눈물샘 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 시스템

눈물샘 줄기 세포 (LGSCs)는 눈물샘 (LG) 세포 재생을 유지하며 acinar 및 ductal 세포의 원천입니다. 따라서, LGSC 이식은 심각한 염증성 손상 및 수성-결핍성 안구 건조증(ADDED)^1,2,3을 치료하기 위한 대안적인 접근법으로 간주된다. LGSCs를 풍부하게하기 위해 여러 가지 배양 방법이 적용되었습니다. Tiwari et al. 여러 성장 인자가 보충 된 콜라겐 I 및 매트릭스 젤을 사용하여 일차 LG 세포를 분리 및 배양했습니다. 그러나, LG 세포는 지속적으로 배양될 수 없었다⁴. 2차원(2D) 배양물을 사용하여, 마우스 LG 유래 줄기세포를 You et ^al.5 및 Ackermann et al.에 의해 분리하였다. 도 ⁶에 나타낸 바와 같이, 줄기/전구 세포 마커 유전자, Oct4, Sox2, Nanog 및 네스틴을 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 계대배양될 수 있었다. 그러나, 이들 세포가 아시나 또는 덕트 세포로 분화할 수 있다는 명확한 징후는 없으며, 생체내에서 분화 가능성을 검증하기 위한 이식 실험은 없다.

최근에, c-kit+ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34-/CD45^- 세포는 유세포 분석기에 의해 마우스 LG로부터 분리되었고, Pax6 및 Runx1과 같은 LG 전구 세포 마커를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 시험관 내에서 덕트 및 아시니로 분화되었다. ADDED를 가진 마우스에서, 이들 세포를 이용한 동위원소 주사는 손상된 LG를 복구하고 LGs²의 분비 기능을 회복시킬 수 있다. 그러나, 이 방법에 의해 단리된 줄기세포의 수는 적었고, 단리된 LGSCs를 확장시키기 위한 적절한 배양 조건은 없었다. 요약하면, ADDED의 치료에서 LGSCs의 연구를 위해 안정적이고 지속적인 확장으로 성인 LGSCs를 효과적으로 분리하고 배양하기 위해 적절한 배양 시스템이 수립 될 필요가있다.

줄기 세포 또는 만능 줄기 세포로부터 유래 된 오가노이드는 관련 기관과 조직학적으로 유사하고 자신의 재생을 유지할 수있는 세포 그룹입니다. 마우스 장 오가노이드가 2009년^Sato et al. 7에 의해 성공적으로 배양된 후, 담낭⁸, 간⁹, 췌장^{10, 위 11}, 유방¹², 폐¹³, 전립선¹⁴ 및 타액선¹⁵와 같은 사토의 배양 시스템에 기초하여 다른 장기로부터의 오가노이드를 연속적으로 배양하였다. . 오가노이드 배양에서 세포 분화 전 성체 줄기세포의 비율이 높기 때문에, 3차원(3D) 오가노이드 배양 방법은 LG의 성체줄기세포의 분리 및 배양에 최적으로 고려된다.

성인 마우스 LGSC 배양 시스템은 3D, 무혈청 배양 방법을 최적화함으로써 본 연구에서 확립되었다. 정상 및 ADDED 마우스 둘 다로부터 배양된 LGSCs가 자가재생 및 증식의 안정한 능력을 나타냈다는 것이 입증되었다. ADDED 마우스 LGs에 이식 한 후, LGSCs는 손상된 LG를 식민지화하고 눈물 생산을 개선했습니다. 또한, 적색 형광 LGSCs를 ROSA26^mT/mG 마우스로부터 분리하고 배양하였다. 이 연구는 ADDED 요법을 위한 임상 적용 에서 시험관내 LGSC 농축 및 LGSC 자가이식편에 대한 신뢰할 수 있는 참조를 제공한다.

이 프로토콜의 모든 실험은 Sun Yat-sen University의 동물 시험 윤리위원회의 동물 보호 지침을 따랐습니다. 모든 셀 관련 동작은 셀 조작실의 초청정 워크벤치에서 수행되어야 한다. 자일렌을 사용하는 모든 작업은 흄 후드에서 수행되어야한다.

