방법 논문

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

DOI:

10.3791/63713

⸱

2022년 4월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

초록

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생체 내에서 단백질 항상성을 이해하는 것은 세포가 생리적 및 질병 조건 모두에서 어떻게 작동하는지 아는 데 중요합니다. 본 프로토콜은 단백질 표지를 특정 세포 집단으로 향하게 하기 위해 조작된 마우스 라인을 사용하여 새로 합성된 단백질의 생체내 표지 및 후속 정제를 설명합니다. L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)의 Cre 재조합 효소 발현에 의한 유도성 라인으로, 그렇지 않으면 발생하지 않는 단백질에 아지도노르류신(ANL) 통합을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하여 생체 내에서 표지된 세포 유형 특이적 단백질체를 정제하고 샘플 복잡성 감소로 인한 단백질 함량의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.

서론

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비정상적인 단백질 항상성은 단백질 합성 및 분해의 불균형으로 인해 발생합니다. 여러 질병은 단백질 항상성의 변화와 관련이 있습니다. 일부 질병의 특징은 다른 세포 하 위치와 뇌 영역에 응집체가 존재한다는 것입니다. 단백질 항상성은 질병에서 중요할 뿐만 아니라 정상 장기 및세포 기능에도 중요한 역할을 합니다1. 예를 들어, 단백질 합성은 단백질 합성을 차단하는 화학적 억제제의 사용에 의해 결정되는 바와 같이 많은 형태의 신경 가소성 2,3에 필요합니다4. 그러나 학습과 기억을 지원하기 위해 프로테옴이 어떤 세포 유형에서 변경되는지, 각 세포 유형의 특정 단백질이 합성 또는 분해에서 증가 또는 감소하는지 명확하지 않습니다. 따라서 단백질 항상성에 대한 포괄적 인 연구는 특정 세포 유형에서 오는 단백질체를 구별 할 수있는 능력을 필요로합니다. 실제로, 다세포 환경에서 발생하는 세포 과정을 연구하기 위한 세포 유형 특이적 단백질체의 식별은 단백질체학에서 중요한 장애물이었습니다. 이러한 이유로 당사는 세포 유형 특이적 단백질체를 식별하고 정제하는 효과적인 방법으로 입증된 생체 직교 방법과 결합된 MetRS* 발현을 사용하여 이 격차를 메우는 기술을 개발했습니다 5,6,7.

돌연변이 MetRS*(MetRS L274G)의 발현은 비-정준 메티오닌 유사체 ANL을 상응하는 tRNA 8,9 내로 로딩하고 이후 단백질에 혼입시킬 수 있게 한다. MetRS* 발현이 세포 유형 특이적 프로모터에 의해 조절되는 경우, 비표준 아미노산은 세포 선택적인 방식으로 단백질에 통합됩니다. 일단 ANL이 단백질에 통합되면, 클릭 화학에 의해 선택적으로 기능화 될 수 있으며, 이어서 이미징 (FUNCAT) 또는 웨스턴 면역 블롯 (BONCAT)에 의해 시각화 될 수있다. 대안적으로, 단백질은 선택적으로 정제되고 질량 분석법 (MS)에 의해 확인 될 수있다. 이 기술을 사용하여 Cre 재조합 효소의 제어하에 MetRS* 단백질을 발현하는 마우스 라인을 만들었습니다. 사용 가능한 Cre-mouse 라인의 수가 증가함에 따라 MetRS* 시스템은 모든 분야에서 기존 Cre-라인이 있는 모든 조직의 모든 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. ANL을 사용한 단백질 표지는 시험관 내 또는 생체 내에서 가능하며 마우스 행동 또는 단백질 무결성을 변경하지 않습니다6. 라벨링 기간은 각 연구자의 과학적 질문에 맞게 조정할 수 있으며, 새로 합성 된 단백질 (라벨링 시간 단축) 또는 전체 프로테옴 (라벨링 시간 단축)을 라벨링합니다. 이 기술의 사용은 연구자가 연구하고자하는 유형의 세포 수에 의해 제한됩니다. 따라서 이 방법으로는 숫자가 적거나 대사율이 낮은 세포 유형에서 단백질을 분리할 수 없습니다. 제시된 방법의 목표는 생체 내에서 표지된 세포 유형 특이적 단백질/프로테옴을 식별하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 살아있는 마우스에서 ANL로 세포 유형 특이적 단백질체를 표지하고 표지된 단백질을 정제하는 방법을 설명합니다. 정제 후, 단백질은 일상적인 질량 분석 프로토콜 5,10에 의해 확인될 수 있다. 특정 세포 집단에서 단백질을 선택적으로 정제하여 이 방법에서 달성한 샘플 복잡성의 감소는 실험자가 예를 들어 환경 변화에 대한 반응으로 프로테옴의 미묘한 변화를 감지할 수 있도록 합니다. 표지된 단백질의 정제는 MS 분석 또는 표지 기간을 포함하지 않고 ~10일 내에 달성할 수 있습니다. 여기에서는 MetRS* 발현 마우스에 ANL을 투여하는 두 가지 방법, 즉 (1) 음용수에 아미노산을 첨가하는 방법과 (2) 복강 주사로 ANL을 도입하는 방법에 대해 설명합니다. ANL 투여를 위해 선택된 방법에 관계없이, 단리 및 정제 단계는 동일하다(단계 2부터).

