뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

활동 전위는 뇌에서 정보의 기본 단위이며, 축삭을 통한 활동 전위 전파는 정보 처리의 한 기둥을 형성합니다 ^1,2,3. 뉴런은 전형적으로 다수의 다른 뉴런으로부터 구심성 입력을 수신하고, 주어진 좁은 시간 윈도우 내에 이들 입력을 통합한다(^4,5). 따라서 축삭의 활동 전위 전파 메커니즘은 연구자로부터 상당한 관심을 받았습니다.

축삭을 통해 전파 될 때, 활동 전위는 축삭을 따라 반복적으로 재생되어 안정적인 전파를 보장합니다⁶. 턱이있는 척추 동물 (gnathostomes)의 대부분의 뉴런에서 축삭은 신경교 세포의 유형 인 근처의 희소 돌기 아교 세포 또는 Schwann 세포에서 생성되는 지질이 풍부한 물질 인 미엘린 덮개로 둘러싸여 있습니다 (^7,8에서 검토). 이 myelin sheath는 축삭을 전기적으로 절연하여 커패시턴스를 줄이고 활동 전위 전파를 효율적이고 빠르며 낮은 에너지 소비로 허용합니다. Myelin은 축삭을 균일하게 덮지 않지만 Ranvier의 노드라고 하는 축삭 사이에 짧은 간격이 있는 부분으로 축삭을 덮습니다(^9,10에서 검토됨). 축삭의 전기 절연 수준을 제어하는 수초화 두께와 축삭을 따라 활동 전위가 재생되는 빈도를 제어하는 Ranvier 노드의 간격은 활동 전위 전파 속도에 영향을 미칩니다 (¹¹에서 검토).

수초화 두께가 축삭^12,13,14에서 활동 전위 전파 속도에 영향을 미친다는 것을 시사하는 많은 문헌이 있습니다. 더욱이, 축삭 수초화의 변화는 다수의 CNS 결핍 15,16,17,18,19,20,21을 초래할 수 있다. 따라서 많은 연구 노력의 초점이 축삭 수초화의 측정 및 특성화를 포함한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 미엘린 두께의 측정은 전자 현미경으로 가장 일반적으로 수행되었으며, 이는 상당한 양의 조직 준비가 필요하고 면역 조직 화학과 함께 사용하기가 어려운 기술입니다. 그러나 코히어런트 안티-스톡스 라만 분광법(CARS)을 기반으로 하는 축삭 수초화를 측정하는 더 빠르고 간단한 기술도 있습니다. CARS 레이저는 다양한 주파수로 튜닝될 수 있고, 지질을 여기시키기에 적합한 주파수로 튜닝될 때, 미엘린은 임의의 추가 라벨(²²)에 대한 필요 없이 이미지화될 수 있다. 지질 영상화는 표준 면역조직화학과 조합될 수 있어서, 지질은 몇몇 형광 채널⁽²³)과 함께 영상화될 수 있다. CARS를 사용한 이미징 수초화는 전자 현미경보다 훨씬 빠르며 EM보다 낮지 만 동일한 유형의 축삭에서 수초화의 작은 차이도 감지하기에 충분한 분해능을 가지고 있습니다.

모든 실험은 모든 관련 법률, 국립 보건원 지침을 준수했으며 콜로라도 대학교 Anschutz 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물

1. 잭슨 연구소에서 얻은 C57BL/6J(스톡 #000664) 마우스(Mus musculus ) 또는 원래 Charles River에서 얻은 몽골 저빌(Meriones unguiculatus)을 사용하십시오.

2. 조직 준비

1. 심경 관류의 경우, 펜토 바르비탈 (120 mg / kg 체중)로 관심있는 설치류 종을 과다 복용하고 인산염 완충 식염수 (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na₂HPO 4) 다음에₄ % 파라 포름 알데히드 (PFA) ²⁴.
   1. 특히 가위를 사용하여 복부와 흉곽을 열고 켈리 지혈 집게로 흉곽을 제자리에 고정하여 심장을 노출시킵니다.
   2. 관류 펌프에 연결된 23GA 바늘을 좌심실에 삽입하고 가위를 사용하여 우심방을 빠르게 자릅니다.
   3. 관류 펌프와 심장의 바늘을 통해 PBS를 10 분 동안 투여하여 뇌와 혈액을 깨끗이합니다.
   4. 관류 펌프를 4분 동안 10% PFA로 전환하고 팔다리와 꼬리의 강성을 확인하여 성공적인 관류를 확인합니다.
2. 관류 후 동물의 목을 베고 두개골에서 뇌를 제거하십시오. PBS로 옮기기 전에 뇌를 4 % PFA로 밤새 유지하십시오. 뇌간을 4% 아가로오스(PBS 포함)에 삽입하고 200μm 두께의 비브라톰을 사용하여 관상으로 자릅니다.

