Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산

뉴캐슬병 바이러스는 조류 오르토아불라바이러스-1로도 알려져 있으며, 종양 용해 바이러스 또는 바이러스 벡터 백신 1,2,3,4,5,6,7로 사용될 가능성이 있는 외피형 조류 파라믹소바이러스이다. 가장 최근에, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 발현하도록 조작된 NDV는 마우스 및 햄스터 챌린지 모델^7,8,9에서 효과적인 비내 백신으로 특성화되었다. 암 면역요법으로 사용될 때, 선천적 면역 세포, 특히 자연 살해 세포의 모집, 타입 I 인터페론의 생산, 및 항종양 특이적 T 세포^10,11,12,13의 생성을 초래한다. 이러한 강력한 면역자극 특성 외에도, NDV는 강력한 안전성 프로파일과 잘 확립된 역유전학 시스템^(14,15)을 갖는다. 이러한 바람직한 특성은 수많은 전임상 및 인간 임상 시험 (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17에서 NDV의 평가를 촉발시켰다. 이 매우 유망하고 면역자극성 바이러스 벡터를 더욱 발전시키기 위해서는 생체내에서 안전하게 투여될 수 있는 고역가, 초순수 NDV를 생산 및 정제하기 위한 상세한 방법이 필요하다.

NDV는 조류 파라믹소 바이러스이기 때문에 배아 된 닭 알에서 가장 자주 증폭됩니다. NDV를 전파하기 위해 이용가능한 세포 기반 시스템이 있지만, 대부분은 배아 닭 난자⁽¹⁸)에서 달성된 것과 유사한 역가를 생산할 수 없었다. 그럼에도 불구하고 계란 기반 생산이 길고 쉽게 확장 할 수 없다는 사실을 포함하여 계란에서 NDV를 생산하는 데는 몇 가지 단점이 있으며, 대량의 SPF 닭고기 달걀을 소싱하는 것이 문제가 될 수 있으며 계란 알레르겐 13,18,19,20으로 오염 될 가능성이 있습니다. . 최근에, 한 그룹은 무혈청 배지에서 현탁액에서 성장한 베로 세포가 정제²¹ 이전에 계란에서 달성된 것과 유사한 역가에 대한 NDV의 복제를 지지할 수 있음을 보여주었다. 그러나, 이러한 바이러스를 베로 세포에 적응시키기 위해 바이러스의 직렬 패시징이 필요하고, 서스펜션 베로 세포로부터 NDV를 정제하는 방법의 최적화가 여전히 요구된다⁽²¹).

앞서 강조한 바와 같이, 생체 내 고역가, 생체 등급 바이러스를 정제하는 데 사용되는 방법은 질문²²의 바이러스에 따라 다릅니다. 재조합 NDV의 생성에 사용할 수 있는 잘 확립된 역유전학 시스템이 있다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 cDNA 클론, 헬퍼 플라스미드, 및 헬퍼 바이러스의 사용을 수반하는 이 공정은 이전에^15,23에서 상세히 기술되었다. 이 프로토콜은 렌토제닉 또는 메소제닉 NDV에 적용될 수 있다. 이 프로토콜에 기재된 바이러스는 바이러스 P와 M 유전자 사이에 삽입된 해파리 빅토리아로부터의 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 재조합 메소제닉 NDV를 개별 전사 유닛으로서 사용하며, 이는 이전에 외래 전이유전자 삽입을 위한 최적의 부위로서 기술되었기 때문에²⁴.

동봉 된 방법은 100 ~ 500 nm의 크기와 밀도¹⁵를 기준으로 NDV의 정제를 간략하게 설명합니다. 이것은 약 3 주 내에 생체 등급의 고역가 NDV 스톡의 생성을 허용했으며, 계란이 접수 된 시점부터 최종 역가를 갖는 것까지 시작되었습니다. 접선 유동 여과, 깊이 여과 및 밀도 구배 초원심분리와 같은 계란 기반 바이러스의 대규모 생산에 자주 사용되는 기술이 설명되어 이러한 방법을 더 큰 규모의 생산으로 번역 할 수 있습니다. NDV의 정제를 위한 이전에 기술된 기술들은 바이러스-안정화 완충제의 혼입, 밀도 구배 초원심분리 동안 요오드딕사놀의 사용, 및 생체 등급 품질을 보장하기 위한 다양한 품질 관리 조치의 설명(¹⁵)에 의해 개선되었다. 이것은 0.8 내지 1.0 L의 알란토시스 유체에서 3 ×^{10 10} PFU/mL만큼 높은 역가에 도달하는 생체내 등급 NDV의 정제를 허용하였다.

동물 사용과 관련된 모든 작업은 캐나다 동물 관리위원회에 따라 구엘프 대학 동물 관리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 작업은 캐나다의 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 실험실에서 수행되며, 메소제닉 NDV는 위험 그룹 2 병원체입니다. NDV의 증폭 및 정제에 관여하는 모든 단계는 안전성 및 멸균 목적을 위해 유형 IIA 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 한다.