1. LGSC 1차 배양

1. LG 절연
   1. 6-8 주 된 BALB / c 수컷 마우스를 구하고 귀 뒤의 피부를 잘라 LG와 그 주변의 결합 조직을 노출시킵니다. 핀셋의 도움으로 무딘 해부로 결합 조직을 벗기고 LG를 제거하십시오.
   2. 멸균된 10 mM PBS 용액 4 mL로 LG를 두 번 헹구어 6 cm 접시에서 혈액을 제거하였다. LG를 10초 동안 4mL의 75% 에탄올로 6cm 접시에 담그고 즉시 10mM PBS로 두 번 헹구십시오.
2. LG의 단일 셀 얻기
   1. HEPES 버퍼 용액 (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 초순수에서 150 mM NaCl)을 사용하여 25 U/mL 디스파제를 제조하였다. 0.1% 콜라게나제 I 용액을 초순수로 준비한다.
   2. LG를 작은 단편 (약 1^mm3)으로 자르고 멸균 된 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고 조직을 500 μL의 25 U / mL 디스 파제 및 500 μL의 0.1 % 콜라게나제 I로 37 °C에서 1 시간 동안 처리하십시오.
   3. 10 mM PBS를 사용하여 트립신-EDTA 용액 (0.05 g/L 트립신, 0.04 g/L EDTA)을 준비한다. 단계 1.2.2로부터의 LG 단편을 37°C에서 10분 동안 1 mL의 0.05% 트립신-EDTA로 처리하고, 반복적으로 피펫팅함으로써 단편을 단일 세포로 해리시킨다.
   4. 현탁액을 70 μm 필터를 통해 여과하고, 여과액을 멸균된 15 mL 원심분리 튜브에 수집하고, 150 × g 에서 5분 동안 원심분리한다.
   5. 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 10 mL의 10 mM PBS를 첨가하여 세포 펠릿을 세척하고, 현탁액을 원심분리한다.
   6. 단계 1.2.5를 반복하고, 상청액을 제거하고, DMEM/F12 1mL(둘베코의 변형된 이글 배지와 Ham's F-12의 1:1 혼합물)를 첨가하여 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
3. LGSC 일차 문화
   1. DMEM/F12, 1x N2 보충제, 1x B27 보충제, 2mM 글루타민 대체물, 0.1mM NEAA(비필수 아미노산), 50ng/mL 뮤린 표피 성장 인자(EGF), 100ng/mL 섬유아세포 성장 인자 10(FGF10), 10ng/mL Wnt3A 및 10μM Y-27632(ROCK 억제제)를 포함하는 눈물샘 줄기 세포 배지(LGSCM)를 준비합니다.
   2. 20 μL의 매트릭스 겔-LGSCM 매트릭스 (매트릭스 겔: LGSCM = 1:1)를 24-웰 플레이트의 웰의 중앙에 첨가한다. 피펫 팁을 사용하여 이를 원형(직경 6-8 mm)으로 팽창시키고, 혼합물을 37°C에서 20분 동안 인큐베이션하여 웰을 프리코트한다.
   3. 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정하고 40 μL의 LGSCM과 총 1 × 10⁴ 세포를 매트릭스 겔의 40 μL에 첨가한다. 이들을 피펫으로 부드럽게 혼합하여 매트릭스 겔-LGSCM 혼합물을 얻었다(매트릭스 겔: LGSCM=1:1).
   4. 피펫을 사용하여 단계 1.3.2에서 24-웰 플레이트의 각 웰에서 예비코팅된 영역 위에 혼합물 80 μL를 조심스럽게 떨어뜨린다.
   5. 상기 혼합물을 37°C에서 20분 동안 인큐베이션하고 600 μL의 LGSCM을 첨가하였다.
   6. 각 웰의 배양액을 이틀에 한 번씩 바꿉니다. 배양 7일 후, 거꾸로 현미경(아이피스: 10x, 목표: 4x)하에서 직경이 100-300 μm인 LGSC 구체를 찾아본다.
      참고: LGSC는 총 14일 이상 배양할 수 있습니다.
4. 상기 기술된 단계에 따라 ROSA26^mT/mG 마우스 및 DED 마우스(NOD/ShiLtJ)의 일차 LGSCs를 분리하고 배양한다.

2. LGSC 유지 보수 및 통과

1. 구 배양 웰로부터 배양 배지를 제거한다.
2. 37°C에서 30분 동안 10 U/mL 디스파제 및 100 μL의 10 mM PBS의 20 μL에서 배양하여 7일 동안 배양된 LGSC 구체를 분해한다.
3. 현탁액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고 4분 동안 150 × g 에서 원심분리한다. 상층액을 제거하십시오.
4. 구체를 1 mL의 0.05% 트립신-EDTA로 37°C에서 5분 동안 처리하였다. 1 mL의 0.05% 트립신 억제제(TI)와 피펫을 반복적으로 첨가하여 트립신을 중화시키고 구체를 단일 세포로 해리시킨다.
5. 150 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠렛 중의 LGSCs를 얻었다. LGSCM 1 mL를 첨가하여 LGSC 펠릿을 재현탁시킨다.
6. 단계 1.3.1 내지 1.3.6에 기재된 바와 같이 단일 세포를 플레이트화한다.

3. LGSC 차별화

1. 절차 1: 무작위 분화를 위해 LGSC 배양 시스템으로 LGSCs의 배양 시간을 7일에서 14일로 연장한다.
2. 절차 2: 덕트 세포의 분화를 위한 LGSC 배양의 시작에서 매트릭스 겔-LGSCM 혼합물의 비율을 1:1에서 1:2로 변경한다. LGSCs를 14일 동안 유도를 위해 매트릭스에 시드한다(단계 1.3 참조).
3. 절차 3: 계대 후, LGSCM을 아시나 세포의 분화를 위해 LGSCM-10% 소 태아 혈청(FBS) 혼합물로 교체한다. 14일 동안 분화를 유도하였다.

4. LG 조직 탈수

1. LG 조직을 얻고(단계 1.1.1) LGs를 6 cm 디쉬에서 멸균된 10 mM PBS 용액 4 mL로 2분 동안 헹구었다. 조직을 10 % 포르말린 용액으로 옮겨 24 시간 동안 고정시킵니다.
2. 고정된 조직을 2분 동안 10 mM PBS로 헹구어 포르말린을 제거하고, 조직을 조직 포매박스로 옮겼다. 임베딩 박스를 자동 탈수기에 넣으십시오.
3. 자동 탈수기를 사용하여 다음과 같이 조직을 탈수시킵니다 : 70 % 에탄올, 2 시간; 80% 에탄올, 2시간; 90% 에탄올, 30분; 95% 에탄올, 30분; 절대 에탄올, 30min; 절대 에탄올, 2 시간; 절대 에탄올: 100% 크실렌 (1:1) 혼합물, 30 분; 100% 자일렌, 30분; 100% 자일렌, 2시간; 100% 자일렌: 파라핀 (1:1) 혼합물, 30 분; 파라핀, 2 시간; 파라핀, 3 시간.