3. 염색

1. Nissl용 얼룩 없는 부유 절편을 항체 배지(AB 배지:0.1 M 인산염 완충액(PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4),150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% 소 혈청 알부민(BSA))에서 표준 실험실 쉐이커(²⁵)에서 실온에서 30분 동안 시각화하기 위해.
   1. 알루미늄 호일 및/또는 덮개를 사용하여 빛으로부터 섹션을 보호합니다. 550nm 이하의 파장은 CARS 이미징과 호환됩니다(그림 1).
      참고: Triton-X 또는 기타 시약이 지질의 CARS 이미징에 영향을 미칠 것으로 예상하지는 않지만 특정 항체 배지를 사용한 추가 제어가 필요할 수 있습니다.
2. 일시 중지 지점: 이미징할 때까지 자유 부동 섹션(빛으로부터 보호되는 동안)을 PBS에 저장합니다. 절편화되면 2주 이내에 뇌 절편을 이미지화합니다.

그림 1: CARS 이미징은 면역형광 이미징과 결합할 수 있습니다. 그래프는 CARS 이미징이 660/640nm 적색 신호 스펙트럼²⁶에서 발생한다는 것을 보여줍니다. 이 파장은 녹색, 파란색 또는 UV 범위에서 충분히 멀리 떨어져 있어 CARS 신호와 이러한 범위의 면역형광법을 조합할 수 있습니다. 구체적으로, 그래프는 또한 청색 형광단으로 태그된 Nissl에 대한 여기 및 방출을 나타내며, 이는 본 간행물에 대한 대표적인 결과를 수집하는 동안 CARS와 결합되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 이미징

참고: CARS 레이저 설정에는 80MHz 클럭을 제공하는 파이버 레이저와 CARS 신호를 수집하는 데 필요한 Stokes 빔이 1031nm로 고정된 770-990nm의 조정 가능한 범위를 가진 OPO(광학 파라메트릭 발진기) 레이저가 포함되어 있습니다. 두 빔 모두에 대해 하나의 조리개가 있습니다.

1. 샘플을 현미경으로 가져오기 전에 CARS 레이저를 켜고 최소 1시간 동안 예열하고 CARS 레이저를 정렬하고 Koehler는 전방 CARS 이미징을 위해 콘덴서 광학 장치와 현미경의 다이어프램을 정렬합니다.
   참고: 이 단계는 CARS 현미경의 적절한 기능에 매우 중요합니다.
   1. 두 레이저 빔(펌프 및 스토크)의 공간 정렬을 위해 CARS 레이저 GUI를 통해 두 개의 내부 PSD(위치 감지 감지기)에 액세스합니다.
   2. 파장이 다르기 때문에 분산이 다른 두 레이저(펌프 및 스토크)의 펄스를 겹치는 데 도움이 될 수 있는 CARS 레이저 GUI의 지연 기능을 사용하여 시간 정렬을 달성합니다. 따라서, 펌프 및 스톡스 빔의 시간적 및 공간적 중첩은 모두 GUI를 통한 사용자 입력으로 수행된다.
   3. 외부 잠망경(설정의 마지막 두 거울)을 조정하여 공간적으로 겹쳐진 두 개의 레이저를 현미경의 스캐닝 헤드 미러에 중앙에 놓습니다.
   4. 최상의 전방 CARS 비스캔 감지를 위해 콘덴서가 Koehler-ed인지 확인하십시오(즉, 콘덴서가 중앙에 있고 균일한 조명을 얻기 위해 다이어프램에 초점을 맞춥니다).
2. 면역형광 컨포칼 이미징 및 CARS 이미징의 경우 형광 이미징을 위한 가시광선 레이저가 장착된 컨포칼 현미경을 통합하여 CARS 레이저를 전방 및 에피 CARS 비스캔 검출기(NDD)와 함께 장착합니다(그림 2).
3. 커버 슬립 (도립 현미경 용), 조직 건조를 방지하기 위해 PBS, 조직을 커버 슬립 근처에 유지하기위한 유리 무게가있는 배양 접시에 섹션을 놓습니다.
4. 사다리꼴 몸체(MNTB)의 내핵과 같은 뇌 영역을 이미징하기 위해 에피 방향으로 CARS 신호를 수집하고 정방향으로 0.55NA 콘덴서를 통해 CARS 신호를 수집하는 역할을 하는 60X, 1.2NA 적외선 보정 물 대물렌즈로 z-스택 또는 단일 이미지를 촬영합니다.
   1. CARS 레이저 GUI를 사용하여 약 600mW 펌프/프로브 및 300mW 스톡스에서 CARS 이미지를 촬영합니다. 이러한 레이저 출력 값은 시스템에 의해 내부적으로 측정됩니다. 샘플 위치에서 두 레이저의 출력은 25mW 미만이며 조직 샘플에 안전합니다.
   2. 펌프와 Stokes 빔을 공간적으로나 시간적으로 겹칩니다. OPO를 797.2nm로 조정합니다. 이것은 650 nm의 CARS 파장을 산출한다. 에너지 수준이 높기 때문에 결과적으로 바닥 상태로의 복귀는 여기로 안티 스토크 (파란색 이동)됩니다.
   3. 대역통과 필터(640-680nm)를 사용하여 epi 또는 전방 비스캔 검출기에서 CARS 신호를 캡처한 다음 면역형광 라벨(이 경우 형광 라벨이 Nissl로 표시됨)을 순차적으로 검출합니다.
      참고: Nissl 뉴런 소마 마커는 CARS 640-680nm 대역통과 필터에 포착되지 않으므로 아래 제시된 이미지에서 형광과 CARS 이미징을 조합할 수 있습니다.
   4. CARS와 형광은 PMT를 공유하지 않습니다. 최적의 지질 신호에 이러한 설정을 사용하여 뇌 영역의 수초화를 선택적으로 이미지화합니다.
      주의: 레이저 빔으로부터 사용자를 보호
5. 이미지를 .oib 파일로 저장하면 추가 정량화를 위해 이미지 분석 프로그램으로 가져올 수 있습니다(그림 3).