1. 특정 병원균이없는 배아 닭 알을 사용한 NDV의 증폭

1. SPF 배아 닭 알의 접종
   참고 : 일반적으로 XNUMX 개의 SPF 배아 닭 알을 사용하여 NDV의 생체 등급 배치 로 하나를 생성합니다. 하나 또는 이십 개의 여분의 달걀을 주문하여 운송 중 손상과 생존 가능성의 변동성을 고려하십시오. 배아 된 닭고기 알은 생물학적 물질이며 제도적 지침에 따라 처리해야합니다. 그러나 배아가 부화되지 않기 때문에 기관 동물 관리위원회 승인이 필요하지 않습니다.
   1. SPF 배아 닭 알을 수용한 후, 37°C, 60% 습도의 계란 배양기에서 9일 동안 배양한다. 인큐베이터가 매 시간마다 알을 자동으로 흔들거나 회전하도록 설정되어 있는지 확인하십시오.
      참고 : 계란은 실온에서 최대 24 시간 또는 4 °C에서 최대 72 시간 동안 보관할 수 있습니다. 그러나 이것은 배아 생존력을 감소시킬 수 있습니다.
   2. 배양 8-11 일 후 (이상적으로는 9 일째에), 배아 생존력을 결정하기 위해 알을 촛불로 촛불로 만듭니다. 웹과 같은 혈관구조(그림 1A)와 배아 이동을 실행 가능한 배아의 지표로 찾습니다. 이러한 기능이 없는 계란은 폐기하십시오(그림 1B).
   3. 생존 가능한 난자에서 공기 주머니와 배아 사이의 계면을 연필로 'X'로 표시하십시오 (그림 1A). 이 주사 부위가 혈관 조직의 천공을 일으키지 않도록하십시오. 접종이 준비되는 동안 표시된 알을 인큐베이터로 돌려 보내십시오.
   4. 모든 SPF 배아 닭 알을 주입하는 데 필요한 바이러스의 양을 계산하십시오. 각 난자가 100 μL의 부피로 100 PFU의 바이러스를 받는지 확인하십시오. 바이러스를 인산염 완충 식염수 (PBS)에 희석하여 1 × 10³ PFU / mL의 농도로 희석하십시오. 바이러스 투여의 부정확성을 설명하기 위해 접종물의 20 %를 추가로 준비하십시오.
   5. 정전기 방지 물티슈를 사용하여 70 % 에탄올에 희석 된 10 % 요오드 용액으로 표시된 계란의 꼭대기를 청소하십시오. 용액이 건조 될 때까지 약 1-2 분 정도 기다리십시오.
   6. 조심스럽게 한 쌍의 멸균 된 날카로운 핀셋을 사용하여 껍질을 관통하십시오. 계란 사이의 70 % 에탄올에 핀셋을 살균하십시오.
   7. 1 mL 주사기 및 25 G 바늘을 사용하여, 단계 1.1.4에서 제조된 접종물 100 μL를 맥락막알란토익 공동에 주입한다(도 1C). 바늘로 계란에 거의 90 ° 각도로 접근하십시오. 바늘을 chorioallantoic 막의 꼭대기에 바로 삽입하십시오.
   8. 예방 접종 후 매니큐어를 사용하여 펑크 부위를 덮고 알을 인큐베이터로 되돌립니다. 접종 후 24 시간까지 흔들림 설정이 켜져 있는지 확인하십시오.
   9. 접종 후 24 시간 후에 계란 생존력을 확인하십시오. chorioallantoic 막과 배아 운동에서 혈관 구조가 부족한 죽은 난자를 버리십시오 (그림 1B).
      참고 :이 난자는 NDV가 아닌 접종 과정으로 인해 사망했습니다.
   10. 계란을 인큐베이터로 돌려 보내고, 로커는 OFF를 설정하여 계란 단백질로 알란토릭 유체의 오염을 방지합니다.
   11. 죽은 알을 확인하기 위해 1.1.9 단계에서 설명한 것처럼 12-24 시간마다 알을 확인하십시오. 접종 후 24시간 후에 죽는 난자를 4°C로 옮겨 자가 분해를 최소화하십시오. 차가워진 후 2-12 시간 이내에 알란토닉 유체를 수확하십시오.
   12. 적어도 72 시간 동안 알을 품는다.
       참고: NDV의 메소제닉 균주를 전파하는 경우, 최적의 배양 시간은 60-72 h이며, 배양 시간이 길어지면 알란토성 유체의 선명도가 감소하여 정제 과정이 손상될 수 있습니다. 이 문제는 렌토제닉 NDV 균주를 전파할 때 배아를 죽이는 데 훨씬 더 오래 걸리기 때문에 중요하지 않습니다.
   13. 적절한 인큐베이션 기간 후, 알란토시스 유체를 수확하기 전에 나머지 알을 2-12 h 동안 4°C로 옮긴다.
2. NDV를 포함하는 알란토익 유체 수확
   1. 차가운 달걀을 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 계란의 꼭대기를 70 % 에탄올로 닦으십시오.
   2. 멸균 핀셋과 외과 용 가위를 사용하여 공기 낭이있는 달걀의 정점면을 엽니 다.
   3. 껍질을 제거하여 맥락알란토막이 드러납니다(그림 1D).
   4. 조심스럽게 멤브레인을 뚫고 다시 벗겨서 알란토익 공동을 노출시킵니다(그림 1E). 노른자 낭이 실수로 구멍을 뚫지 않도록하고 계란을 망칠 수 있도록하십시오.
   5. 무딘 포셉을 사용하여 배아를 잡고 배아 주머니를 엽니 다.
      참고: 배아낭 내부의 액체에는 NDV도 포함되어 있습니다.
   6. 포셉으로 배아를 감압하고 10 mL 혈청 학적 피펫을 사용하여 알란토릭 유체를 수집하십시오.
   7. 알란토닉 유체를 해명될 때까지 15mL 원뿔형 튜브의 얼음 위에 보관하십시오.
      참고 : 알란토액이 노란색 인 경우 노른자 낭이 손상되어 알란토액은 폐기해야합니다.
   8. 알란토닉 유체를 함유하는 원뿔형 튜브를 4°C에서 10분 동안 1,500 × g 에서 원심분리한다.
   9. 일시 중지 지점: 정화된 알란토릭 유체를 50 mL 원뿔형 튜브에 분취하여 장기간 보관(예: 몇 주 내지 몇 달)을 위해 -80°C에 보관하고, 동결 해동의 가혹한 영향으로부터 바이러스를 보호하기 위해 슈크로스를 최종 농도 5%로 보충합니다. 대안적으로, 단기 저장 (예를 들어, 1-3일) 동안, 알란토시스 유체를 수크로오스 (최종 5%) 또는 3x 만니톨-라이신 (ML) 완충액 (15% 만니톨, 3% 라이신; 완충제 제조법에 대해서는 보충 표 S1 참조)으로 보충하여 4°C에서 저장 전에 1x (5% 만니톨, 1% 라이신)의 최종 농도를 수득한다.