5. LG 오가노이드/구 탈수

1. 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 LG 오가노이드/구체(단계 2.1-2.3)를 얻고 2분 동안 멸균된 10mM PBS 용액 1mL로 LG 오가노이드/스피어를 헹구십시오.
2. 100 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
3. 다음과 같이 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비한다: 1 M NaOH의 10 mM PBS 400 mL와 40 μL의 혼합물에 PFA 20 g을 첨가하고, 용액을 잘 흔들고, PFA가 완전히 용해될 때까지 65°C 수조에서 2시간 동안 가열한다. 실온으로 냉각한 후, 10 mM PBS를 사용하여 부피를 500 mL로 구성하고 이를 4°C에서 저장한다.
4. 오가노이드/구 펠릿이 있는 마이크로 원심분리 튜브에 4% PFA 1mL를 넣고 고정을 위해 튜브를 4°C 냉장고에 넣고 24시간 이상 보관합니다.
5. 고정 후, 100 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 1 mL의 10 mM PBS를 오가노이드/구 펠릿이 있는 마이크로원심분리 튜브에 넣고 2분 동안 피펫팅하여 부드럽게 혼합하여 PFA를 헹구십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다.
6. 100 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
7. 열 임베딩 하이드로젤을 용해시키고 50-60 μL의 임베딩 하이드로젤을 오가노이드/구 펠릿에 첨가하고 혼합한다. 혼합물을 액적 형태의 파라필름 상에 피펫팅하고 실온에서 응고될 때까지 5분 동안 기다린다.
8. 다음과 같이 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 오가노이드 / 구체로 젤을 탈수시킵니다.
   1. 튜브에 50% 에탄올 1 mL를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 기다린 다음, 피펫팅을 통해 튜브에서 액체를 제거하였다. 에탄올 농도를 70%, 80%, 90%, 95%로 연속적으로 변경하여 이 단계를 반복한다.
   2. 튜브에 절대 에탄올 1 mL를 넣고 실온에서 30 분 동안 기다린 다음 피펫팅으로 튜브에서 액체를 제거하십시오. 이 단계를 반복합니다.
   3. 튜브에 0.5 mL의 절대 에탄올과 0.5 mL의 100% 크실렌의 혼합물 1 mL를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 기다리고, 피펫팅에 의해 튜브로부터 액체를 제거하였다.
   4. 튜브에 100% 크실렌 1mL를 넣고 실온에서 30분 동안 기다린 다음 피펫팅을 통해 튜브에서 액체를 제거합니다. 이 단계를 반복합니다.
      참고: 단계 5.8.5-5.8.6은 65°C의 금속 욕조에서 수행해야 합니다.
   5. 0.5 mL의 파라핀과 0.5 mL의 100% 크실렌의 혼합물 1 mL를 튜브에 첨가하고, 65°C에서 30분 동안 기다리고, 피펫팅에 의해 튜브로부터 액체를 제거하였다.
   6. 튜브에 파라핀 1 mL를 첨가하고, 65°C에서 30분 동안 기다리고, 피펫팅에 의해 튜브로부터 액체를 제거하였다. 이 단계를 반복하고 처리 시간을 1h로 연장합니다.

6. 파라핀 임베딩 및 단면화

1. 파라핀 임베딩
   1. 임베딩하기 전에 임베딩 기계를 켜고 예열하여 파라핀 탱크에서 파라핀 왁스를 녹입니다.
   2. 탈수 된 조직 또는 오가노이드 / 구 젤을 임베딩 아이언 박스의 홈에 넣고 철 상자를 임베딩 기계의 파라핀에 넣으십시오.
   3. 플라스틱 뚜껑을 제거하고 플라스틱 임베딩 박스를 철제 박스에 올려 덮으십시오. 임베딩 아이언 박스를 냉각 테이블로 옮깁니다.
   4. 파라핀이 임베딩 박스의 블록으로 응축된 후, 철 박스에서 꺼내어 직접 슬라이스하거나 4°C 냉장고에 임시로 보관한다.
2. 파라핀 단면화
   1. 파라핀 슬라이스 전에 파라핀 슬라이서를 미리 조립하고 예열을 위해 슬라이서의 싱크대에 증류수를 넣으십시오. 수온이 42 °C로 상승하면 슬라이싱을 시작하십시오.
   2. 파라핀 슬라이서의 샘플 슬롯에 샘플을 고정시킵니다. 슬라이싱 중에 섹션 두께를 5μm로 조정합니다.
   3. 샘플을 지속적으로 단면화합니다. 슬라이서 탱크의 미끄럼 방지 슬라이드에 완전히 바둑판식 부분을 고정합니다.
   4. 절편화 후, 샘플 조직이 부착된 슬라이드를 37°C의 생화학적 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 건조시킨다. 슬라이드를 4°C의 냉장고에 임시로 보관한다.

