Summary
Gli studi sulla biomeccanica della parete cellulare sono essenziali per comprendere la crescita e la morfogenesi delle piante. Il seguente protocollo è proposto per studiare le pareti cellulari primarie sottili nei tessuti interni di giovani organi vegetali utilizzando la microscopia a forza atomica.
Abstract
Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e, quindi, le dimensioni e la forma future della pianta. Molte tecniche sofisticate sono state sviluppate per misurare queste proprietà; tuttavia, la microscopia a forza atomica (AFM) rimane la più conveniente per studiare l'elasticità della parete cellulare a livello cellulare. Uno dei limiti più importanti di questa tecnica è stato che solo le cellule viventi superficiali o isolate possono essere studiate. Qui viene presentato l'uso della microscopia a forza atomica per studiare le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie appartenenti ai tessuti interni di un corpo vegetale. Questo protocollo descrive le misurazioni dell'apparente modulo di Young delle pareti cellulari nelle radici, ma il metodo può essere applicato anche ad altri organi vegetali. Le misure vengono eseguite su sezioni derivate dal vibratomo di materiale vegetale in una cella liquida, il che consente (i) di evitare l'uso di soluzioni plasmolizzanti o l'impregnazione del campione con cera o resina, (ii) di rendere gli esperimenti veloci e (iii) di prevenire la disidratazione del campione. Sia le pareti cellulari anticlinale che periclinale possono essere studiate, a seconda di come il campione è stato sezionato. Le differenze nelle proprietà meccaniche dei diversi tessuti possono essere studiate in una singola sezione. Il protocollo descrive i principi della pianificazione dello studio, i problemi con la preparazione e le misurazioni dei campioni, nonché il metodo di selezione delle curve di forza-deformazione per evitare l'influenza della topografia sui valori ottenuti del modulo elastico. Il metodo non è limitato dalla dimensione del campione, ma è sensibile alle dimensioni delle celle (cioè, le cellule con un grande lume sono difficili da esaminare).
Introduction
Le proprietà meccaniche della parete cellulare della pianta determinano la forma della cellula e la sua capacità di crescere. Ad esempio, la punta crescente del tubo pollinico è più morbida delle parti non in crescita dello stesso tubo1. La formazione dei primordi sul meristema di Arabidopsis è preceduta da una diminuzione locale della rigidità della parete cellulare nel sito del futuro primordio 2,3. Le pareti cellulari di Arabidopsis hypocotyl, che sono parallele all'asse di crescita principale e crescono più velocemente, sono più morbide di quelle che sono perpendicolari a questo asse e crescono più lentamente 4,5. Nella radice di mais, la transizione delle cellule dalla divisione all'allungamento è stata accompagnata da una diminuzione dei moduli elastici in tutti i tessuti della radice. I moduli sono rimasti bassi nella zona di allungamento e sono aumentati nella zona di allungamento tardivo6.
Nonostante la disponibilità di vari metodi, le grandi matrici di informazioni biochimiche e genetiche sulla biologia della parete cellulare ottenute annualmente sono raramente confrontate con le proprietà meccaniche delle pareti cellulari. Ad esempio, i mutanti sui geni correlati alla parete cellulare hanno spesso una crescita e uno sviluppo alterati 4,7,8, ma sono raramente descritti in termini di biomeccanica. Una delle ragioni di ciò è la difficoltà di condurre misurazioni a livello cellulare e subcellulare. La microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente l'approccio principale per tali analisi9.
