Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolasjon og karakterisering av cyanobakterielle ekstracellulære vesikler

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

Den nåværende protokollen gir detaljerte beskrivelser for isolasjon, konsentrasjon og karakterisering av ekstracellulære vesikler fra cyanobakterielle kulturer. Tilnærminger for rensing av vesikler fra kulturer i ulike skalaer, avveininger blant metoder og hensyn til arbeid med feltprøver diskuteres også.

Abstract

Cyanobakterier er en mangfoldig gruppe fotosyntetiske, Gram-negative bakterier som spiller kritiske roller i globale økosystemer og fungerer som essensielle bioteknologiske modeller. Nyere arbeid har vist at både marine og ferskvann cyanobakterier produserer ekstracellulære vesikler - små membranbundne strukturer frigjort fra mikroberens ytre overflate. Mens vesikler sannsynligvis bidrar til ulike biologiske prosesser, forblir deres spesifikke funksjonelle roller i cyanobakteriell biologi stort sett ukjente. For å oppmuntre til og fremme forskning på dette området, presenteres en detaljert protokoll for å isolere, konsentrere og rense cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Det nåværende arbeidet diskuterer metoder som med hell har isolert vesicles fra store kulturer av Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis. Metoder for kvantifisering og karakterisering av vesicleprøver fra disse stammene presenteres. Tilnærminger for isolering av vesicles fra akvatiske feltprøver er også beskrevet. Til slutt diskuteres også typiske utfordringer med cyanobakteriell vesiclerensing, metodologiske hensyn for ulike nedstrømsapplikasjoner, og avveiningene mellom tilnærminger.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er sfæriske strukturer, som varierer mellom ~ 20-400 nm i diameter, utgitt av nesten alle organismer i deres omkringliggende miljø 1,2,3. Vesicles er avgrenset av en lipid bilayer og kan ikke gjenskape seg selv. I Gram-negative bakterier antas disse strukturene først og fremst å oppstå ved å "blebbe" av små porsjoner fra den ytre membranen. Likevel kan andre prosesser, inkludert flagellarbevegelse, cellelys og sekresjon av både indre og ytre membranmateriale, produsere vesicles samt 4,5. Elbiler kan inneholde ulike biomolekyler, inkludert lipider, løselige og membranproteiner, nukleinsyrer og metabolitter, og kan transportere dette materialet mellom cellene 4,5,6. Gitt disse funksjonene studeres elbiler for å forstå deres mulige roller i et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert cellulær kommunikasjon, biofilmdannelse, horisontal genoverføring, vertsfasingsdynamikk og næringsutveksling 4,6.

Cyanobakterier er en stor og mangfoldig gruppe Gram-negative bakterier, inkludert encellede og filamentøse organismer. De er av interesse fra mange perspektiver, inkludert å forstå deres fysiologi og mangfold 7,8, de kritiske økosystemfunksjonene de betjener 9,10, og deres nytte for bioteknologi11,12. Cyanobakterier finnes i et bredt spekter av habitater, enten som frittlevende organismer i marine, ferskvann og terrestriske miljøer, eller i symbiotiske assosiasjoner med moser, bregner, planter eller i lav og svamper13. De fungerer som avgjørende primærprodusenter i akvatiske økosystemer, produserer oksygen og organisk karbon gjennom oksygenisk fotosyntese 9,10, og noen er i stand til å fikse atmosfærisk nitrogen også7. Marine og ferskvann cyanobakterier, inkludert Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis, produserer elbiler under laboratorieforhold 14,15,16, og cyanobakterielle vesikler finnes også i naturlige miljøer 14,17. De biologiske og økologiske funksjonene til cyanobakterielle vesikler er ukjente, men videre forskning på dette området vil sannsynligvis gi ny innsikt i spørsmål om cyanobakteriell fysiologi, differensiering, kommunikasjonsstrategier, evolusjon og trofiske interaksjoner. I tillegg kan cyanobakterielle elbilers evne til å bære ulike kategorier av biomolekyler ha kommersielle applikasjoner18,19.

Den nåværende protokollen beskriver metoder for å isolere og karakterisere vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver for å muliggjøre og oppmuntre til en bredere undersøkelse av cyanobakteriell ekstracellulær vesiclebiologi. Mens arbeidsflyten beskrevet her er analog med protokoller for isolering og karakterisering av elbiler fra andre bakterier, inneholder cyanobakterielle kulturer og feltprøver vanligvis lavere celle- og vesiclekonsentrasjoner enn det som ofte observeres med vertsrelaterte eller patogene modellsystemer 20,21,22. Studier av cyanobakterielle elbiler krever derfor spesielle hensyn og optimaliseringer for dyrking og vesicleisolasjon, som varierer videre mellom stammer og mediebakgrunn. Siden ingen enkeltprotokoll vil fungere like bra for alle stammer, vekstforhold og nedstrømsapplikasjoner, tilbyr vi flere alternativer og diskuterer avveiningene som er involvert, slik at forskerne kan bestemme tilnærmingene som passer best for å løse deres eksperimentelle spørsmål.

Protocol

De cyanobakterielle stammene er hentet fra flere kultursamlinger (se Diskusjon for detaljer).

1. Cyanobakteriell dyrking

  1. Dyrk marine cyanobakterier Prochlorococcus og Synechococcus ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Dyrk Prochlorococcus- og Synechococcus-stammer i polykarbonatflasker ved hjelp av et passende medium som Pro99 eller SN (se Materialfortegnelse). For detaljer, se tidligere publiserte referanser23,24.
    2. Akklimatiser kulturene ved å dyrke dem over to til tre overføringer (1:20 fortynning av kultur til friske medier for hver passasje) under de ønskede temperatur- og bestrålingsforholdene som kreves for eksperimentet.
      MERK: Typiske vekstforhold23,25 inkluderer temperaturer mellom 15-30 °C ved bestråling mellom 8-150 μmol fotoner m-2 s-1, men individuelle belastningstoleranser og optima varierer mye26 og må settes basert på veiledning fra relevante kultursamlingsinstruksjoner eller litteratur. Overvåk vekstraten ved hjelp av kulturfluorescens eller strømningscytometri teller23, og sørg for at kulturer vokser med en konsistent eksponentiell rate i steady-state før du begynner eksperimentet.
    3. Utfør et sett med påfølgende gradvise overføringer fra mindre til større volumer når cellene når sen eksponentiell fase (f.eks. 20 ml < 250 ml < 2 L < 10 L < 20 L).
      MERK: Store volumkulturer kan ikke inokuleres direkte fra små mengder startkultur. Vær oppmerksom på at større kulturer kan kreve tilsetning av buffere (for eksempel 1 mM HEPES, pH 7,5 eller 3,75 mM TAPS, pH 8), sammen med supplerende natriumbikarbonat eller boblende med steril luft24.
  2. Dyrk ferskvann cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803.
    1. Forbered en kultur av Synechocystis sp. PCC 6803 som skal brukes som inoculum ved å dyrke den med lufting (boblende luft ved 1 L /min), ved 30 °C, under 16 timers lys (fotoner teller 50 μmol m-2 s-1) / 8 t mørkt regime, opp til en optisk tetthet ved 730 nm (OD730) på 1,0 (eksponentiell fase) i BG11 medium27.
    2. Inokuler 30 ml av denne kulturen Synechocystis sp. PCC 6803 i 570 ml BG11 medium til en OD730 av 0,05 i 1 L glassgassvaskflasker.
    3. La cellene vokse med lufting, ved 30 °C, under 16 timers lys (fotontall på 50 μmol m-2 s-1) / 8 t mørkt regime, opp til et endelig OD730 på 1,0-1,5.

