Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Etablierung eines Minipig-Modells der Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion unter Verwendung absteigender Aortenkonstriktion. Die Methoden zur Beurteilung der Herzmorphologie, Histologie und Funktion dieses Krankheitsmodells werden ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Mehr als die Hälfte der Fälle von Herzinsuffizienz (HF) werden weltweit als Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) klassifiziert. Großtiermodelle sind nur begrenzt geeignet, um die grundlegenden Mechanismen der HFpEF zu untersuchen und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung des chirurgischen Vorgehens der absteigenden Aortenkonstriktion (DAC) bei tibetischen Minischweinen, um ein Großtiermodell der HFpEF zu etablieren. Dieses Modell nutzte eine präzise kontrollierte Verengung der absteigenden Aorta, um eine chronische Drucküberlastung in der linken Herzkammer zu induzieren. Mittels Echokardiographie wurden die morphologischen und funktionellen Veränderungen des Herzens beurteilt. Nach 12 Wochen DAC-Stress war das Ventrikelseptum hypertroph, aber die Dicke der Hinterwand war signifikant reduziert, begleitet von einer Dilatation des linken Ventrikels. Die LV-Ejektionsfraktion der Modellherzen wurde jedoch während des 12-wöchigen Zeitraums bei >50 % gehalten. Darüber hinaus zeigte das DAC-Modell Herzschäden, einschließlich Fibrose, Entzündung und Kardiomyozytenhypertrophie. Die Markerwerte für Herzinsuffizienz waren in der DAC-Gruppe signifikant erhöht. Diese DAC-induzierte HFpEF bei Minischweinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung molekularer Mechanismen dieser Krankheit und für präklinische Tests.
Introduction
Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) macht mehr als die Hälfte der Herzinsuffizienzfälle aus und ist zu einemweltweiten Problem der öffentlichen Gesundheit geworden1. Klinische Beobachtungen haben auf mehrere kritische Merkmale der HFpEF hingewiesen: (1) ventrikuläre diastolische Dysfunktion, begleitet von erhöhter systolischer Steifigkeit, (2) normale Ejektionsfraktion in Ruhe mit beeinträchtigter Trainingsleistung und (3) kardiales Remodeling2. Zu den vorgeschlagenen Mechanismen gehören hormonelle Dysregulation, systemische mikrovaskuläre Entzündungen, Stoffwechselstörungen und Anomalien in sarkomeren und extrazellulären Matrixproteinen3. Experimentelle Studien haben jedoch gezeigt, dass eine Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) diese Veränderungen verursacht. Klinische Studien haben die therapeutischen Wirkungen von Angiotensinrezeptor-Inhibitoren und Medikamenten zur Behandlung von HFrEF bei HFpEF 4,5 untersucht. Es sind jedoch einzigartige Therapieansätze für HFpEF erforderlich. Verglichen mit dem Verständnis der klinischen Symptome sind die Veränderungen in der Pathologie, Biochemie und Molekularbiologie der HFpEF nach wie vor schlecht definiert.
Tiermodelle der HFpEF wurden entwickelt, um die Mechanismen, diagnostischen Marker und therapeutischen Ansätze zu erforschen. Labortiere, einschließlich Schweine, Hunde, Ratten und Mäuse, können HFpEF entwickeln, und verschiedene Risikofaktoren, einschließlich Bluthochdruck, Diabetes mellitus und Alterung, wurden als Induktionsfaktoren ausgewählt 6,7. Zum Beispiel induziert Desoxycorticosteronacetat allein oder in Kombination mit einer fett-/zuckerreichen Ernährung HFpEF bei Schweinen 8,9. Die ventrikuläre Drucküberlastung ist eine weitere Technik, die zur Entwicklung von HFpEF in Groß- und Kleintiermodellen verwendet wird10. Darüber hinaus wurden in den letzten Jahren auf allen Kontinenten spezifische EF-Cut-off-Werte zur Definition von HFpEF eingeführt, wie in den Leitlinien der European Society of Cardiology, der American College of Cardiology Foundation/American Heart Association11, der Japanese Circulation Society/der Japanese Heart Failure Society12 zu sehen ist. Daher können viele bereits etablierte Modelle für HFpEF-Studien geeignet werden, wenn die klinischen Kriterien übernommen werden. Youselfi et al. behaupteten beispielsweise, dass ein genetisch veränderter Mausstamm, Col4a3-/-, ein wirksames HFpEF-Modell sei. Dieser Stamm entwickelte typische HFpEF-Herzsymptome, wie diastolische Dysfunktion, mitochondriale Dysfunktion und kardiales Remodeling13. In einer früheren Studie wurde eine energiereiche Diät verwendet, um bei Affen im Alter von14 Jahren einen kardialen Umbau mit einem mittleren EF-Bereich zu induzieren, der durch eine Stoffwechselstörung, Fibrose und reduzierte Aktomyosin-MgATPase im Myokard gekennzeichnet ist. Die transversale Aortenkonstriktion (TAC) der Maus ist eines der am weitesten verbreiteten Modelle zur Nachahmung der Hypertonie-induzierten ventrikulären Kardiomyopathie. Der linke Ventrikel verläuft von einer konzentrischen Hypertrophie mit erhöhter EF zu einem dilatativen Remodeling mit reduzierter EF15,16. Die Übergangsphänotypen zwischen diesen beiden typischen Stadien deuten darauf hin, dass die Aortenkonstriktionstechnik zur Untersuchung der HFpEF verwendet werden kann.
