포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

클론 종양 집단을 둘러싼 수많은 세포 유형의 중요성은 발암 분류에 중요한 요소입니다. 이러한 종양 미세환경(TME) 조성 및 상호작용을 해명하는 것에 대한 관심은 암 치료 무기고의 일부로서 면역-기반 요법의 확립 이후 지속적으로 증가하였다. 따라서, 치료 전략은 종양 중심 접근법에서 TME 중심 접근법¹로 이동하였다.

종양 감시 및 암 발생에서 면역 세포의 역할을 밝히려는 노력은 최근 몇 년 동안 눈에 띄게 증가했습니다 ^2,3. 의학 연구에서, 세포 측정 기반 방법과 단일 플렉스 및 멀티플렉스 이미징 기술을 포함한 많은 방법이 TME의 여러 요소의 고유 한 상호 작용을 해독하려는 시도의 일환으로 발생했습니다.

유세포 분석기 (1960 년대에 발명 됨), 형광 활성화 세포 분류 및 질량 세포 측정과 같은 선구적인 방법은 주로 TME 성분⁴를 확인하고 정량화하는 데 중점을 둡니다. 세포측정법 기반 정량적 기술이 면역 풍경 표현형을 허용하더라도, 세포 공간 분포를 결정하는 것은 불가능하다. 반대로, 표준 단일플렉스 면역조직화학과 같은 방법은 조직 구조를 보존하고 연구자들이 세포 분포를 분석할 수 있게 하지만, 단일 조직 절편에서 표적의 수가 감소하는 것은 이러한 방법의 한계이다 ^5,6. 지난 몇 년 동안, 멀티플렉스 면역형광, 바코딩 형광 이미징 및 이미징 질량 분광법과 같은 단일 세포 분해능을 위한 멀티플렉스 이미징 기술은 동일한 조직 섹션⁷을 사용하여 동시 마커 염색에 대한 정보를 획득하기 위한 포괄적인 전략으로 부상하였다.

여기에서는 금속 태깅된 항체와 이차 이온 질량 분광법을 결합하고 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 및 신선한 냉동(FF) 조직 샘플^8,9를 이용한 단일 세포 분해능 정량화^, 마커 공동발현(표현형) 및 공간 분석을 가능하게 하는 기술을 제시합니다. FFPE 샘플은 조직 보관 샘플에 가장 널리 사용되는 재료이며, 신선한 냉동 샘플⁽¹⁰)보다 멀티플렉스 이미징 기술에 대해 더 쉽게 이용가능한 자원을 나타낸다. 또한이 기술은 몇 달 후 이미지를 다시 획득 할 수있는 가능성을 제공합니다. 여기에서, FFPE 조직 샘플을 사용하는 우리의 염색 및 이미지 처리 프로토콜에 대해 논의한다.

조직 샘플은 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터의 기관 검토 위원회에 따라 연구 목적으로 수득되었고, 샘플은 추가로 비확인되었다.

1. 항체 선택

1. 연구 질문을 정의하여 가장 적합한 항체 클론을 선택하십시오. Human Protein Atlas, 출판된 연구 및 항체 제조업체 웹 사이트를 연구 자료로 사용하십시오.
   참고 : 적절한 인간 조직 대조군과 동일한 인간 조직 대조군을 다른 단계에서 염색 할 것을 선택하는 것은 마커가 올바르고, 올바른 장소에서, 그리고 올바른 세포 구획에서 염색되었는지 확인하는 데 중요합니다. 정상 조직 및 신생물성 조직을 포함하는 작은 조직 마이크로어레이(TMA)는 염색 검증을 위해 항상 권장됩니다.
2. 운반체가 없는 항체만 사용하여 패널을 설계하십시오.
   참고: 상용성 담체가 없는 항체를 사용할 수 없는 경우 담체가 없는 항체 제형의 사용이 필요합니다. 정제 키트는 항체를 정확한 제형으로 조정하는데 사용될 수 있다. 소 혈청 알부민과 같은 단백질 첨가제는 콘쥬게이션 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
3. 마커 발현의 세포하 패턴을 결정하기 위해 표준 발색성 면역조직화학을 사용하여 각 항체를 시험 및 적정하고; 막, 세포질, 또는 핵 염색; 및 대조군 조직에서 특정 세포에서의 발현.
   참고 : 그러나 각 항체는 pH 6 시트레이트 및 pH 9 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)에서 테스트해야하며 패널이 pH 6 시트레이트 또는 pH 9 EDTA로 염색되는지 여부를 결정해야합니다. pH 9 EDTA의 사용은 특히 이 방법론으로 작업할 때 좋은 신호를 얻기 위해 권장됩니다.
4. 양성 대조군에서의 발현 패턴에 따라 최적의 염색 농도를 선택하십시오.
5. 면역조직화학 마커 풍부도, 아세포 국소화, 및 다른 표적과의 세포 공동발현에 따라 이용가능한 금속 동위원소 중 하나에 각각의 항체를 할당한다.
6. 항체를 상응하는 할당된 금속으로 염색하고 이전에 사용된 동일한 대조군 조직에서의 발현과 비교한다.
   참고: 항체 금속 접합은 항체 준비, 환원 및 후속 접합으로 시작됩니다 (보충 파일 1). 각각의 금속-로딩된 폴리머 튜브는 100 μg의 항체를 표지하기에 충분하다.