2. 알란토시스 유체로부터의 NDV의 정제

1. 알란토익 유체의 깊이 여과
   1. 정화된 알란토익 유체를 -80°C에서 보관하고, 정제 전날 밤 4°C에서 해동시킨다.
   2. 생물학적 안전 캐비닛에서 그림 2와 같이 튜브 및 연동 펌프를 설치합니다.
   3. 아직 수행하지 않은 경우, 알란토시스 유체를 3x ML 버퍼와 결합하여 최종 농도 1x로 한다.
   4. 깊이 필터를 부착하기 전에 50 mL의 0.5 M NaOH를 시스템을 통해 폐기물 용기에 통과시켜 튜빙을 멸균하십시오.
   5. 100 mL의 멸균 분자 등급의 물을 시스템을 통과시켜 튜브를 헹구고 폐기물 용기에 넣으십시오.
      참고: NaOH는 NDV를 불활성화시키기 때문에, 바이러스 함유 알란토액(allantoic fluid)을 도입하기 전에 라인을 적절하게 세척하는 것이 중요합니다.
   6. 이를 통해 50 mL의 PBS를 실행함으로써 시스템을 프라임하고, 튜브 내에 약 5 mL의 PBS가 남아 있을 때 펌프를 정지시킨다.
   7. 1-3μM 고정 등급의 깊이 필터를 튜브에 부착하고 깊이 필터의 정점 쪽에 있는 두 번째 캡을 제거하여 필터를 배출합니다. 시스템을 통해 추가로 50mL의 PBS를 실행하기 시작합니다.
   8. PBS가 필터 상단의 통풍구를 통해 흐르기 시작하면 포트를 닫고 PBS를 라인을 통해 계속 흐릅니다.
      참고: 경미한 기포는 허용되지만 다량의 공기가 있으면 2.1.7 및 2.1.8 단계에 설명된 대로 필터를 다시 배출해야 합니다.
   9. 튜브에 약 5 mL의 PBS가 남아 있을 때 펌프를 정지시킨다.
   10. 폐기물 용기를 새로운 멸균 수집 용기로 교체하고 깊이 필터를 통해 알란토익 유체를 가동하기 시작하십시오.
       참고 : 압력은 바이러스의 전단을 초래하므로 10 psi를 초과해서는 안됩니다. 압력은 펌프의 유량을 줄이거나 증가시켜 조작 할 수 있습니다. 압력이 10psi를 초과하기 시작하고 유량을 더 이상 줄일 수 없는 경우 새 깊이 필터를 사용해야 합니다. 이 경우, 단계 2.1.6-2.1.8은 동종 유체의 흐름을 재개하기 전에 수행되어야 한다.
   11. 모든 알란토익 유체가 필터를 통과하면 라인을 통해 50mL의 1x ML 버퍼를 실행하여 바이러스 회수를 극대화하십시오.
   12. 라인이 건조 될 때까지 액체를 수집하십시오. 바이러스를 4°C에서 밤새 또는 최대 36시간까지 보관하십시오.
       참고: 바이러스가 깊이 여과되면 깊이 여과를 완료한 후 36시간 이내에 정화 과정을 계속하십시오.
   13. 깊이 필터를 분리하고 0.5 M NaOH에 보관하기 전에 시스템을 통해 42°C로 예열된 0.5 M NaOH, 400 PPM 표백제 100 mL를 실행하여 튜빙을 살균한다.
2. NDV의 농도에 대한 접선 유동 여과
   1. 도 3A에 묘사된 바와 같이(및 이전에^{도 25}에 도시된 바와 같이) 카세트의 구성요소들을 생물학적 안전 캐비닛에 조립한다.
      참고: 매니폴드와 엔드플레이트는 세제로 세척하고 사용하기 전에 건조해야 합니다. 실리콘 가스켓은 재사용이 가능하며 카세트와 함께 0.5M NaOH에 보관해야 합니다.
   2. 접선 유동 여과(TFF)(교차 흐름 여과라고도 함) 시스템을 '개방형' 형태로 설정합니다(그림 3B).
      1. 카세트를 처음 사용하는 경우 TFF 카세트를 용출 형상에 조립하고 멸균 분자 등급 물 100mL로 플러시합니다(그림 3C).
      2. 저장소 탱크에 5mL의 물만 남아 있으면 펌프를 일시 중지하고 TFF 시스템 설정을 닫힌 형태로 변경합니다(그림 3D).
      3. 100 mL의 0.5 M NaOH, 400 PPM 표백제를 42°C로 예열하여 저장소에 첨가하고, 30-60분 동안 시스템을 통해 순환시킨다.
      4. 흐름을 일시 중지하고 TFF 시스템을 용출 설정으로 되돌리고 흐름을 재개하여 세척 용액을 용출시킵니다.
      5. 저장소에 약 5mL가 남아 있으면 펌프를 일시 중지하고 멸균 분자 등급의 물 100mL를 첨가하여 시스템을 헹구십시오.
      6. 저장소에 약 5mL가 남아 있으면 펌프를 일시 중지하고 TFF 시스템을 개방 형상에 놓습니다(그림 3B). 2.2.3단계를 계속합니다.
   3. 100 mL의 0.5 M NaOH를 연동 펌프를 사용하여 시스템을 통해 통과시켜 카세트 및 튜빙을 멸균한다. 카세트 무결성을 유지하기 위해 압력이 30psi를 초과하지 않는지 확인하십시오.
   4. 저장고에 약 5mL의 0.5M NaOH가 남아 있을 때 펌프를 일시 중지합니다.
   5. 100 mL의 멸균 분자 등급의 물을 저장소에 넣고 카세트를 통해 유체를 다시 통과시킵니다. 저장소를 소용돌이 치며 저수지의 측면에서 모든 NaOH를 씻어 바이러스의 불활성화를 방지하십시오. 저장소 세척 단계를 반복하십시오.
   6. 저수지에 약 5 mL의 멸균 된 분자 등급의 물이 남아 있으면 펌프를 일시 중지하십시오.
   7. PBS 100 mL를 저장고에 넣고 소용돌이치며 멸균된 분자 등급의 물이 측면에서 세척되도록 합니다. 카세트를 통한 액체의 흐름을 재개하십시오.
   8. 저장소에 약 5mL가 남아 있으면 펌프를 일시 중지하고 깊이 여과 된 알란토익 유체를 저장소에 넣고 펌프 흐름을 재개하십시오.
   9. 압력 게이지 1(그림 3B)을 모니터링하여 바이러스의 전단을 방지하기 위해 10psi를 초과하지 않도록 합니다. 연동 펌프의 속도와 C 클램프의 사용을 조합하여 폐기물에 대한 용출을 증가시킵니다.