Die pathologischen Merkmale, die zelluläre Signalübertragung und die mRNA-Profile eines porcinen HFpEF-Modells wurden bereits veröffentlicht17. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Etablierung dieses Modells und die Ansätze zur Bewertung der Phänotypen dieses Modells vorgestellt. Das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, der Operationsplan wurde gemeinsam vom leitenden Prüfarzt, Chirurgen, Labortechnikern und Tierpflegern erstellt. Die Minischweine wurden Gesundheitsuntersuchungen unterzogen, einschließlich biochemischer Tests und Echokardiographie. Nach der Operation wurden entzündungshemmende und schmerzstillende Eingriffe durchgeführt. Zur Beurteilung der Phänotypen wurden Echokardiographie, histologische Untersuchung und Biomarker eingesetzt.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute genehmigt (Zulassungs-Nr. IACUC2017009). Alle Tierversuche wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Aufl., 2011, The National Academies, USA) durchgeführt. Die Tiere wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung des Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute untergebracht (Lizenz-Nr. SYXK (YUE) 2016-0122, China). Sechs männliche tibetische Minischweine (n = je 3 für die Scheingruppe und die DAC-Gruppe, 25-30 kg Gewicht) wurden verwendet, um das HFpEF-Modell zu entwickeln.
1. Vorbereitung von Tieren und Instrumenten
- Akklimatisieren Sie die Tiere vor der Operation 14 Tage lang in der Einrichtung.
- Führen Sie vor der Operation Gesundheitsuntersuchungen durch, einschließlich biochemischer Tests und Echokardiographie. Schließen Sie die Tiere mit kardialen Anomalien in der Struktur (Ventrikeldilatation oder Hypertrophie) und Funktion (EF <50%) gemäß den T/CALAS85-2020 Laboratory animals - Guidelines for the health assessment of major organs, like heart, liver, kidney, and brain of large laboratory animals (Chinese Association for Laboratory Animal Sciences, China) aus.
- Fasten Sie die Tiere mehr als 12 Stunden vor der Narkose, indem Sie am Tag der Operation nicht füttern.
- Bereiten Sie den Operationssaal und die Geräte vor (Abbildung 2). Überprüfen Sie die Beatmungsstation, die Veterinär- und Patientenmonitore, das veterinärmedizinische Ultraschallsystem, den Aspirator und andere chirurgische Geräte. Autoklavieren Sie die Schere, die Pinzette, die Retraktoren, die Skalpellgriffe, den Absaugkopf, die chirurgischen Nadeln usw. (siehe Materialtabelle).
2. Sedierung, tracheale Intubation und Venenkanülierung
- Wiegen Sie die Tiere und berechnen Sie die Narkosemittel. Die Minischweine werden mit 1 mg/kg Zoletil-Injektion (Tiletamin und Zolazepam zur Injektion) und 0,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid-Injektion sediert (siehe Materialtabelle).
- Fixieren Sie die Minipigs und legen Sie sie in die richtige seitliche Liegeposition auf den OP-Tisch. Schalten Sie die Heizung ein, um die Körpertemperatur der Tiere aufrechtzuerhalten.
- Führen Sie die Echokardiographie (Schritt 5) durch und entnehmen Sie 2 ml Blutproben.