2. Separasjon av cyanobakteriell biomasse fra den lille partikkelfraksjonen (vesicle)

MERK: For det første anbefales det å skille celler fra supernatanten gjennom sentrifugal pelletering av celler. Men når kulturvolumene er for store til at dette kan være mulig, er det mulig å hoppe over sentrifugering og fortsette direkte til å filtrere hele kulturer ved hjelp av kapselfiltrering (trinn 2.4).

  1. Utfør sentrifugering til separate celler (best for volumer opp til ~4 L, avhengig av tilgjengelig sentrifugekapasitet).
    1. Autoklaver eller vask sentrifugeflaskene grundig med vann av ultrarent type type Type I (se Materialfortegnelse), og påse at det ikke gjenstår rester av såpe eller annet materiale.
    2. Last kulturprøver inn i et passende antall sentrifugerflasker og balanser dem.
    3. Spinnkulturer i > 10 000 x g ved 4 °C i 10 minutter. Hvis supernatanten forblir synlig uklar, øk sentrifugeringsforholdene til 20 minutter ved maksimal hastighet og prøv på nytt.
    4. Dekanter forsiktig eller rørt supernatant inn i et rent kar og fortsett til en av følgende filtreringsalternativer som er nevnt i trinn 2.2-2.4.
  2. Alternativ 1: Utfør sprøytefiltrering med 0,2 μm filtre (for prøvevolumer opp til ~ 50 ml).
    1. Fyll en steril 50 ml sprøyte med et stort sett cellefritt kulturmedium, og filtrer den gjennom et filter på 0,2 (eller 0,45) μm polyetersulfon (PES) (se materialtabellen). Samle filtratet i en ren, sterilisert beholder.
    2. Gjenta dette trinnet til filteret er tilstoppet (f.eks. blir det vanskelig å skyve med sprøyten). Erstatt med et nytt filter, og fortsett til prøven er grundig filtrert.
  3. Alternativ 2: Utfør 0,2 μm vakuumfiltrering (opptil ~ 4 L).
    1. Vask og rengjør vakuumapparatet grundig ved hjelp av type I - ultrarent vann, koble det til en vakuumfelle og pumpe (se Materialbord).
    2. Sett inn et 0,2 μm filter med riktig diameter og klem vakuumapparatet.
    3. Tilsett en liten mengde kulturprøve, og sørg for at vakuumtrykket forblir <10 psi.
    4. Fortsett å filtrere kulturen i små intervaller til den er fullført. Hvis filtreringshastigheten avtar betydelig, stopp vakuumet og skift ut filteret.
    5. Samle den <0,2 μm fraksjonen som inneholder vesicles i en ren beholder.
  4. Alternativ 3: utfør 0,2 μm kapselfiltrering (for prøvevolumer > ~ 4 L)
    1. Rengjør fleksibelt rør- og oppsamlingsbeholder på riktig måte ved å vaske med vann og mildt vaskemiddel. Skyll materialet med destillert og deionisert vann.
      MERK: Før bruk skal materialet skylles med type I - ultrarent vann.
    2. Plasser kulturen som skal filtreres på et sikkert, forhøyet sted med det endelige oppsamlingsfartøyet nedenfor. Koble et kapselfilter på 0,2 μm (se Materialliste) til ett rørstykke og plasser det i et oppsamlingsbeholder.
    3. Plasser en annen slange i prøven, start en gravitasjonssifon ved å trekke noen prøver inn i slangen med en sprøyte, og koble slangen til kapselfilteret. Bruk ventilen til å frigjøre overflødig luft og fyll kammeret med supernatant.
    4. La materialet bevege seg gjennom kapselen til prøven er grundig filtrert. Hvis strømningshastigheten blir for langsom (< ~ 1/10th startstrømningshastigheten, eller kommer ut fallende i motsetning til en kontinuerlig flytende strøm), vent eller bruk forsiktig kraft med en peristaltisk pumpe til tilbaketrykket øker. Alternativt kan du delvis gjenopprette strømningshastighetene ved å midlertidig koble fra filteret, bakgrunnsflushing akkumulert biomasse fra innstrømningssiden med ultraclean vann til materialet ikke lenger er synlig uklart, og start deretter filtreringsprosessen på nytt.

3. Konsentrere vesicle-prøven

  1. Alternativ 1: Utfør sentrifugal ultrafiltrering for å konsentrere små (<500 ml) volum av prøver.
    1. Skyll de 15-20 ml ultrafiltrerings sentrifugalkonsentratorene du velger med type I - ultrarent vann.
    2. Legg konsentratorene inn i sentrifugen og spinn ved 4400 x g ved 4 °C. Kast gjennomkjøringen og gjenta dette trinnet minst to ganger til.
    3. Legg den supernatante prøven i vannskyllede konsentratorer og spinn under samme forhold. Avhengig av eksperimentelle mål, kan prøvefiltratet kastes eller samles inn for ytterligere konsentrasjon (med konsentratorer med en nominell molekylvektgrense på 3 kDa) og analyse.
    4. Gjenta dette trinnet til prøven er konsentrert til et endelig volum på ~ 15-30 ml.
  2. Alternativ 2: Utfør tangentiell strømningsfiltrering (TFF) for å konsentrere et stort (>500 ml) prøvevolum.
    1. Sett opp TFF-apparatet i henhold til produsentens retningslinjer (se Materialfortegnelse). Fest en peristaltisk pumpe til inntakslinjen og plasser justerbare klemmer på retentate-linjen. Desinfiser TFF som anbefalt av produsenten, og skyll deretter enheten med 1 L vann av type I - ultrapure grade.
      MERK: Inntaks- og retentatelinjene skal plasseres i et rent prøvereservoar (glassflaske). Filtratlinje(r) skal rettes inn i et avfallsfartøy eller en vask.
    2. Tilsett <0,2 μm filtrat i prøvereservoaret. Øk pumpehastigheten og tilbaketrykksnivåene langsomt på retentatelinjen for å øke produksjonen fra filtratlinjene.
    3. Fortsett å kjøre TFF, og fyll på reservoaret med kultur supernatant når materialet fjernes. Unngå å la inntakslinjen komme ut av prøven under behandlingen for å unngå å introdusere luftbobler. Pass på at matetrykket ikke overstiger ~ 10 psi og at retentate strømmer ut av TFF i et konsistent tempo tilbake i reservoaret.
    4. Slutt å konsentrere prøven når volumet i reservoaret når lavest mulig mengde som trengs for å opprettholde strømmen inn i inntakslinjen uten å introdusere luftbobler.
    5. Lukk utløpslinjen med en klemme. Fjern tilbaketrykket på retentatelinjen og omsirkuler den konsentrerte supernatanten gjennom filteret i ~ 10 min, og reduser resirkuleringshastigheten til 20-40 ml / min for å maksimere utvinningen.
    6. Flytt retentate-linjen inn i et rent kar, fjern inntakslinjen fra prøven og samle det konsentrerte materialet. Utvinn eventuelt gjenværende materiale i prøvereservoaret ved hjelp av en pipette.
    7. Filtrer det konsentrerte supernatantet gjennom et 0,2 μm sprøytefilter (trinn 2.2) for å sikre at ingen celler forblir.
      MERK: Trinn 3.2.7 er valgfritt.
    8. Oppbevar om nødvendig det endelige konsentratet ved 4 °C i ca. 3 uker før du går over til vesicle rensing (trinn 4).