Negli ultimi anni sono stati condotti numerosi studi basati sull'AFM sulla biomeccanica della parete cellulare vegetale. Sono state studiate le proprietà meccaniche delle pareti cellulari dei tessuti esterni di Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 e cipolla 12, nonché delle cellule in coltura 13,14,15. Tuttavia, le cellule superficiali di una pianta possono avere pareti cellulari le cui proprietà meccaniche differiscono da quelle dei tessuti interni6. Inoltre, le cellule vegetali sono pressurizzate dal turgore che le rende più rigide. Per eliminare l'influenza della pressione del turgore, i ricercatori devono utilizzare soluzioni plasmolizzanti 2,3,4,5,10,11 o decomporre i valori ottenuti in turgore e contributi della parete cellulare 12. Il primo approccio porta alla disidratazione del campione e modifica lo spessore e le proprietà della parete cellulare16, mentre il secondo approccio richiede ulteriori misurazioni e matematica complicata e si applica solo a cellule di forma relativamente semplice12. Le proprietà della parete cellulare dei tessuti interni possono essere valutate su criosezioni17 o sezioni di materiale vegetale impregnato di resina8. Tuttavia, entrambi i metodi comportano la disidratazione e / o l'impregnazione dei campioni, che porta inevitabilmente a cambiamenti nelle proprietà. Le proprietà delle cellule isolate o in coltura sono difficili da mettere in relazione con la fisiologia dell'intera pianta. Sia la coltivazione che l'isolamento delle cellule vegetali possono influenzare le proprietà meccaniche delle loro pareti cellulari.
Il metodo qui presentato integra gli approcci sopra menzionati. Usandolo, è possibile esaminare le pareti cellulari primarie di qualsiasi tessuto e in qualsiasi fase dello sviluppo delle piante. Le osservazioni di sezionamento e AFM sono state eseguite in liquido che evita la disidratazione del campione. Il problema del turgore è stato risolto quando le cellule vengono tagliate. Il protocollo descrive il lavoro con le radici di mais e segale, ma qualsiasi altro campione può essere esaminato se è adatto per il sezionamento del vibratomo.
Gli studi AFM qui descritti sono stati eseguiti utilizzando la tecnica forza-volume. Strumenti diversi usano nomi diversi per questo metodo. Tuttavia, il principio di base è lo stesso; Una mappa forza-volume del campione è ottenuta da un movimento sinusoidale o triangolare del cantilever (o campione) per ottenere una certa forza di carico in ogni punto analizzato, registrando la deflessione a sbalzo18. Il risultato combina un'immagine topografica della superficie e la serie di curve forza-distanza. Ogni curva viene utilizzata per calcolare la deformazione, la rigidità, il modulo di Young, l'adesione e la dissipazione di energia in un punto specifico. Dati simili possono essere ottenuti mediante spettroscopia di forza punto per punto dopo la scansione in modalità di contatto19, sebbene richieda più tempo.
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Protocol
1. Preparazione del campione per le misurazioni AFM
- Materiale vegetale: Sterilizzare i semi di mais (Zea mays L.) e segale (Secale cereale L.) con una soluzione di NaOCl allo 0,35% per 10 minuti, lavare 3 volte con acqua distillata e quindi crescere idroponicamente al buio a 27 °C per 4 giorni e 2 giorni, rispettivamente. Per l'esperimento sono state utilizzate radici primarie.
- Preparazione di soluzioni e campioni per il sezionamento di vibratome
- Preparare la soluzione di agarosio per l'incorporazione delle radici sciogliendo il 3% (p / p) di agarosio a basso punto di fusione in acqua usando un forno a microonde.
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in acqua. Se per lo studio è necessario un tampone o qualsiasi altro tipo di mezzo, è meglio utilizzare lo stesso mezzo per la preparazione dell'agarosio, durante il sezionamento e nella cella liquida dell'AFM per evitare di danneggiare il campione. - Versare uno strato di 4 mm di agarosio fuso al 3% sul fondo della capsula di Petri (diametro = 35 mm) e lasciarlo raffreddare leggermente per evitare danni termici al campione.
- Posizionare orizzontalmente sull'agarosio tre o quattro piccoli pezzi (lunghi circa 5 mm) dell'organo vegetale studiato orizzontalmente sull'agarosio.
NOTA: I campioni devono essere immersi per metà ma non immersi nello strato di agarosio. Se il campione non è immerso, potrebbe fuoriuscire dall'agarosio durante il sezionamento del vibratomo. Se il campione affonda sul fondo, sarà troppo vicino al bordo della sezione e diventerà scomodo per ulteriori passaggi. - Quando un film sottile e semi-solido appare sopra il primo strato di agarosio (30-60 s), versare con attenzione un secondo strato sopra.