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프로토콜

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모든 동물 실험은 독일(RP 다름슈타트, 프로토콜: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) 또는 스페인(UCM 동물 실험 위원회 및 마드리드 코무니다드 환경 상담, 프로토콜 번호: PROEX 005.0/21)의 허가를 받아 수행되었으며 막스 플랑크 협회 규칙 및 스페인 규정을 준수하고 동물 복지에 대한 EU 지침을 따릅니다.

1. ANL 을 이용한 생체 내 대사 표지

  1. 음료수:
    1. ANL과 맥아당을 생쥐의 일반 식수에 녹입니다. 권장 맥아당 농도는 0.7%(wt/vol)입니다. 음용수에 첨가되는 ANL의 최대량은 1 % (wt / vol)입니다. 혼합물이 준비되면 여과로 멸균하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    2. 단계 1.1에서 제조된 혼합물을 마우스에 제공한다. 오염을 방지하기 위해 병을 자주 교체하고(예: 3일마다) 매일 점검하여 오염 또는 막힘 가능성을 찾으십시오. 쥐의 ANL 섭취량을 알기 위해 매일 체중을 측정하여 음주의 양을 모니터링하십시오.
      참고: 여기에서 평가된 최대 라벨링 기간은 음용수에서 1%의 ANL 농도를 사용하여 3주이며, 그 결과 뇌에서 잘 감지할 수 있는 라벨링이 발생했습니다. 좋은 라벨링도 2 주 안에 달성 할 수 있습니다. 더 짧은 라벨링 시간, 더 긴 시간 포인트 또는 다른 ANL 양은 이 관리 방법을 사용하여 우리에 의해 연구되지 않았으며, 이는 전술한 내용이 효과가 없다는 것을 의미하지 않습니다. ANL 혼입률은 연구된 조직 또는 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 라벨링 시간은 과학적 질문에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, 프로테옴을 표지하는 경우, 표지 시간은 연구 된 조직에서 단백질의 평균 반감기의 함수로 계산되어야합니다. 새로 합성 된 단백질을 확인하는 데에만 관심이 있다면 시간을 단축 할 수 있습니다. 표지 기간 및 ANL 투여량은 각각의 실험 조건 및 관심 세포 유형에 대해 경험적으로 시험되어야 한다.
  2. 복강 내 투여 :
    1. ANL을 400 mM의 생리학적 NaCl 용액, 포스페이트 식염수 완충액(PBS), 또는 물에 용해시킨다.
    2. 용액의 삼투압이 생리적 범위 내에 있는지 확인하십시오. 여기서, 10 mL/kg 체중의 ANL 용액을 마우스에 투여한다.
      참고: 뇌의 흥분성 뉴런에서 좋은 표지는 1주일 동안 400mM ANL로 매일 1회 복강주사(IP)로 성공적으로 얻을 수 있습니다. 이 연구에서는 낮은 ANL 농도 또는 IP 주입에 의한 다른 표지 기간이 테스트되지 않았으며, 이는 효과가 없다는 것을 의미하지는 않습니다. ANL은 일부 회사에서 염산염으로 공급됩니다. 이 경우 용액의 pH를 적절한 pH로 조정해야합니다 (투여 경로에 따라 다름). ANL은 또한 Link et al.11 에 의해 공개된 방법에 따라 일부 변형5와 함께 합성될 수 있다. ANL 라벨링은 다른 ANL 농도, 시간 스팬 및 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 대사율이 낮은 조직/세포 유형의 경우 항상 ANL 투여 1주일 전부터 저함량 메티오닌 식단을 사용할 수 있습니다. 400mM ANL이 사용되는 경우, 4°C에서 저장하면서 침전될 수 있고; 37 ° C까지 가열하면 ANL이 용액으로 다시 들어갑니다. 주사하기 전에 실온에 두십시오. 대부분의 세계 지역에서 마우스에 대한 ANL 투여는 동물 실험이며 관련 당국의 승인을 받아야합니다.