4. Vesicle isolasjon og rensing

  1. Pellet direkte ved ultracentrifugation ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Plasser den konsentrerte <0,2 μm kulturprøven i et rent ultrasenterrør. Tilsett rent medium eller buffer etter behov for å sikre at røret er helt fylt.
      MERK: Hvis den endelige kulturprøven er for stor til å passe i ett rør, kan du enten pellet materialet i flere rør som skal kombineres før vasketrinnene eller pelletsen serielt i samme rør.
    2. Om nødvendig, lag en balanse og spinn ved ~ 100,000 x g i 3 timer ved 4 °C.
    3. Fjern forsiktig supernatanten med en pipette. Mens cyanobakterielle vesicle pellets kan vise litt farge, er de ofte usynlige.
    4. Vask det pelleterte materialet ved å legge til ferske kulturmedier eller vaskebuffer som 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (se Diskusjon) til ultracentrifugerøret, bland ved skånsom pipettering, og spinn igjen som i trinn 4.1.2. Gjenta vaskeprosessen en gang til.
    5. Resuspend den endelige pellets i frisk kultur ved gjentatte ganger, men forsiktig pipettering opp og ned rundt bunnen av røret med en 1 ml pipette. Overfør til et rent fartøy.
  2. Utfør tetthet gradient ultracentrifugation.
    1. Forbered jodloksanollagrer (se Materialfortegnelse) ved å lage en 4x konsentrert versjon av bufferbakgrunnen som er ønsket for prøven (se Diskusjon).
    2. Bland en del av 4x bufferen med tre deler av 60% jodxanol lager for å lage en 45% iodixanol løsning.
    3. Fortynn 45% iodixanol med volumer på 1x buffer for å skape lagre av gradientmedier ved 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% og 10% endelige iodiksanolkonsentrasjoner.
      MERK: Den totale mengden som trengs vil variere med kapasiteten til ultracentrifuge rotoren / rørene.
    4. Sett opp en ultracentrifuge tetthetsgradient ved å nøye legge over like mengder på 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% og 0% ioxidinol i et ultracentrifuge rør slik at hele volumet av røret brukes.
      MERK: Den ekstracellulære vesicle-prøven som skal renses, bør plasseres øverst på gradienten som en del av 0% jodxanollaget. Hvis det endelige volumet av vesicle-prøven overskrider størrelsen på 0% laget, bland overflødig vesicle-prøve med nok 45% iodixanol og / eller buffer for å generere det nødvendige volumet av 10% eller høyere konsentrasjonsoptimpreplagre, og bruk disse på tilsvarende sted i gradienten.
    5. Snurr gradienten ved ~100 000 x g ved 4 °C i 6 timer.
    6. Samle brøker (vanligvis 0,5 ml hver for en ~4,5 ml gradient) ved forsiktig pipettering eller bruk av en brøksamler (se Materialtabell).
    7. Bestem tettheten til hver brøk (i g/ml) ved hjelp av en analytisk balanse og kalibrert pipette for å måle vekten av et kjent prøvevolum. Fjern prøven fra røret, bestem vekten og returner prøven direkte.
    8. Fortynn individuelle fraksjoner i et nytt ultracentrifuge rør med ren buffer og vask materialet som nevnt i trinn 4.1.2-4.1.4. Alternativt kan du bruke dialyse- eller ultrafiltreringskolonner for å gjenopprette partikler.
      MERK: Cyanobakterielle ekstracellulære vesicles migrerer vanligvis til oppdriftstettheter på ~ 1,14-1,19 g / ml i jodoksanol.
  3. Oppbevar vesiklene ved 4 °C hvis de skal brukes innen 1-3 uker. Frys vesiklene ved -20 °C eller -80 °C hvis de ikke brukes lenger enn den perioden.

