수초화를 시각화하는 것은 신경계를 연구하는 많은 연구자들에게 중요한 목표입니다. CAS는 미엘린과 같은 특수 구조를 조명하는 뇌와 같은 조직 내에서 지질을 기본적으로 이미지화할 수 있는 면역형광법과 호환되는 기술입니다.
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방법 논문
뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션
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이 논문에서
요약
초록
일관된 안티 스톡스 라만 분광법(CARS)은 화학자와 물리학자가 분자의 시그니처 진동에 대한 일관된 신호를 생성하기 위해 고전적으로 사용하는 기술입니다. 그러나 이러한 진동 신호는 뇌와 같은 해부학 적 조직 내의 분자의 특성이기도하므로 신경 과학 응용 분야에 점점 더 유용하고 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, CARS는 이러한 분자 내의 화학 결합을 특이적으로 여기시켜 지질을 측정할 수 있으므로 신경 전달에 관여하는 미엘린과 같은 조직의 다양한 측면을 정량화할 수 있습니다. 또한, 미엘린을 정량화하기 위해 전형적으로 사용되는 다른 기술과 비교하여, CARS는 또한 면역형광 기술과 호환되도록 설정될 수 있어서, 나트륨 채널 또는 시냅스 전달의 다른 성분과 같은 다른 마커와의 공동 표지를 허용한다. 수초화 변화는 다발성 경화증과 같은 탈수초성 질환 또는 취약 X 증후군 또는 자폐 스펙트럼 장애와 같은 기타 신경학적 상태에서 본질적으로 중요한 메커니즘이 새로운 연구 분야입니다. 결론적으로, CARS는 신경 과학의 긴급한 질문에 답하고 다양한 신경 학적 상태와 관련된 기본 메커니즘에 대한 증거를 제공하기 위해 혁신적인 방법으로 활용 될 수 있습니다.
서론
활동 전위는 뇌에서 정보의 기본 단위이며, 축삭을 통한 활동 전위 전파는 정보 처리의 한 기둥을 형성합니다 1,2,3. 뉴런은 전형적으로 다수의 다른 뉴런으로부터 구심성 입력을 수신하고, 주어진 좁은 시간 윈도우 내에 이들 입력을 통합한다(4,5). 따라서 축삭의 활동 전위 전파 메커니즘은 연구자로부터 상당한 관심을 받았습니다.
축삭을 통해 전파 될 때, 활동 전위는 축삭을 따라 반복적으로 재생되어 안정적인 전파를 보장합니다6. 턱이있는 척추 동물 (gnathostomes)의 대부분의 뉴런에서 축삭은 신경교 세포의 유형 인 근처의 희소 돌기 아교 세포 또는 Schwann 세포에서 생성되는 지질이 풍부한 물질 인 미엘린 덮개로 둘러싸여 있습니다 (7,8에서 검토). 이 myelin sheath는 축삭을 전기적으로 절연하여 커패시턴....
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프로토콜
모든 실험은 모든 관련 법률, 국립 보건원 지침을 준수했으며 콜로라도 대학교 Anschutz 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물
- 잭슨 연구소에서 얻은 C57BL/6J(스톡 #000664) 마우스(Mus musculus ) 또는 원래 Charles River에서 얻은 몽골 저빌(Meriones unguiculatus)을 사용하십시오.
2. 조직 준비
- 심경 관류의 경우, 펜토 바르비탈 (120 mg / kg 체중)로 관심있는 설치류 종을 과다 복용하고 인산염 완충 식염수 (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) 다음에4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 24.
- 특히 가위를 사용하여 복부와 흉곽을 열고 켈리 지혈 집게로 흉곽을 제자리에 고정하여 심장을 노출시킵니다.
- 관류 펌프에 연결된 23GA 바늘을 좌심실에....
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결과
다른 기술에 비해 CARS 현미경의 가장 큰 장점 중 하나는 형광 이미징23과의 호환성입니다. 그림 1 은 스펙트럼에서 거의 / 전혀 겹치지 않는 면역 형광 마커로 태그 된 Nissl과 비교하여 CARS 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 2 는 컨포칼 현미경과 함께 CARS에 설정된 레이저를 보여줍니다. 그림 3 은 세포체(청록색)와 미엘린 신호(자홍색)를 모두 보여주는 CARS 이미징을 사용하여 얻을 수 있는 gerbil 및 마우스의 단일 스택 및 z-스택 최대 투영으로 두 개의 대표적인 이미지를 보여줍니다.