2. 조직 수확, 용해 및 단백질 추출

  1. 조직 해부: 관심 세포 유형을 포함하는 조직 영역을 해부하고 수집된 조직 조각의 무게를 기록합니다.
    알림: 샘플은 -80 ° C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다 (정지 점). 본 프로토콜에서는 마우스 피질과 해마를 해부하였다.
  2. 조직 용해: 용해 완충액(PBS pH 7.4, 1% wt/vol SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol/vol), 프로테아제 억제제(PI)(EDTA free 1:4000))의 부피를 첨가하여 실온에서 조직을 균질화합니다. 예를 들어, 20mg 티슈 조각의 경우 240-300μL의 용해 완충액을 추가합니다. 균질화 될 때까지 조직을 분쇄하십시오.
    알림: 샘플은 -80 ° C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다 (정지 점). 1.5mL 튜브에서 직접 균질화하려면 특히 작은 조직 조각을 처리할 때 휴대용 배터리로 작동되는 균질기를 사용하는 것이 좋습니다. 더 큰 조각의 경우 Dounce 균질화기를 사용할 수 있습니다. 프로테아제 억제제 (PI)가 포함 된 모든 완충액에는 사용 직전에 첨가해야하며 더 일찍 첨가해서는 안됩니다.
  3. 단백질 변성: 균질액을 75°C로 15분 동안 가열하고 17,000 x g 에서 10°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.
  4. 단백질 함량 측정: 각 샘플의 단백질 농도를 측정하고 동일한 단백질 농도와 비교할 모든 샘플을 조정합니다. 용해 완충액을 추가하여 농도를 조정하십시오. 최적의 농도 범위는 2-4 μg/μL입니다.
    알림: 샘플은 -80 ° C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다 (정지 점).
  5. 알킬화
    1. 균질화된 샘플을 PBS(pH 7.8) + PI(EDTA 프리 1:4000)에서 2-3배로 희석한다.
    2. 요오드 아세트 아미드 (IAA)를 최종 농도 20mM (저장 용액 500mM)에 첨가하십시오.
    3. 어둠 속에서 20 ° C에서 1-2 시간 동안 샘플을 그대로 두십시오. 2.5.2-2.5.3단계를 두 번 수행합니다.
      참고: 일부 조직의 경우 음성 대조군의 비특이적 클릭이 높게 유지되면 알킬화12 전에 환원 단계를 수행해야 할 수 있습니다. IAA 스톡을 샘플에 추가하기 직전에 새로 준비하십시오. 샘플은 -80 °C에서 수개월 (정지 점) 동안 보관할 수 있습니다.
  6. 완충액 교환: 클릭 화학 교환 완충액(PBS pH 7.8, 0.04%(중량/부피) SDS, 0.08%(부피/부피) Triton X-100 및 PI(1:4000))을 사용하여 완충액 교환 컬럼을 평형화합니다. 제조업체의 지침을 따릅니다. 모든 알킬화된 샘플을 교환합니다.
    알림: 용출된 샘플은 -80°C에서 몇 개월(정지점) 동안 보관할 수 있습니다. 이 단계에서, IAA는 제거되고, 버퍼는 클릭 화학 버퍼에 의해 교환된다. 단백질은 완충액 교환 과정 동안 단백질이 손실되지 않았는지 확인하기 위해 완충액 교환 단계 후에 다시 측정될 수 있다. 완충액 교환에 사용되는 컬럼의 유형에 따라 단백질이 크게 손실될 수 있습니다. 단백질 손실을 방지하기 위해 권장 컬럼을 사용하십시오. 샘플 보관의 경우 부분 표본을 준비하는 것이 좋습니다.
  7. 실험에서 ANL 통합을 평가하기 위해 반응을 클릭하십시오.
    1. 2.6단계에서 용리된 샘플 40μL를 취하여 PBS(pH 7.8)를 최종 부피 120μL에 첨가한다.
    2. 클릭 화학 반응을 설정하려면 다음 시약을 주어진 순서로 추가하고 각 추가 후 20초 동안 와동합니다: 1.5μL의 트리아졸 리간드(스톡 40mM), 1.5μL의 비오틴 알킨(스톡 5mM) 및 1μL의 Cu(I) 브로마이드(스톡 10mg/mL, 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 DMSO에 용해됨, 소용돌이하지 마십시오). 가능한 한 빨리 시약을 추가하십시오.
    3. 샘플을 연속 회전과 함께 4°C의 암실에서 밤새 배양합니다.
    4. 샘플을 4°C에서 17,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 약간 청록색 펠릿이 보입니다. 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.