2. 항체 패널 디자인

1. 항체 염색의 작은 배치를 만듭니다. 칵테일에서 최대 다섯 개의 마커를 테스트합니다.
   참고: 면역조직화학을 사용하여 이미 접합되고 분석된 항체를 배치로 검사하면 채널 간섭의 조기 식별이 용이해지고 항체를 다른 금속과 재접합할 수 있는 기회를 제공합니다. 또한 적절한 마커 공동발현을 평가할 기회를 제공한다.
2. 네 가지 다른 항체 농도 (0.05 μg / mL, 0.2 μg / mL, 1 μg / mL 및 4.0 μg / mL)로 각 작은 배치를 염색하십시오.
   참고: 상이한 역가를 비교하여, 정확한 위치와 최소 배경 염색 (최상의 신호 대 잡음비)으로 가장 높은 발현을 초래하는 항체 농도를 확인하십시오.

3. FFPE 조직 절편화

1. 금으로 코팅 된 슬라이드 (이 용도에 따라 다름)를 선택하고 마이크로톰에 가깝게 유지하십시오. 홀더에 새 블레이드를 삽입하여 마이크로톰을 준비합니다. 단면 두께를 4-5 μm로 설정합니다.
2. 단면화하기 전에 FFPE 블록을 얼음 위에 놓습니다. 증류수 또는 탈이온수(_diH2O)를 40-45°C로 가열하여 조직 부유욕을 제조하였다.
   참고:_diH2O또는 증류수를 사용하면 오염 가능성이 줄어듭니다.
3. 단면화를 시작합니다. 핀셋을 사용하여 조직 섹션을 물에 넣고 평평하게하십시오. 슬라이드를 사용하여 물에서 조직 섹션을 제거하십시오.
4. 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 실온에서 밤새 말리십시오.

4. FFPE 항체 염색

참고 : 염색 과정은 이틀에 걸쳐 진행됩니다.

주의: 이 프로토콜에 사용된 솔루션은 잠재적으로 부식성이 있으며 피부와 눈에 위험을 나타냅니다. 장갑, 실험실 코트, 보호 눈 및 얼굴 장비를 착용하는 것이 좋으며 우리 기관의 생물 안전 정책의 일부입니다.