7. 헤마톡실린 및 에오신 염색

1. 파라핀 절편을 60°C에서 30분 동안 용융시키고, 절편을 100% 크실렌에 담그고 15분 동안 반복한다.
2. 절편을 5 분 동안 쉐이커에서 절대 에탄올로 처리하십시오.
3. 절편을 진탕기에서 각각 3분 동안 90% 에탄올, 80% 에탄올 및 70% 에탄올로 처리한다.
4. 절편을 쉐이커에서 탈이온수로 5 분 및 2 분 동안 연속적으로 처리하십시오.
5. 젖은 상자에 절편을 4 mg / mL 헤마톡실린 용액으로 5 분 동안 얼룩지게하십시오. 흐르는 물에 섹션을 10 분 동안 헹구십시오.
6. 쉐이커의 절편을 먼저 탈이온수로 2분 동안 교반한 다음 0.5%-1% 에오신으로 1분 동안 교반한다.
7. 절편을 70% 에탄올, 80% 에탄올 및 90% 에탄올로 3분 동안 교반기(각각)에서 연속적으로 교반한다. 절편을 5분 동안 쉐이커에서 절대 에탄올로 교반한다.
8. 절편을 100 % 자일렌에 15 분 동안 담그고 담그기를 반복하십시오.
9. 피펫이나 점적기를 사용하여 중성 발삼 3-4 방울을 슬라이드에 추가하고 커버 슬라이드로 천천히 덮으십시오. 실온에서 슬라이드를 공기 건조시킵니다.

8. 면역조직화학(IHC) 염색

1. 파라핀 절편을 60°C에서 30분 동안 녹이고, 절편을 10분 동안 100% 크실렌에 담그고, 이 단계를 두 번 반복한다.
2. 쉐이커에서 절편을 먼저 절대 에탄올, 90% 에탄올 및 80% 에탄올로 2분 동안 교반한 다음(각각) 연속적으로 탈이온수로 3분 동안 교반한다. 탈이온수로 교반을 두 번 반복하십시오.
3. 절편을 진탕기 상에서 먼저 20 mL의 30%_H2O2및 180 mL의 메탄올의 혼합물로 10분 동안 교반한 다음, 5분 동안 탈이온수로 교반시킨다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
4. 절편을 미리 끓인 시트르산 완충액 (3 g의 Na3C6H5O7.2H2O 및 0.4 g_C6H8O7, pH 6.0)으로 1 L 탈이온수)로옮기고, 마이크로파를 10분 동안 아임계 비등점으로 유지하고, 실온에서 30분 동안 냉각시킨다. 5 분 동안 쉐이커에서 탈 이온수로 섹션을 교반하십시오. 이 단계를 세 번 반복합니다.
5. 절편을 5분 동안 진탕기 상에서 10 mM PBS로 교반하고, 이 단계를 세 번 반복한다. 젖은 상자 위의 조직 부위를 발수제 마커로 감싸고 즉시 사용할 수있는 비 면역 염소 혈청 한 방울을 첨가하여 샘플을 덮은 다음 실온에서 1 시간 동안 놓습니다.
6. 혈청을 제거하고, 샘플에 일차 항체를 첨가하고( 표 물질 참조), 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 일차 항체를 제거하고, 절편을 진탕기 상에서 10 mM PBS로 5분 동안 교반하고, 이 교반 단계를 10 mM PBS로 세 번 반복한다.
7. 이차 항체( 물질 표 참조)를 첨가하여 샘플을 표지하고 실온에서 30분 동안 습윤 박스 상에서 인큐베이션한다. 절편을 진탕기 상에서 10 mM PBS로 5분 동안 교반하고, 교반 단계를 세 번 반복한다.
8. 갓 준비한 0.03-0.05% 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 용액을 첨가하여 젖은 상자에 시료를 덮고 30-90초 동안 염색합니다. 흐르는 물로 섹션을 10 분 동안 헹구십시오.
   참고: 노란색이 나타날 때까지 광학 현미경으로 관찰하여 염색 시간을 조절하십시오.
9. 4 mg / mL 헤마톡실린 용액을 첨가하여 샘플을 덮고 젖은 상자에서 5 분 동안 얼룩지게하고 10 분 동안 흐르는 물로 절편을 헹구십시오.
10. 절편을 각각 80% 에탄올, 90% 에탄올 및 무수 에탄올로 진탕기 상에서 2분 동안 교반하고, 연속적으로 절편을 100% 크실렌에 담그고 30분 동안 담그십시오.
11. 피펫이나 점적기를 사용하여 중성 발삼 3-4 방울을 슬라이드에 추가하고 커버 슬라이드로 천천히 덮으십시오. 실온에서 슬라이드를 공기 건조시킵니다.

9. 오가노이드/구체의 글로벌 면역형광 염색

참고: 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 4% PFA 용액으로 고정된 오가노이드/구체를 수집합니다(단계 5.1 ~ 5.4 참조). 형광 표지를 다음과 같이 수행한다.