      알림: 구리 산화를 피하기 위해 사용 직전에 Cu (I) 브로마이드 스톡을 준비하십시오. 용해된 시료와 시료 간 PBS 사이의 부피 비율을 일정하게 유지하는 것은 각 튜브에서 동일한 최종 세제 농도를 보장하는 데 필수적입니다. 클릭 화학 반응의 조립 속도를 높이려면 튜브 용 랙이있는 테이블 볼텍서를 사용하는 것이 좋습니다. 클릭된 샘플을 몇 개월 동안 -80°C에서 저장하거나 추가 처리(중지 지점)까지 몇 주 동안 -20°C에서 보관하십시오.
  8. 실험에서 ANL 혼입을 평가하기 위한 웨스턴 블롯 분석
    1. 클릭 화학 반응에서 상청액의 20-40 μL로 SDS-PAGE를 실행한다(단계 2.7). 12 % 아크릴 아미드 겔을 사용하고 1 % SDS, 250mM Tris-HCl, 2mM 글리신에서 실행하십시오. 전면이 젤에서 나올 때까지 실행하십시오.
    2. 단백질을 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막(13)으로 옮긴다.
    3. 멤브레인을 GFP 항체(1:500, GFP 단백질은 MetRS*5와 공동 번역됨) 및 비오틴 항체(1:1000)와 함께 4°C에서 밤새 배양하여 비오틴에 접합된 클릭 알킨 검출을 수행합니다.
    4. 1차 항체를 10분 동안 2회 세척하고 2차 항체를 1.5시간 동안 추가합니다.
    5. 2차 항체를 10분 동안 2회 세척하고 스캔하거나(형광단 접합 항체를 사용하는 경우) 필름에 노출시킵니다(고추냉이 과산화효소 접합 항체를 사용하는 경우).
    6. ImageJ 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 비오틴 신호를 정량화하고, 실험의 각 샘플에 대한 일반적인 라벨링을 평가하고, 가능한 이상값을 검출합니다. 실험의 신호 대 잡음비(음성 대조군의 배경에 대한 ANL 샘플 라벨링)를 평가하고 ANL을 채택/통합하지 못한 가능한 동물을 검출합니다.
      참고: ANL 혼입이 높은 샘플의 경우, ANL 혼입 평가를 위해 이 섹션에서 사용된 것과 같은 비절단 알킨을 사용하여 이론적으로 단백질 정제가 가능합니다. 뇌 샘플을 사용하여, 비절단성 알킨을 사용한 단백질 정제 후 MS에 의해 음성 대조군에서 수득된 배경이 너무 높다14. 따라서, 취급하기 쉽고, 절단할 수 없는 알킨만이 제1 일반 샘플 및 실험 평가에 사용되었다. 단백질 정제를 위한 알킨의 유형에 관계없이, 하기 섹션(단계 2.9)에 설명된 알킨 투여량 최적화를 위한 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
  9. 절단 가능한 알킨 투여량 최적화를 위한 클릭 반응
    1. 40μL의 하나의 대표 샘플(2.6단계에서 얻어지고 2.8단계에서 평가됨)로 4개의 튜브를 준비하고 PBS(pH 7.8)를 최종 부피 120μL에 첨가합니다.
    2. 2.7단계에서 설명한 대로 클릭 화학 반응을 설정하되 이번에는 4가지 다른 양의 DST-알킨을 추가합니다. 상기 알킨의 경우 5 μM, 15 μM, 30 μM 및 60 μM을 테스트하는 것이 좋습니다.
    3. 2.8 단계를 반복하여 가장 낮은 배경 신호로 가장 높은 라벨링 효율을 기반으로 연구중인 특정 실험 질문에 가장 적합한 알킨 복용량을 결정하십시오.
      참고: 나머지 샘플을 클릭 반응시키기 전에 알킨의 최적 양을 결정해야 합니다. 사용할 수있는 상업적으로 이용 가능한 알킨의 몇 가지 옵션이 있습니다. 그들은 분열 방식이 다릅니다 (예 : 빛 또는 환원제). 균주 촉진 시약(예: DBCO 시약)을 사용한 무구리 클릭 화학도 가능합니다. 알킨 또는 DBCO 시약의 양의 작은 변화는 종종 음성 대조군 (배경)의 신호를 크게 증가시킵니다. 여기서, 환원제(디술피드 바이오틴 알킨 또는 DST-알킨15)에 의해 절단가능한 이황화 브릿지를 갖는 알킨을 이용한 단백질 정제가 설명된다. DST-알킨을 사용할 때 SDS-PAGE(단계 8.1)를 실행하기 위해 알킨 절단을 방지하기 위해 DTT 또는 β-메르캅토에탄올과 같은 강력한 환원제로 완충액을 로드하지 마십시오. 이 연구에서, 로딩 완충액에 5mM의 N-에틸말레이미드(NEM)를 사용하여 72°C에서 5분 동안 가열하는 것은 DST-알킨 안정성에 영향을 미치지 않습니다. 2.9.2 단계를 반복하여 관찰 된 최상의 범위 내에서보다 세밀한 용량을 테스트 할 수 있습니다.
  10. 단백질 정제를 위한 분취용 클릭 반응
    1. 단계 2.9에서 결정된 최적 알킨 투여량으로 단계 2.6에서 얻은 모든 샘플을 클릭하고 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석한다(단계 2.8).
      알림: 샘플 업스케일링 정확도를 보장하기 위해 파이펫이 적절하게 보정되었는지 확인하십시오. 클릭된 샘플은 -80°C에서 수개월(정지점) 동안 보관할 수 있습니다.