- Intubieren Sie die Minipigs mit einem Endotrachealtubus, der an eine Beatmungsstation für veterinärmedizinische Anästhesie angeschlossen ist (Abbildung 3A) (siehe Materialtabelle).
- Initiieren Sie die Beatmung mit einem Atemzugvolumen von 8 ml/kg und 30 Atemzügen/min. Pflegen Sie die Tiere während des chirurgischen Eingriffs mit 1,5%-2,5% Isofluran.
- Die intravenöse Kanülierung erfolgt mit einem peripheren intravenösen Katheter (26 G) (siehe Materialtabelle) aus einer Ohrvene (in der Regel die marginale Ohrvene, Abbildung 3B).
- Schließen Sie das Tier an einen tierärztlichen Monitor an.
3. Chirurgischer Ablauf
- Rasieren Sie den linken Brustbereich. Tragen Sie 0,7 % Jod und 75 % Alkohol auf, um die Haut vom Schulterblatt bis zum Zwerchfell aseptisch vorzubereiten (Abbildung 3C).
- Legen Sie sterile Abdecktücher über den Operationsbereich.
- Verabreichen Sie Propofol (5 mg/kg) (siehe Materialtabelle) durch intravenöse Injektion, um die Vollnarkose aufrechtzuerhalten.
- Markieren Sie den Schnitt (~15 cm lang) entlang des 4. Zwischenrippenraums vor dem Hautschnitt mit Elektrokauter.
- Öffnen Sie den Brustkorb mit einer Kombination aus Kauter und stumpfer Dissektion des Muskels und des Bindegewebes. Verwenden Sie einen Absauger, um während der Operation Blut zu entfernen.
- Verwenden Sie einen Rippenaufroller, um die Rippen zu spreizen (Abbildung 3D).
- Lokalisieren Sie das thorakale absteigende Aortasegment und bestimmen Sie die Verengungsstelle (Abbildung 3E). Verwenden Sie zwei chirurgische 3-0-Nähte, um das Segment zweimal zu umschlingen (Abbildung 3F). Legen Sie drei Schichten medizinische Gaze zwischen die Naht und die Aorta, um Gewebeschäden durch Nähte zu vermeiden.
- Richten Sie Druckmesseinheiten ein, um den Grad der Verengung zu bestimmen (Abbildung 3F-H).
HINWEIS: Das Gerät enthält einen Katheter, der die Gefäßwand durchsticht, einen Verbindungsschlauch, einen Druckwandler und einen Patientenmonitor. - Ziehen Sie die chirurgische Naht um das absteigende Aortensegment allmählich an, um den gewünschten Verengungsgrad zu erreichen. Lassen Sie die Druckwerte 20 Minuten lang stabilisieren und ziehen Sie die chirurgischen Knoten dauerhaft fest.
- Verwenden Sie einen Drainageschlauch, um die Luft und überschüssige Flüssigkeiten in der Brusthöhle zu evakuieren.
- Schließen Sie die Brustwand in Schichten, nähern Sie sich den Rippen und geteilten Muskeln mit resorbierbaren Nähten wieder an.
- Prüfen Sie, ob Blutungen vorliegen und stellen Sie eine gute Blutstillung sicher.
- Tragen Sie nach der Operation eine Flasche Benzylpenicillin (800.000 Einheiten) (siehe Materialtabelle) auf den Operationsbereich auf.
- Überwachen Sie das Blinzeln der Augen und die Bewegung der Gliedmaßen des Tieres. Trennen Sie das Beatmungsgerät, aber lassen Sie den Endotrachealtubus stehen. Überwachen Sie das Vorhandensein von spontaner Atmung.
- Bringen Sie das Tier in seinen Stallraum zurück und lassen Sie es automatisch aufwachen.
4. Nachsorge
- Benzylpenicillin 1 Woche lang täglich anwenden (20.000 U/kg).
- 1 Woche lang täglich 1 mg/kg Flunixin-Meglumin (siehe Materialtabelle) auftragen.
HINWEIS: Opioid- und NSAR-Analgetika sollten intra- und postoperativ verabreicht werden.
5. Transthorakale Echokardiographie
- Betäuben Sie das Tier mit 1 mg/kg Zoletil und beruhigen Sie es.
- Legen Sie das Tier in eine mobile Rückhalteeinheit mit einer Planenabdeckung.