1. 튜브에 30% 수크로오스 용액 1mL를 첨가하여 오가노이드/구체를 탈수시키고 4°C의 냉장고에서 하룻밤 동안 배양한다.
2. 100 μL의 PBST 용액 (0.1% Triton X-100을 갖는 10 mM PBS 용액)을 튜브에 첨가하여 5분 동안 오가노이드/구체를 헹구고, 튜브를 100 × g 에서 1분 동안 원심분리하고, 펠렛을 수집한다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
3. 바로 사용할 수 있는 비면역 염소 혈청 0.5-1 mL를 튜브에 넣고 실온에서 1시간 동안 밀봉합니다. 튜브를 100 × g 에서 1분 동안 원심분리하고 펠렛을 수집한다.
4. 희석된 일차 항체의 몇 방울을 첨가하여 펠렛을 덮고 4°C의 냉장고에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 튜브를 100 × g 에서 1분 동안 원심분리하고 펠렛을 수집한다.
5. 9.2단계를 반복합니다.
6. 형광 2차 항체 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액의 몇 방울을 튜브에 첨가하여 펠렛을 덮고 4°C에서 24시간 동안 냉장고에서 인큐베이션하여 빛을 피한다.
7. 9.2단계를 반복하여 빛을 피하십시오.
8. PBST 용액 100 μL를 튜브에 첨가하고, 빛으로부터 멀리 떨어진 4°C 냉장고에 임시로 보관한다. 광 시트 스캐닝 현미경을 사용하여 오가노이드 / 구체를 관찰하고 촬영하십시오.

10. LGSC pLX-m체리 트랜스펙션

참고 : 렌티 바이러스 입자의 생산은 생물 안전 캐비닛과 BSL2 생물 안전 수준의 깨끗한 벤치에서 수행되어야합니다.

1. 렌티바이러스 패키징 세포를 293T DMEM + 10% FBS와 함께 6-웰 플레이트에서 37°C, 5%_CO2 에서 3-5일 동안 배양하여 80% 세포 컨플루언시에 도달한다.
2. 렌티바이러스 벡터 pLX-mCherry를 LGSCs로 형질감염시킨다.
   참고: 시약 준비는 6-웰 플레이트의 한 웰에 대해 지시됩니다.
   1. 멸균 1.5mL 원심분리 튜브 두 개를 준비하고 각 튜브에 DMEM/F12 250μL를 추가합니다.
   2. 7.5 μL의 형질감염 시약을 하나의 튜브에 첨가하고 피펫팅으로 시약을 완전히 혼합하십시오.
   3. 내독소가 없는 pLX-mCherry 플라스미드 2μg을 추가하고 렌티바이러스 패키징 플라스미드와 일치하는 lentivirus 패키징 플라스미드를 다른 튜브에 넣고 트랜스펙션 시약(플라스미드 2μL/μg)을 추가합니다.
   4. 액체를 두 원심분리 튜브에 혼합하고 혼합물을 실온에서 5 분 동안 방치하십시오.
   5. 293T 세포의 배양액을 제거하고 단계 10.2.4의 혼합물을 293T 세포에 첨가한다. 배양액을 8시간 후에 신선한 DMEM + 10% FBS로 변경한다.
   6. 48시간 후, 처음으로 바이러스 상청액을 수집하고 0.45 μm 필터를 통해 여과한다. 72시간 후, 두 번째로 바이러스 상청액을 수집하고 이를 다시 0.45 μm 필터로 여과한다.
      참고: 여과된 상청액을 렌티바이러스 형질도입 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
3. DED 마우스(NOD/ShiLtJ)로부터 LGSCs를 얻는다(단계 1 참조).
4. 미리 수집된 pLX-mCherry 렌티바이러스 상청액 1 mL를 첨가하여 세포를 재현탁시킨다.
5. 원심분리 튜브를 37°C의_CO2 인큐베이터 내의 진탕기 상에 놓는다. 100rpm으로 흔들어 렌티바이러스와 세포 사이의 접촉을 최대화합니다. 8시간 후, 혼합물을 250 × g 에서 4분 동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다.
6. DMEM/F12 1mL를 첨가하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정하고 총 1 × 10 내지 10개의⁴ 개의 세포를 매트릭스 겔-LGSCM 매트릭스 (매트릭스 겔: LGSCM = 1:1)의 매트릭스 겔-LGSCM 매트릭스 20 μL로 예비코팅된 24-웰 플레이트의 각 웰에 시드한다 (단계 1.3.2 참조).
7. 배양 7일 후(단계 1 참조), 배양물을 확장하기 위해 형광현미경 하에서 적색 형광을 나타내는 구체를 선택한다.

11. LGSC 정형 외과 이식

참고 : 모든 수술 수술은 SPF 수술실에서 수행되며 모든 수술 도구는 멸균됩니다.