3. 단백질 정제

  1. 버퍼 교환
    1. 모든 클릭된 샘플을 단계 2.6에 기재된 바와 같은 완충액 교환 절차에 따르되, 평형 완충제로서 뉴트라비딘 결합 완충액을 사용한다(PBS pH 7.4, 0.15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 및 PI (1:2000)).
      알림: 용출된 샘플은 -80°C에서 몇 개월(정지점) 동안 보관할 수 있습니다. 이 단계에서, 클릭되지 않은 유리 알킨은 제거되고, 완충액은 뉴트라비딘 결합 완충액에 의해 교환된다.
  2. 뉴트라비딘 비드에 결합
    1. 뉴트라비딘 고용량 비드를 뉴트라비딘 결합 완충액으로 세척하고(단계 3.1 참조); 비드를 완충액과 혼합하고 혼합물을 3000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 세 번 반복하십시오.
    2. 동일한 부피의 건조 비드와 뉴트라비딘 결합 완충액을 첨가하여 뉴트라비딘 비드의 1:1 슬러리를 준비합니다.
    3. 각 샘플 20-40 μL를 사전 정제된 용해물로 따로 보관하고 -20°C에서 보관합니다.
    4. 단백질 농도를 측정하고(단계 2.4 참조), 단백질 100μg을 단계 3.2.2에서 얻은 비드 슬러리 4μL와 혼합합니다.
    5. 혼합물을 연속 회전으로 4°C에서 밤새 배양하여 표지된 단백질이 비드에 결합할 수 있도록 합니다.
      참고: 클릭 화학 반응에 관해서는 단계 3.2.4에 설명된 기본 친화성 정제 반응을 업스케일링할 수 있습니다. 예를 들어, 해마의 흥분성 뉴런으로부터 단백질을 정제하기 위해, 1mg의 단백질 용해물을 40μL의 Neutravidin 비드 (1 : 1 슬러리)와 혼합한다. Neutravidin 비드의 양은 총 단백질 mg 당 표지 된 단백질의 양에 따라 확대 또는 축소 될 수 있으며, 이는 선택된 세포 유형 및 표지 기간에 따라 달라지며 경험적으로 결정되어야합니다.
  3. 뉴트라비딘 비드 세척 및 단백질 용출
    1. 원심분리에 의해 상청액을 수집한다(단계 3.2.1 참조). 추후 분석을 위해 각 상청액의 분취량 20-40 μl를 따로 보관하고 나머지는 -80°C에서 동결시킨다.
    2. 완충액을 첨가하고, 비드를 침전시키고, 상청액을 폐기함으로써 냉각된 뉴트라비딘 세척 완충액 1(PBS pH 7.4, 0.2%(중량/부피) SDS, 1%(부피/부피) 트리톤 X-100 및 PI(1:2000))로 비드를 세척한다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
    3. 이어서, 동일한 완충액을 첨가하고, 상청액을 버리기 전에 4°C에서 연속 회전 하에 10분 동안 비드를 인큐베이션한다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
    4. 3.3.2-3.3.3단계에서 설명한 대로 비드를 세척하되 뉴트라비딘 세척 완충액 2(1x PBS, pH 7.4 및 PI 1:2000)를 사용합니다.
    5. 단계 3.3.2-3.3.3에 설명된 바와 같이 비드를 세척하되 뉴트라비딘 세척 완충액 3(50 mM 중탄산암모늄 및 PI 1:2000)을 사용한다.
