Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64023
Automatic Translation
1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

Summary

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Abstract

Görsel biyokimya, toplu faz çalışmalarında gerçekleşen ortalamada gizlenen tek enzimlerin veya enzim komplekslerinin stokastik özelliklerini gözlemlemek için güçlü bir tekniktir. Görselleştirmeyi başarmak için, bir tuzağın sabit, diğerinin hareketli olduğu çift optik cımbız, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirilmiş çok akışlı bir mikroakışkan odanın bir kanalına odaklanır. Optik cımbızlar, floresan olarak etiketlenmiş DNA'nın tek moleküllerini yakalar ve odadan ve sıkışmış boncuklardan geçen sıvı akışı, DNA'yı B formuna (minimum kuvvet altında, yani 0 pN) uzatır ve nükleik asit siyah bir arka plana karşı beyaz bir ip olarak gözlenir. DNA molekülleri, reaksiyonların kontrollü bir şekilde başlatılmasını sağlamak için aşamayı akışa dik olarak çevirerek bir akıştan diğerine taşınır. Başarıya ulaşmak için, optik olarak berrak kanallara sahip mikroakışkan cihazlar, bir şırınga pompasında yerinde tutulan cam şırıngalarla eşleştirilir. Optimum sonuçlar, akış hücresine kalıcı olarak bağlanmış konektörler, mekanik olarak sert ve kimyasal olarak dayanıklı olan ve laminer akışı yasaklayan kabarcıkları ortadan kaldıran anahtarlama valflerine bağlı borular kullanır.

Introduction

Protein-DNA etkileşimlerini tek molekül düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak görselleştirme yeteneği, genom stabilitesi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır 1,2. DNA'nın tek molekülleriyle birer birer çalışmaya ek olarak, yakındaki tek tek moleküller arasındaki işlemleri görüntüleme yeteneği ek içgörü sağlar 3,4,5. Ek DNA moleküllerinin manipülasyonu hem ek optik tuzaklar hem de yüksek kaliteli, çok kanallı, mikroakışkan akış hücreleri gerektirir6.

Birden fazla optik tuzak oluşturmak için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Bunlar arasında galvanometre tarama aynaları, akustik optik modülatörler ve holografik optik cımbız 4,7,8,9 üreten kırınımsal optikler bulunur. Çoğu zaman, tarama aynaları ve akustik optik modülatörler devre mülk tuzakları üretir. Burada açıklanan kurulumda, tek bir Nd: YAG lazerin ışını polarizasyon üzerine bölünür ve daha sonra galvanometre lazer tarama aynaları mobil tuzak olarak adlandırılan şeyin konumunu kontrol eder (Şekil 1)4. Tuzak ışını mikroskop hedefinin arka açıklığına yönlendirmek için aynaların ve filtrelerin konumlandırılmasını kolaylaştırmak için bir HeNe lazer kullanılır. Bu, HeNe ışını çıplak gözle görülebildiği için genel hizalamayı kolaylaştırırken, kızılötesi ışınlar görünmez. HeNe ışını, aynaların ve diğer bileşenlerin konumlandırılmasını daha az stresli hale getirmek için çalışmak için daha güvenlidir. Başlangıçta, bu lazerin ışın yolu 1064 nm ışından ayrıdır, ancak aynı ışın yoluna ve daha sonra mikroskop hedefine sokulur. Fiziksel hizalama sağlandıktan sonra, 1064 nm ışının HeNe ışınının üzerine konumlandırılması yapılır ve bu, ışın konumunu ve kalitesini görselleştirmek için bir kızılötesi görüntüleyici ve çeşitli ışın görüntüleme araçlarının kullanılmasıyla kolaylaştırılır. Daha sonra, ışın genişletici tanıtılır ve elde edilen genişletilmiş kızılötesi ışın, hedefin arka açıklığına hizalanır. Son olarak, hedef kaldırılır ve her polarize ışındaki güç ölçülür ve λ/2 dalga plakaları kullanılarak eşit olacak şekilde ayarlanır (Şekil 1C). Güç ölçümleri, hedefe geri dönüldüğünde de yapılır ve tipik olarak% 53'lük bir güç kaybı olur. Bununla birlikte, odak düzleminde kararlı sabit ve hareketli optik tuzaklar oluşturmak için yeterli güç vardır (Şekil 1D).