1. 7일 동안 배양된 ROSA26^mT/mG 마우스로부터 LGSC 구체를 적색 형광(td-Tomato) 또는 mCherry 형질감염으로부터 수득한다(단계 1 참조).
2. 사용하기 전에 얼음 위에 매트릭스 젤과 DMEM/F12의 1:1 혼합물이 들어있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 식히십시오. LGSC 구체를 단일 세포로 소화하고 튜브에서 2 × 10⁶ cells/mL의 밀도로 세포를 재현탁하십시오.
3. 펜토바르비탈 나트륨 (50 mg / kg)의 복강 주사로 NOD / ShiLtJ 마우스를 마취하십시오.
   참고 : NOD / ShiLtJ 마우스는 눈물 분비 감소, 염증성 침윤 및 궤도 궤양을 포함한 특발성 ADDED 증상이있는 이상적인 모델입니다.
4. 마취 후 건조를 방지하기 위해 눈에 식염수 또는 수의사 연고를 사용한 다음 안과 가위를 사용하여 마취 마우스의 귀 뒤 (눈 근처)의 피부를 5-8mm 잘라 LG를 노출시킵니다.
   참고 : Iodophor는 절개 주위의 소독에 엄격하게 사용해야합니다.
5. 2 × 10⁴ 셀을 왼쪽 LG에 주입하고 세포가없는 혼합물을 대조군으로 오른쪽 LG에 주입하십시오 (단계 11.2 참조).
6. 주사 후 LG를 안과 포셉으로 원래 위치로 복원하고 상처를 봉합하십시오. 마우스에게 2 개월 동안 먹이를주고 치료 효과를 관찰하십시오.
   참고 : 케이지 쿠션 재료는 수술 후 엄격하게 멸균되어야하며 쿠션 재료는 하루에 한 번 교체해야합니다. 상처를 봉합 한 후, 트라마돌은 진통제를 달성하기 위해 2.5 mg / kg의 표준 용량으로 마우스의 꼬리 정맥에 선택적으로 주입 될 수 있습니다.
7. 실험 2개월 후에 이들 마우스를 마취시킨다(단계 11.3 참조). 안구 영역의 증상을 촬영하십시오.
   1. 마취 동안, 다음과 같은 증상을 찾으십시오 : 목과 사지 근육 이완; 깊고, 느리고, 꾸준한 호흡; 동공 협착; 각막 반사 실종.
   2. 마취 및 수술 중에 마우스의 체온을 37°C로 유지하십시오. 수술 후 쥐의 식수에 적절한 항생제를 첨가하여 상처 감염의 위험을 줄입니다. 쥐가 흉골 잔해를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 상태로 두지 마십시오. 수술을받은 마우스를 완전히 회복 될 때까지 다른 마우스의 회사에 반환하지 마십시오.
   3. 안구 영역의 증상을 촬영 한 후 ImageJ 소프트웨어를 열고 파일 |를 클릭하십시오. 오픈 | 자유형 선택, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 채 이미지에서 궤도 궤양 영역을 선택합니다. | 분석을 클릭하십시오. 궤양의 상대적 영역을 얻기 위해 측정하십시오.
8. 페놀 레드 코튼 실을 마취 마우스의 측면 칸투스에 10 초 동안 놓는 단계; 면실의 변색 된 부분의 길이를 측정하고 기록하십시오. 눈물 측정 후 자궁 경부 척추 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다.
9. 마우스를 해부하고 IHC 분석을 위한 LGs를 얻었다.

12. RNA 분리

참고: 실험 전에 원심분리기를 4°C로 예냉하고 모든 시약 및 소모품에 RNAse 오염이 없음을 보장합니다.

1. LGSC 또는 LG 파편을 마이크로 원심분리 튜브에 수집하십시오. 세포 용해 완충액 1 mL를 첨가하고 와류 진동에 의해 세포 또는 조직을 완전히 용해시킨다.
2. 클로로포름 0.2 mL를 첨가하고, 1분 동안 와류 진동 후 실온에서 10분 동안 방치한다. 4°C, 12,000 × g에서 15분 동안 원심분리한다.
   참고 : 원심분리 후 액체는 세 층으로 나뉘며 RNA는 가장 투명한 성상에 있습니다.
3. 최상부 투명한 수성상을 조심스럽게 피펫팅하고, 이를 새로운 1.5 mL RNAse-free 원심분리 튜브로 옮긴다.
4. 같은 양의 이소프로필 알코올을 넣고 부드럽게 섞으십시오. 혼합물을 실온에서 10분 동안 방치한 다음, 4°C, 12,000 × g에서 15분 동안 원심분리한다.
5. 상층액을 제거하고, 75% 에탄올 1 mL를 첨가한다. 튜브를 뒤집어 펠렛을 세척하고 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 7,500 × g으로 세척한다. 이 단계를 반복합니다.
6. 상층액을 조심스럽게 제거하고 원심분리 튜브를 울트라클린 워크벤치에 넣어 약 20 분 동안 건조시킵니다.
   참고: 흰색 펠릿이 반투명해지면 다음 단계로 진행하십시오. 얼음에서 모든 작업을 수행하십시오.
7. 20 μL의 RNAse-프리 물을 첨가하여 펠렛을 완전히 용해시킨다. 분광광도계( 표 문헌 참조)를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 RNA 용액을 -80°C에 저장한다.