그림 2: 레이저 스캐닝 컨포칼에 통합된 CARS 레이저(빨간색 화살표) 및 비스캔(NDD) 에피 및 전방 감지를 보여주는 CARS 기기 다이어그램. 순방향 NDD에서는 515nm(주황색 화살표)에서 CH 결합(진한 빨간색 화살표) 및 SHG(두 번째 고조파 생성)에 대한 CARS를 획득합니다. epi NDD에서는 C-H 결합(진한 빨간색 화살표) 및 2PE(이광자 방출) 자가형광(하늘색 화살표)에 대한 CARS를 획득합니다. 순차적으로 형광 공초점 이미지를 획득할 수 있습니다(가시광선 레이저의 경우 녹색 화살표, 공초점 검출의 경우 파란색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: CARS는 뇌 조직(뇌간)의 미엘린(자홍색)을 밝히는 동시에 Nissl(청록색) 또는 형광 마커를 이미징할 수 있습니다. 두 패널은 몽골 저빌 (단일 이미지 M. unguiculatus, 그림 3A, C, E)과 마우스 (z- 스택 최대 투영 M. musculus, 그림 2B, D, F) 뇌의 대표적인 결과를 보여 주며,이 기술이 여러 종에 걸쳐 사용될 수 있음을 나타냅니다. 그림 3A, B는 Nissl을 시안으로, C,D는 CARS 신호를 마젠타색으로 보여주고, E, F는 Nissl 및 CARS 신호를 각각 저빌 또는 마우스용 패널과 결합합니다. 두 이미지 세트 모두 뇌간에서 사다리꼴 몸체 (MNTB)의 내측 핵 부분을 보여줍니다. MNTB의 뉴런은 심하게 수초화된 축삭으로부터 입력을 받는데, 축삭은 거대한 시냅스²⁷의 일종인 헬드의 꽃받침에서 끝납니다. 스케일 바는 20 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

다른 기술에 비해 CARS 현미경의 가장 큰 장점 중 하나는 형광 이미징23과의 호환성입니다. 그림 1 은 스펙트럼에서 거의 / 전혀 겹치지 않는 면역 형광 마커로 태그 된 Nissl과 비교하여 CARS 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 2 는 컨포칼 현미경과 함께 CARS에 설정된 레이저를 보여줍니다. 그림 3 은 세포체(청록색)와 미엘린 신호(자홍색)를 모두 보여주는 CARS 이미징을 사용하여 얻을 수 있는 gerbil 및 마우스의 단일 스택 및 z-스택 최대 투영으로 두 개의 대표적인 이미지를 보여줍니다.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.