Summary
본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.
Abstract
다발성 경화증 (MS)은 염증성 침윤, 탈수초화 및 축삭 손상을 특징으로 하는 중추신경계(CNS)의 전형적인 자가면역 질환이다. 현재 MS를 완전히 치료할 수있는 조치는 없지만 질병 진행을 제어하고 완화하기 위해 여러 질병 수정 요법 (DMT)을 사용할 수 있습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)과 MS 환자의 CNS 병리학적 특징 사이에는 상당한 유사성이 있다. EAE는 MS 약물의 효능을 결정하고 MS 질환에 대한 새로운 치료법 개발을 모색하는 대표적인 모델로 널리 사용되었습니다. 마우스에서 EAE의 활성 유도는 안정하고 재현 가능한 효과를 가지며,자가 면역 신경 염증에 대한 약물 또는 유전자의 효과를 연구하는데 특히 적합하다. C57BL/6J 마우스를 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG35-55)로 면역화하는 방법과 임상 점수 시스템을 사용하여 질병 증상의 일일 평가가 주로 공유됩니다. 다양한 임상 증상을 가진 MS의 복잡한 병인을 감안할 때 기존 임상 점수 시스템은 질병 치료 평가를 만족시킬 수 없습니다. 단일 개입의 단점을 피하기 위해 MS 환자에서 불안과 유사한 기분 및 골다공증의 임상 증상을 기반으로 EAE를 평가하는 새로운 지표를 만들어 MS 치료에 대한보다 포괄적 인 평가를 제공합니다.
Introduction
자가면역질환은 자체 항원에 대한 면역계의 면역 반응으로 인해 조직 손상 또는 기능 장애를 초래하는 다양한 장애입니다1. 다발성 경화증 (MS)은 염증성 침윤, 탈수 초화 및 신경 축삭 변성 2,3을 특징으로하는 중추 신경계 (CNS)의 다발성 신경 병증의 만성자가 면역 질환입니다. 현재 MS는 전 세계적으로 250 만 명의 사람들에게 영향을 미쳤으며, 대부분 가족과 사회의 중추 인 20-40 세의 젊은 및 중년의 사람들입니다. 이것은 가족과 사회에 상당한 영향과 해를 끼쳤습니다 2,4.
MS는 다양하고 복잡한 임상 증상을 가진 다 인성 질환입니다. 염증성 침윤 및 탈수초화를 특징으로 하는 고전적인 신경 장애 외에도 MS는 종종 시각 장애, 사지 운동 이상증, 인지 및 정서 장애 5,6,7을 보여줍니다. MS 환자가 적절하고 올바른 치료를받지 못하면 절반은 20 년 후에 휠체어에서 살게되고 거의 절반이 우울 및 불안 증상을 경험하여 일반 인구보다 훨씬 높은 수준의 자살 충동을 느끼게됩니다 8,9.
오랜 연구 기간에도 불구하고 MS의 병인은 여전히 파악하기 어렵고 MS의 발병 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. MS의 동물 모델은 설치류와 인간 면역계의 중요한 차이에도 불구하고 질병 개발 및 새로운 치료법을 탐구하는 동시에 몇 가지 기본 원칙을 공유하는 테스트 도구 역할을 허용했습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 현재 MS 연구를 위한 이상적인 동물 모델로, 미엘린 단백질의 자가항원 면역을 사용하여 감수성 마우스에서 CNS 성분에 대한 자가면역을 유도하고 체액성 면역 반응을 향상시키기 위해 완전한 프로인트 보조제(CFA) 및 백일해 독소(PTX)를 추가합니다. 유전적 배경 및 면역 항원에 따라, MS10,11,12의 다양한 임상 형태를 모방하기 위해 급성, 재발-완화 또는 만성을 포함한 다양한 질병 과정이 얻어진다. EAE 모델의 구축에 일반적으로 사용되는 관련 면역원은 자가 CNS 단백질, 예컨대 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 또는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)으로부터 유래한다. MBP- 또는 PLP-면역화된 SJL/L 마우스는 재발-완화 과정을 개발하고, MOG는 C57BL/6 마우스11,12,13에서 만성 진행성 EAE를 유발한다.
질병 수정 요법 (DMT)의 주요 목적은 질병 증상을 최소화하고 기능을 개선하는 것입니다6. MS를 완화하기 위해 여러 약물이 임상적으로 사용되지만 아직 완전히 치료하는 데 사용되는 약물은 없으므로 시너지 치료의 필요성이 드러납니다. C57BL/6 마우스는 현재 트랜스제닉 마우스를 구축하는데 가장 통상적으로 사용되며, 이 작업에서, 5점 척도를 갖는 C57BL/6J 마우스에서 MOG35-55 에 의해 유도된 EAE 모델을 사용하여 질환 진행을 모니터링하였다. EAE 모델은 또한 불안-유사 기분 및 골 손실, 및 널리 공지된 탈수초성 병변을 앓고 있다. 여기서, 개방 필드 테스트 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (Micro-CT) 분석을 사용하여 여러 관점에서 EAE의 증상을 평가하는 방법이 또한 설명된다.
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Protocol
동지 대학의 동물 관리위원회는 현재의 작업을 승인했으며 모든 동물 관리 지침을 따랐습니다. 8-12주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 그룹에서 나이와 성별이 동일하다는 것이 보장되었습니다. 그렇지 않으면 질병에 대한 감수성이 영향을 받았습니다. 마우스는 일정한 조건 (실온 23 ± 1 ° C, 습도 50 % ± 10 %)에서 12 시간의 밝고 어두운 사이클을 번갈아 가며 마우스 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 특정 병원체가없는 환경에 수용되었습니다.
1. MOG35-55 에멀젼의 제조
- 열 불활성화 동결건조된 결핵균(MTB, H37Ra)을 추가하여 프로인트 보조제(자체 1mg/mL의 열 불활성화 MTB, H37Ra 함유)를 완성하여 최종 MTB 농도가 5mg/mL가 됩니다( 재료 표 참조).
알림: 전체 작업은 생물 안전 캐비닛에서 완료해야합니다. 부는 공기를 열지 마십시오. - 동결건조된 MOG35-55 펩타이드( 재료 표 참조)를 멸균 사전 냉각 인산완충식염수(PBS)(칼슘 및 마그네슘 이온 없음, pH 7.4)에 용해시켜 2mg/mL 농도의 항원 용액을 준비합니다.
- 깨끗한 2mL 미세 원심분리기 튜브를 가져다가 멸균된 5mm 강철 볼( 재료 표 참조) 하나를 각 튜브에 추가합니다.
- 5 mg / mL의 MTB와 500 μL의 MOG35-55 항원 용액을 포함하는 500 μL의 완전한 Freund의 보조제를 하나의 강구가 들어있는 위의 미세 원심 분리 튜브에 첨가하십시오.
- 위의 튜브를 TissueLyser( 재료 표 참조)에서 10분 동안 진동시키고 얼음에서 10분 동안 식힌 다음 4번 반복하여 잘 혼합하고 마지막으로 흰색 점성 용액을 형성합니다.
알림: 우수한 유화는 MOG35-55 에멀젼을 준비하는 핵심 단계이므로 철저한 혼합이 필요합니다. TissueLyser는 28Hz의 속도로 설정됩니다.
2. 백일해 독소 (PTX)의 제조
- ddH2O로 PTX를 100 μg / mL 농도로 준비하고 4 ° C에서 보관하십시오.
- PTX 원액을 멸균 1x PBS(칼슘 및 마그네슘 이온 없음, pH 7.4)로 50배 희석하여 사용할 200ng/100μL 용액을 만듭니다.
3. EAE 동물모델 구축
- 8-12주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 EAE 모델을 구축하였다. 예방 접종 전에 마우스가 먹이 환경에 적절하게 순응하는지 확인하십시오.
- 준비된 MOG35-55 에멀젼(단계 1)을 장비의 펄스 버튼( 재료 표 참조)을 눌러 4°C에서 2-3초 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 모든 에멀젼을 침전시킵니다.
알림: MOG35-55 에멀젼은 -20°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 약물 실패를 피하려면 가능한 한 빨리 사용하는 것이 좋습니다. - 22G 바늘을 1mL 주사기 배럴에 부착하고 MOG 35-55 에멀젼을 흡인하고 MOG35-55 에멀젼을 새 1mL 주사기 배럴에 옮깁니다. 1mL 주사기 배럴과 밀봉 필름이 있는 26G 바늘 사이의 연결을 고정합니다( 재료 표 참조).
알림: MOG35-55 에멀젼을 1mL 시린지 배럴에 넣을 때 기포를 피하십시오. - 주사 부위를 70 % 에탄올로 닦고 소독하십시오.
- MOG35-55 에멀젼을 마우스의 등쪽 척추의 양쪽에 피하 주사하고 각 측면에 100 μL를 주입합니다. 주입 작업이 완료된 후 생쥐의 등쪽 피부 아래에 구근 덩어리가 자동으로 형성되는 것을 관찰하십시오.
알림: 숙련 된 실험자가 예방 접종 과정을 수행하고 마우스에 가해지는 압력을 최소화하기 위해 주사가 부드럽고 천천히 수행되는지 확인하십시오. - 위의 마우스에 100μL의 PTX를 복강내 주사한다(단계 2).
참고: 예방 접종일은 0일째입니다. 또한, 마우스의 꼬리에 색상 마커를 사용하는 것과 같은 후속 일일 평가를 위해 마우스를 정확하게 식별할 수 있는지 확인하십시오. - 예방 접종 후 2 일째에 동일한 용량의 PTX를 주사하십시오.
- 면역화되지 않은 마우스 그룹을 야생형(WT) 마우스로 준비한다.
4. 마우스의 임상 모니터링
- EAE 및 WT 마우스의 체중을 매일 기록한다.
참고 : EAE의 중증도는 마우스의 체중 감소와 양의 상관 관계가 있으므로 체중도 매우 중요한 모니터링 지표입니다. - 표 1에 나열된 0-5 점수 시스템을 사용하여 예방 접종 후 0-21 일에서 마우스의 상태를 모니터링합니다.
알림: 그 사이의 증상은 플러스 또는 마이너스 0.5점으로 계산됩니다.
5. 오픈 필드 테스트
참고: 이 단계를 위해 선택된 실험 동물은 초기 발병, 피크 및 관해 기간의 EAE 마우스입니다. 또한, WT 마우스를 대조군으로 사용하였다. 모든 마우스는 EAE 모델링을 위해 불안 장애를 갖는 마우스를 배제하기 위해 모델링 전에 불안-유사 행동에 대해 시험되었다는 것을 주목해야 한다. 또한, 완전한 운동 불능력을 갖는 피크 및 관해 기간의 EAE 마우스는 시험에서 제외되었다.
- 40 × 40 × 40cm3 오픈 필드 반응 챔버 및 운동 활동(open field) 비디오 분석 시스템을 준비한다( 재료 표 참조).
알림: 카메라는 상자를 완전히 덮는 위치에 설치되고 반응실은 고르게 조명되며 테스트 룸은 조용한 영역이어야 합니다. - 실험을 시작하기 1시간 전에 습관화를 위해 테스트 마우스를 시험실에 두십시오.
- 테스트를 시작하기 전에 전체 영역에 70% 에탄올을 뿌리고 깨끗한 종이 타월로 닦아 반응 챔버가 깨끗한지 확인합니다.
- 탐험을 시작하기 전에 케이지에서 각 마우스를 개별적으로 제거하고 경기장의 같은 구석에 놓습니다.
참고: 상자의 하단은 16개의 그리드로 나뉘며, 그 중 중간 4개의 그리드 영역은 중앙 영역이고 주변 영역은 주변 영역입니다. - 비디오 분석 시스템의 메뉴 표시줄에서 캡처 시작 버튼을 클릭하고 시간을 기록하고 촬영을 시작합니다.
- 시험실에서 조용히 하십시오.
- 녹음 과정에서 마우스를 5분 동안 자유롭게 움직이십시오.
- 획득 시스템을 중지하고 비디오를 저장합니다.
- 마우스를 경기장에서 꺼내 케이지에 다시 넣고 다음 마우스로 진행합니다.
알림: 냄새 및 기타 물질을 제거하기 위해 실행 사이에 70% 에탄올로 테스트 영역을 청소하십시오. - 비디오 분석 시스템을 사용하여 결과를 분석합니다.
6. 뼈 표현형 분석
- EAE 및 WT 마우스를 21일째에 자궁경부 탈구에 의해 안락사시킨다.
알림: 자궁 경부 탈구 수술을 수행하는 직원은 동물이 죽는 동안 견뎌내는 통증을 최소화하도록 잘 훈련되어야합니다. - 마우스를 해부 트레이에 평평하게 놓고 사지를 고정하십시오.
- 집게로 마우스 뒷다리 피부를 잡고 가위로 마우스 피부와 근육 조직을 엽니 다.
- 가위로 경골과 엉덩이 뼈에서 대퇴골을 조심스럽게 분리하십시오.
- 대퇴골에 부착 된 근육을 가위로 제거하고 대퇴골을 실온에서 70 % 에탄올에 넣습니다.
- 등방성 복셀 크기가 10μm이고 피크 X선 튜브 전압이 70kV이고 X선 강도가 0.114mA인 micro-CT 시스템( 재료 표 참조)을 사용하여 원위 대퇴골을 스캔합니다.
참고: 3D 가우스 필터를 사용하면 2D 임계값 이미지의 노이즈를 제거할 수 있습니다. - 중간 대퇴골에서 스캔한 100개의 슬라이스를 분석하여 뼈 부피, 조직 부피, 골밀도, 섬유주 분리, 섬유주 수, 섬유주 연결 밀도, 섬유주 및 피질 두께를 포함한 대퇴골 매개변수를 측정합니다.
참고 : 마우스의 원위 대퇴골 성장판의 근위 끝에서 시작하여 골단 캡 구조가 전혀없는 절편이 발견되어 근위 대퇴골쪽으로 100 개의 슬라이스를 계속 확장했으며, 이는 골단 섬유주를 식별하기 위해 내부 피질 표면에서 몇 복셀에서 수동으로 윤곽이 그려진 윤곽이었습니다. - micro-CT 시스템의 윤곽 영역에서 임계값 2D 이미지를 쌓아 3D 재구성을 생성합니다.
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Representative Results
마우스의 면역화 후, 마우스의 체중을 매일 기록하고, 이들의 임상 증상을 상기 기재된 프로토콜에 따라 평가한다 (단계 4). MOG 펩타이드로 면역화 된 C57BL / 6J 마우스에서 병변의 위치는 주로 척수에 국한되어 있기 때문에 EAE 마우스의 병인은 꼬리 끝에서 머리로 퍼집니다. 질병의 시작 부분에서 EAE 마우스는 꼬리의 약점과 처짐을 나타내며 뒷다리의 약점, 조정되지 않은 움직임 및 마비가 뒤 따른다. 질병이 악화됨에 따라 점차 앞다리의 약화, 마비로 발전하고 심한 경우에는 생쥐를 움직이기가 어렵고 심지어 거의 죽을 수도 있습니다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 상이한 정도의 EAE 병리를 갖는 마우스의 상태 다이어그램은 무증상에서 고-스코어링 EAE 증상으로 변화하는 마우스 그룹의 예시적인 그림을 도시한다(스코어 4). EAE 마우스의 체중이 임상 증상과 상관 관계가 있다고 앞서 언급되었습니다. WT 마우스와 비교하여, EAE 마우스의 체중 감소는 면역화 후 처음 며칠 내에 발생하기 시작할 수 있는 반면, EAE 마우스의 임상 증상은 일반적으로 면역화 후 6-9일에 시작되고 14-16일에 피크에 도달할 것이다. 그 후, EAE 마우스의 증상은 일반적으로 부분적으로 회복되고, 동시에 마우스의 체중 감소가 완화 될 것이다 (그림 1B, C). 따라서, EAE 발병 과정은 일반적으로 조기 발병, 피크 및 관해 기간으로 나뉘며, 이러한 시점의 예측은 결과 파라미터를 평가하는 데 중요하다. 일반적으로, EAE 병변 부위에서의 면역 세포 및 사이토카인의 생산을 분석하기 위해, 질환의 피크에서 EAE 마우스의 뇌 및 척수 내의 면역 세포를 단리하고 추가로 처리할 수 있으며, 이는 유세포분석법14,15에 의해 분석될 수 있다. 피크 발병시 척수 조직은 또한 척수14,16의 염증 세포 침윤 및 탈수 초화를 추가로 조사하기 위해 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 및 룩솔 패스트 블루 염색을 준비하는 데 가장 적합합니다. EAE의 상이한 발병 시간에서 면역계의 변화를 모니터링하기 위해, 조기 발병시 비장 및 림프절도 필수 옵션17,18이다. 또한, MOG-면역화된 EAE 마우스의 비장 또는 림프절로부터의 세포는 EAE 마우스(18)의 수동 면역화를 유도하기 위해 시험관내에서 MOG의 재자극 후에 수용자 마우스로 전달되는 전달 모델을 구축하는데 통상적으로 사용된다.
MS는 염증성 탈수초화 및 뉴런 손실 2,3을 특징으로 하는 중추신경계의 자가면역 염증성 유도성 탈수초성 병변이다. 이 질환은 일반적으로 정서 장애와 같은 정신과 적 동반 질환을 동반하며, 그 중 불안 장애는 MS 환자에서 매우 흔하며 MS 환자의 최대 30 %가 불안으로 고통받습니다 9,19. 불안 장애는 과도한 정서적 스트레스와 걱정을 특징으로하는 정신과 적 이상입니다. 오픈 필드 테스트는 종종 설치류20,21의 불안에 대한 행동을 분석하는 데 사용됩니다. 초기 발병, 피크 및 관해 기간 동안 개방 필드 테스트에서 EAE 마우스의 탐색 행동을 분석하는 데 도움을 받아 EAE 마우스도 MS 환자와 유사한 불안 유사 행동을 갖는 것으로 나타났습니다 (그림 2A). 오픈 필드 테스트에서 불안한 설치류는 활동이 감소하고 모서리에 더 가까워지는 것에 대한 선호도, 주변 영역에 대한 편향, 중앙 영역을 탐험하려는 욕구 부족을 포함하여 고정 관념 행동이 증가하는 경향이 있습니다. WT 마우스와 비교하여, EAE 마우스는 EAE 마우스가 아직 운동 장애가 없는 질병의 초기 발병에서도 질병의 3개 기간 모두에서 보행 거리 및 이동 시간이 현저히 낮았다(도 2B,C). 또한, EAE 마우스는 정상 마우스보다 훨씬 적은 거리를 통과하고 중앙 영역에 덜 머무르며, 심지어 주변 영역에서만 움직이며, 명백한 불안과 유사한 기분을 나타낸다(도 2D,E). EAE 마우스는 발병이 경미할 때, 즉 운동 협응일 때 여전히 강한 불안과 같은 기분을 나타낸다. 일부 연구에 따르면 이것은 신경 전달 물질 분비22,23에 더 영향을 미치는 경미한 신경 염증에 기인 할 수 있습니다. EAE 마우스에서 불안과 같은 기분 유발 요인을 모니터링하는 오픈 필드 테스트는 연구자가 MS 정신과 적 동반 질환을 이해하고 치료하는 데 도움이 될 수 있습니다.