13. PCR

1. 역전사 반응
   1. 총 RNA 1 μg(RNA 용액의 농도에 따라 첨가된 RNA 용액의 부피 계산)을 PCR 반응 튜브에 첨가하고, 변성을 위해 65°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
   2. 얼음 위에 1분 동안 넣은 다음 총 부피가 12μL에 도달할 때까지 효소가 없는 물을 첨가한다. 4 μL의 4x DNA 마스터 믹스를 첨가하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
   3. 튜브를 얼음 위에 놓고 4μL의 5x RT 마스터 믹스를 넣고 부드럽게 섞습니다. 다음 PCR 설정을 설정합니다: 15분 동안 37°C, 5분 동안 50°C, 5분 동안 98°C, 1분 동안 4°C.
   4. 이를 -20°C에 보관하거나 역전사 반응이 완료된 후 다음 단계로 진행한다.
2. PCR 반응
   1. 다음과 같이 PCR 튜브에서 PCR 반응을 준비한다: 14.1 μL의 효소 없는 물, 2 μL의 dNTP, 2 μL의 10x 버퍼, 0.8 μL의 프라이머 (10 μM, 0.4 μL의 정방향 프라이머, 및 0.4 μL의 역방향 프라이머, 물질의 표 참조), 1 μL의 역전사 cDNA (단계 13.1 참조) 및 0.1 μL의 Taq 효소.
   2. 제조된 PCR 반응을 PCR용 PCR 장치에 넣는다. PCR 절차에 대한 Taq 효소 키트의 지침을 참조하십시오 ( 물질 표 참조).
3. 아가로스 겔 전기영동
   1. 분석 저울을 사용하여 트리스 242g과 Na2EDTA·_{2H2O 37.2g}의 무게를 측정하고 1L 비이커에 첨가하십시오. 비이커에 ~ 800 mL의 탈이온수와 57.1 mL의 빙초산을 첨가하고, 잘 섞고, 탈이온수 1L를 첨가하여 50x TAE 완충액을 얻은 다음 실온에서 보관하십시오.
      참고: 사용하기 전에 50x TAE 버퍼를 탈이온수로 희석하십시오.
   2. 분석 저울을 사용하여 1.2g의 아가로스를 칭량하고 80mL의 1x TAE 완충액을 함유하는 원뿔형 플라스크에 첨가한다. 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지에서 반복적으로 가열하십시오.
   3. 용액 온도가 60°C로 떨어질 때까지 흐르는 수돗물 아래에서 플라스크를 식힌다. 8 μL의 핵산 얼룩을 첨가하고, 잘 섞은 후 용액을 젤라틴화 탱크에 붓고, 빗을 놓고, 실온에서 30 분 동안 방치하십시오.
   4. 빗을 꺼내 PCR 산물을 준비된 아가로스 겔에 로딩한다. 120V에서 30분 동안 전기영동을 수행합니다.
   5. 겔을 ECL Gel 이미징 시스템에 놓고 사진을 촬영한다.

3D, 무혈청 문화 시스템 구축
본 연구에서는 마우스 LGSC용 EGF, Wnt3A, FGF10 및 Y-27632를 포함하는 LGSCM을 개발하였고, LGSCs는 3D 배양법으로 성공적으로 분리 및 배양하였다(도 1A). C57BL/6 마우스, NOD/ShiLtJ 마우스, BALB/c 마우스 및 ROSA26mT/mG 마우스로부터의 LGSCs의 성공적인 3D, 무혈청 배양 시스템이 이 방법16을 사용하여 확립되었다. 수컷 마우스의 경우, 1.5-2 × 10개의6 개의 세포를 해리시킴으로써 2개의 LGs로부터 수득하였다. 배양 1주일 후, 배양 초기에 1 × 10개의 4개의 LG 세포를 시딩할 때 30-60개의 구가 형성되었다. 더욱이, 이 방법에 의해 배양된 세포는 Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin 및 기타 줄기세포 마커(16)를 발현했는데, 이는 수득된 세포가 LGSCs의 특성을 가졌다는 것을 나타낸다. Krt14 및 Ki67은 7일 동안 배양된 LGSCs에 의해 형성된 모든 구체에서 발현되었고(도 1B), LGSCs가 자가재생 능력을 가졌다는 것을 나타낸다.

7일간의 배양 동안, LGSCs 구체는 직경 100 μm에 도달하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 7일째에 세포성을 나타내었다(도 1C 및 도 1F). 1차 배양 및 계대 배양 7일 후에 얻은 LGSCs의 농축 인자는 이 방법으로 농축된 LGSC가 강한 증식 능력을 가졌다는 것을 나타내었다(그림 1D). 이 시스템에서 LGSC는 40 회 이상 계대 될 수 있으며 여전히 줄기 세포 특성을 유지했습니다 (그림 1E 및 그림 1G). 결론적으로, 이 논문은 시험관 내에서 LGSCs를 위한 3D, 무혈청 배양 시스템을 확립하기 위한 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜에 의해 배양된 세포는 지속적이고 안정한 증식 능력을 갖는다.

시험관내 분화 유도
시험관내에서 LGSCs의 분화능을 분석하였다. 7일 이상 배양하였을 때, LGSCs는 점차 성장 능력을 상실하고, 분화와 관련된 AQP5, Ltf, Krt19 및 기타 마커의 발현은 증가한 반면, Krt14의 발현은 점차 감소하였다 16. LGSCs는 FBS와 낮은 비율의 매트릭스 겔에 의해 더 많은 새싹을 형성하도록 유도되었다 (도 2A, B). 또한, H&E 염색은 FBS가 구체가 더 많은 캐비테이션 구조를 생성하도록 유도할 수 있음을 나타냈다(도 2C).

이전 연구는 매트릭스 경도가 감소하면 LGSC가 덕트와 같은 오가노이드로 분화되는 것을 촉진한다고 제안했습니다. 기저층 세포는 Krt14를 발현하는 줄기세포의 특성을 유지한 반면, 기저 상층 세포는 충치가 있는 덕트 유사 구조로 분화되어 Krt19를 발현하였다. 또한 FBS를 첨가하면 LGSC가 아시나 유사 오가노이드로 분화되어 높은 핵 / 세포질 비율로 줄기 세포의 특성을 유지할 수 있습니다. 일부 분화된 아시나-유사 세포는 낮은 핵/세포질 비율16으로 높은 수준의 AQP5를 발현하였다.