    6. 사용된 건조 비드의 1 부피에 해당하는 부피의 Neutravidin 용출 완충액(5% (vol/vol) β-메르캅토에탄올 및 0.03%(wt/vol) SDS)으로 비드를 20°C에서 30분 동안 인큐베이션하여 클릭된 단백질을 용리시킵니다.
    7. 비드를 열블록 쉐이커에서 연속 교반(1000 rpm)에 의해 용리 동안 현탁액으로 유지한다. 두 번 용리하고 두 용출액을 결합합니다.
      참고 : 단계 3.2.1에 설명 된대로 슬러리 (비드)와 수성 상 (상청액)의 고체 분획을 분리하기 위해 설정된 원심 분리는 3.3.1-3.3.7 단계에 적용됩니다. 단백질 용리가 완료되지 않은 경우 SDS 양을 증가시킬 수 있습니다. 그러나 SDS의 0.08%-0.1%를 초과하는 양으로 비드에 비특이적으로 결합된 단백질이 용리되기 시작합니다. β- 메르 캅토 에탄올은 휘발성이며 독성이 있습니다. 3.3.6-3.3.7 단계에 후드를 사용하는 것이 좋습니다. 단계 3.2.3 및 3.3.1에서 수집된 샘플은 SDS-PAGE에 의해 실행되고, 친화성 정제(단계 3.3)의 효율을 평가하기 위해 웨스턴 블롯(단계 2.8 참조)에 의해 평가되어야 한다.
  4. 용출된 단백질의 평가
    1. 용리된 샘플의 1/3을 SDS-PAGE에 로드합니다(2.8.1단계 참조).
    2. 겔을 염색하여 은 염색 또는 형광 방법과 같은 고감도 방법을 사용하여 단백질을 시각화합니다.
    3. 샘플의 품질이 기대되는 경우, 즉 음성 대조군에 비해 ANL 표지 샘플에 3-4배 더 많은 단백질이 있는 경우, 용출된 단백질은 참조5에 설명된 것과 같은 일상적인 질량 분석 방법으로 식별할 수 있습니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

설명된 프로토콜(그림 1에 요약됨)에 따라 ANL을 7일 동안 매일 복강주사(400mM ANL 10mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) 또는 음용수(0.7% 말토오스, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*)를 통해 마우스에 투여했습니다. 표지 후, 상응하는 뇌 영역을 해부하고, 용해시키고, 알킬화하고, 클릭시켰다. 클릭 반응은 SDS-PAGE 및 웨스턴 이뮤노블롯으로 분석하였다. 실험의 대표 이미지는 IP 주입에 의한 ANL 투여에 대해 도 2에 나타내고 음용수를 통한 ANL 투여에 대해 도 3에 나타내었다. 그림의 목적은 두 라벨링 프로토콜이 모두 작동한다는 것을 보여주는 것이지 비교하는 것이 아닙니다. 표시된 두 가지 실험 (해마와 피질의 흥분성 뉴런과 소뇌의 Purkinje 뉴런)에서 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜의 중요한 측면은 다음과 같습니다. DST- 알킨을 사용할 때 충분한 생물학적 복제, ANL 투여 경로, 양 및 기간, 샘플의 알킬화, 알킨 농도 및 β- 메르 캅토 에탄올 제거를 갖는 음성 대조군의 포함.