DNA işlemlerini görüntülemek için, mikroakışkan akış hücreleri, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip tek molekül düzeyinde kontrollü ölçümlere izin verdikleri için önemli bir rol oynamaktadır (Şekil 2). Mikroakışkan terimi, 5-500 μm10,11 arasında değişen boyutlarda bir veya daha fazla kanaldaki sıvıları manipüle etme yeteneğini ifade eder. Akış terimi, bir kanal içindeki gerçek sıvıyı ifade eder ve kanal, bir akışkan akışının veya akışlarının hareket ettiği fiziksel kanalı ifade eder. Tek kanallı akış hücresi tasarımı, reaksiyonların gözlemlendiği ve tipik olarak sadece bir sıvı akışının mevcut olduğu ortak, fiziksel bir kanala sahiptir. Bu nedenle, bu tasarımlar tek akışlı akış hücreleri olarak bilinir. Buna karşılık, çok akışlı akış hücreleri, iki veya daha fazla giriş kanalının tek, ortak, fiziksel bir kanalda birleştiği mikroakışkan bir cihaz olarak tanımlanır (Şekil 2A). Ortak kanal içinde, bireysel kanallardan kaynaklanan sıvı akışları birbirine paralel olarak akar ve difüzyon nedeniyle aralarında sadece minimum karışım meydana gelerek ayrı kalır (Şekil 2B). Deney kurulumlarının çoğunda, tek bir pompa sıvıları her kanala aynı hızda iter. Buna karşılık, sınır yönlendirmesi kullanıldığında, üç veya daha fazla, bağımsız olarak kontrol edilen pompa, sıvıları kanallardan iter. Bununla birlikte, her pompa farklı bir hızda çalışır, ancak ortak kanaldaki net akış hızı sabit12'dir. Bu, sadece pompa hızını değiştirerek ana kanal bileşenlerinin hızlı bir şekilde değiştirilmesini sağlar.

Laminer akışa ek olarak, bir diğer kritik faktör, laminer sıvı akışı içindeki parabolik hız profilidir. En yüksek akış hızı derenin ortasında, en yavaş ise yüzeylerin yanında meydana gelir (Şekil 2C)13. Bu profilin, floresan DNA'nın hassas bir şekilde görselleştirilmesi ve doğru tek moleküllü analizler için akışta tutulan bir boncuğa bağlı bir DNA molekülünü tamamen gerdiği düşünülmelidir. Burada, DNA B formuna gerilir ve 0 pN kuvvet altında yerinde tutulur. Bunu başarmak için, optik tuzak konumunun odaklanması alt kapak kayma yüzeyinden 10-20 μm yükseklikte olmalıdır (Şekil 2D). DNA molekülünün B formunun ötesine gerilmemesine dikkat edilmelidir, çünkü bu enzim reaksiyonlarını inhibe edebilir. Tipik tampon koşullar altında, 1 μm = 3.000 bp DNA14. Ayrıca, kapak kaymasından 10-20 μm uzakta tutularak, DNA kompleksi yüzeyden uzağa yerleştirilir ve böylece yüzey etkileşimleri en aza indirilir.