5. Karakterisering av de isolerte vesikler

  1. Utfør negativ flekkoverføringselektronmikroskopi (se Materialtabell) (TEM, partikkelstørrelse, struktur, renhet).
    1. For å forbedre bildekvaliteten, glødutladning av overflaten på et tidligere belagt TEM-rutenett ved hjelp av et glødutladningssystem i henhold til produsentens retningslinjer (se Materialfortegnelse).
    2. Påfør forsiktig ~ 5 μL av vesicle prøven og la sitte i 5 min.
      MERK: Prøver med vesiclekonsentrasjoner > 109 ml-1 vil vanligvis gi de beste resultatene; mer fortynnede prøver vil ha få vesicles per bilde.
    3. Fjern prøven ved å berøre kanten av et rutenett til et stykke rent filterpapir.
    4. Rør en 20-50 μL dråpe av 2% uranylacetat (se Materialbord) på en flat overflate dekket av plastfilm, og legg rutenettet flytende på toppen av det i 2 min.
    5. Fjern uranylacetat ved hjelp av filterpapir og flyt kort på en dråpe ultrapure vann for å vaske. Gjenta vannvasken en gang til.
      MERK: Det endelige tørkegitteret er klart for visualisering etter trinn 5.1.5.
  2. Utfør ultratynn seksjonsfarging for TEM (partikkelstørrelse, intern struktur).
    1. Resuspend pellet fra trinn 4.1.5 med 1 ml 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakroktolatbuffer (pH 7) (se Materialtabell) og fest prøven i 2 timer ved 4 °C.
    2. Spinn ved ~100 000 x g i 1 t ved 4 °C.
    3. Vask pelletsen forsiktig med 0,1 M natriumkakrodosylatbuffer (pH 7), og spinn deretter ved ~ 100 000 x g i 1 time ved 4 °C.
    4. Fest pelletsen med 1 ml 1% osmium tetroksid (se Materialtabell) (fremstilt i 0,1 M natriumkakroktylatbuffer) i 1 t, og vask deretter som i trinn 5.2.3.
    5. Dehydrer prøven med 1 ml av en stigende serie etanol (50%, 70%, 90% og to ganger i absolutt etanol) i trinn på 10 min hver ved 4 °C.
    6. Tilsett 250 μL epoksyharpiks (se Materialtabell) blandet med absolutt etanol (1:1) til pelletsen og inkuber over natten ved 4 °C.
    7. Overfør pelletsen til 500 μL ren harpiks i 24 timer. Deretter inkuberer du harpiksen ved 65 °C i 48 timer.
      MERK: Harpiksen er nå klar til seksjonering av ultramikrotom, i henhold til produsentens anvisninger (se Materialliste).
    8. Flekk gitteret som inneholder seksjoner med 2% uranylacetat (i 50% etanol) i 5 min. Vask glidene forsiktig under rennende deionisert vann i 10-15 s hver. Plasser en dråpe blysitrat (se Materialtabell) og flekk i ytterligere 5 min.
    9. Vask som før, fjern vannet ved å blåse opp gitteret på et filterpapir og lufttørke gitteret. Visualiser etter TEM i henhold til produsentens retningslinjer (se Materialfortegnelse).
  3. Utfør nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) (partikkelstørrelse, konsentrasjon).
    1. Tørk forsiktig støv eller synlig materiale av den optiske flaten ved hjelp av linsepapir. Kontroller om alle O-ringer og andre tetninger er rene og intakte. Slå på instrumentet og start opp programvaren.
    2. Bruk en ren sprøyte, fyll kammeret med ultra-rent vann. Pass på at det ikke er luftbobler til stede.
    3. Klikk på Start kamera og visualiser det optimale området i kammeret om 'avtrykket'. Juster mikroskopstadiet horisontalt eller vertikalt etter behov, slik at signalintensiteten er jevn over bildeområdet. Flytt bildeområdet vannrett i forhold til avtrykket (til høyre, mot den loddrette linjen), og finn et område i nærheten med lavt bakgrunnssignal.
    4. Skyv skyvekontrollene for skjermforsterkning og kameranivå til maksimum, og reduser deretter til det laveste nivået for å se de mest nedtonede partiklene.
      MERK: Typiske innstillinger for cyanobakterielle vesicles bruker en skjermforsterkning på 7 og kameranivå mellom 10-12.
    5. Juster fokuset etter behov for å sikre at partiklene er omtrent like synlige på tvers av synsfeltet. Fortsett å skyve ultrarent vann gjennom kammeret til du visuelt har bekreftet at kammeret er rent.
    6. Fjern gjenværende vann fra kammeret ved hjelp av en annen sprøyte.
    7. Undersøk en prøve av mediet/bufferen prøven din er i for å bestemme bakgrunnspartikkelkonsentrasjonen ved å fylle kammeret med media/buffer ved hjelp av en ren 1 ml sprøyte.
    8. Velg Standardmål fra ROP-rullegardinlisten . Endre innstillinger for å samle minst tre tekniske replikeringer av 60 s videoer hver. Trykk Opprett og kjør skript, og følg instruksjonene. Skyv ~100 μL prøve inn i kammeret mellom replikeringer.
    9. Når oppkjøpet er fullført, fjern restbufferen med en sprøyte, skyll 3-5 ml ultrarent vann gjennom kammeret, og fjern det gjenværende vannet.
    10. Legg vesicle-prøven til kammeret ved hjelp av en 1 ml sprøyte og bekreft oppkjøpsinnstillingene. Hvis partikkelantallet ikke er innenfor instrumentets lineære område (vanligvis mellom 20-80 partikler/ramme), må prøven fortynnes eller konsentreres. Skyv minst 500 μL prøve inn i kammeret før du samler inn data.
    11. Samle inn videodata som i trinn 5.3.8, og sørg for å rengjøre kammeret med ultra-rent vann mellom forskjellige prøver.
    12. Samle alle påfølgende prøver fra samme organisme / eksperiment ved hjelp av identiske kamerainnstillinger for å sikre sammenlignbarhet av data; Endringer i kameranivåinnstillingen kan ha en merkbar effekt på de endelige verdiene som oppnås.
    13. Bestem partikkelparametere ved hjelp av analysedelen av programvaren. Velg Analyse > Åpne eksperiment, og last inn eksempelfilen. Velg Behandle valgte filer , og vent til analysen er fullført. Sørg for å bruke samme deteksjonsterskel for alle påfølgende prøver fra samme eksperiment.
      MERK: Siden cyanobakterielle vesikler ofte er nedtonet, må deteksjonsterskelen vanligvis justeres til den mest følsomme (laveste) verdien.
  4. Utfør dynamisk lysspredning (DLS) (partikkelstørrelse, zetapotensial).
    1. Filtrer gjennom et 0,2 μm porestørrelsesfilter for alle prøver som går inn i DLS for å skjerme ut store partikler som forstyrrer målinger.
    2. Legg til 1 ml av mediet/bufferen i en ren cuvette for å undersøke mulige aggregasjoner eller andre nanopartikler som kommer fra mediet. Sett cuvette med frostet side til venstre inn i mikroprøven, og lukk lokket. La prøven likevekte i minst 5 min.
    3. Angi brytningsindeksen til materialet og materialabsorpsjonen hvis de avviker vesentlig fra standardene for vann.
      MERK: Materialegenskapene vil ha svært liten innflytelse hvis vesiklene er mindre enn 100 nm. Ved måling av overflatepotensialet (zetapotensialet) til elbiler, bør vesicles brukes på nytt i det opprinnelige vekstmediet.
    4. Klikk på Instrument Kontrollpanel for å sjekke avlesningene og starte datainnsamlingen ved å klikke på det grønne ikonet. Hvis verdiene ser bra ut og mediene/bufferen ikke inneholder aggregasjoner eller andre partikler, er du nå klar til å måle prøven.
    5. Legg til 1 ml vesicle-prøve i en ren cuvette og samle inn data som nevnt i trinn 5.4.4. Samle minst tre tekniske replikeringer i 10 minutter hver.
  5. Utfør lipopolysakkaridanalyse (LPS) for å bekrefte at Gram-negative elbiler er til stede i prøven.
    1. Varmeprotese vesicle prøve ved 95 °C i 10 minutter i standard 1x Laemmli prøvebuffer (se Materialfortegnelse).
    2. Inkuber med 0,2 U av type XIV-protease fra Streptomyces griseus (se Materialtabellen) ved 37 °C i 30 minutter for å fjerne forurensende glykoproteiner.
    3. Separate behandlede prøver ved elektroforese på denaturering av 16 % (w/v) SDS-polyakrylamidgeler etter den tidligere publiserte protokollen16.
    4. For å oppdage LPS, flekk gelen enten med kommersielt tilgjengelige fargesett eller med en modifisert sølvfargingsteknikk28. Kvantifisere den relative LPS-overfloden ved densitometrianalyse av fargede geler i henhold til tidligere publiserte Referanser 29,30.

6. Vesicle produksjon rate målinger

  1. Bruk nanopartikkelsporingsanalyse som i trinn 5.3, eller tilsvarende teknologi, måler partikkelkonsentrasjonen i vekstmediet for eksperimentet. Hvis det blir funnet et høyt partikkelantall, filtrerer du gjennom et 0,1 μm porefilter og kontrollerer på nytt.
    MERK: For å minimere feilen, bør mediebakgrunnspartikkelkonsentrasjonen være mindre enn 10% av partikkelkonsentrasjonen som finnes i kulturer med lavest tetthet.
  2. Akklimatiser kulturen ved å dyrke celler for minst to påfølgende serielle overføringer under media og miljøforhold som er ønsket for forsøkene som i trinn 1.1.2. Kulturer må overføres mens de fortsatt er i eksponentiell vekstfase. Sørg for at de målte vekstratene for kulturen er konsistente på tvers av overføringer; Hvis ikke, fortsett å overføre kulturer til vekstratene er reproduserbare.
  3. Samle tidskursprøver ved inokulering og regelmessig tidsbetimede intervaller over vekstkurven inn i den tidlige stasjonære fasen. Forskyv tidspoeng for å få samlet inn minst 3-4 prøver i hele spekteret av eksponentiell vekst. Hvis du vil ta prøver på hvert tidspunkt, utfører du følgende trinn.
    1. Filtrer 1 ml eller mer av kulturen direkte gjennom et rent, sterilt 0,2 μm sprøytefilter og lagre filtratet for å måle vesikleskonsentrasjon som i trinn 5.3. Frys tidskursprøvene hvis ønskelig. Bruk relativ fluorescens for å følge kulturens vekstdynamikk.
    2. Lagre et utvalg av hele kulturen for å bestemme populasjonsstørrelsen ved hjelp av en metode som passer for organismen (strømningscytometri, kolonibelegg; eller på annen måte).
  4. Oppnå målinger av celler og vesicle-lignende partikler (per ml) ved hvert tidspunkt.
  5. Identifiser tidspunktene som oppstod i den eksponentielle vekstfasen. Hvis du vil beregne r, antall vesikler produsert per celle per generasjon, mellom to punkt under eksponentiell vekst (vanligvis begynnelsen og slutten av tidskurset), bruker du ligningen i Tilleggsfil 1.
    MERK: Denne metoden er bare gyldig under vekstforhold i steady-state; underliggende forutsetninger og avledning av beregningen er beskrevet i referanse14.