NOTA: Lo strato inferiore di agarosio non deve solidificarsi completamente. In caso contrario, i due strati potrebbero separarsi l'uno dall'altro durante ulteriori lavori. - Dopo che l'agarosio è completamente solidificato, ritagliare il blocco contenente il campione. Modellare il blocco in una piramide tronca esagonale per garantirne la stabilità durante un'ulteriore sezione (Figura 1A).
NOTA: il campione può essere orientato verticalmente o orizzontalmente all'interno di questo blocco a seconda del tipo di sezione richiesta. Quando si prepara il blocco, lasciare 2-3 mm di agarosio attorno al campione. In questo caso, la sezione del campione sarà trattenuta dallo strato di agarosio al 3%, che faciliterà la sua ulteriore immobilizzazione (Figura 1B).
- Preparare la soluzione di agarosio per l'incorporazione delle radici sciogliendo il 3% (p / p) di agarosio a basso punto di fusione in acqua usando un forno a microonde.
- Sezionamento del campione con la vibratoma
- Incollare il blocco allo stadio vibratomo con adesivo cianoacrilato. Posiziona il palco nella vibratoma in modo che uno degli angoli della piramide sia rivolto verso la lama del vibratomo. Versare acqua nel bagno vibratomo.
- Impostate i parametri di sezionamento (spessore della sezione, velocità della lama e frequenza di vibrazione) e tagliate il campione.
NOTA: Utilizzare gli spessori di sezione compresi tra 200 e 400 μm. Una sezione troppo sottile può introdurre errori nella valutazione delle proprietà meccaniche, mentre una sezione troppo spessa è soggetta a rotture. Per le radici di segale e di mais sono state utilizzate una velocità della lama di 1,3 mm·s-1 e una frequenza di oscillazione di 90 Hz. - Usando un pennello sottile, spostare la sezione dal bagnomaria su un vetrino e posizionare una goccia d'acqua sulla sezione per evitare che si secchi. Controllare la qualità della sezione al microscopio ottico.
NOTA: le sezioni oblique non possono essere utilizzate per misurare il modulo di elasticità. Le pareti cellulari devono essere perpendicolari al piano della sezione, altrimenti potrebbero piegarsi o piegarsi sotto la punta AFM.
- Immobilizzazione della sezione per le misure AFM (Figura 1B)
- Versare uno strato di agarosio fuso all'1% (p/p) (~1 ml) sul fondo del cappuccio della piastra di Petri usando una pipetta.
NOTA: Assicurarsi che i lati del cappuccio della capsula di Petri non impediscano alla punta di avvicinarsi al campione. Lo strato di agarosio dovrebbe avere uno spessore di 1 mm e dovrebbe coprire l'intero fondo del cappuccio. - Dopo che l'agarosio all'1% si è solidificato, rimuovere l'acqua in eccesso dalla sezione portando la carta da filtro sul bordo.
NOTA: Non toccare la sezione della pianta con la carta per evitare danni e completa asciugatura del campione. - Trasferire con attenzione la sezione dal vetrino al centro del cappuccio della piastra di Petri usando un pennello. Utilizzando una pipetta da 20 μL, aggiungere con cautela l'1% di agarosio attorno alla sezione (Figura 1B).
NOTA: L'agarosio all'1% non deve salire sul campione stesso. Dovrebbe coprire solo i bordi dello strato di agarosio al 3% che trattiene l'esemplare vegetale. L'agarosio all'1% dovrebbe formare piccole collinette sui bordi di questo strato di agarosio al 3%. Grandi collinette possono impedire al cantilever di avvicinarsi al campione. - Versare l'acqua o altra soluzione da utilizzare per l'AFM nel tappo della capsula di Petri con la sezione immobilizzata.
- Versare uno strato di agarosio fuso all'1% (p/p) (~1 ml) sul fondo del cappuccio della piastra di Petri usando una pipetta.
2. Preparazione e calibrazione AFM
NOTA: Il metodo forza-volume di AFM genera una matrice spazialmente risolta di curve forza-distanza ottenute in ciascun punto dell'area studiata. Ottenere tutti i parametri per la modalità forza-volume (rigidità a sbalzo, IOS, ecc.) in modalità contatto. Procedure simili per strumenti di altri produttori sono state descritte in precedenza10,20.
- Selezionare il tipo appropriato di cantilever .
NOTA: La rigidità a sbalzo deve essere paragonabile alla rigidità del campione21. Un cantilever molto più rigido del campione non devierà molto, mentre un cantilever troppo morbido non deformerà abbastanza il campione. Una frequenza di risonanza tipica dovrebbe essere sufficiente per far oscillare il cantilever nel liquido (cioè, essere almeno alcune decine di kHz). L'area di contatto dovrebbe essere piccola rispetto alla dimensione della parete cellulare poiché il campione in studio nei calcoli del modulo di Young è assunto come un semispazio infinito. Per le radici di segale e di mais sono stati utilizzati i seguenti cantilever acuti: cantilever taglienti con una frequenza di risonanza tipica di 60 kHz, una costante media della molla di 1,5 N·m-1 e un raggio apicale di 10 nm, o cantilever sferici con una frequenza di risonanza tipica di 75 kHz, una costante media della molla di 2,8 N·m-1, e un raggio apicale di 150 nm. - Accendere il dispositivo AFM e il software associato (Tabella dei materiali). Montare il cantilever sul supporto della punta per la cella liquida. Posizionare una goccia di liquido sulla punta per evitare la formazione di bolle d'aria sulla punta mentre la si immerge nel liquido.
NOTA: In caso di formazione di bolle, il liquido può essere rimosso con una salvietta di precisione e quindi è possibile posizionare una nuova goccia. - Montare il supporto della punta sulla testina di scansione.
- Inserire un campione duro (vetrino fresco) in un tappo a capsula di Petri. Versare il liquido in esso, assicurandosi che copra il vetrino. Posizionare la testina di scansione sul palco e sollevare il campione in modo che il liquido copra il cantilever.
- Scegliere la scheda Teste nel menu a discesa Strumenti . Assicurarsi che la testina di scansione per la cella liquida sia selezionata.
- Fare clic sul pulsante Mira per aprire la finestra Puntamento laser . Fare clic sul pulsante Fotocamera per aprire la finestra Microscopio ottico . Posizionare il laser sulla punta del cantilever, utilizzando le viti sulla testa AFM e la finestra del microscopio ottico per l'orientamento.
- Scegli la modalità Semicontatto dal menu a discesa nella finestra principale del programma.
- Aprire la scheda Risonanza e scegliere il tipo di cantilever utilizzato nel menu Sonde . Fare clic sul pulsante Auto per determinare la frequenza di risonanza.
NOTA: se il cantilever utilizzato non è elencato, aprire Strumenti > Probe Passport. Creare un nuovo file, immettere i parametri a sbalzo e salvarlo. Quindi sceglilo nel menu a discesa Sonda . - Scegli la modalità Contatto dal menu a discesa nella finestra principale del programma.
- Fare clic sul pulsante N_Force Cal per aprire la finestra di calibrazione a sbalzo. Scegliere il cantilever utilizzato e fare clic sul pulsante Sweep , quindi sul pulsante Spect Meas per determinare la costante della molla a sbalzo utilizzando la procedura di regolazione termica. Chiudere la finestra.
- Impostare il setpoint su 1 nA. Apri la scheda Approccio e fai clic sul pulsante Landing per avvicinarti all'esempio.
- Aprire la scheda Scansione . Impostare la frequenza di scansione su 0,5 Hz. Fare clic sul pulsante Area e impostare la dimensione della scansione su 10 μm x 10 μm e il punto di scansione su 256 x 256. Fare clic sul pulsante Esegui e scansionare circa 20 righe per verificare che non vi sia alcuna contaminazione sul vetro. Fare clic sul pulsante Stop per terminare la scansione senza perdere dati.
- Aprire la scheda Curve . Impostare i parametri per la retrazione e l'avvicinamento rispettivamente a 500 nm e -100 nm.
- Scegliere l'ultima scansione nel menu a discesa Selezionare Fotogramma (Frame ) per osservare la superficie.
- Trova un'area pulita sul vetro e indica il punto in cui deve essere presa la curva forza-deformazione, quindi fai clic sul pulsante Esegui per ottenere la curva. Registra da tre a cinque curve di forza in punti diversi della scansione.
- Fate clic sul pulsante Dati (Data ) per aprire la finestra di analisi e selezionare il fotogramma con la curva forza-deformazione.
- Fare clic sul pulsante Marcatori coppia e indicare la parte lineare della curva di retrazione per calcolare il rapporto tra il segnale DFL e lo spostamento, che è la sensibilità ottica inversa (IOS, nA nm-1) o sensibilità di deflessione.
- Ripetere il punto 2.17 per tutte le curve registrate e annotare tutti i valori calcolati del rapporto segnale DFL/spostamento. Dovrebbero essere uguali.
- Chiudere la finestra di analisi, fare clic sulla scheda Approccio (Approach ), quindi sul pulsante Rimuovi per ritrarre la sonda dal campione.
3. Acquisizione dei dati
- Guidare il campione sotto il cantilever AFM utilizzando il microscopio ottico. Fare clic sulla scheda Approccio , quindi sul pulsante Landing per avvicinarsi al campione in modalità contatto con un SetPoint di 1 nA.
- Fare clic sulla scheda Scansione , quindi sul pulsante Area . Selezionare la dimensione dell'area di 70 μm x 70 μm da scansionare.
- Fare clic sul pulsante Move Probe e controllare l'intera area di scansione spostando lo scanner su di esso. In base al grado di protrusione dello scanner, trova il punto più alto.
- Aprire la scheda Approccio , quindi fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dall'esempio. Utilizzando il punto più alto come bersaglio, fare clic sul pulsante Landing per avvicinarsi nuovamente al campione. Quindi, controllare nuovamente la superficie facendo clic sul pulsante Sposta sonda e spostando lo scanner su di essa. Nessuno dei punti nell'area dovrebbe richiedere che lo scanner sia completamente sollevato.
NOTA: idealmente, la gamma z dello scanner dovrebbe superare la differenza di altezza del campione. Tuttavia, è accettabile se alcuni punti dell'area di scansione sono al di sotto della capacità dello scanner. Allo stesso tempo, non dovrebbero esserci molti di questi punti. Grandi aree che non possono essere raggiunte dallo scanner possono causare l'aborto di scansione. - Impostare la frequenza di scansione su 0,5 Hz. Impostare la dimensione della scansione su 70 μm x 70 μm e il punto di scansione su 64 x 64. Fare clic sul pulsante Esegui e scansionare per verificare la superficie del campione e la sua possibile contaminazione con agarosio.
NOTA: se il campione ha celle con un grande lume, la dimensione dell'area di scansione può essere ridotta o deve essere spostata in modo che ci siano più pareti cellulari nella scansione. - Fare clic sul pulsante On nella parte superiore della finestra principale per disattivare il ciclo di feedback.
- Scegli la modalità HDPlus (metodo forza-volume) nel menu a discesa nella finestra principale del programma. Apparirà una finestra aggiuntiva (finestra HD).
- Impostare SetPoint su 0,1 nA nella finestra principale del programma.
- Nella scheda Main della finestra HD, impostare i parametri di scansione (ampiezza e frequenza del movimento sinusoidale a sbalzo) appropriati al campione studiato.
NOTA: Ogni tipo di campione e cantilever richiede la selezione dei parametri di scansione. Sono necessari alcuni esperimenti preliminari. Per le radici di mais o di segale sono stati utilizzati cantilever affilati e sferici a un'ampiezza di 400 nm e una frequenza di 300 Hz. - Apri la scheda Rumori nella finestra HD e inserisci la frequenza di risonanza del cantilever.
- Apri la scheda Quant della finestra HD e inserisci IOS, rigidità a sbalzo, raggio e angolo della punta. Selezionate il modello di contatto che verrà utilizzato per i calcoli in base alla geometria della punta.
NOTA: Il modello DMT tiene conto della forza di adesione esistente tra la sonda e il campione ed è più comunemente usato in meccanobiologia21. - Aprire la scheda Scansione della finestra HD e selezionare i segnali da registrare. Selezionare la direzione in cui viene registrato il segnale. Selezionare la casella Volume forza per ottenere un record di tutte le curve di forza .
NOTA: registrare il segnale del modulo di elasticità in entrambe le direzioni avanti e indietro. Fornirà più punti da calcolare. - Fare clic sul pulsante Off nella parte superiore della finestra principale del programma per attivare il ciclo di feedback.
- Fare clic sul pulsante PhaseCorr nella finestra HD principale per correggere la sensibilità del sistema ottico.
- La scheda vs Time della finestra HD principale presenta la funzione del segnale DFL rispetto al tempo in tempo reale; Selezionare le parti di questa funzione che verranno utilizzate per la determinazione del livello di base e per adattare il modello di contatto per ulteriori calcoli.
- Impostare il valore del punto di scansione su 256 x 256 nella finestra principale del programma. Impostare la frequenza di scansione su 0,2 Hz e fare clic sul pulsante Esegui per eseguire la scansione del campione.
- Dopo l'interruzione della scansione, fare clic sul pulsante On nella parte superiore della finestra principale per disattivare il ciclo di feedback.
- Scegliere Modalità contatto nel menu a discesa, aprire la scheda Approccio e fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre l'esempio.
- Fare clic sul pulsante Dati per aprire il software di analisi e salvare l'output.
- Alla fine della giornata di misurazione, rimuovere il supporto della punta a sbalzo dalla testa e sciacquarlo accuratamente con acqua ultrapura più volte. Ogni volta, rimuovere l'acqua con una salvietta di precisione.
4. Valutazione dei dati e post-elaborazione
NOTA: non fare affidamento sui valori del modulo elastico calcolati automaticamente. Poiché la superficie varia notevolmente in altezza, molte curve artefatto dovrebbero essere espulse.
- Aprire il file salvato nel software di analisi.
- Selezionare il fotogramma HDForceVolume .
- Tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare un fotogramma visivo ottenuto nella stessa direzione di scansione. Fare clic sul pulsante Carica mappa esterna per vedere dove si trovano le pareti cellulari.
NOTA: qualsiasi mappa del segnale può essere utilizzata come cornice visiva, ma l'utilizzo della mappa del segnale DFL (diversi strumenti possono riferirsi ad essa come segnale di deflessione o segnale di errore) può essere il modo più semplice. - Controllare InvOptSens (IOS) e i valori di rigidità a sbalzo nella scheda Principale .
- Apri la scheda Aggiuntivi e controlla i parametri della punta e il modello di contatto.
- Fate clic su vari punti sulle pareti delle celle sulla cornice visiva e selezionate solo le curve ben descritte dal modello. Per informazioni dettagliate, vedere Risultati rappresentativi.
- Annotare i valori ottenuti.
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Representative Results
I tipici moduli elastici e le mappe DFL, nonché le curve di forza ottenute sulle radici di segale e mais con il metodo descritto, sono presentati nella figura 2. La figura 2A mostra il modulo elastico e le mappe DFL ottenute sulla sezione trasversale della radice primaria di segale. Le aree bianche nella mappa del modulo (Figura 2A, a sinistra) corrispondono a una sovrastima errata del modulo di Young dovuta al raggiungimento del limite da parte dello scanner nella direzione z. Questa immagine non è comoda per essere utilizzata come mappa esterna per un'ulteriore selezione di curve di forza soddisfacenti. La mappa del segnale DFL (mappa di deflessione/errore) presentata a destra (Figura 2A) è più adatta a questo scopo.
Le mappe dei moduli delle sezioni trasversali e longitudinali della radice di mais sono mostrate nella figura 2B,C. Lo scanner che è stato completamente esteso durante il tentativo di raggiungere il fondo del campione può causare misurazioni errate e persino scansioni interrotte (parte superiore della Figura 2C). A volte, dopo aver ottenuto una buona scansione in modalità contatto, lo strumento contrae improvvisamente completamente lo scanner, allarmando che ha raggiunto il limite massimo di direzione z quando passa alla modalità forza-volume. Significa che il campione non è stato immobilizzato correttamente e galleggiato. Dovrebbe essere preparato un nuovo campione.
La contaminazione da agarosio può anche essere un motivo per preparare un nuovo campione (Figura 2D,E). La presenza di agarosio può essere verificata mentre si ottiene la prima scansione nella modalità di contatto (punto 3.5). Idealmente, le pareti cellulari e alcuni fondi cellulari dovrebbero essere visibili su tali scansioni (Figura 2D); tuttavia, in caso di immobilizzazione imprecisa, la superficie può essere ricoperta di agarosio (Figura 2E), che maschera la topografia del campione.
La Figura 2F mostra quattro diverse curve di forza registrate in diversi punti della stessa parete cellulare. La curva registrata al punto 1 non mostra alcuna linea di base. Significa che non c'era separazione della punta a sbalzo dalla parete cellulare. Il modulo calcolato da questa curva è stato sovrastimato. La curva registrata al punto 3 mostra una spalla sulla parte in avvicinamento. Questo artefatto potrebbe indicare che la parete cellulare era piegata. Entrambe le curve registrate ai punti 1 e 3 devono essere espulse. I punti 2 e 4 mostrano curve di forza soddisfacenti con valori simili di moduli. I seguenti criteri possono essere utilizzati per distinguere le curve corrette: (i) il livello della linea di base dovrebbe essere evidente sia nelle parti in avvicinamento che in quelle in ritrazione della curva; (ii) non ci dovrebbero essere irregolarità come spalle o cedimenti (appare rispettivamente come valori di forza costanti e un'improvvisa diminuzione dei valori di forza nel mezzo della pendenza); (iii) il modello selezionato deve adattarsi bene alla curva. Per tutte le curve selezionate, i valori massimi di forza applicata devono essere simili. Una forza massima applicata che è significativamente superiore o inferiore al valore previsto può anche essere utilizzata come criterio per l'espulsione della curva. L'utilizzo di reti neurali per scartare curve di scarsa qualità19 può accelerare l'elaborazione dei risultati.
Figura 1: Fasi critiche nella preparazione del campione . (A) Frammento di radice incorporato in un blocco di agarosio e montato sullo stadio del vibratomo. (B) Sezione campione posta sopra uno strato di agarosio all'1% e immobilizzata con agarosio supplementare in un cappuccio a capsula di Petri. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini e misurazioni tipiche dell'AFM sulle radici primarie . (A) Modulo di elasticità e mappe DFL di una sezione trasversale della radice di segale. Mappe del modulo di elasticità completamente registrate (B) e interrotte (C) ottenute su sezioni longitudinali e trasversali della radice di mais. Vista 3D di sezioni pulite (D) e ricoperte di agarosio (E) di radici di mais. (F) Una mappa DFL di una sezione trasversale della radice di mais. I punti 1-4 sulla parete cellulare mostrano le posizioni in cui sono state registrate le curve di forza presentate sul lato destro dell'immagine. La linea rossa è per avvicinarsi, la linea blu è per la retrazione e la linea nera mostra l'adattamento del modello meccanico di contatto. Le curve registrate nei punti 1 e 3 presentano artefatti e non possono essere utilizzate per i calcoli. Le radici di segale sono state esaminate con punte affilate e le radici di mais sono state esaminate con punte sferiche. Abbreviazioni: Rhiz = rizoderma, Exo = esoderma, OC = corteccia esterna, IC = corteccia interna, End = endoderma, Per = periciclo e VP = parenchima vascolare. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e quindi le dimensioni e la forma future della pianta. Il metodo basato sull'AFM qui presentato integra le tecniche esistenti utilizzate per studiare le proprietà delle pareti cellulari delle piante. Permette di studiare l'elasticità delle pareti cellulari, che appartengono ai tessuti interni della pianta. Utilizzando il metodo presentato, sono state mappate le proprietà meccaniche delle pareti cellulari in diversi tessuti della radice di mais in crescita ed è stato costruito un modello matematico basato su queste proprietà6. La radice simulata ha risposto all'applicazione della pressione che imita il turgore modificando le dimensioni lineari. Questi cambiamenti erano nello stesso intervallo e nella direzione opposta di quelli mostrati da una radice appena asportata nel mezzo plasmolizzante6.
La preparazione del campione è fondamentale per questo protocollo. L'essiccazione del campione deve essere evitata durante l'intera preparazione. Il corretto posizionamento del materiale vegetale da sezionare è una questione importante; Le pareti cellulari devono essere orientate rigorosamente perpendicolarmente al futuro piano di scansione. In caso contrario, si otterranno curve forza-deformazione insoddisfacenti perché la parete cellulare è stata piegata o piegata. La sezione incorporata nell'agarosio deve essere fissata saldamente con agarosio aggiuntivo (Figura 2B). Quest'ultimo non dovrebbe entrare nel campione, altrimenti verranno misurate le proprietà dell'agarosio. La parte più importante di questo protocollo è filtrare le curve di forza risultanti. Anche lo studio di oggetti modello, come le griglie di calibrazione AFM, può portare a una percentuale significativa di curve di forza-deformazione errate22. L'uso diretto dei valori del modulo calcolato senza analizzare le curve di forza-deformazione sottostanti può portare a conclusioni errate (Figura 2F).
La tecnica non è limitata dalla localizzazione della cellula o dalla dimensione degli organi vegetali. Tuttavia, gli oggetti troppo piccoli sono difficili da tagliare, orientare e immobilizzare. Le celle con un grande lume sono difficili da lavorare poiché vi è un'alta probabilità di interruzione della scansione (Figura 2C).
Con tutti i vantaggi dell'utilizzo di sezioni vegetali non fisse preparate con un vibratomo, ci sono almeno due questioni cruciali: la possibilità di sviluppare una reazione di stress dopo il taglio del materiale vegetale e la possibilità di solubilizzazione parziale del materiale dalle pareti cellulari tagliate. Entrambi possono portare a cambiamenti nella composizione e nelle proprietà delle pareti cellulari. La presenza di una risposta immediata allo stress sul taglio è stata testata su apici di Arabidopsis 10. Non è stato riportato alcun effetto significativo sulle proprietà osservate. Sono stati condotti esperimenti per testare i cambiamenti nelle proprietà delle pareti cellulari tagliate durante la loro incubazione in acqua19. Non vi è stata alcuna tendenza stabile nei valori apparenti del modulo di Young misurati sulla stessa parete della radice di mais per almeno mezz'ora19. Tuttavia, è meglio mantenere il tempo degli esperimenti il più breve possibile e controllare ogni campione per tali cambiamenti durante l'incubazione del campione in acqua.
L'AFM è una potente tecnica per studiare le pareti cellulari delle piante. Tuttavia, è ovvio che i calcoli del modulo di elasticità, della rigidità e dell'adesione si basano su diverse ipotesi che non sono soddisfatte dalle pareti cellulari delle piante. Tutti i modelli di meccanica di contatto utilizzati da AFM considerano il campione studiato come un semispazio infinito di materiale isotropo, il che non è vero per le pareti cellulari vegetali. Allo stesso tempo, si presume che la geometria e le proprietà del penetratore siano accuratamente misurate e costanti per tutta la durata della vita a sbalzo, il che può anche essere errato. Inoltre, le pareti cellulari delle piante mostrano un comportamento meccanico complesso che coinvolge componenti elastici, viscoelastici e plastici, e di solito solo uno di questi può essere misurato in un singolo esperimento. Tuttavia, i dati ottenuti utilizzando metodi basati su AFM sono correlati in modo affidabile con la crescita delle cellule vegetali e le prestazioni meccaniche in vari organi e specie 3,4,5,6. Tutto ciò significa che sia la tecnica stessa che la comprensione dei dati ottenuti con essa possono essere migliorate.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Dmitry Suslov (Università statale di San Pietroburgo, San Pietroburgo, Russia) e la Prof.ssa Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russia) per aver fornito semi di mais e segale, rispettivamente. Il metodo presentato è stato sviluppato nell'ambito del progetto della Fondazione scientifica russa n. 18-14-00168 assegnato a LK. La parte del lavoro (ottenimento dei risultati presentati) è stata eseguita da AP con il sostegno finanziario dell'incarico governativo per il FRC Kazan Scientific Center di RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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