Cre 드라이버가 없는 ANL 표지 동물에서 진행된 음성 대조군 샘플을 포함하는 것이 중요하므로 MetRS* 발현이 없습니다. 이러한 샘플은 ANL 표지 Cre 유도 MetRS* 마우스의 샘플과 병행하여 프로토콜에 설명된 모든 단계를 거쳐야 합니다. 클릭되지 않은 샘플은 유효한 컨트롤이 아니며, 이 컨트롤만 사용하여 얻은 결과는 지정되지 않은 클릭으로 인한 것일 수 있습니다. 우리는 MetRS* 유전자를 발현하지 않는 세포에서 ANL의 혼입이나 Cre가 없는 세포에서 MetRS* 발현을 관찰하지 못했습니다. 따라서, ANL로 표지된 wt 동물은 음성 대조군으로서 사용될 수 있다.

여기에 설명된 프로토콜이 샘플이 손실될 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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BAC는 스페인 과학 혁신부(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), 마드리드 자치 커뮤니티(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) 및 MICINN(PID2020-113270RA-I00) 보조금의 지원을 받습니다. R. A-P는 마드리드 자치 공동체 (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)의 자금 지원을 받고 있습니다. E.M.S.는 막스 플랑크 협회, 유럽 연구위원회 (보조금 743216), DFG CRC 1080 : 신경 항상성의 분자 및 세포 메커니즘 및 DFG CRC 902 : RNA 기반 조절의 분자 원리. D.C Dieterich와 P. Landgraf의 기술적 조언과 DST-Alkyne의 합성에 감사드립니다. E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast 및 MPI for Brain Research의 동물 시설에 감사드립니다. Nex-Cre 마우스 라인을 공유해 주신 Sandra Goebbels에게 감사드립니다. 영어 편집에 도움을 주신 Antonio G. Carroggio에게 감사드립니다. 학사 실험을 설계, 수행 및 분석했습니다. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. 및 S. T. D. 실험을 수행하고 분석했습니다. BAC와 E.M.S.는 실험을 설계하고 프로젝트를 감독했으며 BAC는 논문을 썼습니다. 모든 저자가 논문을 편집했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12% 아크릴아마이드 겔GenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-MercaptoethanolSigmaM6250독성; 실험실 가운, 장갑 및 흄 후드를 사용하십시오.
암모늄 바이카보네이Sigma9830독성; 실험실 가운, 장갑 및 흄 후드를 사용하십시오
ANLAHA에 대해 이전에 설명한 대로 합성(참고 문헌 5 및 11 참조)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
Biotin alkyneThermo,B10185
Chicken 항체 anti-GFPAves1020
Complete EDTA-free 프로테아제 억제제Roche4693132001Toxic; 실험실 가운과 장갑을 사용하십시오.
구리(I) 브로마이드시그마25418599.999%(wt/wt)
이황화 태그(DST)-알킨프로브라고 하는 참조 번호 15에 보고된 바와 같이 합성됨
DMSO시그마276855
필터MerkSCGP00525
요오도 아세트아미드(IAA)SigmaI1149
IR 안티 치킨 800LI-CORIRDye 800CW당나귀 안티 닭 2차 항체
IR 안티 라빗 680LI-CORIRDye 680RD염소 안티 토끼 IgG 2차 항체
말토오스시그마M9171
수동 믹서BioSpec 제품1083
NaClSigmaS9888
N-ethylmaleimideSigma4259유독; 실험복, 장갑 및 흄 후드를 사용하십시오.
NeutrAvidin 비드Pierce29200
니트로셀룰로오스 멤브레인Bio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7.8참조 번호 5에 설명된 준비
PD SpinTrap G-25 컬럼GE HealthcareBuffer exchange
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo,23225Pierce BCA 단백질 분석 키트의 시약은 수생 생물에 독성이 있습니다.
Polyclonal rabbit anti-biotin 항체Cell Signaling5597
PVDF 막MilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  러닝 버퍼 MOPSGenScriptM00138
SYPRO 루비 스테인SigmaS4942
테이블 자동 VortexerEppendorfMixmate
Triazole 리간드Sigma678937
Triton X-100SigmaT9284
WaterSigmaW4502분자 생물학 등급
트 :

참고문헌

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