      참고: 연동 펌프와 C 클램프의 속도를 결합하면 압력이 증가합니다.
   10. 저장고에 50-100 mL의 알란토익 유체가 남아 있을 때, 펌프를 일시 정지시켜 1x ML 버퍼 150-200mL를 첨가하여 버퍼 교환을 수행한다.
   11. 펌프 흐름을 재개하고 압력 게이지 1(그림 3B)을 다시 모니터링하여 10psi를 초과하지 않도록 합니다.
   12. 저수지에 5-10 mL가 남아 있으면 펌프를 일시 중지하십시오.
   13. 두 개의 C클램프를 사용하여 그림 3C와 같이 두 개의 폐기물 라인을 닫습니다.
   14. 저장소에 공급되는 잔류 라인을 분리하고 50mL 원뿔형 튜브에 삽입합니다(그림 3C).
   15. 펌프의 흐름을 재개하고 저수지 탱크에 몇 방울의 유체가 남았을 때 일시 중지하십시오.
   16. 폐기물 라인에서 C클램프를 분리하고 잔류 공급 라인을 저수지 탱크에 다시 연결합니다(그림 3B).
   17. 20-25mL의 1x ML 버퍼를 넣고 저장소 탱크에 약 5mL가 남을 때까지 펌프 흐름을 재개합니다.
   18. 2.2.13~2.2.16단계를 반복합니다.
       참고: 바이러스 수율을 높이기 위해 2.2.17단계와 2.2.13~2.16단계를 반복하여 3^번째 용출을 수행할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 바이러스는 처음 두 개의 용출에 존재한다.
   19. 용출을 마친 후 바이러스를 얼음 위에 놓거나 4°C에 둔다.
   20. 라인을 청소하려면 그림 3D에 표시된 것처럼 폐기물 라인이 저장소로 다시 공급되는 폐쇄 루프 형식( 그림 3D)이 되도록 시스템을 설정합니다.
   21. 250 mL의 0.5 M NaOH, 400 PPM 표백제를 첨가하여 42°C로 예열하여 시스템 세척을 진행한다.
   22. 하룻밤 사이에 시스템을 통해 세척 용액을 흐르게하십시오.
       참고: 세척 용액을 재순환하는 동안 펌프가 50mL/min의 속도로 작동하면 약 5psi의 압력을 관찰해야 합니다. 압력이이를 초과하면 카세트가 더러워지고 세척액을 교체하고 공정을 반복해야합니다.
   23. 폐기물 라인과 잔류 라인을 모두 폐기물 용기로 보내 세척 용액을 분리하십시오.
   24. 400-500 mL의 멸균수를 저수지에 넣고 시스템을 통해 폐기물 용기로 흘립니다.
   25. 약 5 mL가 저장고에 남아 있을 때, 펌프를 일시 중지하고 100-200 mL의 0.5 M NaOH를 저장 탱크에 첨가하고, 용액을 소용돌이 치며 저장소 용기를 세척한다.
   26. 저장소가 거의 비어 있으면 2.2.23단계를 추가로 두 번 반복합니다.
   27. TFF 셋업을 분해하고, TFF 카세트 및 개스킷을 4°C에서 재밀봉 가능한 비닐 백에 0.5 M NaOH의 작은 부피로 저장한다.
       참고: 튜브는 0.5 M NaOH에 잠겨 실온에서 보관할 수 있습니다.
3. Iodixanol 밀도 구배 초원심분리
   1. 초원심분리기를 켜고 4°C로 예냉되도록 설정하였다. 원하는 로터를 4°C에서도 예냉 합니다(재료 표 참조).
      참고: 로터는 4°C에서 보관해야 합니다.
   2. 스톡 60% 요오딕사놀 용액(구입시 농도)을 사용하여 PBS 및 3x ML 완충액으로 희석하여 40%, 20%, 및 10% 요오드딕사놀 용액을 1x 최종 농도의 ML 완충액으로 생성한다.
   3. 13.2 mL, 개방 탑, 박벽 초원심분리 튜브에서, 각각 0.5 mL, 2.5 mL, 및 2.5 mL의 40%, 20%, 및 10% 요오드딕사놀 용액을 오버레이한다(도 4A).
      참고: 초원심분리기 튜브를 옆으로 기울이고 천천히 용액을 배출하면 두 구배 층이 혼합될 위험이 크게 줄어듭니다. 각 레이어의 분리는 그라디언트의 각 레이어 사이에 "후광"이 표시되어야합니다.
   4. 마커 펜을 사용하여 다양한 그라디언트 레이어의 인터페이스를 표시합니다.
   5. 층 6-6.5 mL의 TFF 절차로부터 용출된 바이러스를 밀도 구배에 걸쳐. 밀도 구배를 방해하지 않도록 단계 2.3.3에 설명된 대로 바이러스를 조심스럽게 첨가하십시오.
   6. 초원심분리 튜브를 오픈 탑 스케일을 사용하여 스윙 버킷 로터용 인서트에 적재( 재료 표 참조)하여 서로 0.01g 이내의 인서트의 균형을 맞춥니다. 체중 차이를 설명하기 위해 PBS 또는 여분의 바이러스 용리액을 사용하십시오.
   7. 튜브가 균형을 이루면 튜브를 뚜껑을 덮고 로터에 적재하십시오.
   8. 4°C에서 125,000 × g 에서 1.5시간 동안 원심분리한다.
      참고: 지연 시작 기능이 있는 초원심분리기를 사용할 수 있는 경우 하룻밤 사이에 수행할 수 있습니다.
   9. 초원심분리 후, 한 쌍의 멸균 포셉을 사용하여 튜브를 제거하십시오. 10%와 20% 그라디언트 사이의 큰 밴드인 대상 밴드를 찾습니다(그림 4B).
   10. 레토르트 스탠드를 사용하여 비커의 상단에 튜브를 매달아 놓습니다.
   11. 18 G x 1.5 인치 바늘을 5 mL 주사기에 부착하고 초원심분리 튜브의 측면에 구멍을 뚫습니다.
       참고: 튜브는 바늘을 위쪽 각도로 향하게 하고 위로 비스듬히 기울여 대상 밴드로 이동하도록 대상 밴드 아래에 약간 구멍을 뚫어야 합니다.
   12. 플런저를 천천히 확장하여 대상 밴드를 제거합니다.
       참고: 대상 밴드 내에서 바늘을 움직여 추출된 바이러스를 최대화하십시오. 다른 밴드나 파편이 대상 밴드와 섞이지 않도록 주의하고, 투석 카세트를 더 많이 사용하게 되므로 과도한 용액을 복용하지 마십시오.