Representative Results

Figur 1 presenterer en oversikt over den cyanobakterielle vesicleisolasjonsprosessen, og fremhever viktige aspekter ved protokollen som er beskrevet her. Spesielt oppmerksom er trinnene som beskriver separasjon av cyanobakteriell biomasse fra den lille partikkelfraksjonen (vesicle), som konsentrerer vesicleprøven og vesicleisolasjon og rensing (figur 1, trinn 2 til 4), som er avgjørende for å oppnå reproduserbare preparater av vesikler. Figur 2 presenterer representative resultater fra isolering og karakterisering av ekstracellulære vesikler fra cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803. Den ytre membranen i denne cyanobakterien har vist seg å inneholde karotenoider31, som gir en karakteristisk oransje farge til vesikles prøver samlet inn ved direkte pelleting gjennom ultracentrifugation (figur 2A). Når vesiclepellet er resuspendert, kan vesikler undersøkes ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), enten ved å fargeprøver med uranylacetat negativt (figur 2B) eller ved observasjon av ultratynne seksjoner (figur 2C). Vesicle størrelsesfordeling og konsentrasjon kan vurderes ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) (figur 2D) og nanopartikkelsporingsanalyser (NTA) (figur 2E). Med den beskrevne protokollen ble vanligvis ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanopartikler per ml oppnådd i en eksponentielt voksende kultur av Synechocystis sp. PCC 6803 ved en OD730 av 1,0. Biokjemiske analyser av isolerte elbiler kan utføres for å utfylle den fysiske karakteriseringen av de isolerte vesikler. Som et eksempel ble rensede Synechocystis sp. PCC 6803 vesicles skilt på en SDS-polyakrylamidgel og farget for lipopolysakkarider (LPS; Figur 2F). Siden LPS er spesifikke for den ytre membranen32, kan LPS-deteksjon validere tilstedeværelsen av membranbundne vesikler og tjene som en markør for å analysere relativt vesicleinnhold mellom preparater fra samme stamme33. Inspeksjon av den relative overfloden av lav vs. høy molekylvekt LPS kan indikere endringer i vesiclesammensetning mellom prøver 34,35.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelle prosedyrer som brukes for cyanobakteriell EV-isolasjon og karakterisering. Skjematiske representasjoner av voksende kulturer (1) og separasjon av cyanobakteriell biomasse fra vekstmediet (2). Cellefrie prøver som inneholder vesikler er konsentrert (3), og deretter isoleres og renses elbilene (4). Avhengig av bruksområdet kan vesiclepreparater karakteriseres ved hjelp av en eller en kombinasjon av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), dynamisk lysspredning (DLS) og lipopolysakkarid (LPS) profilering (5). RT, romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater av den ekstracellulære vesicleisolasjonen og karakteriseringen for cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografi av den ekstracellulære vesicle pellet (EVs pellet) oppnådd etter ultracentrifugation av konsentrert cellefri ekstracellulær medium fra en 600 ml Synechocystis sp. PCC 6803 kultur vokst til en OD730 av 1,0-1,5. Legg merke til den typiske oransje fargen på vesicle pellet avledet fra karotenoidene som finnes i den ytre membranen. (B,C) Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) fotografier av negativt fargede (B) og ultratynne seksjoner (C) av Synechocystis sp. PCC 6803 vesicle prøver. Vektstenger: henholdsvis 200 nm og 50 nm. Prøver ble visualisert på et transmisjonselektronmikroskop operert ved 80 kV. (D) Typisk DLS-plott (Dynamic Light Scattering) som viser fordelingen av vesiclevolum som en funksjon av vesicle diameter (i nm). Fargede linjer angir data fra tre tekniske replikeringsmålinger av samme prøve. (E) Representative nanopartikkelsporingsanalysedata (NTA) av Synechocystis ekstracellulær vesicle størrelsesfordeling (i nm). Den svarte linjen angir gjennomsnittet av tre tekniske replikeringer, og de røde linjene representerer standardfeilen for gjennomsnittet. (F) Lipopolysakkarider (LPS)-profil ble påvist etter å ha separert vesiclepreparatet ved elektroforese på en 16% (w / v) SDS-polyakrylamidgel og farging med et kommersielt LPS-fargesett. Lav- og høymolekylær LPS, tilsvarende henholdsvis grov- og glatt-LPS-former, kan påvises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Formel for å beregne r. Antall vesikler produsert per celle per generasjon mellom to punkter under eksponentiell vekst (vanligvis begynnelsen og slutten av tidsforløpet) bestemmes ved hjelp av denne ligningen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Generelle hensyn
Protokollen (figur 1) presenteres som et sett med alternativer for å markere at det ikke finnes noen "one-size-fits-all"-metode for å arbeide med cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Interesserte forskere kan bruke delene av denne protokollen som er kompatible og passende for deres spesielle modellorganisme, eksperimentelle spørsmål / mål og utstyrstilgjengelighet. Alle vesicle isolasjon tilnærminger innebærer avveininger og vil uunngåelig resultere i en viss grad av skjevhet. Mens man bør søke å minimere dette når det er mulig, er det viktigste hensynet å sikre at den detaljerte metodikken som brukes, rapporteres i henhold til passende MISEV (Minimal informasjon for studier av ekstracellulære Vesicles) retningslinjer36.

Kulturvekst
Cyanobakterielle kulturer kan lett fås fra en av de mange kultursamlingene som er tilgjengelige over hele verden. Noen få eksempler er Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrike), Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, France) og Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Den cyanobakterielle valgstammen må dyrkes under passende middels og miljømessige forhold, varierende betydelig blant forskjellige stammer. En liste over ofte brukte medier for cyanobakteriell dyrking finner du på kultursamlingsnettsteder eller andre publikasjoner 37,38,39.

Å jobbe med cyanobakterielle ekstracellulære vesicles gir noen unike utfordringer sammenlignet med metodene som rapporteres for mange typiske modelllaboratorium heterotrofer. Cyanobakterielle kulturer har vesikkelkonsentrasjoner av størrelsesordener lavere enn de som finnes i andre mikrober som Escherichia coli 14,16,40. Disse forskjellene, antagelig som følge av lavere celletettheter og/eller vesicle-produksjonsrater, betyr at relativt store kulturer (~1-20 L eller mer) kan være nødvendig for å gi tilstrekkelig materiale til bulkanalyser. Dermed oppfordres forskere til å teste vesicle utbytter fra mindre kulturer for å bestemme hvor mye materiale som vil være nødvendig for å oppnå sine ønskede sluttmål. Viktigheten av å fastslå om mediene som brukes til eksperimentet har en påviselig svevestøvbakgrunn, må også understrekes før du begynner et eksperiment, da dette materialet potensielt kan forvirre vesiclepopulasjonskvartifisering, redusere følsomheten til vesicle konsentrasjon / størrelsesmålinger, eller forurense de endelige vesiclepreparatene.

