Summary
De in vitro reactivering van beweeglijke cellen is een cruciaal experiment in het begrijpen van de mechanismen van celmotiliteit. Het protocol beschrijft het reactiveren van de gedemembraneerde celmodellen van Chlamydomonas reinhardtii, een modelorganisme om trilharen/flagellen te bestuderen.
Abstract
Sinds het historische experiment over de samentrekking van geglycerineerde spieren door toevoeging van ATP, dat Szent-Györgyi in het midden van de 20e eeuw aantoonde, is in vitro reactivering van gedemembraneerde cellen een traditionele en krachtige manier om de beweeglijkheid van cellen te onderzoeken. Het fundamentele voordeel van deze experimentele methode is dat de samenstelling van de reactiveringsoplossing gemakkelijk kan worden gewijzigd. Een omgeving met een hoge Ca2+ concentratie die slechts tijdelijk optreedt als gevolg van membraanexcitatie in vivo , kan bijvoorbeeld in het laboratorium worden gerepliceerd. Eukaryote trilharen (ook bekend als flagella) zijn uitgebreide motiliteitsmachines waarvan de regulerende mechanismen nog moeten worden opgehelderd. De eencellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii is een uitstekend modelorganisme op het gebied van trilharen. De reactiveringsexperimenten met behulp van gedemembraneerde celmodellen van C. reinhardtii en hun derivaten, zoals gedemembraneerde axonemen van geïsoleerde trilharen, hebben aanzienlijk bijgedragen aan het begrijpen van de moleculaire mechanismen van ciliaire motiliteit. Die experimenten verduidelijkten dat ATP ciliaire motiliteit stimuleert en dat verschillende cellulaire signalen, waaronder Ca2 +, cAMP en reactieve zuurstofsoorten, ciliaire bewegingen moduleren. De precieze methode voor demembranatie van C. reinhardtii-cellen en reactivering van de celmodellen wordt hier beschreven.
Introduction
De in vitro reactivering van gedemembraneerde beweeglijke cellen is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de moleculaire basis voor het regulerende mechanisme van celmotiliteit. Szent-Györgyi toonde voor het eerst in vitro contractie van konijnenskeletspiervezels geëxtraheerd met 50% glycerol door toevoeging van adenosinetrifosfaat (ATP)1. Dit experiment was het eerste dat bewees dat ATP spiercontractie stimuleert. De methodologie werd al snel toegepast op de studie van ATP-bekrachtigde ciliaire / flagellaire motiliteit, zoals sperma flagella2, Paramecium cilia3 en Chlamydomonas reinhardtii cilia (ook wel flagella genoemd)4 met behulp van niet-ionische detergentia voor demembranatie.
De eencellige groene alg C. reinhardtii is een modelorganisme voor het bestuderen van trilharen: hij zwemt met twee trilharen door ze te slaan als een menselijke schoolslag5. Ciliaire beweging wordt aangedreven door dyneïne, een minus-end gericht motoreiwit op basis van microtubuli 6,7. Ciliaire dyneinen kunnen worden ingedeeld in dyneinen met de buitenarm en dyneinen met de binnenarm. Mutanten zonder elke soort dyneïne zijn geïsoleerd als langzaam zwemmende mutanten met verschillende motiliteitsafwijkingen. Gedetailleerde in vitro motiliteitsanalyse van deze mutanten heeft het dyneïneonderzoek aanzienlijk verbeterd8.
Veel belangrijke bevindingen zijn bereikt met behulp van deze methode en zijn derivaten sinds het in vitro reactiveringsexperiment van gedemembraneerde C. reinhardtii-cellen (celmodellen) werd vastgesteld. Reactivering van celmodellen in een reeks Ca2+ buffers toonde bijvoorbeeldaan 9 dat twee trilharen verschillend worden gereguleerd door submicromolair Ca2+, en deze asymmetrische trilharencontrole maakt de fototactische oriëntatie van C. reinhardtii10 mogelijk. Bovendien vertonen beide trilharen golfvormconversie van de voorwaartse zwemmodus (asymmetrische golfvorm genoemd) naar de achterwaartse zwemmodus (symmetrische golfvorm genoemd die gedurende een korte periode verschijnt wanneer cellen foto- of mechano-shocked zijn)11,12. Deze golfvormconversie wordt geregeld door submillimolar Ca2+, wat werd aangetoond door de reactivering van het zogenaamde nucleoflagellar-apparaat (een complex met twee trilharen, de basale lichamen, de structuren die de basale lichamen met de kern verbinden en het overblijfsel van de kern)11 of gedemembraneerde axonemen van geïsoleerde trilharen13. Anders dan Ca2 +, redox (reductie-oxidatie) evenwicht is een signaal dat de ciliaire kloppende frequentie reguleert, wat werd aangetoond door reactivering van celmodellen in redoxbuffers met verschillende verhoudingen van verminderde glutathion versus geoxideerde glutathion14. Bovendien reguleert cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) asymmetrisch twee trilharen, wat werd aangetoond door de reactivering van axonemen met fotocleavable gekooide cAMP15. Deze in vitro bevindingen, gecombineerd met genetische bevindingen, hebben geleid tot een dieper begrip van de moleculaire mechanismen van trilharenregulatie in C. reinhardtii.
Een protocol voor het reactiveren van de celmodellen wordt hier beschreven. De methode is eenvoudig, maakt verschillende modificaties mogelijk en kan worden toegepast op meerdere organismen die met trilharen bewegen. Omdat gedemembraneerde cellen echter kwetsbaar zijn, zijn er enkele tips nodig om de beweeglijkheid van celmodellen met een goede efficiëntie te reactiveren en tegelijkertijd deciliatie te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een wild-type stam van Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, werd gebruikt voor de huidige studie. CC-125 werd verkregen van Chlamydomonas Resource Center (zie Tabel van materialen) en onderhouden op een Tris-acetaat-fosfaat (TAP)16, 1,5% agarose medium bij 20-25 °C.
1. Celkweek
- Cultuur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) in TAP medium16 in een licht-donker periode van 12 h/12 h (lichtomstandigheden voor de lichtperiode: ~50 μmol fotonen m−2 s−1 wit licht) bij 20-25 °C gedurende 2 dagen (figuur 1).
OPMERKING: De cellen moeten zich in een mid-logaritmische groeifase bevinden (film 1). Lange kweek (>4 dagen, in de laat-logaritmische groei of stationaire fase) vermindert de reactiveringsefficiëntie van gedemembraneerde celmodellen.
Figuur 1: Vloeibare cultuur na 2-daagse kweek. Van een TAP-1,5% agarplaat werd een stuk wild-type cellen om de platinalus te vullen ingeënt tot ~ 150 ml TAP vloeibaar medium in een kolf. De celdichtheid na 2-daagse kweek was 2,3 × 106 cellen/ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Zwemmen van levende cellen. Cellen werden geobserveerd onder een microscoop met een 10x objectieflens en een olie-onderdompeling dark-field condensor. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
2. Voorbereiding van gedemembraneerde celmodellen
OPMERKING: Voordat u met het experiment begint, moet u de wasbuffer op kamertemperatuur houden en de demembranatie, verdunning, reactiveringsbuffers en de ATP-oplossing op ijs houden. De samenstelling van deze buffers is weergegeven in aanvullende tabel 1.
- Centrifugeer ~10 ml vloeistofkweek bij 1000 × g bij 20 °C gedurende 3 minuten.
OPMERKING: Gebruik in het hele protocol van deze stap geen geautoclaveerd plastic materiaal (buizen, pipetpunten, enz.), Waardoor de reactiveringsefficiëntie afneemt. Voor conische buizen hebben hergebruikte buizen de voorkeur. De celdichtheid na 2-daagse kweek kan typisch 1,0-5,0 × 106 cellen / ml zijn. Wanneer de celdichtheid lager is dan dit, neem dan voldoende kweekvolume om ~ 5 × 107 cellen te bevatten. - Gooi het supernatant weg, eerst door decantatie en vervolgens door een Pasteur-pipet, en resuspend de neerslag in ~ 5 ml wasbuffer.
- Centrifugeer cellen in de wasbuffer bij 1000 × g gedurende 3 min bij 20 °C.
- Gooi het bovennatuurlijke middel voorzichtig weg met een pipet (figuur 2).
OPMERKING: Pasteur pipetten hebben de voorkeur. Vermijd bij het gebruik van micropipettes het gebruik van pipetpunten die zijn geautoclaveerd. - Leg ~0,5 ml demembranatiebuffer op een celkorrel, schud de buis voorzichtig met de hand om de cellen ruwweg in de buffer te laten zweven en zet de buis op ijs (figuur 3A).
OPMERKING: Het is op dit moment niet nodig om de pellet volledig te schorsen. Verhoog de concentratie van MgSO4 tot 15 mM in de demembranatie- en reactiveringsbuffers wanneer celmodellen worden gereactiveerd, met een uiteindelijke ATP-concentratie >1 mM voor stabiele reactivering17. - Hang de resterende celkorrel voorzichtig op met een pipet en plaats de buis opnieuw op ijs (figuur 3B).
- Neem 5-10 μL van de celmodellen, verdun 10-voudig met de verdunningsbuffer en observeer onder de microscoop (film 2) om te bevestigen dat alle celmodellen gedemembraneerd zijn en niet zwemmen (figuur 4).
OPMERKING: Als sommige cellen nog zwemmen (levend), voeg dan het niet-ionische reinigingsmiddel dat wordt gebruikt in de demembranatiebuffer rechtstreeks toe aan de celmodeloplossing tot de uiteindelijke concentratie van ~ 0,15%. U kunt ook stap 2.1-2.5 herhalen met de demembranatieoplossing die 0,15% wasmiddel bevat.
Figuur 2: Het weggooien van het supernatant. De rest van het supernatant werd zorgvuldig verwijderd met een Pasteur-pipet nadat het supernatant was verwijderd door decantatie van de buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Demembranatie. (A) Na het overlayen van 0,5 ml demembranatieoplossing op de celkorrel, werd de oplossing met de hand gemengd om de cellen ruwweg op te hangen. (B) Na het mengen werd de rest van de celkorrel volledig in de oplossing gesuspendeerd door een Pasteur pipet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van demembranatie. (A) Een levende cel die vastzit op een glazen dia. (B) Een celmodel dat op een glasplaat is geplakt. Merk op dat in het celmodel de trilharen iets dunner werden. De beelden werden waargenomen onder een microscoop met een 20x objectieflens en een olie-immersie dark-field condensor. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 2: Bevestiging van demembranatie. Celmodel suspensie werd waargenomen onder een microscoop met een 10x objectief lens en een olie-onderdompeling donkerveld condensor. Er zwom geen cel. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
3. Reactivering van gedemembraneerde celmodellen
- Meng 80 μL reactiveringsoplossing, 10 μL ATP-oplossing en 10 μL celmodellen in een buis van 0,5 ml door op de buis te tikken (figuur 5).
OPMERKING: De uiteindelijke ATP-concentratie moet <3 mM zijn omdat de ciliaire slagfrequentie, een parameter voor ciliaire beweging, toeneemt met de ATP-concentratie en verzadigd raakt bij 2-3 mM van ATP17.
LET OP: Mengen door pipetteren of vortexen veroorzaakt deciliatie en vermindert de reactiveringsefficiëntie.- Voeg voor reactivering met <0,2 mM ATP een ATP-regeneratiesysteem toe, zoals 70 E/ml creatinekinase en 5 mM creatinefosfaat (zie Materialentabel).
OPMERKING: De reactiveringsoplossing wordt bereid in een hogere concentratie (1,125x, aanvullende tabel 1) dan de verdunningsoplossing, zodat na het mengen van de in water opgeloste ATP de volgende eindconcentraties bereiken: 30 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM MgSO4, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM EGTA en 50 mM kaliumacetaat (zie Materiaaltabel).
- Voeg voor reactivering met <0,2 mM ATP een ATP-regeneratiesysteem toe, zoals 70 E/ml creatinekinase en 5 mM creatinefosfaat (zie Materialentabel).
- Plaats ~30 μL van de gemengde oplossing op een glazen dia en plaats er voorzichtig een afdekplaat op met afstandhouders om mechanische schokken voor de celmodellen te voorkomen (figuur 6).
OPMERKING: Witte petroleum of dubbelzijdige tapes kunnen worden gebruikt om de afstandhouders te maken. - Bekijk de gereactiveerde celmodellen onder een microscoop (film 3).
Figuur 5: Mengoplossing door op de buis te tikken. (A) Aan 80 μL van de reactiveringsoplossing werden 10 μL ATP-oplossing en 10 μL celmodellen in opeenvolgende volgorde toegevoegd. (B) De oplossing werd gemengd door met een vinger op de buis te tikken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Afstandhouders maken op de randen van de afdekking. (A) Op de rug van een hand werd een dunne laag witte aardolie aangebracht. (B) Een kleine hoeveelheid witte aardolie werd afgeschraapt met een rand van een dekplaat. (C) Er is een afstandhouder gemaakt op de rand van een afdekplaat. (D) Aan de andere kant van de weg werd een andere afstandhouder gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 3: Zwemmen van gereactiveerde celmodellen. De beweeglijkheid van de celmodellen werd gereactiveerd door ATP toe te voegen bij een eindconcentratie van 1 mM en waargenomen onder een microscoop met een 10x objectieflens en een olie-onderdompeling donkerveldcondensor. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het demembranatie- en reactiveringsproces in de wilde soort C. reinhardtii (CC-125) wordt hier getoond. De kweek 2 dagen na inenting kreeg een lichtgroene kleur (stap 1.1) (figuur 1). Cellen werden verzameld (stap 2.1), gewassen (stap 2.2) en gedemembraneerd (stap 2.5). Na demembranatie werden alle celmodellen immotiel (stap 2.7). De gedemembraneerde trilharen (axonemen genoemd) blijven aan het cellichaam vastzitten, wat aantoont dat de immotiliteit van de celmodellen niet wordt veroorzaakt door deciliatie (figuur 4). Na vermenging met de reactiveringsbuffer en ATP (stap 3.1) werd >50% van de celmodellen beweeglijk (stap 3.2). De reactiveringssnelheid wordt verhoogd door voorzichtig en grondig mengen bij stap 3.1. (% beweeglijke cellen). Zelfs zonder het ATP-regeneratiesysteem (stap 3.1.1) bleven de gereactiveerde cellen gedurende ~ 90 minuten bewegen met de uiteindelijke ATP-concentratie van 1 mM, voordat de beweging geleidelijk werd gestopt.
Aanvullende tabel 1: Samenstelling van de in het onderzoek gebruikte oplossingen en buffers. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee cruciale stappen in dit protocol. De eerste is een proces dat bekend staat als demembranatie, dat voorzichtig maar grondig moet worden uitgevoerd. Deciliatie (d.w.z. het losmaken van trilharen van het cellichaam) wordt geïnduceerd door krachtig pipetteren of vortexen, waardoor de celmodellen onbeweeglijk worden, zelfs na de toevoeging van ATP. Typisch worden 5 × 107 cellen gesuspendeerd in ~ 0,5 ml demembranatiebuffer (uiteindelijke celdichtheid: 1 × 108 cellen / ml). De reactiveringssnelheid van de celmodellen zou afnemen als de celmodeldichtheid veel lager is dan dit (bijv. 1 × 106 cellen / ml). Deze celmodeldichtheidseffecten op reactivering zijn onduidelijk, maar de celextracten bevatten waarschijnlijk de factoren die reactivering helpen. Natuurlijk, hoe hoger de celdichtheid, hoe moeilijker het zal zijn voor grondige demembranatie. Onvoldoende demembranatie kan leiden tot contaminatie van levende cellen met celmodellen. Bewegende cellen zijn in dit geval te zien in stap 2.7. Besmetting van levende cellen zal leiden tot een verkeerde interpretatie van de effecten van ATP of andere componenten (zoals Ca2+) die aan de reactiveringsbuffer zijn toegevoegd. Deze stap vereist vaardigheid.
De tweede cruciale stap is reactivering. Net als bij de demembranatiestap induceert krachtig pipetteren voor het mengen van de oplossing ook deciliatie. Daarom heeft het mengen van oplossingen met tapbuizen de voorkeur. Deze stap vereist ook vaardigheid. Bovendien wordt het gebruik van buizen van 0,5 ml aanbevolen in deze stap wanneer het volume van de oplossing 100 μL is (zoals beschreven in dit protocol).
Zoals vermeld in de inleiding, is een voordeel van dit protocol dat het mogelijk is om de effecten van verschillende biologische signalen in vitro te onderzoeken waarvan de concentraties slechts tijdelijk in vivo verhoogd zijn. Ca2+ kan bijvoorbeeld aan de reactiveringsoplossing worden toegevoegd. Vanwege de chelatie-effecten van EGTA in dit geval, moet de uiteindelijke calciumconcentratie na het mengen van alle oplossingen (stap 3.1) zorgvuldig worden berekend. Voor het berekenen van de eindconcentratie van vrije Ca2+ in een buffer in aanwezigheid van chelaatvormers is het programma CALCON18 geldig. Een voorbeeld van de calciumhoudende reactiveringsbuffer is te zien in een eerdere studie19. Opgemerkt moet worden dat een hoge concentratie van Ca2+ (>10−5 M) deciliatie20 induceert, en daarom moet het effect van Ca2+ op de ciliaire motiliteit worden getest bij lagere concentraties zoals eerder beschreven21.
De methode heeft bepaalde beperkingen. De samenstelling van de reactiveringsbuffer weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de in vivo ionische omstandigheden. Dus als er enig verschil in de ciliaire beweging werd waargenomen tussen de celmodellen en de levende cellen, zou men voorzichtig moeten zijn om te bepalen of dit geen artefact is vanwege de buffersamenstelling. Als we bijvoorbeeld experimenteren met deze klassieke buffersamenstelling, is de ciliaire slagfrequentie lager dan verwacht wanneer de ATP-concentratie >1 mM17 is. Een oplossing voor dit probleem is het verhogen van de Mg2+ concentratie en het toevoegen van adenosinedifosfaat (ADP) samen met ATP; dan neemt de ciliaire slagfrequentie toe zoals verwacht17. Het is dus noodzakelijk om de buffersamenstelling te wijzigen volgens het doel van het experiment.
Het huidige protocol kan worden toegepast op andere algensoorten die met trilharen zwemmen. Zo zou de beweeglijkheid van gedemembraneerde Volvox rousseletii, de meercellige Volvocales groene alg met 5.000-10.000 Chlamydomonas-achtige cellen, gereactiveerd kunnen worden door ATP toe te voegen zoals C. reinhardtii celmodellen22. In dit geval waren verschillende wijzigingen nodig: polyethyleenglycol (PEG) werd weggelaten om de bolvorm van gedemembraneerde V. rousseletii te behouden, en de concentraties van Igepal CA-630 (detergent) werden gewijzigd als gevolg van een gradiënt in de detergentieve gevoeligheid van de voorste pool naar de achterste pool, het hoogst bij de eerste en het laagst bij de laatste. Met aanpassingen werd dit protocol ook toegepast op de kleinste meercellige Volvocales-soort, viercellige Tetrabaena socialis23. Om het huidige experiment met een nieuw organisme uit te proberen, zal optimalisatie nodig zijn door de typen en de concentraties van de componenten in de demembranatie- en reactiveringsbuffers, met name detergentia en PEG, te wijzigen. Afhankelijk van de grootte en morfologie van het organisme, moeten de centrifugatie-instellingen worden afgestemd. Perfusie is ook een optie voor demembranatie in plaats van centrifugatie22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) aan de N.U. (19K23758, 21K06295) en K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), van de Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) aan K.W., en van de Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) aan N.U. en K.W. Wij danken mevrouw Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) voor haar hulp bij het opstellen van de cijfers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Szent-Gyorgyi, A. Free-energy relations and contraction of actomyosin. Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).
- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).
- Sale, W. S., Satir, P. Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).
- Fox, L. A., Sale, W. S. Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules. Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).
- Kamiya, R., Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, Pt 3 529-537 (2005).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Saegusa, Y., Yoshimura, K. cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas. Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).
- bio.chuo-u. , Available from: http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html (2022).
- Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).
- Yueh, Y. G., Crain, R. C. Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry. Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).
- Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation. Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).
- Ueki, N., Wakabayashi, K. Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