   13. 일단 표적 밴드가 추출되면, 바늘을 제거하고, 남아있는 용액이 폐기물 비이커로 배수되도록 한다. 다른 모든 초원심분리 튜브로부터의 모든 밴드가 추출될 때까지 표적 밴드를 50mL 원뿔형 튜브에 분배한다.
   14. 모든 초원심분리 튜브에서 모든 대상 밴드가 추출될 때까지 2.3.10-2.3.13단계를 반복합니다.
   15. 단계 2.3.10 내지 2.3.13에 설명된 바와 같이 표적 대역을 추출하는 대안적인 접근법
       1. 피펫을 사용하여 표적 밴드를 오버레이하는 액체를 천천히 제거한다. 일단 표적 밴드에서, 피펫을 사용하여 추출하고 50 mL 원뿔형 튜브에 바이러스를 저장한다.
          참고: 이렇게 하면 초원심분리기 튜브를 재사용할 수 있습니다.
4. 바이러스 용액에서 요오드릭사놀 제거
   참고: NDV 함유 밴드는 15%와 16% 사이의 요오드딕사놀 밀도로 나타난다. 용액 중의 요오드딕사놀의 농도는 표준 곡선을 참조하여 340 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정될 수 있다(보충 도 S1). 이 단계는 이 농도의 요오드딕사놀 용액을 C57BL/6 마우스에 투여했을 때 부작용이나 급성 독성이 관찰되지 않았으므로 생략될 수 있다.
   1. 0.5-3 mL 10 kDa 분자량 컷오프 투석 카세트를 1분 동안 PBS에 침지시켜 미리 습윤시켰다.
      참고 : 투석막은 매끄럽고 울퉁불퉁 한 모양으로 바뀌어야합니다. 추출 된 바이러스의 부피가 10 mL를 초과하는 경우, 두 개의 0.5-3 mL 투석 카세트 또는 5-12 mL 투석 카세트를 사용해야합니다.
   2. 적용 가능한 경우 5 또는 10 mL 주사기와 18 G x 1.5 인치 무딘 필 바늘을 사용하여 50 mL 원뿔형 튜브에서 바이러스를 수집하십시오.
   3. 주사기를 사용하여 투석 카세트에 들어가고 막을 관통하지 않도록주의하고 바이러스를 주입하십시오.
      참고: 투석 카세트는 카세트에 있는 공기 포켓의 위치를 조작하기 위하여 회전될 수 있습니다. 카세트에서 바늘을 제거하기 전에 공기 주머니를 제거해야합니다.
   4. 1 L 비이커를 멸균 1x PBS로 채우고, 교반 막대 및 투석 카세트를 내부에 넣고, 덮는다. 부드럽게 교반하면서 4°C에서 인큐베이션한다.
      참고: 압출된 폴리스티렌 폼과 탄성 밴드를 사용하여 투석 카세트를 부착하여 PBS에 부유되도록 하십시오. 카세트는 ML 버퍼로 인해 약간 팽창 할 수 있습니다.
   5. 1-2시간 후, 신선한 1x PBS로 교체하고, 약간의 교반으로 또 다른 8-10 h 동안 4°C에서 계속 인큐베이션한다.
      참고: 이 작업은 하룻밤 사이에 수행할 수도 있습니다.
   6. 신선한 1x PBS로 다시 한 번 교체하고, 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다.
5. 바이러스 용액의 농도
   1. 투석 버퍼에서 투석 카세트를 꺼내고(그림 4C) 밀봉이 가능한 작은 비닐 봉지에 넣습니다. 투석 카세트가 완전히 잠기도록 40% 20,000MW 폴리에틸렌글리콜 15-25mL를 첨가한다.
   2. 실온에서 흔들면서 배양하십시오. 5 또는 10 mL 주사기 및 18 G x 1.5 인치 무딘 필 바늘을 사용하여 카세트 내의 바이러스의 부피를 주기적으로 확인한다.
      참고: 바이러스를 집중시키는 데 필요한 시간은 시작 볼륨과 원하는 최종 볼륨에 따라 달라집니다. 전형적으로, 최종 원하는 부피는 알란토성 유체의 출발 부피에 관계없이 1 내지 1.5 mL 사이이다. 부피를 확인할 때 포트 무결성을 손상시키고 폴리에틸렌 글리콜 용액과 바이러스가 혼합 될 수 있으므로 동일한 포트를 사용하지 않도록주의하십시오.
   3. 투석 카세트에서 농축된 바이러스를 제거하기 전에, 카세트를 1x PBS로 간단히 헹구고 18 G x 1.5 인치 무딘 채우기 바늘을 공기로 채운다.
   4. 공기로 채워진 주사기를 투석 카세트에 넣고 플런저를 누르십시오. 농축된 바이러스가 도입된 공기 중 어느 것도 제거하지 않고 제거될 수 있도록 장치를 회전시킨다.
   5. 농축된 바이러스를 50 mL 원뿔형 튜브에 분배하고, 분배된 부피를 기록한다.
   6. 동일한 주사기와 바늘을 사용하여 투석 카세트에 적절한 양의 60 % 수크로스를 주입하여 이전에 제거 된 바이러스와 결합 할 때 5 % 수크로오스의 최종 농도가 되도록합니다.
   7. 장갑을 낀 손가락을 사용하여 멤브레인을 마사지하여 막에 부착되었을 수있는 잔류 바이러스를 제거하고 손상되지 않도록주의하십시오. 투석 카세트에서 과도한 공기 중 일부를 제거하여 배출 과정을 용이하게하십시오.
   8. 이 세척을 이미 50mL 코니컬 튜브에 있는 바이러스와 결합하십시오.
      참고: 바이러스는 이제 5% 수크로오스에 있고 20 μL, 50 μL, 100 μL 또는 200 μL 분취량으로 분주될 준비가 되고 -80°C에서 저장된다. 대안적으로, 장기 저장을 위해, NDV는 섹션 2.6에 기재된 바와 같이 동결건조되고 4°C에서 저장될 수 있다.
6. NDV의 동결 건조
   1. 1.5 mL 원심분리 튜브 또는 15 mL 원뿔형 튜브에서 분취한 바이러스를 44× 10-3 MBAR 및 ^- 52°C에서 16시간 동안 동결건조시킨다.
   2. 동결건조된 샘플을 바이러스 역가의 현저한 감소 없이 4°C에서 보관한다.

3. 품질 관리 분석

1. 게놈 확인을 위한 바이러스 RNA 분리 및 역전사 PCR
   1. 20 μL 바이러스 분취량을 해동시킨다. 키트와 함께 제공된 바이러스 RNA 분리 프로토콜을 따르십시오.
   2. 단리된 RNA를 즉시 역전사용 주형으로 사용하여 PCR (RT-PCR)을 사용하거나 이를 -80°C에 보관한다.
   3. 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 기재된 바와 같이 역전사 반응을 준비한다.
   4. 얻어진 cDNA를 다양한 품질 관리 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 NDV 병리형(표 1, F 단백질 프라이머 세트) 및 필요한 유전자 조절 요소의 존재(표 1, 전이유전자 프라이머 세트)를 확인하였다.
      참고: 프라이머는 전파되는 NDV의 균주를 기반으로 설계되어야 합니다.
      1. 경로형의 주요 결정인자인 F 단백질 절단 부위를 서열화하기 위해, F 단백질 프라이머 세트를 사용한다(표 1). 길이가 435 염기쌍인 PCR 산물을 찾아본다.
         참고: 여기서, 프라이머는 NDV의 라소타 균주(Genbank 수탁 AF077761.1)를 기반으로 설계되었다. 외래 전이유전자가 P 및 M 유전자⁽²⁴) 사이에 삽입될 때 최적의 전이유전자 발현이 발생한다는 것이 잘 확립되어 있다.
      2. 이식유전자 프라이머 세트를 사용하여 이식유전자의 유전자 시작 및 유전자 말단 요소의 무결성을 확인한다. PCR 산물을 서열화하여 유전자 시작 및 유전자 말단 서열 무결성을 확인한다.
   5. DNA 시퀀싱을 위해 PCR 산물을 보내고 상동성을 위한 주형과 비교한다.
2. SDS PAGE 및 Coomassie 염색을 통해 오염 단백질을 검출합니다.
   1. 밀도 구배 SDS PAGE 겔을 먼저 캐스팅하여 6% 및 15% 폴리아크릴아미드 용액을 제조하였다(보충 표 S1). 10 mL 피펫을 사용하여 15% 용액 5 mL를 뽑은 다음, 6% 용액 5 mL를 그립니다.
   2. 용액에서 피펫을 제거하고 간단히 공기를 끌어 올려 기포를 생성합니다.
      참고: 기포가 위쪽으로 이동하면 솔루션이 혼합되어 SDS PAGE 그라디언트가 생성됩니다.
   3. 용액을 캐스팅 장치에 분배하고 30 분 동안 응고되도록하십시오.
   4. 20 μL의 최종 부피에서, 바이러스의 분취량을 4x 환원 완충액 (보충 표 S1)과 결합하여 최종 농도가 1x가 되도록 하고, 열순환기에서 95°C에서 10분 동안 끓인다. 바이러스의 적어도 1 × 10⁷ PFU를로드하십시오.
   5. SDS PAGE를 실행 버퍼(보충 표 S1)에 잠기고 샘플을 로드합니다.
   6. 젤을 120V에서 1-1.5 시간 동안 실행하십시오.
   7. 실행중인 버퍼에서 젤을 제거하고 더 작은 용기로 옮깁니다.
   8. 쿠마시 염색 용액(보충 표 S1)을 첨가하여 겔을 덮는다. 실온에서 4-5 시간 동안 인큐베이션한다.
   9. 염색 용액을 제거하고 탈기 용액 (보충 표 S1)을 첨가하고, 교반하면서 실온에서 4-8 시간 동안 인큐베이션한다. 얼룩 제거 용액을 서너 번 바꿉니다.
      참고 : 젤은 맑아야하며 색상은 염색 전과 같아야합니다.
   10. 비색 설정에서 젤을 이미지화합니다. 알란토액 및 정제된 바이러스로부터의 샘플을 함유하는 쿠마시 염색된 SDS PAGE 겔의 대표적인 이미지에 대해서는 도 5 를 참조한다.
3. 중간 조직 배양 감염 용량 (TCID₅₀) 및 면역 형광 분석에 의한 감염성 바이러스 역가의 정량화
   참고: 베로 세포는 DF1 세포에 대한 대안으로 사용될 수 있다; 그러나, 세포변성 효과(CPE)는 베로 세포에서 덜 뚜렷하다. NDV는 L289A 돌연변이를 보유하고, 이는 fusogenicity를 향상시키고, P 및 M 유전자 사이에 GFP를 발현하는 것이 이 검정에 사용되고 있다.
   1. 2% 우태아 혈청(FBS)과 125μg/mL 트립신으로 보충된 DMEM을 사용하기 전날 20,000 세포/웰에서 DF1 세포의 96웰 플레이트를 80μL의 부피로 시드하십시오. 세포를 37°C 및 5%_CO2에서 인큐베이션한다.
   2. 다음날, 얼음 위에서 20 μL 분취량의 바이러스를 해동시킨다.
   3. 1.5 mL 튜브를 사용하여 연속 희석액을 준비하십시오. 바이러스 10 μL를 PBS 990 μL로 희석하여 시작하여 ^10-2 희석액을 제조하였다. 900 μL의 PBS로 만들고 이전 희석액의 100 μL를 첨가하여 최소한으로 최대 ^10-10 의 다른 모든 희석물을 준비한다.
      참고: 희석 사이를 이동할 때 새 피펫 팁을 사용하십시오.
   4. 각 희석액의 20 μL를 사용하여 도 6에 도시된 바와 같이 96-웰 플레이트의 각 웰을 감염시킨다.
      참고: 각 웰의 최종 부피는 100 μL가 될 것이다.
   5. CPE/GFP의 존재를 검사하거나 간접 면역형광 분석(IFA)을 수행하기 전에 플레이트를 37°C 및 5%_CO2에서 적어도 48시간 동안 인큐베이션한다.
      참고: 이러한 배양 조건 하에서, CPE는 10시간 후에 명백하며(그림 7A-D), 다음 24시간 동안 증가한다(그림 7E-H). 플레이트는 GFP 또는 CPE에 의해 스코어링되는 경우 CPE의 강도를 향상시키기 위해 더 오래 인큐베이션될 수 있다.
      1. CPE 또는 GFP로 점수가 매겨지고 IFA를 수행하지 않으면 3.3.18.1단계로 건너뜁니다.
   6. IFA를 수행하는 경우, 1x PBS의 100 μL로 세포를 두 번 헹구십시오.
   7. PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
   8. 세포를 각각 100 μL의 1x PBS, 0.1% 트윈 20 (0.1% PBS-T)로 3x 5분간 세척하였다.
   9. PBS에 0.1% NP-40의 100 μL를 첨가하고, 이를 실온에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 세포를 투과시킨다.
   10. 세포를 0.1% PBS-T의 100 μL로 3x 5분 동안 세척한다.
   11. 0.1% PBS-T에 희석된 5% (V/V) 정상 염소 혈청으로 구성된 블로킹 완충액 100 μL를 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 첨가한다.
   12. 0.1% PBS-T에 희석된 1차 마우스 항-NDV 리보뉴클레오단백질 항체를 웰당 100 μL씩 1 μg/mL로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
   13. 세포를 0.1% PBS-T의 100 μL로 5분 동안 3x 세척한다.
   14. 0.1% PBS-T에 희석된 AlexaFluor 488 염소 항-마우스 2차 항체 100 μL를 2 μg/mL에 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   15. 세포를 0.1% PBS-T의 100 μL로 5분 동안 3x 세척한다.
   16. 최종 세척 후, 세포를 0.1% PBS-T의 100 μL에 남겨 둔다.
   17. 반전된 형광 현미경을 사용하여 웰을 이미지화합니다.
   18. IFA를 수행할 때, 음성 대조군 웰에서 보이는 것보다 더 큰 형광을 보이며, 이는 도 8에 도시된 바와 같이 웰이 NDV에 대해 양성임을 나타낸다.
       1. NDV CPE를 특징 짓는 syncytia 및 크고 둥근 셀의 존재를 찾으십시오. 점수가 매겨진 웰이 GFP를 발현하는 바이러스에 감염된 경우, GFP의 존재를 찾으십시오.
   19. 적절한 정보를 Spearman-Karber 역가 계산기(²⁶)에 입력하여 바이러스의 PFU/mL를 결정한다(표 2). 예를 들어_TCID50 역가 플레이트에 대해 도 6을 참조한다.
4. 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)에 의한 바이러스 역가의 정량
   참고: 시간을 절약하고 시료 조작을 줄이기 위해 한 단계 qRT-PCR 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 프로브 기반 분석은 바이러스 서열에 대한 검출의 특이성을 증가시키기 위해 사용된다.
   1. 바이러스 서열의 알려진 양의 표준 곡선을 만듭니다 (보충 그림 S2A, B).
      참고: 이것은 NDV L 유전자의 합성 500 bp 이중 가닥 DNA 단편을 구입함으로써 수행될 수 있다. NDV L 유전자의 500 bp 단편에 대한 서열은 보충도 S2C에서 볼 수 있다.
   2. 바이러스 DNA 단편의 양 (일반적으로 제조업체에 의해 나노그램 또는 펨토몰로 제공됨)을 아보가드로의 수 및 몰을 분자 식 (Eq (1))을 사용하여 DNA 단편의 분자 수 또는 사본의 수로 변환하십시오.
      (1)
   3. 공지된 바이러스 DNA 단편 카피의 10배 희석 시리즈를 제조하여, 1.00 내지 10 카피×부터^{시작하여 1.00 × 10,00} 카피까지 표준 곡선 샘플을 준비하였다.
   4. 알려지지 않은 샘플에서 NDV RNA의 양을 확인하려면 RNA 추출 키트를 사용하여 NDV RNA를 추출합니다. 키트와 함께 제공된 프로토콜을 따르십시오. RNA가 추출되면 원스텝 qRT-PCR 키트에 제공된 권장 프로토콜을 진행하십시오.
   5. 다음 온도 및 사이클링 조건으로 실시간 PCR 기기에서 반응을 실행한다: 1) 55°C에서 10분 동안 역전사의 1 사이클; 2) 1분 동안 95°C에서 초기 변성의 1 사이클; 3) 변성 40 사이클 (10 초 동안 95 °C), 확장 (30 초 동안 60 °C) 및 형광 신호 획득.
   6. qRT-PCR 분석이 완료되면 실시간 PCR 기기 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선 샘플을 기반으로 표준 곡선을 생성합니다 (보충 그림 S2A, B).
      참고 : 소프트웨어는 또한 표준 곡선을 기반으로 알 수없는 샘플에서 NDV RNA의 양을 계산합니다.
5. 생쥐의 급성 독성에 대한 안전성 테스트
   1. 급성 독성을 평가하기 위해 꼬리 정맥을 통해 1 × 10⁸ PFU의 바이러스를 정맥 주사하여 8 주령의 BALB / C 마우스 세 마리에 주사하십시오.
   2. 마우스에서 체중 감소(>20%), 구부러진 자세, 주름진 코트, 혼수 상태 및 호흡 변화와 같은 부작용이 있는지 모니터링합니다. 처음 48시간 동안 매일 서너 번 평가합니다. 생쥐는 48 시간 후에 회복되기 시작해야하므로 완전히 회복 될 때까지 하루에 한 두 번 모니터링하십시오.
      1. 식염수를 피하 투여하고 필요에 따라 지원 치료를 받으십시오. 예를 들어, 회복 다이어트 젤, 땅콩 버터를 보충하거나 열 퍽을 사용하십시오. 동물 관리 기관 지침에 의해 설명 된대로 종점 기준에 도달 한 마우스를 이소플루란 과다 복용 후 자궁 경부 탈구로 안락사시킵니다.