En annen utfordring for feltet er at ikke alle cyanobakterier vokser godt, eller i det hele tatt, i ren kultur. Inntil gjengitt aksenisk, tolkninger av fysiske vesicle egenskaper, produksjon priser, eller innhold kan ikke nødvendigvis føre til klare konklusjoner om vesikler produsert av noen belastning i samfunnet. Forskere anbefales også å vurdere hvilke andre typer partikler som kan være til stede og potensielt forveksles med vesikler av spesifikke nanopartikkelanalyseverktøy, som ikke nødvendigvis kan diskriminere mellom forskjellige partikkeltyper. For eksempel kan det være viktig å verifisere at belastningen som brukes mangler en prophage, enten via genomsekvensering, induksjonsanalyser eller på andre måter eller ikke frigjør andre typer partikler. Etter vår erfaring er de fleste cyanobakterielle vesiklene <0,2 μm i diameter, men når man ser på en ny stamme eller veksttilstand, bør man bekrefte om bruk av et 0,45 μm porestørrelsesfilter endrer størrelsesfordelingen av rensede partikler.

Mange aspekter av kulturforhold kan påvirke vesicle produksjon og innholdet41,42. Dermed må de fysiske og kjemiske forholdene som brukes til kulturvekst (inkludert lysbestråling, temperatur og mediesammensetning) dokumenteres og kontrolleres i den grad det er mulig for å sikre reproduserbarhet av resultater. Enhver kjemisk analyse av vesicleinnhold må ta hensyn til bakgrunnssammensetning, spesielt ved gjennomføring av "-omics" stil høygjennomstrømningsanalyser. Dette kan være spesielt kritisk når du bruker udefinerte medier, for eksempel de som er basert på en naturlig sjøvannsbakgrunn eller supplert med gjærekstrakt eller trypton. Å bruke et definert vekstmedium kan være å foretrekke avhengig av de eksperimentelle målene.

Forskere må nøye overvåke kulturvekstdynamikken med jevne mellomrom for å sikre at de vet hvor i vekstfasen en gitt batchkultur er, og ikke bare samle prøver etter en vilkårlig tid. Vesicle-sammensetningen kan variere på tvers av vekstfaser, spesielt mellom eksponentielle og stasjonære faser41,42. For eksempel kan minst en brøkdel av vesikler som er samplet i den stasjonære fasen oppstå fra en annen cellulær mekanisme, for eksempel cellelys, som ikke vil oppstå under eksponentiell vekst. Selv om dette fortsatt kan være av stor biologisk interesse, er det viktig å kjenne prøven. Hvis en cyanobakteriell kultur når ønsket vekstfase på et tidspunkt da det ikke er mulig å fortsette direkte til prøvekonsentrasjon, separere cellene fra <0,2 μm brøkdel umiddelbart (med sentrifugering og / eller direkte 0,2 μm filtrering), og deretter lagre den cellefrie filtratet ved 4 °C anbefales. Materialet kan lagres på denne måten i dager med liten eller ingen merkbar innvirkning på konsentrasjonen eller størrelsesfordelingen av vesikler.

Vesicle rensinger
Det hyppige behovet for å isolere vesikler fra betydelige volumkulturer er avgjørende i den cyanobakterielle vesicleisolasjonsarbeidsflyten. Når du arbeider med større mengder materiale, må vesiklene konsentreres før nedstrøms separasjonsarbeidsflyter. Konsentratorer (tangentielle strømningsfiltermembraner eller sentrifugalkolonner) med en nominell molekylvektgrense på 100 kDa anbefales vanligvis, da de tillater separasjon fra løselig materiale med lav molekylvekt samtidig som konsentrasjonstiden holdes rimelig, men 30 kDa-filtre brukes også ofte med suksess. Mens flere ikke-ultracentrifugation-baserte metoder for rensing av vesikler (f.eks. størrelseseksklusjonskromatografi, mikrofluidbaserte systemer, affinitetsfangstteknikker og nedbørsbaserte tilnærminger) blir populære i det ekstracellulære vesicle-feltet, etter vår erfaring, kan disse tilnærmingene resultere i reduserte utbytter og er vanligvis uforenlige med kulturvolumene som trengs.

Forskere må vurdere sammensetningen av jodxanolbakgrunnen og vaske-/resuspensionbufferne som brukes under vesicle rensing for å sikre at de er kompatible med de ønskede nedstrømsapplikasjonene. I mange tilfeller kan den endelige vesicle-prøven brukes på nytt i vekstmedier eller en definert buffer som kan sammenlignes i sammensetning med vekstmediet (f.eks. naturlig vs. kunstig sjøvann). Dette kan imidlertid ikke være mulig med marine cyanobakterielle vesikler, noe som vil kreve ytterligere eksperimentell manipulering for analyse, da høye saltkonsentrasjoner som ligner sjøvannsnivåer kan hemme mange enzymatiske reaksjoner. I slike tilfeller fungerer standard laboratoriebuffere som 0,2 μm filtrert, 1x PBS vanligvis bra for å opprettholde stabiliteten til marine cyanobakterielle vesicles og kan være mer kompatible med nedstrøms eksperimentelle prosesser.

Tetthet gradient rensing kan betraktes som valgfritt avhengig av eksperimentelle mål og kultursammensetning, men anbefales sterkt for å produsere en mer strengt ren og reproduserbar prøve. EV-populasjoner er heterogene og finnes på tvers av en rekke oppdriftstettheter, som ytterligere varierer etter belastning, vekstforhold og andre faktorer 4,5,6. Tetthetene som er oppført ovenfor representerer de som vanligvis finnes for vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver i jodoksanol, men resultatene i andre stammer kan variere. Andre tetthetsgradientmaterialer som sukrose og CsCl kan brukes til vesikler, men de vil migrere til forskjellige oppdriftstettheter i disse bakgrunnene. Ulike gradient media bakgrunner kan bias utvinning av lipid-lukkede virus43 og kan potensielt påvirke utvinning av vesicles fra ulike stammer.

Vesicle kan gå tapt på flere punkter gjennom vesicle isolasjon, og gradient rensing prosessen beskrevet her, redusere utbyttet og øke mengden startmateriale som trengs for å oppnå en gitt endelig vesicle utbytte for nedstrøms applikasjoner. Spesiell forsiktighet bør utvises ved arbeid med vesicle pellets etter ultracentrifugation. Mens noen cyanobakterielle vesikler kan ha karotenoider eller andre forbindelser som kan gi vesikkelprøver en viss mengde pigmentering (figur 2), avhengig av belastningen eller mengden materiale, forventes det ikke nødvendigvis å kunne visualisere vesiles pellet direkte. Vær oppmerksom på hvor pellets forventes å bli gitt typen sentrifugerotor som brukes. Når det er mulig, foreslås rensede vesicleprøver å bli undersøkt av elektronmikroskopi for å verifisere sammensetningen av det endelige materialet som er gjenvunnet.

Virkningen av lagringsforholdene på vesicles og innholdet forblir et åpent spørsmål. Selv om det er funnet at lagringen ikke har en bemerkelsesverdig effekt på cyanobakteriell vesicle størrelse eller konsentrasjon14, kan funksjonaliteten til isolerte vesiclepreparater endres over tid44. Mens fryse-/tinesykluser bør unngås når det er mulig, synes effekten av å fryse prøver på generelle vesicle-tall og størrelser å være minimal. Man bør være klar over potensialet for fryse-tine sykluser for å påvirke sammensetningen av vesicle innhold, for eksempel lengden på vesicle-assosierte nukleinsyrer eller stabiliteten av proteiner.