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토론
점점 더 많은 문헌이 뇌 기능에서 미엘린의 역할을 강조합니다 13,16,21,28. 또한, 우리는 수초 두께와 수초 패턴이 다발성 경화증 (29 년 검토), 노화 (30 년 검토), 자폐증20,31 및 기타 여러 가지 신경 학적 상태에서 변할 수 있음을 알고 있습니다. 따라서 점점 더 많은 연구자들이 뇌 조직과 동물 모델, 여러 의학적 조건 및 점점 더 많은 실험 상황에서 수초화를 평가해야한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 뇌 조직에서 수초화를 이미지화하는 전통적인 방법에는 항체 표지, 광학 현미경 및 전자 현미경.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) 및 NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 및 FRAXA (McCullagh)에서 지원합니다. CARS 이미징은 NIH P30 NS048154 및 NIH P30 DK116073에 의해 부분적으로 지원되는 콜로라도 대학교 Anschutz Medical Campus의 신경 기술 센터의 Advanced Light Microscopy Core 부분에서 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| < 강한 > 마취 : < / 강한 > | |||
| 바늘이있는 1 mL 일회용 주사기 27 GA x 0.5 " | Exel int | 260040 | |
| 치명적인 + | Vortech | ||
| 외과 : < / strong> | |||
| Spring 가위 - 8mm 절삭 첨단 | 과학 도구 | 15024-10 | |
| 표준 핀셋 | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| 바늘 끝, 23 GA x 1" | BD 정밀 글라이드 | 305193 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS): | |||
| 염화칼 | 륨 Sigma | P9333 | |
| 인산칼륨 모노베이스 | Sigma | P5655 | |
| 펌프(가변 유량 포함) 또는 이와 동등한 | |||
| 염화나트륨 | Fisher Chemical | s271-1 | |
| 나트륨 인산염 이염 기 | 성 시그마 | S7907 | |
| < 강> 해부 : < / 강> | |||
| 50 mL 바이알 4 % PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes 스프링 가위 | 파인 사이언스 도구 | 15011-12 | |
| 파인 사이언 | 도구 | 11050-10 파인 사이언스 도구 11050-10 | |
| 얕은 유리 또는 플라스틱 트레이, 약 10" x 10" | |||
| 표준 핀셋 | 파인 사이언스 도구 | 11027-12 | |
| 수술용 가위 - 블런트 | 파인 사이언스 도구 | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| 웰 플레이트 | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| strong>Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL의 Millipore H2O | ||
| 인산염 완충 (PB): | |||
| 인산칼륨 모노염기 | 시그마 | P5655 | |
| 인산나트륨 이염기성 | 시그마 | S7907 | |
| BSA (소 혈청 알부민) | 시그마 생명과학 | A2153-100g | |
| 염화나트륨 | 피셔 화학물질 | s271-1 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 - 알드리치 | x100-500ml | |
| 니슬 435/455 | 인비트로젠 | N21479 | |
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| APE 피코 에메랄드 레이저 | Angewandte Physik & 일렉트로닉 | ||
| 대역 통과 필터 (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470 / 100m-2P | |
| 대역 통과 필터 (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515 / 30m-2P | |
| 대역 통과 필터 (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660 / 40m-2P | |
| 컨포칼 현미경 | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer | pipet Fisher | 13-711-7M | |
| 이색성 롱패스, 565nm | 크로마 기술 | , 565dcxr | |
| , 이색성 롱패스, 585nm | 크로마 기술 | , 585dcxr | |
| 이색성 쇼트패스, 750nm | 크로마 기술 | , T750spxrxt | |
| 유리 바닥 배양 접시 | MatTek | P35G-0-10-C | |
| , 유리 무게(10mm x 10mm 보로 로드) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| 다광자 단역 통과 방출 필터 680nm | 크로마 기술 | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
참고문헌
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General P....
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