질병의 진행과 함께, MS는 본질적으로 결국 운동 이상증으로 나타납니다. 연구에 따르면 MS 환자는 주로 골량 손실로 인해 골다공증 및 골절에 대한 감수성이 더 높으며 운동 이상증의 중증도는 환자의 골밀도24,25와 밀접한 상관 관계가 있습니다. 유사한 현상이 EAE 동물 모델의 도움으로 Micro-CT 분석에 의해 관찰 될 수있다 (그림 3A, H). 마우스에서 대퇴골의 섬유주 분석 데이터로부터, EAE 마우스는 WT 마우스에 비해 골밀도 (BMD)가 현저히 감소했으며, 이는 골강도에 대한 반응의 중요한 지표이자 골다공증 진단을위한 중요한 기초이다 (그림 3B). 추가 분석에 따르면 섬유주 골 손실은 건강한 WT 마우스에 비해 EAE 마우스에서 유의하게 발생했으며 섬유주 연결 밀도, 섬유주 수 및 섬유주 두께의 감소가 동반되었습니다. 이들은 모두 감소된 골량의 특징이며, 이는 EAE가 또한 마우스의 대퇴골에서 섬유주 골 손실을 유발함을 시사합니다(그림 3C-F). 동시에, 뼈 섬유주의 구조적 형태가 바뀌었고, 섬유주의 간격이 크게 증가했다. 간격이 클수록 뼈의 골다공증이 높아집니다 (그림 3G). 이것은 MS 환자가 골다공증에 걸리기 쉽다는 개념과 일치합니다. 대퇴골 골간골의 피질 뼈에서, EAE 모델에서 피질 뼈의 두께는 정상 마우스에서보다 현저히 작았다 (그림 3I). MS에서 운동성 감소 및 근이영양증 증가는 골다공증, 골절 및 기계적 힘 감소로 인한 골 흡수 증가와 밀접한 관련이 있으며 점차적으로 뼈 완전성을 감소시켜 골다공증 및 골절의 위험을 증가시킵니다26. EAE 마우스에서 대퇴골의 Micro-CT 분석은 뼈 건강을 잘 모니터링 할 수 있으며 개입은 EAE의 상태를 제어하는 데 도움이됩니다.
그림 1 : EAE의 임상 증상 모니터링. (a) 상이한 정도의 EAE 병리를 갖는 마우스의 예시적인 사진. (b) WT 및 EAE 마우스의 체중 변화. (c) WT 및 EAE 마우스에서의 임상 점수. 데이터는 평균 ± SEM (n = 5), ***p < 0.001 대 WT 마우스, 양방향 분산 분석 검정으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 오픈 필드 테스트에서 EAE 마우스의 불안 유사 행동. (A) 오픈 필드 테스트의 대표 트랙 플롯. 이동 거리 (B), 활동 지속 기간 (C), 중앙에서의 이동 거리 (D), 및 초기 발병, 피크 및 관해 기간에 WT 마우스 및 EAE 마우스의 중심에서 보낸 시간 (E). 데이터는 평균 ± SEM (n = 3), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 대 WT 마우스, 스튜던트 t-검정이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: EAE 마우스의 뼈 건강에 대한 Micro-CT 분석. (A) 대퇴 섬유주 구조의 대표적인 3D 이미지 (스케일 바, 100 μm). 골밀도 (B), 골 부피 / 조직 부피비 (C), 연결 밀도 (D), 수 (E), 두께 (F) 및 대퇴 섬유주의 분리 (G)는 Micro-CT 분석에 의해 결정되었습니다. (H) 피질골의 대표적인 3D 이미지(스케일 바, 100μm). (I) 미세 컴퓨터 단층 촬영 데이터에서 얻은 피질 두께. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 대 WT 마우스, 스튜던트 t-검정이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 점수 | 임상 증상 | ||
| 0 | 임상 징후 없음 | ||
| 0.5 | 꼬리 약점, 꼬리 앞 떨어짐 | ||
| 1 | 꼬리가 완전히 마비 됨 | ||
| 2 | 뒷다리의 경미한 마비 (양쪽 뒷다리의 약화 또는 일방적 인 마비, 조정되지 않은 걷기, 핀치에 대한 반응) | ||
| 3 | 뒷다리의 완전한 마비, 뒷다리가 끌리고 걷기, 뒷다리가 꼬집음에 반응하지 않음 | ||
| 4 | 뒷다리의 마비와 앞다리의 약점 | ||
| 5 | 죽음에 가까웠거나 죽어가는 것 | ||
표 1: 임상 점수 시스템.
| 항원 | 거르다 | 특성 | 신청 | 제한 | ||
| 증권 시세 표시기 | SJL/J34 | 재발 완화 EAE | 임상 재발과 관련된 세포 및 분자 사건에 대한 연구 | T 세포 특이적 반응으로 제한됨; SJL/J 균주에서 특정 유전자와 경로를 연구하는 것은 어려운 일입니다. | ||
| 증권 시세 표시기 | SJL/J35 | 급성 마비에서 회복 된 후 부분 또는 전체 수혜자에서 재발 마비가 발생했습니다. | 신경염증 및 면역체계 활성화 연구 | T 세포 특이적 반응으로 제한됨; SJL/J 균주에서 특정 유전자와 경로를 연구하는 것은 어려운 일입니다. | ||
| 모그35-55장 | C57BL/631 | 1차 진행성 EAE; 만성 진행성 EAE | 축삭 손상 메커니즘의 연구; 형질전환 및 녹아웃 모델의 분자 질병 메커니즘 연구 | 1차 탈수초화 및 미엘린 재생 연구는 가치가 제한적입니다. | ||
| 척수 균질 액 | 비오지 ABH36 | 재발 완화 EAE | MS에 대한 미엘린 재생 및 신경 보호 요법 연구 | 임상 적으로 진행되지 않으며 시간이 지남에 따라 신경 학적 결손이 축적됩니다. CD4 T 세포 특이적 반응으로 제한됨 | ||
| 테일러 쥐 뇌척수염 바이러스 | SJL/J, SWR, PL/J12,31을 포함한 여러 종류의 마우스가 매우 민감합니다. | 염증성 탈수초화의 바이러스 모델 | 축삭 손상 및 염증 유발 탈수초화 연구 | MS 특이 적 바이러스 감염은 확인되지 않았습니다. 미엘린 재생은 평가하기 어렵고, 탈수초화와 미엘린 재생이 동시에 발생합니다. | ||
| 큐프리존 | C57BL/6 마우스에서 널리 사용되는 반면 CD1 균주와 같은 다른 균주는 구리 큐프리존으로 인한 손상에 덜 민감합니다.37,38 | 탈수초화 및 재수초화의 독성 모델 | T 세포 비의존적 탈수초화, 특히 미엘린 재생 및 기본 미엘린 복구 과정에 대한 연구 | 중요한 자발적인 myelin 재생은 독성 손상의 중단 후에 발생합니다. 탈수초화는 뇌 영역에 따라 다르며 척수 탈수초화를 연구하는 데 유용하지 않습니다. | ||
| 리소레시틴 | SJL/J12, C57BL/639 등 | 탈수초화 및 재수초화의 독성 모델 | T 세포 비의존적 탈수초화, 특히 미엘린 재생 및 기본 미엘린 복구 과정에 대한 연구 | MS 동안 관찰 된 면역 반응 부족 | ||
| 에티듐 브로마이드 | C57BL/640 등 | 탈수초화 및 재수초화의 독성 모델 | 국소 탈수초성 병변 연구 및 탈수초화 및 미엘린 재생의 동역학 예측 | 에티듐 브로마이드는 세포를 포함하는 모든 핵소체를 손상시킵니다. MS와의 제한된 상관 관계 | ||
표 2: MS의 다양한 마우스 모델.
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Discussion
MS는 CNS의 탈수초성 염증성 질환이며 젊은 사람들에게 만성 장애를 유발하는 가장 흔한 신경 질환 중 하나이며가족과 사회에 큰 부담을 줍니다3,4. MS는 항상 기관-특이적 T 세포-매개 자가면역 질환으로 분류되어, 자가면역계가 CNS를 천천히 침식하도록 유도하며, 이는 몸 전체에 걸쳐 다수의 시스템을 수반할 것이다27. 전형적인 임상 증상으로는 시각 장애, 운동 장애,인지 및 정서적 장애 등이 있습니다 6,7. MS는 적절하게 치료하지 않으면 점진적으로 악화되어 심각한 실명과 마비로 이어지는 치명적인 질병입니다28. MS의 발병 기전은 임상 증상과 병리학 적 진행이 이질적이기 때문에 아직 완전히 이해되지 않았으므로 동물 모델은 MS 치료의 연구 및 개발에 필수적입니다.