Vesicles fra field samples
Dagens metoder for å isolere ekstracellulære vesikler fra naturlige vannmiljøer er konseptuelt og operasjonelt lik de som er beskrevet her for store volumkulturer. Likevel kan de kreve enda større mengder materiale. Slike feltprøver kan innebære innsamling, filtrering og konsentrasjon av hundrevis til tusenvis av liter vann for å oppnå tilstrekkelig materiale til analyse. Avhengig av turbiditeten til prøven som brukes, kan det være nødvendig med inkorporering av ett eller flere forfiltreringstrinn før 0,2 μm-filteret. Den spesifikke TFF-enheten som brukes, bør være egnet for arbeid med så store volumer på rimelig tid (ideelt sett i timerekkefølgen) og uten å legge for mye press på prøven. I praksis innebærer dette ofte å bruke et mye større totalt overflateareal enn det som kan brukes på kulturbaserte prøver, samt rør med større diameter for å lette økte strømningshastigheter. Dette økte filteroverflatearealet vil sannsynligvis føre til en marginal økning i partikkeltap sammenlignet med mindre TFF-ordninger og et større sluttvolum av konsentrat; Disse bekymringene må imidlertid balanseres med hensyn til total saksbehandlingstid. For situasjoner som et utvidet oseanografisk cruise der prøver ikke vil komme tilbake til et laboratorium i mange dager etter prøvetaking, anbefaler vi å utføre innledende filtrerings- og TFF-trinn på 0,2 μm i feltet. Dette mindre volumet av konsentrert materiale kan deretter lagres ved 4 °C eller -80 °C om bord (avhengig av tilgjengelighet og nedstrøms analytiske hensyn) til det returneres til laboratoriet for endelig behandling.

Isolasjon og separasjon av ekstracellulære vesikler fra andre små partikler, både organiske og uorganiske, kan være utfordrende, og metoder for å skille forskjellige partikler er ennå ikke perfekte. For eksempel kan jodxanol tetthet gradienter ikke lett skille alle klasser av vesicles og virus tilstede i en gitt prøve. Ettersom typer forvirrende partikler, og deres fysiske egenskaper, vil variere mellom prøvetakingssteder, er det for tiden umulig å gi en protokoll som robust vil partisjonere alle klasser av små akvatiske partikler. Prøving og feiling er avgjørende, og eksperimentering med jodloksanolområdet som brukes i gradient- og ultracentrifugationforholdene, vil være nødvendig for å maksimere separasjonen; En samling mindre volum, mer fint løst tetthet brøker kan også være nødvendig. Avhengig av konteksten kan bruk av CsCl-graderinger i stedet for jodloksanol bidra til å skille miljøpartikler45. Likevel kan endringen i osmotiske forhold føre til skjevheter i de endelige gjenvunne produktene, som diskutert ovenfor.

Vesicle karakterisering
Nanopartikkelanalyseinstrumenter er ennå ikke rutinemessig tilgjengelige i mikrobiologiske laboratorieinnstillinger, men blir stadig mer tilgjengelige. Alle metoder har fordeler og ulemper, og vi gjør ingen spesifikk godkjenning av en plattform som bedre enn alle andre for cyanobakterielt vesiclearbeid; Faktisk har alle spesielle avveininger angående kostnader, oppløsning, brukervennlighet, deteksjonsgrenser, kompatibilitet med forskjellige vekstmedier / bufferbakgrunner og datareroduserbarhet. I tillegg til instrumenter basert på nanopartikkelsporingsanalyse beskrevet ovenfor, kan andre tilnærminger, inkludert nanostrømcytometri, mikrofluid resistiv pulssensor og justerbar resistiv pulsmåling, brukes46,47. Brukere bør være forsiktige med å lære detaljene i deres tilgjengelige instrumentering og verifisere at det fungerer bra med systemet deres, da vi har opplevd vanskeligheter når de bruker noen plattformer med sjøvannsbaserte medier. Vi oppfordrer feltet til å bevege seg mot kvantitativ karakterisering av vesicle størrelse, konsentrasjoner og produksjonsratene. Måling av vesiclekonsentrasjoner på en grunnleggende partikkel per ml-basis, og ikke når det gjelder proteininnhold eller andre beregninger, vil tillate integrering av vesikler i mer kvantitative rammer og muliggjøre intercomparisons mellom stammer og forhold. Videre innsats for å forbedre evnen til å kalibrere konsentrasjonsmålinger for < 100nm partikler er nødvendig.

Det faktum at vesicle produksjonshastighetsmålinger gjøres direkte fra 0,2 μm filtrert kultur supernatant for å minimere partikkeltap, vil være forbundet med andre rensetrinn beskrevet ovenfor. Dette betyr imidlertid at tilnærmingen ikke nødvendigvis diskriminerer mellom faktiske ekstracellulære vesikler og andre små partikler som finnes i kulturene. Bare telling av partikler innenfor bestemte størrelsesområder (f.eks. 50-250 nm diameter) kan bidra til å utelukke noen outliers, men visuell bekreftelse på at pelleted <0.2 μm kulturinnhold synes å være membranbundne vesikler (ved TEM eller andre tilnærminger) er nødvendig for å kunne spesifikt hevde at man måler produksjonen av vesikler i motsetning til produksjon av vesicle-lignende partikler.

En viktig faktor i vesicle karakterisering er å sikre at vesicle prøven blir analysert i riktig lineær følsomhetsområde av nanopartikkel analyse enhet. Når en prøve er for konsentrert, er det enkelt å fortynne det materialet med en ren buffer og analysere det på nytt. På den annen side kan den relativt lave celle- og/eller vesicletettheten til noen cyanobakterielle kulturer noen ganger gi vesiclepreparater som er under noen instrumenters deteksjonsgrenser. I tilfeller der dette skjer med bulk vesicle rensing, kan man vurdere å vokse større volumkulturer, re-pelleting og resuspending det endelige materialet i et mindre volum, eller vurdere om det er et skritt i isolasjonsprosessen der overdreven tap oppstår og kan reduseres. Ved måling av vesicle produksjonshastigheter er rettelsene ikke nødvendigvis så enkle. Prøver kan konsentreres om nødvendig, men den første bør se om justeringer i mediet kan føre til høyere celletetthet eller om tilstrekkelig konsentrerte prøver kan oppnås fra senere tidspunkter i eksponentiell fase der konsentrasjonene vil være høyere.