1. 시약 준비 (1 일째)
   1. 트윈(TBS-T)으로 20x 트리스 완충 식염수 50mL를 희석하여 950mL의_diH2O에 녹여 TBS-T 1L를 만든다.
   2. 10x 트리스에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 8 mL를 희석하여 72 mL의_diH2O에 넣고 1x 열 유도 에피토프 검색(HIER) 용액을 만든다.
   3. 당나귀 혈청을 1x TBS-T로 희석하여 최종 농도 5%로 희석하여 차단 완충액을 만듭니다. 사용 준비가 될 때까지 용액을 4°C에서 보관하십시오.
2. HIER 준비: 전처리(PT) 모듈
   주의: PT 모듈에 사용되는 시약에 담근 시약이나 부품을 취급할 때는 화학 보호 장갑을 착용하십시오.
   1. 140 mL의 10x 인산완충식염수(PBS)를 희석하여 1,260 mL의_diH2O를 만들어 1x PBS의 1.4 L를 만든다. 대안적으로, 7개의 PBS 정제를 1.4 L의_diH2O로 희석한다.
   2. 탱크에 PBS 1.4 L를 채우고 준비된 슬라이드 챔버 용기에 1x HIER 용액 100 mL를 탱크에 넣습니다.
   3. 탱크를 PT 모듈에서 75°C로 예열한다.
3. 과도한 파라핀 제거
   1. 오븐에서 70°C에서 20분 이상 슬라이드를 굽습니다.
      참고: 일부 조직이나 절편은 더 긴 베이킹 시간이 필요할 수 있습니다. 뇌 조직 또는 TMA에 권장되는 베이킹 시간은 1 시간입니다. 이것은 16 시간 (하룻밤) 또는 실험실 경험에 따라 확장 될 수 있습니다.
   2. 구운 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 흄 후드 아래의 셰이커에서 다음 세척 단계를 수행하십시오. 다음 용액으로 슬라이드를 세척하십시오: 30초 동안 자일렌 2x(금속 없음), 30초 동안 100% 알코올 2x(무금속), 30초 동안 95% 알코올 2x(금속 무함유), 30초 동안 80% 알코올(무금속), 30초 동안 70% 알코올(무금속), 30초의 경우 diH2O2x(무금속).
   3. 항원 검색이 준비될 때까지 슬라이드를 신선한_diH2O용기에 보관하십시오.
      참고: 슬라이드는 절차가 끝날 때까지 말려서는 안 됩니다.
4. 항원 검색
   1. 슬라이드를 PT 모듈 내부의 1x HIER 버퍼가 들어있는 예열된 슬라이드 챔버에 넣습니다. 덮개를 탱크에 놓습니다. 뚜껑을 닫고 걸치십시오.
   2. PT 모듈의 메뉴 단추를 눌러 주 메뉴를 열고 설정 주기 (시간 및 온도) 단추를 눌러 사용자 지정 프로그램을 만듭니다.
   3. PT 모듈을 97°C에서 40분 동안 실행합니다. 그 후, PT 모듈은 자동으로 65 °C로 냉각됩니다.
   4. 65°C 온도에 도달하면 PT 모듈에서 슬라이드를 제거합니다. 슬라이드를 실온에서 30 분 동안 유지하십시오.
      참고: PT 모듈은 온도가 65°C까지 냉각될 때까지 열리지 않습니다. 이 과정에서 슬라이드의 황금색 표면을 만지지 말고 항상 장갑을 착용하십시오.
5. 항체 차단
   1. 셰이커를 70rpm으로 설정합니다.
   2. 슬라이드를 1x TBS-T에 5 분 동안 2x 담궈서 씻으십시오.
   3. 소수성 장벽 펜을 사용하여 슬라이드 가장자리에서 적어도 1mm 떨어진 조직 섹션 주위에 테두리를 그려 15-30 초 동안 건조시킵니다.
      참고: 염색에 대한 조직 간섭을 피하기 위해 펜액이 조직 부분에 닿지 않도록 주의하십시오. 잠재적 인 누출을 피하기 위해 장벽을 당기는 동안 펜을 너무 세게 누르지 마십시오. 최적의 염색 및 이미지 획득 결과를 위해, 조직 절편은 15mm x 30mm 이하의 프레임에서 금으로 코팅된 슬라이드의 중간에 배치되어 슬라이드의 외부 가장자리에 배치된 조직 또는 가이드 점을 건드리지 않고 장벽을 그릴 수 있는 충분한 공간을 확보합니다.
   4. 펜 잔여물을 제거하려면 슬라이드를 TBS-T에 담그십시오.
   5. 실온에서 수분 챔버에서, 조직 절편을 100-200 μL의 블로킹 버퍼와 함께 20분 동안 인큐베이션한다. 항체 마스터 믹스가 준비될 때까지 조직 인큐베이팅을 블로킹 완충액에 남겨둔다.
6. 항체 패널 준비
   참고: 항체 패널 칵테일의 최종 부피는 추정된 조직 섹션 표면적에 따라 달라집니다. 20mm x 20mm의 면적을 커버하려면 100-200 μL의 칵테일을 준비하십시오.
   다음을 수행하여 금속 동위원소 접합 항체의 항체 패널 칵테일을 준비한다.
   1. 차단 완충액 부피에 첨가된 항체 칵테일 부피와 동일한 칵테일의 최종 부피를 확인한다.
   2. 프로젝트의 패널 스프레드시트에서 모든 항체, 희석 및/또는 항체 농도에 대한 사양을 확인합니다.
   3. 모든 항체 함유 튜브를 5분 동안 10,000 x g 에서 스핀다운한다. 블로킹 완충액에 개별 항체를 추가하고 아주 잘 섞는다. 피펫팅 할 때 항체 튜브의 바닥을 방해하지 마십시오.
   4. 0.1 μm 원심 필터 장치를 100 μL의 블로킹 버퍼로 예습하여 항체 패널을 필터링한다. 필터를 10,000 x g 에서 2분 동안 회전시키고 피펫으로 블로킹 버퍼 유동을 제거하였다.
   5. 항체 패널을 스핀 컬럼으로 옮기고 필터를 10,000 x g 에서 2분 동안 스핀한다. 스핀 컬럼을 폐기하고 여과된 항체 패널로서 유동-스루를 사용한다.
      참고: 금속 교환을 방지하기 위해 칵테일을 만든 직후에 염색을 수행하십시오. 항체 칵테일을 연장된 시간 동안 보관이 필요한 경우, 동결건조를 실시할 수 있다.
7. 항체 염색
   1. 각 슬라이드의 측면을 팁으로 채우고 작업 와이퍼에 가장자리를 부드럽게 탭하여 슬라이드에서 블로킹 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.
   2. 슬라이드를 수분 챔버에 놓고 100-200 μL의 항체 마스터 믹스를 조직에 첨가하십시오 (조직과의 접촉 및 기포 생성을 피하십시오).
   3. 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 염색 배치에 첨가한다.
   4. 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 (14-16 h) 인큐베이션한다.
8. 시약 준비 (2 일째)
   1. 100 mL의 10x 저바륨 PBS, pH 7.4를 희석하고, 900 mL의_diH2O에 희석하여 1x PBS를 만든다.
   2. 저바륨 PBS (340 mL의 저 바륨 PBS + 10 mL의 70 % 글루타르알데히드)에서 2% 글루타르알데히드의 작업 원액 350 mL를 준비한다.
      주: 후드 아래에서 희석을 수행하십시오. 글루타르알데히드는 매우 점성이 강한 액체입니다. 1 mL 피펫을 사용하고 튜브 밖으로 쏟아져 나올 정도로 액체가 될 때까지 매번 1 mL의 저바륨 PBS를 글루타르알데히드 튜브에 첨가하십시오.
   3. 10x 트리스, pH 8.5를 900 mL의_diH20에 희석하여 1x 트리스를 만듭니다.
9. 고정 및 탈수
   1. 항체 마스터 믹스를 각 슬라이드에서 분리하려면 슬라이드를 옆으로 기울이고 작업 와이퍼에 가장자리를 부드럽게 탭합니다.
   2. 다음 완충액에서 가벼운 교반에서 중간 정도의 교반으로 슬라이드를 세척하십시오 : 1x TBS-T, 각각 5 분 동안 3x 회 (금속 없음); 5분 동안 2% 글루타르알데히드를 여과하고; 여과된 1x 트리스, pH 8.5, 30초 동안 3x; 30초동안 여과된 diH2O2x; 30 초 동안 70 % 알코올 (금속 없음); 30 초 동안 80 % 알코올 (금속 없음); 30 초 동안 95 % 알코올 (금속 없음); 및 30 초 동안 100 % 알코올 (금속 없음).
   3. 각 슬라이드의 가장자리를 작업 와이퍼에 대고 부드럽게 탭하여 과도한 알코올을 제거하고 잔류 알코올이 실온에서 증발하도록하십시오 (~ 5-10 분).
   4. 이미지 획득 전에 적어도 1시간 동안 데시케이터에서 슬라이드를 건조시키거나 슬라이드를 진공 챔버에 보관하여 장기간 보관하십시오.

5. 이미지 수집

1. 슬라이드 설정
   참고: 계측기를 사용하여 스캔하기 전에 아래 설명된 단계에 따라 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램을 사용하여 슬라이드를 정의하고 설정해야 합니다.
   1. 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램의 슬라이드 페이지에서 새 슬라이드 기탁을 클릭하고 원하는 세부 정보(이름, 슬라이드 식별, 위치 및 설명)를 입력합니다.
   2. 섹션 추가를 클릭하여 스캔 섹션을 만듭니다. 각 섹션에 대한 정보(프로젝트 이름, 슬라이드 이름, 블록 및 위치)를 입력합니다. 생성된 새 슬라이드/섹션을 저장하려면 제출을 클릭합니다.
   3. 리소스 탭에서 패널 페이지를 열고 사용할 패널을 선택합니다. 새 패널의 경우 새 패널 만들기를 클릭합니다.
   4. 패널을 선택한 후 섹션을 클릭하십시오. 2단계에서 만든 섹션을 추가합니다. 섹션 할당 편집을 클릭합니다. 제출을 클릭하여 저장합니다.
2. 계측기 설정
   참고: 이 장비(자료 표 참조)는 특정 제어 소프트웨어 프로그램( 자료 표 참조) 을 사용하여 작동합니다.
   1. 제어 소프트웨어에 로그인합니다. 계측기가 절전 모드에 있는 경우 깨우기를 클릭합니다.
      참고: 작동 최소 1시간 전에 계측기를 예열하는 것이 좋으며, 이는 빔 초점 안정화에 도움이 됩니다.
   2. 슬라이드를 로드하려면 Exchange 샘플을 클릭한 다음 계속 을 클릭하여 문을 엽니다. 슬라이드를 로딩 슬롯에 넣고 샘플을 위로 향하게 하고 레이블을 오른쪽에 놓습니다. 계속 을 클릭하여 도어를 닫습니다.
      참고: 슬라이드가 올바르게 로드되지 않으면 경고음과 슬라이드를 조정하라는 알림이 나타납니다.
   3. 프로젝트를 선택한 다음 로드된 샘플의 슬라이드 이름을 선택합니다.
   4. 슬라이드 광학 이미지 창에서 파노라마 이미지를 시각화합니다.
3. 시야각(FOV) 선택 및 획득
   1. 모드 메뉴를 클릭하고 SED (이차 전자 검출기)를 선택하십시오. 이미징 모드 메뉴를 클릭하고 QC -300 μm를 선택하십시오.
   2. Jog Stage를 클릭하여 FOV 위치를 제어한 다음 화살표를 클릭하여 FOV의 위치를 탐색하고 선택합니다.
   3. FOV 추가를 클릭하고 필드 크기로 400μm x 400μm를 설정한 다음 이미징 모드로 미세 및 1ms의 유지 시간을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
      참고: 설정된 유지 시간은 원하는 해상도에 따라 다릅니다. 해상도가 증가함에 따라 유지 시간이 증가합니다. 획득 시간은 검출기 침입 기간 및 작동 길이를 포함한 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 하나의 FOV에 대한 평균 획득 시간은 약 17 분입니다. 최대 8시간 동안 기기를 논스톱으로 사용하면 약 28개의 FOV를 스캔할 수 있습니다. 획득 한 이미지의 품질은 연속 사용 시간 후에 감소합니다.
   4. FOV 목록을 만든 후 이미지 초점으로 진행하고 빔을 이미지화되지 않을 조직 영역으로 이동하여 오명을 조정합니다. 명확한 중앙 이미지가 얻어질 때까지 매개 변수를 조정합니다.
      참고: 이미지 획득을 최적화하려면 슬라이드에서 조직 섹션을 중앙 집중식으로 유지하는 것이 이상적입니다. 초점을 맞추는 동안 중앙 영역에만 대한 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 조직 부분이 너무 크면 가장자리의 초점이 맞지 않고 이미지가 흐려집니다.
   5. 실행 시작을 클릭하십시오. 획득 한 이미지는 자동으로 업로드되어 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램에 저장됩니다.