알란토익 유체 수확
알란토액은 배아 된 닭 알에서 수확되므로 명확하고 투명하게 보일 것입니다. 유체가 불투명하고 노란색으로 나타나면 이는 오염 물질의 존재를 나타냅니다. 정제 중에이 알란토닉 유체를 포함하면 압력이 빠르게 상승하고 10 psi를 초과하여 바이러스의 전단과 전염성 바이러스의 손실을 초래하므로 정제 과정을 방해합니다. 피 묻은 것처럼 보이는 Allantoic 액체는 계란이 너무 많은 PFU의 바이러스로 접종되었음을 암시합니다. 이 달걀 배치의 수율은 예상보다 현저히 낮을 것이며이 바이러스가 생체 내에서 사용될 가능성은 거의 없습니다. 렌토제닉 NDV를 접종한 난자는 그림 1에서 시각화된 바와 같이 72시간 후에도 여전히 혈관구조가 뚜렷해야 하며 배아는 죽지 않아야 한다. 그들이 가지고 있다면, 이것은 배아가 어떤 식 으로든 손상되었거나 오염되었음을 암시합니다.

Iodixanol 밀도 구배 초원심분리
초원심분리 후, 고역가, 백색, NDV 함유 밴드는 10% 및 20% 구배 사이에 위치해야 합니다(그림 4B).

SDS-PAGE 젤의 쿠마시 염색
도 5는 정제되지 않은 (레인 2)와 정제된 바이러스 스톡 (레인 3) 사이의 차이를 보여준다. 이 둘의 비교는 오염시키는 단백질 밴드의 강도의 현저한 감소와 정제된 바이러스 스톡에서 우세한 NDV 밴드의 출현을 보여준다.

TCID 50에 의한 바이러스 역가의 정량화
NDV의 농축 재고를 적정할 때 권장 조건을 사용하는 경우 24시간 후에 CPE가 분명해야 합니다(그림 6). 유사한 역가의 렌토제닉 NDV 균주와 비교하여, CPE는 동시에 메소제닉 균주에서 더욱 뚜렷하다.

8주령 BALB/C 마우스의 급성 독성 분석
1 × 108 PFU를 정맥 내 투여했을 때, 마우스는 체중 감소 >20 %, 주름진 코트, 구부러진 자세 및 비정상적인 호흡과 같은 부작용을 모니터링해야합니다. 처음 24-36 시간 이내에 마우스는 체중이 감소하기 시작하고 주름진 코트와 구부러진 자세를 개발할 가능성이 큽니다. 그러나 바이러스가 충분히 순수하면 마우스는 36 시간 후에 체중 증가와 자세 및 코트 상태의 개선으로 관찰 된 바와 같이 회복되기 시작합니다. 36 h까지 이러한 회복 징후를 보이지 않는 마우스는 종점 기준에 대해 계속 면밀히 모니터링해야합니다. 전형적으로, 이것은 바이러스 입자의 응집으로 인해 잠재적으로 부정확 한 적정 때문에 발생했습니다.