Begrensninger
Som med alle protokoller har vesicleisolasjon ved hjelp av disse tilnærmingene klare begrensninger. Disse tilnærmingene er ikke avhengige av deres garanti for at en helt ren forberedelse av vesicles vil bli isolert. Både kulturer og feltprøver kan inneholde andre materialer, som migrerer på samme måte som vesikler i tetthetsgradienter. Likevel er disse typer ekstra rensemetoder i det minste avgjørende for å sikre strenghet og reproduserbarhet av vesicleanalyse. Mens vi beskriver vesicle isolasjon tilnærminger i sammenheng med cyanobakterier, kulturer av mange andre mikrober vil også inneholde vesikler ved relativt lave konsentrasjoner, og prosedyrene beskrevet her bør være generelt anvendelige. Det forventes at disse metodene ikke vil fungere som en permanent protokoll, men i stedet som et utgangspunkt for å anspore fremtidige fremskritt i arbeidet med ekstracellulære vesicles fra forskjellige mikrober. Fremtidig innsats er nødvendig for å fusjonere disse metodene med andre tilnærminger som størrelseseksklusjonskolonner eller asymmetrisk feltflytfraksjonering for å forbedre diskriminering og separasjon av ulike kategorier av små partikler fra kulturer og miljøprøver. Vi håper også at disse teknikkene kan fortsette å utvikle seg sammen med forbedringer i nanopartikkelkarakteriseringsteknologier for å forbedre evnen til å undersøke heterogenitet innen vesiclepopulasjoner, deres innhold og deres eksakte funksjonelle roller i miljøet.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner støtten fra i3S Scientific Platforms "Biointerfaces and Nanotechnology", og "Histology and Electron Microscopy", et medlem av den nasjonale infrastrukturen portugisisk plattform for bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Vi takker også prof. J. A. Gonzalez-Reyes (University of Córdoba, Spania) for å bidra til å optimalisere den ultratynne seksjonsfargingsprotokollen for TEM, og Dr. Cecília Durães og Dr. Ana Rita Pinto (Universitetet i Porto, Portugal) for nanopartikkelsporingsanalysen.

Dette arbeidet ble finansiert av US National Science Foundation (OCE-2049004 til SJB), av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) midler gjennom COMPETE 2020 Operacional Program for Competitiveness and Internationalization (POCI), Portugal, 2020, og av portugisiske midler gjennom Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior innenfor rammen av prosjektet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 til PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia er også sterkt anerkjent for stipendiatskapet SFRH/BD/130478/2017 (SL) og FCT Investigator grant IF/00256/2015 (PO). M.C.M.-M. ble støttet av et Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (Reintegration panel) innenfor Horizon 2020 Framework Programme (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Coelho, C., Casadevall, A. Answers to naysayers regarding microbial extracellular vesicles. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1005-1012 (2019).
  4. Schwechheimer, C., Kuehn, M. J. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nature Reviews Microbiology. 13 (10), 605-619 (2015).
  5. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  6. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological Functions and Biogenesis of Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles. Annual Review of Microbiology. 64 (1), 163-184 (2010).
  7. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  8. Flores, E., Herrero, A. Compartmentalized function through cell differentiation in filamentous cyanobacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 39-50 (2010).
  9. Flombaum, P., et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9824 (2013).
  10. Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: the structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
  11. Abed, R. M. M., Dobretsov, S., Sudesh, K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology. 106 (1), 1-12 (2009).
  12. Lea-Smith, D. J., et al. Editorial: Exploring the growing role of cyanobacteria in industrial biotechnology and sustainability. Frontiers in Microbiology. 12, 1963 (2021).
  13. Garcia-Pichel, F., Zehr, J. P., Bhattacharya, D., Pakrasi, H. B. What's in a name? The case of cyanobacteria. Journal of Phycology. 56 (1), 1-5 (2020).
  14. Biller, S. J., et al. Bacterial vesicles in marine ecosystems. Science. 343 (6167), 183 (2014).
  15. Pardo, Y. A., Florez, C., Baker, K. M., Schertzer, J. W., Mahler, G. J. Detection of outer membrane vesicles in Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 362 (20), (2015).
  16. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  17. Biller, S. J., et al. Membrane vesicles in sea water: heterogeneous DNA content and implications for viral abundance estimates. The ISME Journal. 11 (2), 394-404 (2017).
  18. Yin, H., et al. Synechococcus elongatus PCC7942 secretes extracellular vesicles to accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis. Theranostics. 9 (9), 2678-2693 (2019).
  19. Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Extracellular vesicles: An overlooked secretion system in cyanobacteria. Life. 10 (8), 129 (2020).
  20. Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e60359 (2019).
  21. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila outer membrane vesicles: Isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55146 (2017).
  22. Fantappiè, L., et al. Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  23. Moore, L. R., et al. Culturing the marine cyanobacterium Prochlorococcus. Limnology and Oceanography: Methods. 5 (10), 353-362 (2007).
  24. Rippka, R., et al. Prochlorococcus marinus Chisholm et al. 1992 subs. Pastoris subs. nov. Strain PCC 9511, the first axenic chlorophyll a2/b2-containing cyanobacterium (Oxyphotobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5), 1833 (2000).
  25. Moore, L. R., Chisholm, S. W. Photophysiology of the marine cyanobacterium Prochlorococcus: Ecotypic differences among cultured isolates. Limnology and Oceanography. 44 (3), 628 (1999).
  26. Charpy, L., Larkum, A. W. D. Bulletin de l'Institut Océanographique de Monaco, (n spécial 19). , 457-475 (1999).
  27. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  28. Fomsgaard, A., Freudenberg, M. A., Galanos, C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology. 28 (12), 2627-2631 (1990).
  29. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  30. Peterson, T. Densitometric analysis using NIH image. North American Vascular Biology Organization (NAVBO) eNewsletter. 16 (3), (2010).
  31. Jürgens, U. J., Weckesser, J. Carotenoid-containing outer membrane of Synechocystis sp. strain PCC6714. Journal of Bacteriology. 164 (1), 384-389 (1985).
  32. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 99-128 (2014).
  33. McBroom, A. J., Johnson, A. P., Vemulapalli, S., Kuehn, M. J. Outer membrane vesicle production by Escherichia coli is independent of membrane instability. Journal of Bacteriology. 188 (15), 5385-5392 (2006).
  34. Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamicin: a novel mechanism of enzyme secretion. Journal of Bacteriology. 177 (14), 3998-4008 (1995).
  35. Nguyen, T. T., Saxena, A., Beveridge, T. J. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Journal of Electron Microscopy. 52 (5), 465-469 (2003).
  36. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  37. Norena-Caro, D. A., Malone, T. M., Benton, M. G. Nitrogen sources and iron availability affect pigment biosynthesis and nutrient consumption in Anabaena sp. UTEX 2576. Microorganisms. 9 (2), 431 (2021).
  38. Rippka, R. Isolation and purification of cyanobacteria. Methods in Enzymology. , Academic Press. 3-27 (1988).
  39. Van Alphen, P., Abedini Najafabadi, H., Branco dos Santos, F., Hellingwerf, K. J. Increasing the photoautotrophic growth rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by identifying the limitations of its cultivation. Biotechnology Journal. 13 (8), 1700764 (2018).
  40. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA. mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12 (383), (2021).
  41. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
  42. Soares, N. C., et al. Associating growth-phase-related changes in the proteome of Acinetobacter baumannii with increased resistance to oxidative stress. Journal of Proteome Research. 9 (4), 1951-1964 (2010).
  43. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  44. Dell'Annunziata, F., et al. Outer membrane vesicles derived from Klebsiella pneumoniae are a driving force for horizontal gene transfer. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8732 (2021).
  45. Linney, M. D., Schvarcz, C. R., Steward, G. F., DeLong, E. F., Karl, D. M. A method for characterizing dissolved DNA and its application to the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography: Methods. 19 (3), 210-221 (2021).
  46. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  47. Cimorelli, M., Nieuwland, R., Varga, Z., vander Pol, E. Standardized procedure to measure the size distribution of extracellular vesicles together with other particles in biofluids with microfluidic resistive pulse sensing. PLoS ONE. 16 (4), 0249603 (2021).

Tags

Biologi utgave 180
Isolasjon og karakterisering av cyanobakterielle ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, S. J.,… More

Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter