Name: 포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 학습하세요 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 통해 종양 미세 환경을 분석하는 방법을. 항체 최적화와 단일 조직 섹션에서 최대 40개 마커 동시 정량화가 가능합니다.

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저자들은 이 기사를 편집한 MD 앤더슨의 연구 의학 도서관인 편집 서비스(Editing Services)의 돈 노우드(Don Norwood)와 MD 앤더슨(MD Anderson)의 번역 분자 병리학과의 멀티플렉스 면역형광 및 이미지 분석 연구소(Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory)를 인정한다. 이 간행물은 부분적으로 국립 암 연구소 (NCI) 협력 협약 (U24CA224285)을 통해 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터 암 면역 모니터링 및 분석 센터 (CIMAC)에 제공된 암 면역 모니터링 및 분석 센터 - 암 면역 데이터 커먼즈 네트워크 (CIMAC-CIDC)에 대한 과학적 및 재정적 지원에 의해 촉진 된 연구에서 비롯되었습니다.

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저자는 공개 할 갈등이 없습니다.

TME의 여러 구성 요소 간의 복잡하고 복잡한 상호 작용에 대한 포괄적 인 해명은 암 연구의 중추적 인 목표로 남아 있습니다. 제조업체는 이러한 노력의 일환으로 특히 지난 5 년 동안 수많은 다중 분석을 도입했습니다. 다중화 공간 분석은 종양 샘플에서 구조적 형태를 보존하면서 여러 표적의 동시 분류를 용이하게하는 다재다능하고 강력한 도구입니다. 공간 분석 기술은 본원에 기재된 기술(11,12,13)과 같은 형광 이미징 또는 질량 분광법을 사용하여 수행될 수 있다.
염색 전에, 항체 염색 재현성을 표준화하기 위해 정기적인 면역조직화학 프로토콜에 이어 염색 프로토콜을 이용한 항체 최적화가 요구된다. 매우 잘 알려진 사실은 상이한 정규 항체 클론이 상이한 조건 하에서 최적의 발현을 가질 수 있다는 것이다. 그러나, 항체...

클론 종양 집단을 둘러싼 수많은 세포 유형의 중요성은 발암 분류에 중요한 요소입니다. 이러한 종양 미세환경(TME) 조성 및 상호작용을 해명하는 것에 대한 관심은 암 치료 무기고의 일부로서 면역-기반 요법의 확립 이후 지속적으로 증가하였다. 따라서, 치료 전략은 종양 중심 접근법에서 TME 중심 접근법1로 이동하였다.
종양 감시 및 암 발생에서 면역 세포의 역할을 밝히려는 노력은 최근 몇 년 동안 눈에 띄게 증가했습니다 2,3. 의학 연구에서, 세포 측정 기반 방법과 단일 플렉스 및 멀티플렉스 이미징 기술을 포함한 많은 방법이 TME의 여러 요소의 고유 한 상호 작용을 해독하려는 시도의 일환으로 발생했습니다.
유세포 분석기 (1960 년대에 발명 됨), 형광 활성화 세포 분류 및 질량 세포 측정과 같은 선구적인 방법은 주로 TME 성분4를 확인하고 정량화하는 데 중점을 둡니다. 세포측정법 기반 정량적 기술이 면역 풍경 표현형을 허용하더라도, 세포 공간 분포를 결정하는 것은 불가능하다. 반대로, 표준 단일플렉스 면역조직화학과 같은 방법은 조직 구조를 보존하고 연구자들이 세포 분포를 분석할 수 있게 하지만, 단일 조직 절편에서 표적의 수가 감소하는 것은 이러한 방법의 한계이다 5,6. 지난 몇 년 동안, 멀티플렉스 면역형광, 바코딩 형광 이미징 및 이미징 질량 분광법과 같은 단일 세포 분해능을 위한 멀티플렉스 이미징 기술은 동일한 조직 섹션7을 사용하여 동시 마커 염색에 대한 정보를 획득하기 위한 포괄적인 전략으로 부상하였다.
여기에서는 금속 태깅된 항체와 이차 이온 질량 분광법을 결합하고 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 및 신선한 냉동(FF) 조직 샘플8,9를 이용한 단일 세포 분해능 정량화, 마커 공동발현(표현형) 및 공간 분석을 가능하게 하는 기술을 제시합니다. FFPE 샘플은 조직 보관 샘플에 가장 널리 사용되는 재료이며, 신선한 냉동 샘플(10)보다 멀티플렉스 이미징 기술에 대해 더 쉽게 이용가능한 자원을 나타낸다. 또한이 기술은 몇 달 후 이미지를 다시 획득 할 수있는 가능성을 제공합니다. 여기에서, FFPE 조직 샘플을 사용하는 우리의 염색 및 이미지 처리 프로토콜에 대해 논의한다.

<table><tbody><tr><td>100% 시약 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td></td></tr><tr><td>95% 시약 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3404</td><td></td></tr><tr><td>80% 시약 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3279</td><td></td></tr><tr><td>70% 시약 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R315</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS-T</td><td>Ionpath</td><td>567005</td><td></td></tr><tr><td>10X 저바륨 PBS pH 7.4</td><td>Ionpath</td><td></td><td></td>567004</tr><tr><td>10X 트리스 pH 8.5&nbsp;</td><td>Ionpath</td><td>567003</td><td></td></tr><tr><td>4&deg; C 냉장고</td><td>ThermoScientific</td><td>REVCO</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배리어 피펫 팁 P10</td><td>Olympus</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배리어 피펫 팁 P20</td><td>Olympus</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배리어 피펫 팁 P200</td><td>Olympus</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배리어 피펫 팁 P1000</td><td>Olympus</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>원심 필터 Ultrafree-MC</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 H2O</td><td>Ionpath</td><td>567002</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip 슬라이드 염색 용기, 녹색</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>71385-G</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip 슬라이드 염색 용기, 노란색</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71385-Y</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip 슬라이드 염색 키트(Jar+Rack), 백색</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>71388-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip 스테인리스 스틸 홀더</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>71388-50</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 70% EM 등급</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>16360</td><td></td></tr><tr><td>HIER(Heat Induced Epitope Retrieval) 버퍼: EDTA가 있는 10X Tris, pH 9</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>내열 슬라이드 챔버</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62705-01</td><td></td></tr><tr><td>소수성 장벽 펜</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>MIBI/O 소프트웨어</td><td>, 이온경로</td><td>NA</td><td></td></tr>, <tr><td>MIBI제어 소프트웨어</td><td>, 이온경로</td><td>NA</td><td></td></tr>, <tr><td>MIBI슬라이드</td><td>이온경로</td><td>567001</td><td></td></tr><tr><td>MIBIscope</td><td>, 이온경로</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Moisture Chamber (Humid Chamber)</td><td>Simport</td><td>M922-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>PT Module</td><td>Thermo Scientific</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units</td><td>Fisher Scientific</td><td>097403A</td><td></td></tr><tr><td>쉐이커</td><td>BioRocker</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>스핀 컬럼 (Ultrafree-MC 스핀 필터, 0.5mL 0.1&mu; m)</td> <td>MillQ</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>6901</td><td></td></tr><tr><td>진공 캐비닛 데시케이터</td><td>VWR</td><td>30621-076</td><td></td></tr><tr><td>Task-whipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

면역 기반 치료법의 발전은 암 치료 및 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이것은 종양 면역 풍경의 특성화에 대한 수요 증가를 촉발시켰다. 표준 면역 조직 화학은 조직 아키텍처를 연구하는 데 적합하지만 소수의 마커 분석으로 제한됩니다. 반대로, 유세포 분석기와 같은 기술은 조직 형태학에 대한 정보가 손실되지만 동시에 여러 마커를 평가할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 표현형 및 공간 분석을 통합하는 다중화 전략이 종양 면역 풍경의 특성화에 대한 포괄적 인 접근법으로 부상했습니다. 여기에서는 분석 개발 및 최적화, 조직 준비 및 이미지 획득 및 처리의 기술적 단계에 중점을 둔 금속 표지 항체와 이차 이온 질량 분광법을 결합한 혁신적인 기술에 대해 논의합니다. 염색하기 전에 금속 표지 항체 패널을 개발하고 최적화해야합니다. 이 하이플렉스 이미지 시스템은 단일 조직 섹션에서 최대 40개의 금속 태그가 지정된 항체를 지원합니다. 참고로, 신호 간섭의 위험은 패널에 포함된 마커의 수에 따라 증가합니다. 패널 설계 후, 이러한 간섭을 최소화하기 위해 항체에 대한 금속 동위원소 할당에 특별한주의를 기울여야한다. 예비 패널 검사는 항체의 작은 서브셋 및 대조군 조직에서 전체 패널의 후속 검사를 사용하여 수행된다. 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직 절편을 얻어 금 코팅 슬라이드에 장착하고 추가로 염색한다. 염색은 2 일이 걸리며 표준 면역 조직 화학 염색과 매우 유사합니다. 샘플이 염색되면 이미지 수집 장비에 배치됩니다. 시야가 선택되고 이미지가 수집, 업로드 및 저장됩니다. 마지막 단계는 시스템의 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 간섭을 필터링하고 제거하기위한 이미지 준비입니다. 이 플랫폼의 단점은 분석 소프트웨어가 부족하다는 것입니다. 그러나 생성 된 이미지는 다른 계산 병리학 소프트웨어에 의해 지원됩니다.

편도선 및 폐 선암종 TMA 조직 절편(두께 5 mm)을 수득하고, 조직 크기 및 슬라이드의 안전한 여백에 관한 사양에 따라 금 코팅된 슬라이드의 중간에 놓았다. 조직의 가장자리와 유리 슬라이드의 측면 및 열등한 경계 사이의 5mm 및 10mm의 자유 유리 여백은 최적의 염색을 위해 각각 필요합니다. 조직 절편을 슬라이드에 대한 절편의 적절한 부착을 보장하기 위해 염색 전에 오븐에서 밤새 구웠다. 항체 패널은 23개의 마커로 구성되었다. 동일한 염색 배치에서, 다수의 조직을 함유하는 편도선 슬라이드 및 TMA 슬라이드를 폐 선암종 샘플에서 희소하게 발현된 마커의 발현을 평가하기 위해 포함시켰다(도 1). 양성 대조군은 패널에 사용된 항체의 표적에 따라 선택될 필요가 있다; 예를 들어, SOX10 발현을 평가하기 위해서는 흑색종 샘플이 필요하며, GAFP 발현을 평가하기 위해서는 교모세포종 샘플이 필요하다(그림 2)....

암 면역 요법 시대에, 종양 미세 환경 역학을 밝히는 것에 대한 관심이 눈에 띄게 증가했습니다. 이 프로토콜은 염색 및 이미징 단계와 관련하여 질량 분광법 이미징 기술을 자세히 설명하므로 고도로 다중화 된 공간 분석이 가능합니다.

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

이러한 프로토콜은 단일 세포 분해능 정량화, 마커 동시 발현 및 포르말린 고정 및 파라핀 포매 및 신선한 냉동 조직 샘플을 사용한 특수 분석을 가능하게 하여 암에서 면역 세포의 역할을 해명합니다. 이 기술은 단일 조직 섹션에서 40 마커의 동시 특성화를 용이하게하고 샘플에서 조직의 구조를 널리 보존하는 강력한 도구입니다. 중요한 단계는 항체 최적화 및 검증입니다.단계를 완료하지 못하면 이미지 품질이 낮아져 고품질의 재현 가능한 데이터 및 결과가 손상될 수 있습니다. 모든 항체 함유 튜브를 10, 000 x G에서 5 분 동안 스핀 다운하여 시작하고 개별 항체를 블로킹 버퍼에 추가하고 잘 혼합하십시오. 피펫팅할 때 항체 튜브의 바닥을 방해하지 마십시오.0.1 마이크로미터 원심 필터 장치를 100 마이크로리터의 블로킹 완충액으로 사전 습윤시켜 항체 패널을 여과한다. 필터를 10, 000 x G에서 2분 동안 돌리고 피펫으로 블로킹 버퍼 유동을 제거합니다. 그런 다음 항체 패널을 스핀 컬럼으로 옮기고 필터를 10, 000 x G에서 2 분 동안 회전시킵니다.스핀 컬럼을 폐기하고 플로우 스루를 여과된 항체 패널로 사용합니다. 항체 염색의 경우 각 슬라이드를 옆으로 기울이고 작업 와이퍼에 가장자리를 부드럽게 두드려 슬라이드에서 차단 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 수분 챔버에 넣고 100 내지 200 마이크로리터의 항체 마스터 믹스를 조직에 첨가한다.양성 및 음성 대조군 슬라이드를 염색 배치에 추가하고 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 기기를 설정하려면 제어 소프트웨어에 로그인하고 기기가 절전 모드인 경우 Wake Up(깨우기)을 클릭합니다. Exchange 샘플을 클릭하여 슬라이드를 로드한 다음 계속을 클릭하여 문을 엽니다.샘플이 위를 향하고 오른쪽에 레이블이 있는 로딩 슬롯에 슬라이드를 넣고 계속을 클릭하여 문을 닫습니다. 프로젝트를 선택한 다음 로드된 샘플의 슬라이드 이름을 선택합니다. 시야 또는 FOV 선택을 위해 슬라이드 광학 이미지 창에서 파노라마 이미지를 시각화하고 모드 메뉴를 클릭하고 2차 전자 검출기를 선택한 다음 이미징 모드 메뉴를 클릭하고 QC 300마이크로미터를 선택합니다.조그 스테이지를 클릭하여 FOV 위치를 제어한 다음 화살표를 클릭하여 FOV의 위치를 탐색하고 선택합니다. FOV 추가를 클릭하고 필드 크기로 400마이크로미터 x 400마이크로미터를 설정하고 이미징 모드로 정밀을 선택하고 유지 시간 1밀리초를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. FOV 목록을 만든 후 이미지 초점으로 진행하고 빔을 이미징되지 않을 조직 영역으로 이동하여 Stigmation을 조정합니다.명확한 중앙 이미지를 얻을 때까지 매개 변수를 조정하고 Start Run을 클릭하십시오. 획득한 이미지는 웹 기반 이미지 관리 애플리케이션에 자동으로 업로드되어 저장됩니다. 여기에 표시된 매트릭스는 프로브 순도와 산화물에서 파생된 누화 백분율을 설명합니다.여기서 파란색 상자는 0.5% 누화 이상을 나타내고 투명 상자는 0.5% 누화 미만을 나타냅니다. Mass 태그의 경우 최소 0.5%누화에 기여한 프로브가 채널에 없거나 하나 또는 두 개 이상의 채널이 여기에 표시됩니다. 프로브 없음, 하나 또는 두 개의 프로브 또는 두 개 이상의 프로브에서 최소 0.5%누화를 수신하는 질량 채널도 표시됩니다.폐 선암, 비종양성 신장 및 편도선과 같은 다양한 조직의 대표적인 염색 이미지가 여기에 묘사되어 있습니다. 이 기술을 사용하여 염색되고 필터링 및 보정 전에 타사 디지털 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시각화된 편도선 조직 섹션의 이미지가 여기에 표시됩니다. 필터링 및 수정 단계 후 동일한 조건에서 동일한 섹션의 이미지가 여기에 표시됩니다.이 방법은 타사 디지털 이미지 분석 소프트웨어에 업로드할 수 있는 이미지를 생성하여 조직 구획화, 세포 분할, 마커 공동 발현, 이웃 분석 및 원거리 분석과 같은 포괄적인 분석을 가능하게 합니다. 고도의 멀티플렉스 이미징 방법은 연구를 통해 사용할 수 있습니다. 다양한 패널을 구성함으로써 연구자들은 암, 정상, 부신 생물, 염증 및 감염성 샘플을 조사 할 수 있습니다.

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암 연구

암세포 단백질체에 대한 심층 분석은 새로운 약물 표적 및 진단 바이오마커의 식별을 용이하게 합니다. 우리는 액체 및 고체 종양에서 유래한 암세포 하위 집단에서 (인) 단백질체의 정량 분석을 위한 실험적 워크플로우를 설명합니다. 이는 세포 농축 전략과 정량적 Super-SILAC 기반 질량 분석법을 결합하여 달성됩니다.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

세포 및 조직 coculture 이미징 질량 분석을 사용 하 여 작은 분자 exchange 검색에 맞게 샘플 준비 하는 새로운 방법 개발 되었다.

조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

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이 프로토콜은 레이저 미세 해부를 사용하여 조직학적으로 해결된 세포 집단의 농축을 위해 염색된 얇은 조직 섹션 이미지로부터 병리학적으로 확인된 관심 영역의 인공 지능 기반 세분화를 위한 고처리량 워크플로우를 설명합니다. 이 전략에는 관심 있는 세포 집단을 나타내는 경계선을 레이저 현미경으로 직접 전송할 수 있는 새로운 알고리즘이 포함되어 있습니다.

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이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 논문에서는 복막 전이의 3차원 구조를 특성화하기 위해 최적화된 다중 면역형광 프로토콜에 대해 설명합니다.

Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편에서 분리된 관심 영역을 사용하여 질량 분석 기반 단백질체학 방법을 확립합니다. 이 프로토콜은 보관된 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편의 특정 조직 영역에서 단백질체를 분석하는 데 사용됩니다.

선택된 조직 영역을 사용하는 질량 분석 기반 단백질체학을 위한 간소화된 접근법

이 프로토콜은 쥐 FFPE 흑색종 조직의 DNA 바코드 기반 이미징을 위한 다중 면역형광 항체 패널을 설계하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 또한 쥐 흑색종 종양 면역 미세환경에 대한 공간 단백질체학 통찰력을 생성하기 위해 오픈 소스 도구를 사용하는 이미지 분석 파이프라인에 대해 설명합니다.

유전적으로 재프로그래밍된 쥐 흑색종의 FFPE 검체를 분석하기 위한 DNA 바코드 기반 다중 면역형광 이미징

학습하세요 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 통해 종양 미세 환경을 분석하는 방법을. 항체 최적화와 단일 조직 섹션에서 최대 40개 마커 동시 정량화가 가능합니다.

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

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