도 1: 지정된 병원체가 없는 배아 닭 난자로부터의 NDV의 감염 및 수확. (A) 배아 이동 이외에 9일간 배양한 후에 명백해야 하는 웹형 혈관구조(화살표). 'X'는 chorioallantoic 막과 공기 공동 사이의 계면과 계란 접종을 위해 구멍을 만들어야하는 곳을 나타냅니다. (B) 죽은 배아를 묘사하는 이미지. 웹과 같은 혈관 구조의 부재에 유의하십시오. 배아 운동의 부족도 관찰 될 것입니다. (c) 공기 공동, 노른자 주머니, 양수 낭, chorioallantoic 막 및 allantoic 유체의 위치를 보여주는 배아 닭 난자의 성분의 도. (d) 쵸알란토막에 노출시키기 위한 외피의 제거. (E) 동종액과 배아가 맥락알란토막의 개구부 이후에 어떻게 보여야 하는지를 예시한다. 약어 : NDV = 뉴캐슬병 바이러스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 깊이 여과에 사용 된 장치의 일반 어셈블리를 개략적으로 설명합니다. 압력 게이지가 깊이 필터의 상류에 설치되어 있는지 확인하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 다양한 구성의 접선 흐름 여과 설정. 화살표는 유체 흐름의 방향을 보여줍니다. (A) TFF 카세트가 조립되는 방법의 그림. (B) 유체의 정제 및 농축 동안 사용되는 "개방"구성에서 TFF 시스템의 개략도. (C) 바이러스 및 세척 용액의 용출 중에 사용되는 유체가 시스템으로부터 용출될 때 TFF 설정의 개략도. (D) TFF 시스템의 청소 중에 사용되는 "폐쇄형" 구성에서 TFF 시스템의 회로도. 약어: TFF = 접선 유동 여과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: TFF로부터의 농축된 바이러스의 밀도 구배 초원심분리 및 투석. (A) 요오드딕사놀 밀도 구배의 조성을 나타내는 개략도. (b) 정제 공정 동안 ML 완충액을 사용하여 생산된 바이러스의 초원심분리에 따른 바이러스 밴딩 패턴. 주요 바이러스-함유 밴드는 검정 타원형으로 표시된다. (c) 투석 절차 말기에 요오딕사놀 구배를 통해 제조된 바이러스 10 mL가 로딩된 투석 카세트의 전형적인 크기. 약어: TFF = 접선 유동 여과; ML = 만니톨-라이신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔. 겔은 정제되지 않은 (레인 2)와 정제 (레인 3) 메소제닉 NDV 스톡 사이의 오염 단백질의 존재를 비교하여 1 × 105 PFU가 로딩되었을 때. 레인 1 및 4 = 분자량 사다리 (MW). NDV HN,F0, 및 그의 서브유닛은 절단에 뒤이어,F1 및F2, 그들의 각각의 분자량(27 )과 함께 백색 폰트로 도시된다. 약어: SDS-PAGE = 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동; NDV = 뉴캐슬병 바이러스; PFU = 플라크-형성 단위; HN = 헤마글루티닌; F0 = 융합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6: TCID50에 의한 바이러스 역가를 결정하기 위해 사용된 96-웰 플레이트 레이아웃의 예. 플레이트는 12개의 컬럼으로 나뉘며, 각 컬럼은 상이한 직렬 희석을 나타낸다. 양성 웰(CPE, 전이유전자 발현 또는 IFA에 의해 결정됨)은 회색으로 표시된다. 이 예에서 양성 웰의 수를 감안할 때, Spearman-Karber 역가 계산기를 사용한 후 예상되는 역가 (표 2)는 TCID50/mL 및 PFU/mL 둘 다에 열거되어 있다. 약어:TCID50 = 중간 조직 배양 감염 용량; CPE = 세포변성 효과; IFA = 면역형광 분석법; PFU = 플라크 형성 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 7: 렌토제닉 또는 메소제닉 NDV를 사용한 DF1 세포의 감염 후 CPE의 비교. 0.5의 MOI를 DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% 알란톡시스 유체, 또는 DMEM + 2% FBS + 125 μg/mL 트립신의 상이한 배양 조건 하에서 10시간 인큐베이션(A-D) 또는 24시간 인큐베이션(E-H) 후에 사용하였다. 스케일 바 = 200 μm. 약어: CPE = 세포변성 효과; NDV = 뉴캐슬병 바이러스; MOI = 감염의 다중성; FBS = 소 태아 혈청; DMEM = 둘베코의 수정 된 독수리의 매체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 8: GFP 전이유전자가 결여된 렌토제닉 NDV를 역가하기 위해 IFA가 필요한 상황의 예. 베로 세포를 2% FBS 및 125 μg/mL 트립신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 이미지는 10-7 직렬 희석으로부터 취해졌다. (A) 감염된 세포의 브라이트필드 이미지. (B) IFA가 바이러스 검출에 사용될 때 염색된 세포의 전형적인 모습을 나타낸다. (C) (A)와 (B)의 병합된 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 약어: IFA = 면역형광 분석; NDV = 뉴캐슬병 바이러스; GFP = 녹색 형광 단백질; FBS = 소 태아 혈청; DMEM = 둘베코의 수정 된 독수리의 매체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 뉴캐슬병 바이러스 유전자 세그먼트의 검출을 위한 PCR 및 RT-qPCR 프라이머. NDV 게놈의 두 영역의 특이적 증폭에 사용되는 프라이머 세트. F 단백질 프라이머 세트는 F 단백질 절단 부위에 걸쳐 있는 F 단백질의 영역의 증폭을 초래한다. 트랜스진 프라이머 세트는 최적의 이식유전자 삽입 부위인 포스포단백질과 매트릭스 유전자 사이의 인터제닉 영역을 증폭시킨다. 이 표에는 qRT-PCR 분석에 사용되는 바이러스 L 유전자21 및 L 유전자 프로브를 표적으로 하는 프라이머 서열도 포함되어 있다. 약어: PCR = 중합효소 연쇄 반응; RT-qPCR = 역전사 정량적 PCR; NDV = 뉴캐슬병 바이러스. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 스피어만-카버 역가 계산기. 이 대화식 스프레드시트에는 mL의 웰 접종, 희석 방식 및 희석당 반복실험 횟수를 기반으로 TCID50 결과를 사용하여 바이러스 농도를 결정하기 위한 적절한 워크플로우 및 방정식이 포함되어 있습니다. 농도는 조직 배양물의 50%를 감염시키는데 필요한 mL의 부피(TCID50) 및 바이러스 현탁액의 mL 당 플라크 형성 단위로서 보고된다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 요오드딕사놀 농도의 결정. (a) 340 nm에서 공지된 요오드딕사놀 농도의 용액의 흡광도로부터 생성된 표준 곡선. (B) (A)로부터의 표준 곡선 및 방정식은 밀도 구배 초원심분리, 투석 및 폴리에틸렌 글리콜 농도에 따른 용액 중의 요오드딕사놀의 농도를 결정하기 위해 사용되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충도 S2: NDV L 유전자의 합성 500 bp 이중 가닥 DNA 단편의 qRT-PCR 분석으로부터 생성된 증폭 및 표준 곡선. 증폭 (A) 및 표준 곡선 (B)을 DNA 단편의 10배 연속 희석 (1.0 내지 10,9 카피× 1.0 × 10,0카피)을 함유하는 샘플로부터 생성하였다. 증폭 및 표준 곡선의 경우, 1.0 × 10 카피 및1.0 × 100 카피를 함유하는 샘플은 임계치 미만이었고 35 Cp 미만의 교차점 값을 생성하지 않았다. 최종 표준 곡선은 DNA 단편의 1.0 × 109 카피 내지 1.0 × 102 카피를 함유하는 샘플에 기초하여 생성되었다. (c) qRT-PCR 프로토콜에서 표준 곡선을 생성하는데 사용되는 500개 뉴클레오티드 NDV L 유전자 단편의 DNA 서열. 약어: PCR = 중합효소 연쇄 반응; RT-qPCR = 역전사 정량적 PCR; NDV = 뉴캐슬병 바이러스; Cp = 교차점. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S3 : 투석 카세트에서 NDV의 로딩 및 추출. (a) 투석 카세트의 전형적인 크기는 수크로오스 밀도 구배로부터 분리된 대략 10 mL의 바이러스 함유 용액으로 로딩되고 투석 단계의 끝에서 이미지화된다. (b) ML 완충액 보충 없이 요오드딕사놀 밀도 구배 초원심분리를 사용할 때 얻어진 결과의 일례. 둘러싸인 것은 제거를 위한 표적 바이러스 밴드이다. 화살표로 표시된 것은 손상된 비리온을 포함할 수 있는 추가적인 밴드이다. 정제 공정에서 ML 버퍼를 혼입한 후, 이 밴드는 더 이상 명백하지 않다는 점에 유의한다. 약어: NDV = 뉴캐슬병 바이러스; ML = 만니톨-리신. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 정제 공정 동안 사용되는 웨스턴 블롯 용액 및 ML 버퍼를 생성하는 데 필요한 단계를 제공합니다. 약어: SDS-PAGE = 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동; TEMED = 테트라메틸에틸렌디아민; ML = 만니톨-리신. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.