MS에 대해 가장 빈번하게 연구된 동물 모델은 EAE이며, 이는 주로 능동 면역화 및 수동 면역화의 두 가지 모델링 방법을 갖는다29. 전자는 단순성, 마우스 조사 부족 및 짧은 사이클 시간 때문에 널리 채택됩니다. EAE 활성 면역 모델은 설치류를 자가-미엘린 항원 또는 그의 후속 펩티드로 면역화시킴으로써 CNS에서 자가면역 반응을 유도하며, 일반적으로 꼬리 약화 및 사지 마비로 나타난다13. 구체적으로, C57BL/6J 마우스에서 MOG 35-55에 의해 유도된 EAE 모델은 CNS 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 동반하는 교대 완화-재발 주기를 특징으로 하며, 이는 MOG35-55-유도된 EAE를 바람직한 모델 11,12로 만든다. EAE는 MOG 35-55 펩티드의 피하 주사에 의해 감작되고, MTB가 풍부한 면역 강화제 CFA로 유화되고,0-2 일30 일에 혈액 뇌 장벽 교란 효과가있는 PTX의 복강 내 주사가 주어진 마우스에서 잘 유도 될 수있다. EAE 모델의 가장 큰 과제는 약한 증상의 발생률이 낮다는 것이며 몇 가지 영향 요인이 실험 과정에 중요합니다. (1) 마우스의 연령 및 환경은 EAE에 대한 감수성에 영향을 미칠 것이다. 따라서 실험 전에 같은 나이의 마우스를 선택해야합니다. 케이지 할당 전에 마우스에 가중치를 부여하고 무작위로 그룹화해야하며 각 그룹의 무게를 가깝게 유지해야합니다. 또한 독립적 인 실험 간의 환경 조건이 비슷한지 확인하십시오. (2) PTX의 농도 : PTX의 주요 역할은 혈액 뇌 장벽의 투과성을 증가시켜 병원성 T 세포가 CNS로 들어가 관련 사이토 카인을 분비하고 염증 반응을 촉진하여 궁극적으로 신경 축삭의 바깥층에 싸인 미엘린 단백질의 가수 분해를 유도하는 것입니다. EAE 마우스에서 질병의 발병은 PTX 투여 농도가 감소함에 따라 지연되었고, PTX가 60 % 이상 감소하면 질병의 중증도가 약화 될 것이다. (3) MOG 35-55 항원의 용해: 동결 및 해동을 방지하기 위해 동결 건조된 MOG35-55 항원을 동결 및 해동을 방지하기 위해 별도의 패키지, 4mg/튜브로 조달하는 것이 좋습니다. 또한 PTX를 사용하여 CFA로 유화하는 것이 더 좋기 때문에 PTX는 멸균수 대신 용해에 사용됩니다. (4) MOG35-55 항원과 CFA는 진동에 의해 충분히 유화되어야 유중수 구조를 형성할 수 있으며, 에멀젼 방울이 장시간 수면에 분산되지 않아 유화가 양호함을 나타냅니다. (5) 2점 주입을 마우스 EAE 모델링에 사용하였다. 주사 부위는 바람직하게는 허리 위와 목 아래, 척추에 가깝게 위치하여 마우스가 피부를 핥고 물어뜯는 것을 방지하여 MOG35-55 에멀젼이 유출되는 것을 방지합니다.
그러나, MOG35-55 항원에 의해 유도된 EAE 모델은 여전히 몇 가지 한계를 갖는다. CD4 T 세포에 의해 매개되는 원발성 축삭 손상의 염증성 뇌병증 모델로서, 주요 병변은 MS 병리학31,32,33과 상이한 2차 탈수초화 및 덜 1차 탈수초화를 갖는 대규모 축삭 변성이다. MOG35-55에 의해 유도된 EAE 모델은 주로 CD4 T 세포에 의해 구동되는 면역 반응을 반영하는 반면, CD8 T 및 B 세포와 같은 다른 면역 세포는 이 모델31에 강한 참여감을 갖지 않는다. 또 다른 제한 인자는 MOG35-55에 의해 유도된 EAE가 MS 병태생리학의 면역학적 성분에 대해 특정 편향을 가지며, 표 2에 기재된 바와 같이, 탈수초화 및 미엘린 재생 과정 34,35,36,37,38,39,40의 연구와 같은 CNS 병리에 초점을 맞춘 연구를 고려할 때 다른 동물 모델이 고려될 수 있다는 것이다. .
EAE는 MS의자가 면역 특성과 염증 및 탈수 초화 메커니즘12을 모방하는 효과적인 예측 인자이며, 이로 인해 많은 학자들이 MS의 다른 임상 증상을 무시하고 면역 조절 메커니즘을 연구하고 싶어합니다. 연구에 따르면 MS 관련 불안은 면역 조절 장애 및 뇌 염증과 같은 병태 생리 학적 과정에 기인합니다22, 23,41. 불안과 같은 정신 건강 문제는 MS 환자에게 특히 흔하며 불안 장애는 기본적인 일상 업무 수행을 방해하고 삶의 질에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다42,43. EAE 마우스의 운동 능력의 변화는 신경 과정의 변화를 예측할 수 있습니다. 오픈 필드 실험에서, 불안과 유사한 행동은 EAE 마우스에서 발생했으며,질병의 조기 발병을 시작한 탐색 적 행동의 감소 (본질적으로 임상 점수 <0.5 및 정상 마우스와 거의 같은 운동 능력을 가진 피험자)는 불안과 유사한 행동의 발병이 운동 장애보다 선행한다는 것을 시사합니다. 또한, 관해 기간의 EAE 마우스는 증가 된 운동 능력으로 불안과 같은 행동을 개선하지 않았다. 염증 반응의 출현은 신경 활동을 통한 EAE 마우스의 정신 손상을 담당 할 수 있으며, 기분의 변화를 유도하고, 염증성 사이토 카인 수준의 상향 조절은 운동 장애가 발병하기 전에 선조체 시냅스 기능을 방해한다23,41. 그러나 오픈 필드 테스트는 테스트 룸이 조용한 영역이어야한다는 사실에주의를 기울여야하며 테스트 마우스는 새로운 환경으로 인한 과도한 압력을 피하기 위해 사전에 1 시간 동안 방에 순응해야합니다. 마지막 피험자가 남긴 냄새 및 기타 물질을 제거하기 위해 테스트 사이에 에탄올로 추가 세척이 필요합니다. 오픈 필드 테스트의 주요 한계는 EAE 마우스의 운동 기능 장애로 인한 간섭이며, 설치류 불안 유사 행동을 평가하기위한 테스트는 반응 챔버에서 설치류 활동의 거리, 시간 및 범위를 기반으로하며 운동 기능 장애가 불안과 같은 행동에 미치는 영향을 배제 할 수 없습니다. 따라서 향후 연구에서는 운동 장애를 고려해야합니다.
뼈 조직 관련 연구를 분석하는 전통적인 방법은 종종 2차원 뼈 단면 현미경을 사용하는데, 이는 2차원 평면의 영향과 생물학적 표본의 비균질성으로 인해 구조적 형태, 밀도 분포, 방향 분포 및 기타 특성을 분석하는 데 더 큰 어려움을 겪을 수 있습니다. 많은 연구에서 뼈 형태를 설명하는 Micro-CT 시스템의 정확성과 효과를 확인했으며많은 연구 44,45,46에서 미세 구조 검출 결과를 확인했습니다. Micro-CT에 의한 뼈 조직의 3차원 이미징은 보다 직관적이고 정확한 골 조직형태 측정 결과를 가능하게 합니다. 동물을 실행하거나 조직 표본을 손상시키지 않고 작은 동물 및 표본을 스캔하는 것이 달성되어, 조직(44) 내부의 상세한 3차원 공간 구조 정보를 허용한다. 연구에 따르면 MS 환자는 골량 손실과 골다공증에 걸리기 쉽습니다24,25; Micro-CT 시스템으로 EAE 마우스의 대퇴골을 주사하고 이미징함으로써, 골다공증이 발생한 WT 마우스에 비해 EAE 마우스의 대퇴골에서 뼈 미세 구조의 명백한 악화 및 감소 된 골 강도가 관찰 될 수 있었다. Micro-CT 분석은 수행이 비교적 간단하고 상대적으로 저렴하며 Micro-CT 라이브 이미징은 EAE 마우스에 치료를 투여할 때 향후 뼈 건강을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 단점은 EAE 마우스47에서 골 대사 항상성의 근본적인 변화를 관찰하기 위해 혈액 샘플 또는 골 조직형태측정을 통해 평가된 골 회전율 마커가 없다는 것이다. 조골 세포와 파골 세포의 조절은 향후 연구에서 고려 될 수 있습니다.
MS는 여러 증상의 질병이며 질병 관리의 유일한 목표는 질병 증상을 최소화하는 것입니다. 상기 언급된 프로토콜에서, MS의 임상 증상은 MOG35-55 유도 EAE 모델을 구축함으로써 시뮬레이션될 수 있다. EAE 마우스는 운동 기능 장애 및 불안-유사 행동, 및 골다공증의 임상 증상을 보였다. 이 프로토콜에 기재된 5-포인트 스코어링 시스템, 오픈 필드 테스트, 및 Micro-CT 분석은 다수의 관점에서 EAE 마우스의 병리학적 증상을 모니터링할 수 있고, EAE의 치료를 위한 참조 스킴을 제공할 수 있다. 효과적인 질병 조절 약물이 없는 경우, 상승 요법의 잠재적인 조합은 증상을 완화하고 기능을 개선할 수 있는 최상의 기회를 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 중국 국립 자연 과학 재단 (32070768, 31871404, 31900658, 32270754)과 국가 약물 연구 핵심 연구소의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
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