6. 이미지 준비

1. 이미지 등압 보정
   참고: 등압 보정의 목적은 질량 분석기를 사용하여 질량의 차이를 검출할 수 없는 동일하거나 매우 유사한 질량의 동위원소의 존재로 인해 발생하는 채널 간의 유출 신호를 제거하는 것입니다.
   1. 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램에서 녹색 다운로드 아이콘을 클릭하여 FOV(TIFF 이미지)를 저장합니다.
   2. 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램의 정보 탭에서 사용할 수 있는 가장 업데이트된 버전의 이미지 처리 소프트웨어( 자료 표 참조)를 다운로드하여 파일에 저장합니다. .zip 아카이브 파일을 열고 설치 단계를 따르십시오. 설치가 완료되면 소프트웨어를 엽니 다.
   3. 이미지 처리 소프트웨어의 입력 창에서 파일 아이콘을 클릭하여 수정할 이미지가 들어 있는 폴더를 선택합니다. FOV 목록이 로드됩니다.
   4. 입력 창에서 필터 아이콘을 클릭하여 기본 수정 사항을 적용합니다. 각 채널에 대해 보정 전후에 얻은 이미지를 화면 오른쪽에서 시각화합니다.
   5. 출력 창에서 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 수정된 이미지를 저장합니다.
2. 이미지 필터링: 보로노이 테셀레이션
   참고: Voronoi 테셀레이션 다이어그램은 Voronoi 셀에 시드 포인트를 포함하는 공간의 분할을 보여줍니다. 목표는 셀 밀도를 추정하고 셀 경계를 정의하는 것입니다. Voronoi 테셀레이션 계산을 사용하여 마스크가 생성되고 필터링을 위해 원본 이미지에 적용됩니다.
   1. 필터링 탭을 클릭하고 필터링 매개 변수 메뉴에서 Voronoi Tesselation 을 선택합니다.
   2. 입력 창에서 대량 수정.tiff 이미지를 선택합니다. 입력 창에서 필터 아이콘을 클릭합니다.
   3. 출력 창에서 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 필터링된 이미지를 저장합니다. 결과 두 파일에는 접미사 -Filtered.tiff 및 -Filtered.json이 있습니다.
      참고: MassCorrected-Filtered.tiff라는 이름의 이미지는 타사 디지털 분석 소프트웨어 프로그램 또는 오픈 소스 소프트웨어 프로그램에 업로드할 수 있습니다.

편도선 및 폐 선암종 TMA 조직 절편(두께 5 mm)을 수득하고, 조직 크기 및 슬라이드의 안전한 여백에 관한 사양에 따라 금 코팅된 슬라이드의 중간에 놓았다. 조직의 가장자리와 유리 슬라이드의 측면 및 열등한 경계 사이의 5mm 및 10mm의 자유 유리 여백은 최적의 염색을 위해 각각 필요합니다. 조직 절편을 슬라이드에 대한 절편의 적절한 부착을 보장하기 위해 염색 전에 오븐에서 밤새 구웠다. 항체 패널은 23개의 마커로 구성되었다. 동일한 염색 배치에서, 다수의 조직을 함유하는 편도선 슬라이드 및 TMA 슬라이드를 폐 선암종 샘플에서 희소하게 발현된 마커의 발현을 평가하기 위해 포함시켰다(도 1). 양성 대조군은 패널에 사용된 항체의 표적에 따라 선택될 필요가 있다; 예를 들어, SOX10 발현을 평가하기 위해서는 흑색종 샘플이 필요하며, GAFP 발현을 평가하기 위해서는 교모세포종 샘플이 필요하다(그림 2).

그림 1: 동위원소 순도 및 채널 교차 대화. 매트릭스는 프로브 순도 및 산화물 (파란색 상자, ≥0.5 %, 투명 상자 <0.5 %)에서 파생 된 교차 화의 비율을 보여줍니다. 질량 태그의 경우 채널(녹색), 하나 또는 두 개의 채널(노란색) 또는 두 개 이상의 채널(주황색)에 0.5% 이상의 크로스토크를 기여한 프로브가 표시됩니다. 프로브 없음(녹색), 하나 또는 두 개의 프로브(노란색) 또는 두 개 이상의 프로브(주황색)로부터 적어도 0.5% 크로스토크를 수신하는 질량 채널도 또한 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 상이한 조직에서의 대표적인 염색 이미지 . (A) 폐 선암종. (B) 비신생물성 신장. (C) 편도선. CD20은 노란색으로, Ki67은 자홍색으로, CD3는 흰색으로, CD11c는 녹색으로, CD68은 빨간색으로, 시토케라틴은 시안, 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 파란색으로 나타내었다. 배율, 200x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 염색 절차는 표준 면역 조직 화학 염색과 매우 유사하며 이틀 연속으로 발생했습니다. 염색 프로토콜의 5가지 주요 단계는 1) 과량의 파라핀 제거, 2) 항원 검색, 3) 항체 차단, 4) 항체 염색, 5) 고정 및 탈수(도 3)이다. 염색 절차의 근본적인 단계는 플라스틱 제품에 저장된 금속이없는 시약을 사용하고 기계적 손상을 제한하기 위해 샘플을주의 깊게 취급하는 것을 포함하여 샘플의 금속 오염을 피하기 위해 예방 조치를 취하는 것입니다. 염색 직전에 항체 칵테일을 준비하는 것이 좋습니다. 이것은 금속 교환을 감소시킨다. 염색이 완료되면 슬라이드를 저장하고 다음날 스캔했습니다. 이미지를 획득하기 전에 필요한 단계는 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램을 사용한 슬라이드 설정입니다(그림 4).

그림 3: 이미지 획득 워크플로 및 연관된 슬라이드. (A) 이미지 획득 워크플로우 요약. 1) 금속 접합된 항체로 염색된 FFPE 조직 절편은 1차 이온 건을 사용하여 래스터화되어 이차 이온을 방출한다. 2) 비행 시간 질량 분석기는 픽셀 수준에서 질량을 기준으로 이온을 분리하고 측정합니다. 3) 이차 이온의 화소 기반 정량화. y축은 검출된 이온수(피크)에 해당하고, x축은 각 금속의 질량에 해당합니다. 4) 각 질량 스펙트럼의 피크를 기반으로 다차원 이미지가 재구성됩니다. (B) 이 절차에 사용된 슬라이드의 개략도. 최적의 염색 조직을 위해, 섹션은 슬라이드의 측면 가장자리에서 최소 5mm, 열등한 가장자리에서 10mm 이상 위치해야 합니다. 조직 섹션 주위에 소수성 장벽을 그릴 때는 슬라이드 가장자리에서 최소 1mm 떨어진 사각형 안에 보관해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램의 슬라이드 설정 슬라이드 스캔하기 전에 각 슬라이드를 설정해야 합니다. 슬라이드 식별에 도움이 될 수 있는 원하는 세부 정보를 입력합니다. 섹션 추가 (검은색 화살표)를 클릭하여 블록 및 위치 정보를 포함합니다. 저장하려면 제출(빨간색 화살표)을 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

스캔 당일에는 제어 소프트웨어를 사용하여 수집 장비를 켭니다. Exchange 슬라이드 를 클릭하면 계측기의 문이 열리고 슬라이드를 로드할 수 있습니다. 우리는 슬라이드를 오른쪽의 레이블과 마주 보는 로딩 슬롯에 배치했습니다. 한 번에 하나의 슬라이드만 스캔할 수 있습니다. 다음 단계는 FOV를 선택하고 프로토콜에 설명 된 단계에 따라 초점과 스티그먼트를 조정하는 것이 었습니다. 실행 시작을 클릭하여 이미지를 획득했습니다. 획득 시간은 원하는 FOV 크기 및 해상도에 따라 다릅니다. FOV 크기는 200 μm x 200 μm ~ 800 μm x 800 μm이며, 이는 128 픽셀 x 128 픽셀 x 2048 픽셀 x 2048 픽셀의 프레임 크기 범위에 해당합니다. 세 가지 표준 해상도를 사용할 수 있습니다: 굵은, 미세, 초미세. 초미세 분해능에서 더 큰 FOV를 스캔하는 것은 시간이 많이 걸리며 하나의 FOV에 대한 최종 획득 시간은 25초 ~ 4.7시간입니다(그림 5).

그림 5: 제어 소프트웨어를 사용한 이미지 수집. 획득 설정은 원하는 대로 조정할 수 있습니다. 스캔 해상도를 수정하려면 이미징 모드 (검은색 화살표)로 드롭다운 메뉴를 클릭합니다. FOV 크기를 수정하려면 FOV 크기(μm) 필드에 숫자를 입력합니다(빨간색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

스캔이 완료되면 모든 FOV를 포함하는 이미지 세트가 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램에 자동으로 업로드되었습니다. 이미지 저장 외에도이 응용 프로그램은 모든 채널을 함께 또는 별도로 시각화하고 이미지를 조정하며 추가 준비를 위해 이미지를 다운로드 할 수 있습니다. 표준 시각화된 이미지는 TIFF 파일로 저장됩니다(그림 6).

그림 6: 웹 기반 이미지 관리 응용 프로그램을 사용한 이미지 시각화. 획득 한 이미지는 온라인 플랫폼을 사용하여 저장되고 시각화됩니다. 시각화 매개 변수를 조정하고 각 마커의 색상을 변경할 수 있습니다. 이미지 채널 추가 (흰색 화살표)를 클릭하여 다른 마커를 시각화합니다. 배율, 200x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

금속 간섭은 이를 최소화하기 위한 전략의 사용에도 불구하고 금속 라벨링 방법에 내재되어 있다. 항체에 접합된 금속 동위원소에서 과도한 배경 신호를 제거하고 분석을 위한 이미지를 준비하기 위해 관련 이미지 처리 소프트웨어를 사용했습니다( 자료 표 참조). 이미지 준비 절차에는 1) 채널 간 신호를 제거하는 등압 보정과 2) 이미지의 집계로 인한 신호를 제거하는 필터링의 두 단계가 있습니다.

등압 보정을 시작하려면 입력 창의 파일 아이콘을 클릭하여 저장된 TIFF 이미지가 포함된 파일을 선택했습니다. 이 소프트웨어는 파일에 보관 된 모든 TIFF 이미지를로드하여 배치 분석을 가능하게합니다. 그런 다음 입력 창의 필터 아이콘을 클릭하여 이미지를 수정했습니다. 접미사가 -MassCorrected인 결과 파일 두 개가 자동으로 생성되었는데, 하나는 TIFF 형식으로 보관되고 다른 하나는 JSON 형식으로 보관됩니다. 기본적으로 결과 아카이브는 초기 이미지가 로드된 파일과 동일한 파일에 저장되었습니다(그림 7).

그림 7 : 이미지 준비 : 보정 단계. 이미지 처리 소프트웨어에서 준비하기 위해 이미지를 로드하려면 입력 창에서 파일 아이콘(검은색 화살표)을 클릭하고 이미지를 선택합니다. 기본 수정 절차를 적용하려면 입력 창에서 필터 아이콘(빨간색 화살표)을 클릭합니다. 업데이트되고 수정된 이미지를 저장하려면 출력 창에서 플로피 디스크 아이콘을 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이미지 준비의 두 번째 단계는 소프트웨어의 상단 탭에서 선택할 수있는 필터링입니다. 입력 창에서 수정된 이미지를 선택했습니다. 이 단계에서는 자동화된 Voronoi 테셀레이션을 필터링 매개 변수로 사용했습니다. 입력 패널에서 필터 아이콘을 클릭하면 선택한 필터가 모든 채널에 자동으로 적용됩니다. 두 이미지 준비 단계(보정 및 필터링)에서 처리 전후의 각 채널의 이미지와 신호 차이가 화면의 오른쪽에 표시됩니다.

등압 보정 단계와 마찬가지로 TIFF와 JSON 형식의 아카이브가 두 개의 새 아카이브가 생성되었습니다. 이 단계에서 파일 이름 뒤에 오는 접미사는 -Filtered입니다. 따라서 얻어진 최종 이미지의 이름은 MassCorrected-Filtered.tiff이었다. 이러한 단계를 완료함으로써, 우리는 선호되는 디지털 병리학 소프트웨어를 사용하여 분석을위한 이미지를 준비했습니다 (그림 8 및 그림 9). 이 기술을 사용하여, 우리는 단일 조직 절편에서 세포 하위수준에서 채널 사이의 간섭을 최소화하면서 항체 패널의 모든 23 마커를 분석 할 수있었습니다.

그림 8 : 이미지 준비 : 필터링 단계. 이미지 처리 소프트웨어의 위쪽 탭(검은색 화살표)에서 필터링을 선택합니다. 필터링 매개 변수에서 원하는 방법(녹색 화살표)을 선택합니다. 입력 창에서 대량 보정된 이미지를 선택합니다. 선택한 절차를 이미지에 적용하려면 입력 창에서 필터 아이콘(빨간색 화살표)을 클릭합니다. 업데이트된 필터링된 이미지를 저장하려면 출력 창에서 플로피 디스크 아이콘을 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 9: 염색 전후의 대표적인 이미지 준비 방법. (A) 편도선 조직 절편의 이미지는 이 기술을 이용하여 염색하고 필터링 및 보정하기 전에 타사 디지털 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시각화한다. (b) 필터링 및 보정 단계 후 동일한 조건하에서 동일한 섹션의 이미지. CD20은 노란색으로, Ki67은 자홍색으로, CD3는 흰색으로, CD11c는 녹색으로, 시토케라틴은 시안, 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 파란색으로 표시된다. 배율, 200x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 항체 패널 목록. 각각의 항체는 열거된 바와 같이 상이한 질량을 갖는 특정 금속 동위원소에 접합되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 갈등이 없습니다.