HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 경구 조합 항레트로바이러스 치료

만성 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 감염된 개인의 기대 수명은 조합 항레트로바이러스 치료(cART^)로 크게 향상되었습니다^1,2. cART는 HIV-1 복제를 성공적으로 감소시키고 대부분의 HIV-1 만성^{감염 참가자3}에서 CD4+ T 세포 수를 정상으로 증가시켜 전반적인 건강을 개선하고 질병^{진행을 극}적으로 감소시킵니다4. 그러나 잠복 HIV-1 저장소는 급성 감염 ^5,6,7 동안 ART가 시작된 경우에도 설정됩니다. 저장소는 ART 동안 수년에 걸쳐 지속되며 ART 중단 후 빠른 바이러스 반동은 잘 문서화되어 있습니다 ^8,9. ART에서 HIV에 감염된 사람들은 또한 심혈관 질환, 암 및 신경 장애와 같은 동반 질환의 위험이 더 높기 쉽습니다^10,11,12. 따라서 HIV에 대한 기능적 치료가 필요합니다. HIV-1 감염에 대한 동물 모델은 새로운 HIV 치료 전략^13,14,15를 개발하고 검증하는 데 명백한 이점을 제공합니다. 인간화 마우스는 작은 동물 모델로서 다른 조직에서 다계통 인간 면역 세포 재구성을 제공할 수 있으며, 이는 HIV 감염^16,17,18,19에 대한 면밀한 연구를 가능하게 합니다. 인간화 모델 중에서, 인간화 골수-간-흉선 (BLT) 모델은 HIV-1 감염에 대한 기능적 인간 면역 반응뿐만 아니라 만성 HIV-1 감염을 성공적으로 요약한다 20,21,22,23,24. 따라서, 인간화 BLT 마우스 모델은 HIV 연구 분야에서 다양한 측면을 조사하는데 널리 이용되고 있다. 인간화 BLT 마우스는 지속적인 HIV-1 감염 및 병인의 요약을 위한 잘 확립된 모델일 뿐만 아니라 세포 치료 기반 개입 전략의 평가를 위한 결과적 도구이기도 합니다. 현재의 저자 및 다른 사람들은 인간화 BLT 마우스 모델이 지속적인 HIV-1 감염 및 병인^25,26,27을 요약하고 세포 치료 기반 중재 전략 28,29,30,31,32,33을 평가하는 도구를 제공한다는 것을 입증했습니다.

매일 복용하는 항 레트로 바이러스 약물의 조합으로 구성된 cART 요법은 성공적으로 치료 된 개인의 바이러스 부하가 장기간 동안 검출 할 수없는 지점까지 HIV-1 복제를 억제합니다³⁴. 임상적으로 관련된 cART 요법으로 HIV-감염된 인간화 마우스를 치료하는 결과는 HIV-1에 감염된 ART-치료^{된 개체에서} 관찰된 것과 유사하다22: HIV-1 수준은 검출의 한계 이하로 억제되고, cART의 중단은 잠복 저장소(³⁵)로부터 HIV 복제의 반동을 초래한다. 피하 (SC) 27,36,37 또는 복강 내 (IP) ^37,38,39 주사는 인간화 마우스에서 cART 치료에 일반적으로 사용되는 경로입니다. 그러나, 집중적인 일일 주사는 신체적 구속에 의해 동물에게 스트레스를 유도한다(⁴⁰). 또한 노동 집약적이며 날카로운 물건을 사용하는 동안 HIV에 대한 노출이 증가하기 때문에 연구자에게 잠재적으로 안전하지 않습니다. 경구 투여는 HIV-1에 감염된 개인이 복용하는 cART 약물의 흡수, 분포 및 배설을 모방하는 데 이상적입니다. 경구 투여는 일반적으로 항 레트로 바이러스 약물을 멸균 된 (마우스의 면역 결핍으로 인해 필요함) 음식 24,37,41 또는 물^{42,43,44,45,46}에 넣는 맞춤형 및 종종 힘든 절차를 포함합니다. , 이는 많은 항 레트로 바이러스 약물과 화학적으로 양립 할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있고, 마우스가 쉽게 먹거나 마시지 않는 것을 초래할 수도 있습니다 (신체의 복용량 및 약물 수준에 영향을 미칠 수 있음). 여기에 제안된 새로운 peroral cART 투여 방법은 다양한 유형의 항레트로바이러스 약물과의 호환성, 안전성 및 준비 및 투여 용이성, 매일 주사로 인한 동물 스트레스 및 불안 감소로 인해 이전 전달 시도를 능가합니다.

Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) 및 Raltegravir (RAL)는 수용성이 낮은 약물입니다. 흥미롭게도, TDF의 증가된 생체이용률은 지방 식품에서 관찰되며, 이는 지방이 많은 음식에 의한 리파아제의 경쟁적 억제가 TDF⁴⁷에 대한 특정 보호를 제공할 수 있음을 시사한다. 따라서 DietGel Boost 컵은 일반 설치류 차우(100g당 10g) 및 일반적인 마우스 고지방 식단(100g당 40-60g)⁴⁸과 비교하여 적당한 지방 함량(100g당 20.3g)을 기반으로 전달 방법으로 일반 설치류 차우를 대체하기 위해 선택되었습니다. 한 컵의 총 무게는 75g입니다. 따라서 각 컵에는 3 일 동안 5 마리의 마우스에 충분한 양의 음식과 약물이 들어 있습니다.

익명화된 인간 태아 조직은 상업적으로 획득되었다. 동물 연구는 모든 연방, 주 및 지역 지침에 따라 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스 및 (UCLA) 동물 연구 위원회(ARC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 구체적으로, 모든 실험은 UCLA ARC 프로토콜 번호 2010-038-02B에 따라 국립 보건원 (NIH) 및 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AALAC) 국제 실험실 동물의 주거 및 관리에 대한 권장 사항 및 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 수술은 케타민 (100 mg / kg) / 자일 라진 (5 mg / kg) 및 이소 플루 란 마취 (2-3 부피 %)하에 수행되었으며 동물의 통증과 불편 함을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. HIV-1에 감염된 인간화 마우스

참고: 인간화 마우스는 이전에^30,31,49에 기재된 바와 같이 구축하였다. 프로토콜은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.

1. 제조업체의 프로토콜에 따라 항-CD34 마이크로비드 를 통해 인간 태아 간에서 CD34+ 조혈 전구 세포를 정제합니다.
2. 수술 전에 6-8 주 된 NOD / SCID / IL2Rγ-/- (NSG) 수컷 및 암컷 마우스를 마취시키고 아 치사 조사 (2.7 Gy)하십시오.
3. 태아 간과 동일한 기증자로부터 유래 된 흉선을 간과 함께 신장 캡슐 아래에 이식하십시오.
4. 이식 후, 마우스에 0.5백만에서 100만 CD34+ 세포를 정맥주사한다.
5. 8-10주 후, 역궤도 블리드⁵⁰을 통해 마우스 혈액 100μL를 EDTA 5μL가 포함된 미세 원심분리 튜브에 수집하고 350 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
6. 마우스가 HIV-1에 감염된 후 바이러스 부하를 모니터링하기 위해 혈장을 -80 ° C에 보관하십시오. 2mL의 83% NH4C 용액을 넣고 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 용해시킵니다.
7. 용해를 중지하기 위해 10% 태아 소 혈청(FBS)과 함께 RPMI 10mL를 추가합니다. 300 x g 에서 5분 동안 돌립니다.
8. 상청액을 흡인하십시오. 항체 패널( 재료 표 참조)로 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 인간 면역 세포 생착을 확인합니다.
9. 순환하는 CD45+ 세포의 50% 이상을 나타내는 마우스를 인슐린 주사기를 사용하여 HIV-1 균주의 p24 200ng 이상(즉, NFNSXSL9 30,53,54)으로 역안와 정맥 주사 ^51,52로 감염시킵니다. 유세포 분석 분석을 위해 격주로 혈액을 수집하고 바이러스 부하를 측정합니다.

