R., King, K. L., Napolitano, J. M., Swann, T. J., Pekarek, L. G., Blenner, M. A., Dean, D. Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots. J. Vis. Exp. (180), e63395, doi:10.3791/63395 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter