Method Article

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체 내에서 단백질 항상성을 이해하는 것은 세포가 생리적 및 질병 조건 모두에서 어떻게 작동하는지 아는 데 중요합니다. 본 프로토콜은 단백질 표지를 특정 세포 집단으로 향하게 하기 위해 조작된 마우스 라인을 사용하여 새로 합성된 단백질의 생체내 표지 및 후속 정제를 설명합니다. L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)의 Cre 재조합 효소 발현에 의한 유도성 라인으로, 그렇지 않으면 발생하지 않는 단백질에 아지도노르류신(ANL) 통합을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하여 생체 내에서 표지된 세포 유형 특이적 단백질체를 정제하고 샘플 복잡성 감소로 인한 단백질 함량의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.

Introduction

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비정상적인 단백질 항상성은 단백질 합성 및 분해의 불균형으로 인해 발생합니다. 여러 질병은 단백질 항상성의 변화와 관련이 있습니다. 일부 질병의 특징은 다른 세포 하 위치와 뇌 영역에 응집체가 존재한다는 것입니다. 단백질 항상성은 질병에서 중요할 뿐만 아니라 정상 장기 및세포 기능에도 중요한 역할을 합니다1. 예를 들어, 단백질 합성은 단백질 합성을 차단하는 화학적 억제제의 사용에 의해 결정되는 바와 같이 많은 형태의 신경 가소성 2,3에 필요합니다4. 그러나 학습과 기억을 지원하기 위해 프로테옴이 어떤 세포 유형에서 변경되는지, 각 세포 유형의 특정 단백질이 합성 또는 분해에서 증가 또는 감소하는지 명확하지 않습니다. 따라서 단백질 항상성에 대한 포괄적 인 연구는 특정 세포 유형에서 오는 단백질체를 구별 할 수있는 능력을 필요로합니다. 실제로, 다세포 환경에서 발생하는 세포 과정을 연구하기 위한 세포 유형 특이적 단백질체의 식별은 단백질체학에서 중요한 장애물이었습니다. 이러한 이유로 당사는 세포 유형 특이적 단백질체를 식별하고 정제하는 효과적인 방법으로 입증된 생체 직교 방법과 결합된 MetRS* 발현....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 독일(RP 다름슈타트, 프로토콜: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) 또는 스페인(UCM 동물 실험 위원회 및 마드리드 코무니다드 환경 상담, 프로토콜 번호: PROEX 005.0/21)의 허가를 받아 수행되었으며 막스 플랑크 협회 규칙 및 스페인 규정을 준수하고 동물 복지에 대한 EU 지침을 따릅니다.

1. ANL 을 이용한 생체 내 대사 표지

  1. 음료수:
    1. ANL과 맥아당을 생쥐의 일반 식수에 녹입니다. 권장 맥아당 농도는 0.7%(wt/vol)입니다. 음용수에 첨가되는 ANL의 최대량은 1 % (wt / vol)입니다. 혼합물이 준비되면 여과로 멸균하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    2. 단계 1.1에서 제조된 혼합물을 마우스에 제공한다. 오염을 방지하기 위해 병을 자주 교체하고(예: 3일마다) 매일 점검하여 오염 또는 막힘 가능성을 찾으십시오. 쥐의 ANL 섭취량을 알기 위해 매일 체중을 측정하여 음주의 양을 모니터링하십시오.
      참고: 여기에서 평가된 최대 라벨링 기간은 음용수에서 1%의 ANL 농도를 사용하여 3주이며, 그 결과 뇌에서 잘 감지할 수 있는 라벨링이 발생했습니다. 좋은 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

설명된 프로토콜(그림 1에 요약됨)에 따라 ANL을 7일 동안 매일 복강주사(400mM ANL 10mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) 또는 음용수(0.7% 말토오스, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*)를 통해 마우스에 투여했습니다. 표지 후, 상응하는 뇌 영역을 해부하고, 용해시키고, 알킬화하고, 클릭시켰다. 클릭 반응은 SDS-PAGE 및 웨스턴 이뮤노블롯으로 분석하였다. 실험의 대표 이미지는 IP 주입에 의한 ANL 투여에 대해 도 2에 나타내고 음용수를 통한 ANL 투여에 대해 도 3에 나타내었다. 그림의 목적은 두 라벨링 프로토콜이 모두 작동한다는 것을 보여주는 것이지 비교하는 것이 아닙니다. 표시된 두 가지 실험 (해마와 피질의 흥분성 뉴런과 소뇌의 Purkinje 뉴런)에서 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜의 중요한 측면은 다음과 같습니다. DST- 알킨을 사용할 때 충분한 생물학적 복제, ANL 투여 경로, 양 및 기간, 샘플의 알킬화, 알킨 농도 및 β- 메르 캅토 에탄올 제거를 갖는 음성 대조군의 포함.

Cre 드라이버가 없는 ANL 표지 동물에서 진행된 음성 대조군 샘플을 포함하는 것이 중요하므로 MetRS* 발현이 없습니다. 이러한 샘플은 ANL 표지 Cre 유도 MetRS* 마우스의 샘플과 병행하여 프로토콜에 설명된 모든 단계를 거쳐야 합니다. 클릭되지 않은 샘플은 유효한 컨트롤이 아니며, 이 컨트롤만 사용하여 얻은 결과는 지정되지 않은 클릭으로 인한 것일 수 있습니다. 우리는 MetRS* 유전자를 발현하지 않는 세포에서 ANL의 혼입이나 Cre가 없는 세포에서 MetRS* 발현을 관찰하지 못했습니다. 따라서, ANL로 표지된 wt 동물은 음성 대조군으로서 사용될 수 있다.

여기에 설명된 프로토콜이 샘플이 손실될 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BAC는 스페인 과학 혁신부(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), 마드리드 자치 커뮤니티(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) 및 MICINN(PID2020-113270RA-I00) 보조금의 지원을 받습니다. R. A-P는 마드리드 자치 공동체 (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)의 자금 지원을 받고 있습니다. E.M.S.는 막스 플랑크 협회, 유럽 연구위원회 (보조금 743216), DFG CRC 1080 : 신경 항상성의 분자 및 세포 메커니즘 및 DFG CRC 902 : RNA 기반 조절의 분자 원리. D.C Dieterich와 P. Landgraf의 기술적 조언과 DST-Alkyne의 합성에 감사드립니다. E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast 및 MPI for Brain Research의 동물 시설에 감사드립니다. Nex-Cre 마우스 라인을 공유해 주신 Sandra Goebbels에게 감사드립니다. 영어 편집에 도움을 주신 Antonio G. Carroggio에게 감사드립니다. 학사 실험을 설계, 수행 및 분석했습니다. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. 및 S. T. D. 실험을 수행하고 분석했습니다. BAC와 E.M.S.는 실험을 설계하고 프로젝트....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% 아크릴아마이드 겔GenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-MercaptoethanolSigmaM6250독성; 실험실 가운, 장갑 및 흄 후드를 사용하십시오.
암모늄 바이카보네이Sigma9830독성; 실험실 가운, 장갑 및 흄 후드를 사용하십시오
ANLAHA에 대해 이전에 설명한 대로 합성(참고 문헌 5 및 11 참조)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
Biotin alkyneThermo,B10185
Chicken 항체 anti-GFPAves1020
Complete EDTA-free 프로테아제 억제제Roche4693132001Toxic; 실험실 가운과 장갑을 사용하십시오.
구리(I) 브로마이드시그마25418599.999%(wt/wt)
이황화 태그(DST)-알킨프로브라고 하는 참조 번호 15에 보고된 바와 같이 합성됨
DMSO시그마276855
필터MerkSCGP00525
요오도 아세트아미드(IAA)SigmaI1149
IR 안티 치킨 800LI-CORIRDye 800CW당나귀 안티 닭 2차 항체
IR 안티 라빗 680LI-CORIRDye 680RD염소 안티 토끼 IgG 2차 항체
말토오스시그마M9171
수동 믹서BioSpec 제품1083
NaClSigmaS9888
N-ethylmaleimideSigma4259유독; 실험복, 장갑 및 흄 후드를 사용하십시오.
NeutrAvidin 비드Pierce29200
니트로셀룰로오스 멤브레인Bio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7.8참조 번호 5에 설명된 준비
PD SpinTrap G-25 컬럼GE HealthcareBuffer exchange
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo,23225Pierce BCA 단백질 분석 키트의 시약은 수생 생물에 독성이 있습니다.
Polyclonal rabbit anti-biotin 항체Cell Signaling5597
PVDF 막MilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  러닝 버퍼 MOPSGenScriptM00138
SYPRO 루비 스테인SigmaS4942
테이블 자동 VortexerEppendorfMixmate
Triazole 리간드Sigma678937
Triton X-100SigmaT9284
WaterSigmaW4502분자 생물학 등급
트 :

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).

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