성체 눈물샘(LG) 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 방법은 LG 오가노이드 형성의 유도 및 아시나 또는 덕트 유사 세포로의 분화를 위해 잘 확립되어 있다.
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이 논문에서
요약
초록
눈물샘 (LG) 줄기 세포 기반 치료는 눈물샘 질환에 대한 유망한 전략입니다. 그러나, 충분한 수의 LG 줄기세포(LGSCs)를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 무혈청 배양 방법의 결여는 추가적인 연구 및 적용을 위한 하나의 장애물이다. 성인 마우스 LGSCs에 대한 3차원(3D), 무혈청 배양 방법이 잘 확립되어 여기에 도시되어 있다. LGSCs는 지속적으로 계대되고 acinar 또는 ductal-like 세포로 분화하도록 유도될 수 있었다.
LGSC 일차 배양을 위해, 6-8주령의 마우스로부터의 LGs를 디스파제, 콜라게나제 I 및 트립신-EDTA로 소화시켰다. 총 1 × 10개의 4개의 단일 세포를24 -웰 플레이트의 각 웰에 80 μL의 매트릭스 겔-눈물샘 줄기 세포 배지 (LGSCM) 매트릭스에 시딩하고, 20 μL의 매트릭스 겔-LGSCM 매트릭스로 예비코팅하였다. 혼합물을 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 600 μL의 LGSCM을 첨가하여 고형화시켰다.
LGSC 유지를 위해, 7일 동안 배양된 LGSCs는 디스파아제 및 트립신-EDTA에 의해 단일 세포로 분해되었다. 상기 단세포는 LGSC 일차 배양에 사용된 방법에 따라 이식 및 배양하였다. LGSC는 40 회 이상 계대되고 줄기 / 선조 세포 마커 Krt14, Krt5, P63 및 네스틴을 지속적으로 발현 할 수 있습니다. LGSCM에서 배양된 LGSCs는 자기 재생 능력을 가지며 시험관내 및 생체내에서 아시나 또는 덕트형 세포로 분화할 수 있다.
서론
눈물샘 줄기 세포 (LGSCs)는 눈물샘 (LG) 세포 재생을 유지하며 acinar 및 ductal 세포의 원천입니다. 따라서, LGSC 이식은 심각한 염증성 손상 및 수성-결핍성 안구 건조증(ADDED)1,2,3을 치료하기 위한 대안적인 접근법으로 간주된다. LGSCs를 풍부하게하기 위해 여러 가지 배양 방법이 적용되었습니다. Tiwari et al. 여러 성장 인자가 보충 된 콜라겐 I 및 매트릭스 젤을 사용하여 일차 LG 세포를 분리 및 배양했습니다. 그러나, LG 세포는 지속적으로 배양될 수 없었다4. 2차원(2D) 배양물을 사용하여, 마우스 LG 유래 줄기세포를 You et al.5 및 Ackermann et al.에 의해 분리하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 줄기/전구 세포 마커 유전자, Oct4, Sox2, Nanog 및 네스틴을 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 계대배양될 수 있었다. 그러나,....
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프로토콜
이 프로토콜의 모든 실험은 Sun Yat-sen University의 동물 시험 윤리위원회의 동물 보호 지침을 따랐습니다. 모든 셀 관련 동작은 셀 조작실의 초청정 워크벤치에서 수행되어야 한다. 자일렌을 사용하는 모든 작업은 흄 후드에서 수행되어야한다.
1. LGSC 1차 배양
- LG 절연
- 6-8 주 된 BALB / c 수컷 마우스를 구하고 귀 뒤의 피부를 잘라 LG와 그 주변의 결합 조직을 노출시킵니다. 핀셋의 도움으로 무딘 해부로 결합 조직을 벗기고 LG를 제거하십시오.
- 멸균된 10 mM PBS 용액 4 mL로 LG를 두 번 헹구어 6 cm 접시에서 혈액을 제거하였다. LG를 10초 동안 4mL의 75% 에탄올로 6cm 접시에 담그고 즉시 10mM PBS로 두 번 헹구십시오.
- LG의 단일 셀 얻기
- HEPES 버퍼 용액 (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 초순수에서 150 mM NaCl)을 사용하여 25 U/mL 디스파제를 제조하였다. 0.1% 콜라게나제 I 용액을 초순수로 준비한다.
- LG를 작은 단편 (약 1mm3)으로 자르고 멸균 된 15 mL 원심분리 ....
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결과
3D, 무혈청 문화 시스템 구축
본 연구에서는 마우스 LGSC용 EGF, Wnt3A, FGF10 및 Y-27632를 포함하는 LGSCM을 개발하였고, LGSCs는 3D 배양법으로 성공적으로 분리 및 배양하였다(도 1A). C57BL/6 마우스, NOD/ShiLtJ 마우스, BALB/c 마우스 및 ROSA26mT/mG 마우스로부터의 LGSCs의 성공적인 3D, 무혈청 배양 시스템이 이 방법16을 사용하여 확립되었다. 수컷 마우스의 경우, 1.5-2 × 10개의6 개의 세포를 해리시킴으로써 2개의 LGs로부터 수득하였다. 배양 1주일 후, 배양 초기에 1 × 10개의 4개의 LG 세포를 시딩할 때 30-60개의 구가 형성되었다. 더욱이, 이 방법에 의해 배양된 세포는 Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin 및 기타 줄기세포 마.......
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토론
눈물 줄기 세포 배양 및 LG 손상 복구를위한 눈물 줄기 세포의 분리 및 시험관 내 배양을위한 잘 확립 된 방법이 있습니다. Shatos et al.17 and Ackermannet al. (6) 쥐와 생쥐의 눈물 줄기세포를 각각 2D 배양 방법으로 성공적으로 배양 및 계대배양하여, ADD 치료를 위해 눈물 줄기세포를 이식할 수 있게 하였다. 2D로 배양된 LGs의 줄기세포18 및 중간엽 줄기세포19,20에 대한 연구는 이들 세포를 이식하면 ADD의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있음을 보여주었다. 형광-활성화된 세포 분류에 의해, Gromovaet al. 마우스 LGs로부터 LG 전구세포 마커를 발현하는 줄기세포 2개를 선별하여 시험관
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공개 사항
저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (제 31871413 호)의 보조금과 광동 과학 기술 (2017B020230002 및 2016B030231001)의 두 가지 프로그램에 의해 지원되었습니다. 우리는 연구 기간 동안 우리를 도운 연구원들과 동물 센터에서 일하는 직원들에게 동물 보호에 대한 그들의 지원에 진심으로 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
Glycine max
동물 연구 센터대학교 실험 동물 센터 모델 동물 연구 센터기 <에서 유래한 , ,
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | 모델 난징 대학교 | ||
| C57 BL/6J | 쑨원 | ||
| NOD/ShiLtJ | 모델 동물 연구 센터 난징 대학교 | ||
| ROSA26mT/mG | 난징 대학의 | ||
| Equipment< / em>< / u > | |||
| 분석 저울 | Sartorius | ||
| 자동 탈수기 | 열 | ||
| 혈액 계수기 | BLAU | ||
| 세포 계수 | CountStar | ||
| CO2 항온 인큐베이터 | Thermo | ||
| ECL Gel 이미징 시스템 | GE 헬스케어 | ||
| 수조용 전기 수조 | Yiheng 기술 | ||
| 전기 영동 장치 | BioRad | ||
| 형광 정량 PCR 기기 | Roche | ||
| 냉동 조직 슬라이서 | Lecia | ||
| 수평 원심 분리기 | CENCE | ||
| 도립 형광 현미경 | Nikon | ||
| 도립 현미경 | 올림푸스 | ||
| 레이저 라멜라 스캐닝 현미경 사진 | Carl Zeiss | ||
| 액체 질소 용기 | 열 | ||
| 저온 고온 속도 원심분리기 | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop 자외선 분광 광도계 | 온도 | 측정 RNA 농도 | |
| 파라핀 슬라이싱 기계 | Thermo | ||
| PCR 증폭기 | Eppendorf | ||
| pH 값 테스터 | Sartorius | ||
| 4 ° C 냉장고 | Haier | ||
| 자동 온도 조절 문화 발진기 | ZHICHENG | ||
| 조직 파라핀 임베딩 기기 | 열 | ||
| -80°C; C 초저온 냉장고 | 열 | ||
| -20° C 초저온 냉장고 | Thermo | ||
| 초순수 정화 시스템 | ELGA | ||
| u>시약 | |||
| 동물 실험 | |||
| HCG | 시그마 | 9002-61-3 | |
| PMSG | 시그마 | 14158-65-7 | |
| 펜토바르비탈 나트륨 | 시그마 | 57-33-0 | |
| 세포 배양 | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| 콜라겐분해효소 I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | 시그마 | D6429 | |
| DMEM/F12 | 시그마 | D0697 | |
| DMSO | 시그마 | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| 소 태아 혈청 | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco 35050087 | ||
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (매트릭스 젤) | BD | 356231 | |
| 쥐 Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| 쥐 Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| 쥐 EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| 트립신 억제제(TI) | Sigma | T6522 | 는 트립신, 키모트립신 및 플라스미나제를 덜 억제할 수 있습니다. 1mg은 1.0-3.0mg의 트립신을 억제합니다. |
| 트립신 | 시그마 | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE 염색 & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 당나귀 안티-마우스 IgG | Thermo | A-21202 | 사용 희석: IHC) 2 μ g/mL, (IF) 0.2 & g/mL |
| Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼 IgG Thermo | A-21206 | 사용 희석: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL | |
| Alexa Fluor 568 당나귀 안티 마우스 IgG | Thermo | A-10037 | 사용 희석: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL |
| Alexa Fluor 568 당나귀 안티 토끼 IgG Thermo | A-10042 | 사용 희석: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 4 & 뮤; g/mL | |
| Anti-AQP5 rabbit 항체 | Abcam | ab104751 | 사용된 희석액: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 0.1 & g/mL |
| Anti-E-cadherin 쥐 항체 | Abcam | ab11512 | 사용된 희석액: (IF) 5 μ g/mL |
| Anti-Keratin14 토끼 항체 | Abcam | ab181595 | 사용된 희석액: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL |
| Anti-Ki67 토끼 항체 | Abcam | ab15580 | 사용된 희석액: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 1 & 뮤; g/mL |
| Anti-mCherry 마우스 항체 | Abcam | ab125096 | 사용된 희석액: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL |
| Anti-mCherry 토끼 항체 | Abcam | ab167453 | 사용된 희석: (IF) 2 μ g/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| 구연산 | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB 키트(20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| 형광 장착 중간 Dako | S3023 | ||
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| 염소 항-마우스 IgG 항체 (HRP) | Abcam | ab6789 | 사용 희석: 2 μ g/mL |
| 염소 anti-Rabbit IgG 항체(HRP) | Abcam | ab6721 | 사용 희석: 2 μ g/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| 히스토겔(임베딩 하이드로겔) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% 과산화수소 용액 | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG YY-Neutral | balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER AR0009 | ||
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| 파라포름알데히드 | DAMAO | 200-001-8 | |
| 당류 | 광저우 화학 | 57-50-1 | |
| 구연산나트륨 삼염기성 이수화물 | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| 자당 | 광저우 화학 | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. 화합물 | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| 트리톤 X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| 알코올 | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| 클로로포름 | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| 에티듐 브로마이드 | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| 이소프로필 알코올 | 광저우 화학 | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I 마스터 믹스 | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT 마스터 믹스 | TOYOBO-Taq | ||
| DNA 중합효소 | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (핵산 stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & 세포 형질주입 | |||
| Agar | OXID-Ampicillin | ||
| Sigma | 69-52-3 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid 추출 키트 | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid 트랜스펙션 키트 | , Thermo | L3000015 | |
| LR 반응 키트 | , Thermo | 11791019 | |
| 플라스미드 추출 키트 | , TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α 화학적으로 유능한 세포 | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID- | ||
| 효모 추출물 | OXID- | ||
| Primers 및 순서 | Company< | ||
| strong>Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC | Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT | Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA | Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT | Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC | Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 렌티바이러스 무부하 벡터 | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin 실험실, Sun Yat-sen University |
참고문헌
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
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