 생체 내에서 LGSC를 수리하십시오. 
위의 실험을 바탕으로, LGSC가 손상된 LG를 복구하는 능력은 정형 외과 주사에 의해 탐구되었습니다. NOD/ShiLtJ 마우스에 ROSA-LGSCs의 동위원소 주사 후, LG에 인접한 새로운 눈물 소엽이 형성되었다(도 3A-C). 대부분의 소엽은 AQP5의 높은 발현을 갖는 성숙한 acinar 세포로 구성되었고, 낮은 AQP5 발현을 갖는 소뇌 내 덕트 형성이 있었다 (도 3D-F). 8주 동안 ROSA-LGSCs를 주사한 후, 수용자의 궤도 주위의 붕괴를 측정하였다. 측정 결과에 따르면 LGSC를 주입하면 붕괴 면적이 ~ 60 % 감소했습니다 (그림 3G, H). 해부에서는 주사 후 10주 동안 LG 부피가 증가한 것으로 나타났다(도 3I). ROSA-LGSCs 주입 측면에서의 눈물 분비량은 대조군 측에서는 높았지만 야생형 마우스보다 낮았다(도 3J). 이러한 결과는 이 배양 시스템에 의해 수확된 세포가 LGSCs의 특성을 가지며 ADDED 및 xerophthalmia를 가진 마우스에서 줄기 세포 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다.

그림 1: LGSC의 분리 및 특성화. (A) LGSC 1차 및 연속 계대 배양의 전략. (b) 7일째에 LGSCs의 면역형광 염색. LGSCs는 상피 세포 마커 E-cadherin (적색), 줄기 세포 마커 Krt14 (적색), 증식성 세포 마커 Ki67 (적색)을 발현한다. 카운터 스테인, DAPI (파란색). (C) 1, 3, 5 및 7 일 동안 배양에서 LGSC의 형태학. (d) 일차 문화 및 계대 배양에서 LGSC 문화의 상대적 농축 인자. 상대적 농축 인자는 배양 7일 후에 수득된 총 세포 수와 배양물에 시딩된 세포의 수의 비율이다. P < 0.01. (e) 마우스 LG 및 상이한 계대 LGSCs(P1, P10, P20 및 P40)의 성체 줄기/전구 세포 마커의 전사. (F) 7일째 배양에서 LGSCs의 형태학(왼쪽) 및 H&E 염색(오른쪽). (g) LGSCs를 상이한 계대배양(P1, P10, P20, 및 P40)에서 배양하였다. 스케일 바 = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). 약어: LG = 눈물샘; LGSCs = LG 줄기세포; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; NC = 음성 대조군; TE = 트립신-EDTA; H&E = 헤마톡실린과 에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 시험관 내에서 LGSCs의 분화. (A,B) 정상 배지 또는 분화 배지에서 배양된 LGSCs의 형태학. (a) LGSCs를 P10에서 10일 동안 배양하였다(왼쪽: 정상 배지, 오른쪽: FBS 함유 배지). (b) LGSCs를 P31에서 14일 동안 배양하였다(왼쪽: 정상 배지, 오른쪽: 1/3rd 매트릭스 겔을 갖는 배지). (c) 14일 동안 배양한 LGSCs의 H&E 염색 (상단: 정상 배지, 하단: FBS 함유 배지). 스케일 바 = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). 약어: LG = 눈물샘; LGSCs = LG 줄기세포; H&E = 헤마톡실린 및 에오신; FBS = 태아 소 혈청. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: LGSCs 동종이식의 생착 및 ADDED 증상의 완화. (A-F) 8주 후 ROSA-LGSCs의 7일간 배양으로 이식된 NOD/ShiLtJ LG의 IHC 염색. 실험군 및 대조군과 동일한 마우스의 왼쪽과 오른쪽을 사용하십시오. (A-C) 항-td-토마토 항체로 IHC 염색; (D-F) 항-AQP5 항체로 IHC 염색; (A, D) 비히클을 주입한 LG(매트릭스 젤과 DMEM/F12의 1:1 혼합물), (B, E) ROSA-LGSC를 주입한 LG, (C, F) B, E(빨간색 화살표, 소엽 내 덕트)의 검은색 사각형의 확대 이미지. (G, H) 8주째에 ROSA-LGSCs를 주사한 후 NOD/ShiLtJ 마우스 눈 궤도의 상태. LGSC의 주입은 눈 궤도 주위의 붕괴를 상당히 완화시킵니다. (i) 10주째에 NOD/ShiLtJ 마우스의 LGs(왼쪽: 세포 주입측에서 LG, 오른쪽: 대조군에서 LG). (J) 8주 후 ROSA-LGSCs의 7일간 배양물로 이식된 야생형 및 NOD/ShiLtJ 마우스의 눈물 부피. ROSA-LGSC가 주입한 LG의 인열 부피는 대조군 LG보다 높지만 WT LG의 인열 부피보다 현저히 낮습니다. n = 3; NOD/ShiLtJ 마우스, n=4; P < 0.01; *P < 0.05. 스케일 바 = 50 μm (A-F). 약어: LG = 눈물샘; LGSCs = LG 줄기세포; IHC = 면역조직화학적; WT = 야생형; ADD = 수성 결핍성 안구 건조증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.