HINWEIS: Die mobile Rückhalteeinheit (siehe Materialtabelle) verfügt über vier Öffnungen, die dazu bestimmt sind, die Vorder- und Hintergliedmaßen des Tieres zu verlängern. - Rasieren Sie die linke Brust des Tieres.
- Legen Sie die Finger auf die linke Mitte der Brust, um den apikalen Puls zu fühlen. Tragen Sie das Ultraschallgel auf die Umgebung auf.
- Platzieren Sie den Phased-Array-Schallkopf des Ultraschallsystems (3-8 Hz) im dritten Interkostalraum. Bewegen Sie den Schallkopf in eine vordere oder hintere Richtung und stellen Sie den Kerbwinkel ein.
- Identifiziere die Vorhöfe, Ventrikel und Aorta. Nehmen Sie die Bilder der parasternalen Längsachse im B- und M-Modus auf.
HINWEIS: Das B-Mode-Bild stellt den Querschnitt des linken Ventrikels auf der Ebene des Papillarmuskels dar, und das M-Mode-Bild zeigt die Bewegung des linken Ventrikels im Laufe der Zeit. - Drehen Sie den Schallkopfkopf um 90° im Uhrzeigersinn, um die parasternale Kurzachsenansicht zu erhalten. Identifiziere die linke Herzkammer, die rechte Herzkammer und den Papillarmuskel. Nehmen Sie die Bilder im B- und M-Modus auf.
- Verwenden Sie die vom Hersteller des Ultraschallsystems zur Verfügung gestellte Workstation, um die Struktur und Funktion des Herzens zu beurteilen.
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Representative Results
Echokardiographie
Die Herzstruktur und -funktion wurden in den Wochen 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 bewertet. Die B-Mode- und M-Mode-Aufzeichnungen der parasternalen Kurzachsenansicht sind in Abbildung 4A dargestellt. Die echokardiographische Messung umfasste die Dicke des Ventrikelseptums (VST), die Dicke der hinteren Wand (PWT) und die linksventrikuläre Innendimension (LVID). Die VST an der Enddiastole nahm in den DAC-Herzen zu, während die PWT an der Enddiastole während des Beobachtungszeitraums zunahm und dann abnahm, was darauf hindeutet, dass im linken Ventrikel der DAC-Minipigs ein hypertrophes Remodeling vorlag (Abbildung 4B,C). Die LVID an der Enddiastole nahm in den Wochen 4 und 6 ab und stieg dann nach Woche 8 allmählich an, was darauf hindeutet, dass die Ventrikel vor der Dilatation eine konzentrische Hypertrophie erlitten haben (Abbildung 4D). Die LVEF der Modellherzen wurde während des 12-wöchigen Zeitraums bei >50 % gehalten (Abbildung 4E).
Morphologie und Marker für Herzinsuffizienz
Nach der 12. Woche wurden die Herzen wie zuvor beschriebengeerntet 17. Im Vergleich zu denen der Scheinherzen wurde eine Vergrößerung der DAC-Herzen beobachtet (Abbildung 5A). Die Serumkonzentration von kardialem Troponin I (cTnI) wurde in den Wochen 0, 4, 8 und 12 gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem enzymgebundenen Immunosorbent-Assay-Kit bestimmt (siehe Materialtabelle). Die optische Dichte wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Der Herzinsuffizienzmarker cTnI war in den Wochen 4, 8 und 12 in der DAC-Gruppe zu den entsprechenden Zeitpunkten signifikant höher als in der Scheingruppe (Abbildung 5B).
Histologische Untersuchung
Gewebe aus den freien Wänden des linken und rechten Ventrikels, des Ventrikelseptums, des linken und rechten Vorhofs, der Mitralklappe und der Aorta wurden gesammelt und mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Gewebe wurden eingebettet, in Abschnitte geschnitten und mit Hämatoxylin- und Eosinlösung (H & E) gemäß dem vorherigen Berichtgefärbt 17. Hypertrophe Kardiomyozyten, Fibrosen, Entzündungszellen, pyknotische Kerne und andere Strukturen wurden mit einem Lichtmikroskop identifiziert. Kardiomyozyten in den Vorhöfen, im Ventrikelseptum und in den Ventrikeln zeigten eine Hypertrophie mit Pyknose (Abbildung 6A). In der Mitralklappe waren muskuläre Schichten reduziert (Abbildung 6B) und in der Aorta wurde eine vaskuläre endotheliale Hyperplasie beobachtet (Abbildung 6C). Darüber hinaus induzierte DAC eine ausgedehnte Fibrose im Myokard der Minischweine (Abbildung 7A), begleitet von einer Infiltration von Entzündungszellen in den linken Ventrikeln, dem rechten Vorhof und den Aortenwänden (Abbildung 7B).
Abbildung 1: Versuchsplanung. Der Versuchsplan wurde gemeinsam vom Studienleiter, Chirurgen, Labortechnikern und Tierpflegern erstellt. Die Minischweine wurden Gesundheitsuntersuchungen unterzogen, einschließlich biochemischer Tests und Echokardiographie. Im Anschluss an die Operation wurden entzündungshemmende und schmerzstillende Eingriffe durchgeführt. Echokardiographie, histologische Untersuchung und Biomarker-Test bewerteten die Phänotypen der Herzinsuffizienz. Die Anzahl der Tiere, jeweils n = 3, bezog sich auf die Schein- und die DAC-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Chirurgische Geräte. Zu den notwendigen Geräten (A) für die DAC-Operation gehörten ein Absauggerät (a), ein Operationstisch (b), ein Veterinärmonitor (c), LED-OP-Leuchten (d) und eine Beatmungsstation für die Anästhesie (e). Mit einem veterinärmedizinischen Ultraschallgerät wurde die Struktur und Funktion der Tierherzen vor und nach der Operation beurteilt (B). Zu den chirurgischen Instrumenten gehörten ein Laryngoskop (C) und verschiedene Pinzetten, Skalpellgriffe und Scheren (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Chirurgischer Eingriff. Nach der Sedierung wurde das Tier mit einem Endotrachealtubus intubiert (A) und die intravenöse Kanülierung durch eine Ohrvene (B) hergestellt. Die Operationsstelle befand sich an der linken Brust des Tieres (C). Nach der Freilegung der absteigenden Aorta (D,E) wurden die Verengungsstelle (SB) und die invasiven Stellen zur Drucküberwachung (SA, SC) bestimmt (F,G) und der Aortendruck mit einem Patientenmonitor (H) gemessen. Ein Cartoon zeigt die Übersicht über die Verengungsstrategie (I). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Auswertung der transthorakalen Echokardiographie. Die repräsentativen B-Mode- und M-Mode-Bilder der Drucküberlastungsherzen von Woche 0 bis Woche 12 sind in (A) dargestellt. Die Bilder im M-Modus, die für 4 s aufgenommen wurden, werden angezeigt. Der rosafarbene Skalenbalken zeigt die Aufzeichnungslänge von 1 s an.Die Ventrikelseptumdicke (VST) an der Enddiastole nahm in den DAC-Herzen zu (B). Im Gegensatz dazu nahm die hintere Wanddicke (PWT) an der Enddiastole im Beobachtungszeitraum allmählich zu und ab (C). Die linksventrikuläre innere Dimension (LVID) an der Enddiastole nahm in Woche 4 und Woche 6 ab und stieg dann nach Woche 8 allmählich an (D). Die LVEF der Modellherzen wurde während des 12-wöchigen Zeitraums bei >50% gehalten (E). Die Anzahl der Tiere, jeweils n = 3, bezog sich auf die Schein- und die DAC-Gruppe. Unpaarte t-Tests wurden verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu bestimmen. *P < 0,05 vs. Die Scheingruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Herzmorphologie und Serum-cTnI. Die Größe des Herzens schien zuzunehmen (A). Der Herzinsuffizienzmarker cTnI war in den Wochen 4, 8 und 12 in der DAC-Gruppe zu den entsprechenden Zeitpunkten signifikant höher als in der Scheingruppe (B). Die Anzahl der Tiere, jeweils n = 3, bezog sich auf die Schein- und die DAC-Gruppe. Unpaarte t-Tests wurden verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu bestimmen. *P < 0,05 vs. Die Scheingruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Histologie des Myokards, der Mitralklappe und der Aortenwand. Die H&E-Färbung wurde verwendet, um das Herzgewebe am Ende des Experiments zu untersuchen. Kardiomyozyten in Vorhöfen, Ventrikelseptum und Ventrikel zeigten Hypertrophie (Pfeile in grün; A), begleitet von Pyrose (Pfeile in gelb; A). Die Muskelschichten in der Mitralklappe waren reduziert (Pfeile in blau; B). Eine vaskuläre endotheliale Hyperplasie wurde in der Aorta beobachtet (Bereich innerhalb der blauen Linien; C). Rote Sternchen: untersuchte Gewebe; L. Ventrikel, linke Herzkammer; R. Ventrikel, rechter Ventrikel; L. Vorhof, linker Vorhof; R. Atrium, rechter Vorhof. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Fibrose und Entzündung in den DAC-Herzen. Die histologische Untersuchung ergab eine ausgedehnte Myokardfibrose bei DAC-Minischweinen. Es zeigte sich ein fibrotischer Bereich im linken Ventrikel (Sternchen und Pfeile in gelb; A). Die Infiltration von Entzündungszellen wurde in den linken Herzkammern, im rechten Vorhof und in den Aortenwänden beobachtet (Sternchen in grün; B). Rote Sternchen: untersuchte Gewebe; Pfeile in Blau, Eosinophile; L. Ventrikel, linke Herzkammer; R. Atrium, rechter Vorhof. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dieser Studie wurden DAC-Techniken verwendet, um ein HFpEF-Modell für tibetische Minischweine zu entwickeln. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Vorbereitung von Tieren und Instrumenten vorgestellt, einschließlich Sedierung, trachealer Intubation, Venenkanülierung, chirurgischem Eingriff und postoperativer Versorgung. Die Aufnahmetechniken für echokardiographische B-Mode- und M-Mode-Herzbilder werden ebenfalls vorgestellt. Nach der DAC erlitt das Herz in den Wochen 4 und 6 eine linksventrikuläre Hypertrophie und nach der 8. Woche eine Dilatation. LVEF blieb während des 12-wöchigen Zeitraums erhalten. Fibrose und Entzündungen wurden in DAC-Herzen beobachtet.
Die Kombination aus offener Thoraxoperation und Aortenverengung wurde genutzt, um Herzinsuffizienzmodelle bei Groß- und Kleintieren zu entwickeln. Zum Beispiel wurde bereits in den 1950er Jahren über eine durch Aortenverengung induzierte Hypertonie bei Nagetieren berichtet18. Die Verengung der Aorta ascendens bei Schweinen induzierte eine leichte linksventrikuläre Hypertrophie bei 2-4 Wochen alten Schweinen. In Bezug auf die Operationsstelle zur Lokalisierung der Aorta ascendens wurde in einigen Studien der dritte Interkostalraum19,20 ausgewählt, während in einer anderen Studie der vierte Interkostalraum für die laterale Thorakotomieausgewählt wurde 21. Es wurde festgestellt, dass eine Verengung an der absteigenden Aorta bei erwachsenen tibetischen Minischweinen praktisch war. Das absteigende Aortensegment befand sich direkt unter dem vierten Interkostalraum und war von wenig Bindegewebe umgeben.
Der Grad der Verengung kann entscheidend für die Induktion von Schlüsselmerkmalen der HFpEF sein. Melleby et al. berichteten, dass eine kleinere Ringgröße die Hypertrophie beschleunigte, während größere Ringgrößen bei Mäusen mit aufsteigender Aortenkonstriktion zu einer konservierten EF für 8-20 Wochen führten22. Massie et al. legten einen Druckgradienten von 20 mmHg für die Operation am offenen Brustkorb bei Schweinen fest, um eine ventrikuläre Hypertrophie zu induzieren21. Charles et al. verwendeten eine progressive Manschetteninflation, um HFpEF bei weiblichen Yorkshire-Landrassenschweinen zu erzeugen23. In der aktuellen Studie führte ein 20%iger Druckanstieg an der absteigenden Aorta über 12 Wochen zu einer HFpEF. Forscher haben auch Aortenverengungstechniken mit Desoxycorticosteronacetat oder westlicher Ernährung kombiniert, um HFpEF bei weiblichen Ossabaw-Schweinen zu induzieren 10,24. Der Grad der Verengung wird in der Regel durch den mit einem Mikromanometerkatheter oder einer Echokardiographie gemessenen Druck geschätzt. Es wurde ein Gerät zur Messung des Aortendrucks modifiziert. Ein Katheter mit Einweg-Blutdruckwandlern, die an einen Patientenmonitor angeschlossen waren, wurde verwendet, um den Druck an der absteigenden Aorta aufzuzeichnen.
In unserer früheren Studie wurden typische parasternale Längsachsenbilder der HFpEF-Herzen bei Minischweinen gezeigt17; Hier werden repräsentative parasternale Kurzachsenbilder hinzugefügt. In Übereinstimmung mit den früheren Ergebnissen zeigte das Minipig-DAC-Modell während des 12-wöchigen Beobachtungszeitraums zwei unterschiedliche Stadien des kardialen Umbaus, konzentrische Hypertrophie und Dilatation. Diese Phänotypen stimmen mit den klinischen Symptomen der HFpEF überein. Auch neue histologische Erkenntnisse im HFpEF-Modell werden in dieser Arbeit aufgedeckt. Es findet sich eine Kardiomyozytenhypertrophie in den Vorhöfen, im Ventrikelseptum und in den Ventrikeln. Darüber hinaus kommt es zu einer schweren Entzündungszellinfiltration in der linken Herzkammer, im rechten Vorhof und in der Aortenwand. Dies ergänzt die bisherigen Ergebnisse, die eine Hochregulation der Interleukine -6 und -1β, NFκB und der Zytokinproduktion im DAC-Myokard17 zeigten. Die Muskelschicht verschwand in der Mitralklappe des HFpEF-Schweins, was darauf hindeutet, dass Anomalien in der Mitralklappe zur Herzfunktionsstörung beitrugen.
Die Etablierung eines aseptischen chirurgischen Verfahrens ist entscheidend für erfolgreiche und stabile Schweinemodelle. Die Aortenverengungsoperation bei Schweinen erfordert mehr Bediener als bei Nagetieren. In der Regel ist ein erfahrenes OP-Team aus zwei Chirurgen, einem Anästhesisten und zwei OP-Schwestern erforderlich. Diese Rollen können von Tierärzten, Humanchirurgen und/oder gut ausgebildeten Technikern übernommen werden. Im Vergleich zu einer Nagetieroperation, die etwa 30 Minuten dauert, um ein Aortenverengungsverfahren abzuschließen, kann es mehr als 3 Stunden dauern, bis ein ähnliches Verfahren bei Schweinen abgeschlossen ist. In der Praxis schränkt der Mangel an Einrichtungen und qualifiziertem Personal für die Großtierchirurgie die Anwendung von chirurgischen Modellen für Schweine ein.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Guangdong Science and Technology Program (2008A08003, 2016A020216019, 2019A030317014), dem Guangzhou Science and Technology Program (201804010206), der National Natural Science Foundation of China (31672376, 81941002) und dem Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory of Laboratory Animals (2017B030314171) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable surgical suture | Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China | 4-0 | |
| Aesthesia ventilator station | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China | WATO EX-35vet | |
| Aspirator | Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China | YX930D | |
| Benzylpenicillin | Sichuan Pharmaceutical. INC, China | H5021738 | |
| Disposal endotracheal tube with cuff | Shenzhen Verybio Co., Ltd, China | 20 cm, ID 0.9 | |
| Disposal transducer | Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China | ||
| Dissection blade | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | ||
| Electrocautery | Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | GD350-B | |
| Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit | Cusabio Biotech Co., Ltd, China | CSB-E08594r | |
| Eosin | Sigma-Aldrich Corp. | E4009 | |
| Flunixin meglumine | Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2012)-090242103 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich Corp. | H3136 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd, China | Veteasy for animals | |
| Laryngoscope | Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China | For adults | |
| LED surgical lights | Mingtai Medical Group, China | ZF700 | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific, USA | Multiskan FC | |
| Microscope | Leica, Germany | DM2500 | |
| Mobile restraint unit | Customized | N/A | A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover |
| Oxygen | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich Corp. | V900894 | |
| Patient monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | Beneview T5 | |
| Peripheral Intravenous (IV) Catheter | Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China | 26G X 16 mm | |
| Propofol | Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd. | H20051842 | |
| Rib retractor | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Ruler | Deli Manufacturing Company, China | ||
| Scalpel handles | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Scissors (g) | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Suture | Medtronic-Coviden Corp. | 3-0, 4-0 | |
| Ultrasonic gel | Tianjin Xiyuansi Production Institute, China | TM-100 | |
| Veterinary monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | ePM12M Vet | |
| Veterinary ultrasound system | Esatoe, Italy | MyLab30 | Equiped with phased array transducer (3-8 Hz) |
| Xylazine hydrochloride injection | Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2016)-07003 | |
| Zoletil injection | Virbac, France | Zoletil 50 | Tiletamine and zolazepam for injection |
References
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