2. ART 약물의 제조

1. 개별 약물의 무게를 측정하십시오. 예를 들어, cART로 식품 컵 10개를 만들려면 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 250mg의 FTC(엠트리시타빈), 375mg의 TDF, 500mg의 RAL 또는 ELV를 생물안전 캐비닛의 개별 멸균 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
2. 250 mg FTC 튜브(최종 농도 250 mg/mL)에 1 mL의 DMSO를 추가하고, 375 mg TDF 튜브(최종 농도 250 mg/mL)에 1 mL의 DMSO를 추가하고, 500 mg RAL 또는 ELV 튜브(최종 농도 500 mg/mL)에 DMSO 1mL를 추가합니다. 완전히 용해되고 투명한 용액이 얻어 질 때까지 약물 혼합물을 교반하거나 피펫하십시오.
3. 0.22μM 공극 크기 친수성 PVDF 멤브레인 필터를 사용하여 멸균 주사기로 용액을 멸균합니다. 개별 약물 용액은 -20°C에서 12주 동안 보관할 수 있습니다.
4. 사용할 준비가 되면 용액이 투명해질 때까지 37°C에서 각 약물 용액의 분취량 하나를 새로 해동합니다. 피펫을 사용하여 잘 섞는다.
5. 약물을 결합하고 잘 혼합하여 마스터 믹스를 구성합니다 : DMSO에서 1mL의 FTC, DMSO에서 1.5mL의 TDF, DMSO에서 1mL의 ELV 또는 RAL.
   알림: 이 양은 10개의 음식 컵을 만들 것입니다.
6. 350 μL의 cART 마스터 믹스 용액을 한 컵에 넣어 하나의 다이어트젤 부스트 cART 컵을 만듭니다.
7. 0.75mL의 트리메토프림-설파메톡사졸(최종 농도 0.48mg/mL)을 컵에 넣습니다.
8. 1mL 멸균 피펫 팁을 사용하여 완전히 저어줍니다.
9. 필요에 따라 마이크로 주걱으로 원래 컵의 cART가 들어 있는 식품 컵을 60mm 페트리 접시에 분배합니다. 쥐의 수에 따라 각 케이지에 대한 cART가 들어 있는 음식 컵의 양을 계산하기 위해 저울로 음식을 칭량한다.

3. HIV-1 감염 마우스에 대한 ART 약물 투여

1. 케이지에서 일반 차우를 제거하고 cART가 들어있는 식품 컵으로 교체하십시오.
   알림: 평균적으로 마우스는 하루에 최대 5g의 음식을 섭취합니다. 약 1 개의 음식 컵을 2 일 동안 5 마리의 마우스에게 투여 할 수 있습니다.
2. 일주일에 세 번 cART 음식을 새로 고칩니다.
3. 섭취량을 모니터링하기 위해 사용한 컵의 무게를 측정합니다. 소비량을 확인하기 위해 매주 쥐의 무게를 측정하십시오.

4. 실시간 PCR로 바이러스 부하 모니터링

1. 인간 면역 세포 (CD4 및 CD8 T 세포 수준)와 BLT 마우스에서 2 주마다 역궤도 출혈로 HIV-1 복제를 평가합니다. 1.5-1.8단계의 지침에 따라 혈장을 수확합니다.
2. 8주 동안 경구 cART 투여 전과 도중에 HIV-1에 감염된 마우스의 혈장 바이러스 부하를 모니터링합니다. 바이러스 RNA 추출 키트를 이용하여 혈장으로부터 혈장 바이러스 RNA를 추출하고, 앞서 기술한 바와 같이 프라이머 및 프로브(물질 표 참조)를 이용한 실시간 PCR로 정량^한다(문헌 표 ^참조). 다음 사이클링 프로토콜을 사용하십시오 : 48 ° C (15 분), 95 ° C (10 분), 95 ° C (15 초), 60 ° C (1 분) 동안 45 사이클.

5. 유세포분석에 의한 CD4/CD8 비율 평가

1. 1.5-1.8단계에 따라 격주 출혈의 말초 혈액에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
2. 표면 마커로 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석합니다. 유세포분석에서 다음의 표면 마커 항체 27,30,43,49를 사용한다: CD45 (클론 HI30), CD8 (클론 SK1), CD3 (클론 OKT3), CD4 (클론 RPA-T4)^27,30,42,49.

체중이 25g인 평균 마우스가 하루에 4g의 음식을 섭취한다고 가정하면 경구 섭취를 통한 일일 약물 용량은 2.88mg/kg TFV, 83mg/kg FTC 및 768mg/kg RAL에 해당합니다. 최적화된 식품 요법이 독성이 있고 cART의 일일 주사와 비교하여 전반적인 건강에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, 마우스 체중을 경구 또는 피하 주사를 통해 cART 전과 도중에 매주 모니터링하였다. 각 군에서 cART 투여 전에 유의한 체중 차이는 없었다(도 1). 그러나, 마우스 체중은 매일 cART SC 주사 동안 지속적으로 감소하였다. 대조적으로, 다이어트젤의 FTC/TDF/ELV 또는 FTC/TDF/RAL은 경구 cART 투여 5주 후 마우스 체중을 ART 이전 개시 수준으로 회복시켰다. 또한, 랄테그라비르 또는 엘비테그라비르 그룹 간에 유의한 체중 변화는 관찰되지 않았다.

경구 cART 투여가 매일 주사만큼 효과적으로 바이러스 부하를 억제하는지 테스트하기 위해 RT-PCR을 사용하여 격주 혈장 바이러스 부하를 평가했습니다. 도 2 는 FTC/TDF/ELV ART 식품 요법이 4주 이내에 검출할 수 없는 수준으로 바이러스 복제를 100% 효율적으로 억제했음을 보여준다; FTC / TDF / RAL ART 식품 요법은 4 주 이내에 마우스의 80 %를 검출 할 수없는 수준으로 억제 할 수있는 반면, SC 주사를받은 마우스의 70 %만이 치료 4 주 후에 검출 할 수없는 수준에 도달했습니다. 결과는 경구 투여가 SC 주사보다 바이러스 복제를 더 빠르고 효율적으로 억제한다는 것을 입증했습니다. 또한, cART 식품 요법은 SC 일일 주사보다 일찍 말초 혈액에서 CD4 / CD8 비율의 추가 감소를 방지했습니다 (그림 3). 이러한 결과는 제안된 경구 cART 요법이 검출 수준 미만의 혈장 바이러스혈증을 성공적으로 억제하고, CD4 T 세포 수준을 신속하게 회복하며, HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 동물의 전반적인 건강을 개선할 수 있음을 시사했습니다.

그림 1: 다른 그룹에서 HIV-1 감염 후 cART 치료 전과 치료 중 마우스 체중 변화. 인간화 마우스는 면역 재구성 후 HIVNFNSXSL9에 감염되었다. HIV-1 감염 4주 후, 마우스는 피하(SC) 주사를 통해 또는 FTC/TDF/RAL 또는 FTC/TDF/ELV 중 하나를 경구 투여함으로써 FTC/TDF/RAL 요법으로 7.5주 더 치료받았다. 마우스 체중은 HIV 감염 1주일 전부터 측정하였다. 모든 통계적 비교는 Mann-Whitney 검정, 보고 그룹 평균(± SE)을 사용하여 수행되었습니다. 녹색 별표 별은 FTC / TDF / ELV 식품 경구 그룹과 FTC / TDF / RAL SC 주입 그룹 간의 통계적 차이를 보여줍니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 각 그룹에서 n = 6-7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 식품 경구 cART 투여는 더 빠른 바이러스 억제를 보여줍니다. 도 1에 기재된 바와 같이, 마우스는 피하 주사를 통해 그리고 식품 컵 모의, FTC/TDF/RAL 또는 FTC/TDF/ELV 식품 요법의 경구 투여를 통해 추가로 7.5주 동안 치료되지 않거나 FTC/TDF/RAL 요법으로 치료되었습니다. (A) 다른 그룹에서 HIV-1 감염 후 시간 경과에 따른 혈장 바이러스 부하. (B) 다른 그룹의 HIV-1 감염 후 시간 경과에 따른 바이러스 부하 요약, 95% 신뢰 구간(CI)으로 그룹 기하 평균을 보고합니다. 검은색 화살표는 cART 처리된 그룹에 대한 cART 개시 시간을 나타낸다. (c) 각 군에 대한 검출불가능한 바이러스 부하에 대한 cART 치료 후 시간의 생존 분석. n = 각 그룹에서 6-7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: ART 식품 경구 투여는 CD4/CD8 비율의 더 빠른 회복을 보여줍니다. 각 그룹에 대한 HIV-1 감염 후 시간 경과에 따른 말초 혈액의 CD4/CD8 비율. 모든 통계적 비교는 Mann-Whitney 검정, 보고 그룹 평균(± SE)을 사용하여 수행되었습니다. 빨간색 별표 별은 FTC / TDF / RAL 식품 경구 그룹과 FTC / TDF / RAL SC 주사 그룹 간의 통계적 차이를 보여줍니다. *P < 0.05. 각 그룹에서 n = 6-7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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