Mikroakışkan cihaz kanalları oluşturmak için birçok yöntem kullanılmıştır ve bunlar laboratuvarda yapılabilir veya akış hücreleri ticari kaynaklardan satın alınabilir 6,15,16,17. Akış hücrelerini oluşturmak için kullanılan en uygun malzemeler mekanik olarak sert, düşük floresanlı optik olarak şeffaf ve organik çözücülere karşı geçirimsiz olmalıdır6. Sıklıkla, borosilikat float cam veya kaynaşmış silika, optik yakalama, görselleştirme ve kuvvet algılama için uygun olan uzun bir süre boyunca istikrarlı bir akış ortamı sağlamak için kullanılır. Bu malzemeler ayrıca yüzey ıslatmasını ve hava kabarcıklarının giderilmesini basitleştirmek için susuz çözücülerin (örneğin, spektrofotometrik sınıf metanol) ve akış hücresini temizlemek için denatürantların (örneğin, 6M guanidinyum hidroklorür) veya deterjanların kullanılmasına izin verir. Son olarak, akışkanları akış hücrelerine sokmak için kullanılan yöntemler, karmaşık vakum pompası sistemlerinden tek şırıngalı pompalara kadar değişir 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Burada açıklanan yaklaşımda, 10 şırıngaya kadar barındırabilen bir şırınga pompası kullanılmıştır (Şekil 3A). Bu, tek kanallı akış hücrelerini veya birden çok giriş kanalına sahip akış hücrelerini kullanma esnekliği sağlar. Burada, üç kanallı bir akış hücresi kullanılır ve poli-eter-eter-keton (PEEK) borusu kullanılarak şırınga pompasında yerinde tutulan şırıngalarla eşleştirilir (Şekil 3A-C). Akışkanların akışı dört yönlü anahtarlama valfleri tarafından kontrol edilir ve böylece kabarcıkların akış hücresine girmesini en aza indirmeye yarar (Şekil 3A, D). Ek olarak, sert cam duvarlara ve politetrafloroetilen (PTFE) kaplı pistonlara sahip Hamilton gaz geçirmez şırıngalar,pürüzsüz bir akış elde etmek için gerekli olan olağanüstü pürüzsüz piston hareketi sağladıkları için tavsiye edilirler 14,27.

Açıklanan deneysel sistemde, iki ila beş giriş kanalına sahip akış hücreleri kullanılmıştır. Giriş kanallarının sayısı, yapılan deney tarafından belirlenir. RecBCD ve Hop2-Mnd1 çalışmaları için iki akış kanalı yeterli14,28 idi. Helikaz için, enzim DNA'nın serbest ucuna bağlandı ve translokasyon ve çözülmeyi başlatmak için magnezyum ve ATP içeren bir akışa çevrildi. Hop2-Mnd1 için, optik olarak hapsedilmiş DNA, proteinler ve tampon ± iki değerli metal iyonları içeren bitişik sıvı akışına çevrildi. Üç kanallı akış hücrelerinin kullanımı, DNA'nın akış 1'de yakalanmasını, protein bağlanmasının gerçekleşmesine izin vermek için DNA'yı akış 2'ye çevirmesini ve daha sonra ATP'nin mevcut olduğu 3. akışa, örneğin reaksiyonları başlatmasını sağlar. Yukarıdakilerin bir varyasyonu, kanal 2'de floresan etiketli protein kullanmaktır, bu da sıvı akışının tamamen beyaz olmasına neden olur ve DNA'nın görselleştirilmesini engeller. Bu molekül akış 3'e çevrildiğinde, reaksiyonlar başlatıldığında hem proteinler hem de DNA artık görülebilir.

Sıvı akışını kontrol etmek için dört yönlü anahtarlama valflerinin kullanılması, akış hücrelerindeki kabarcıkları ortadan kaldırmak için sistemin kritik bir bileşenidir. Kabarcıklar, öngörülemeyen şekillerde büzüldükleri ve genişledikleri için kararlı sıvı akışına zararlıdır, bu da akış hızında hızlı değişikliklere ve türbülansın ortaya çıkmasına neden olur. Vanalar şırıngalar ve giriş boruları arasına yerleştirildiğinde, şırıngalar değiştirildiğinde valf konumu değiştirilerek akış yolunun bağlantısı kesilir. Yeni şırınga yerleştirildiğinde, piston manuel olarak bastırılabilir, böylece >6 μL dışarı atılır (valfin ölü hacmi) ve bu da kabarcıkları neredeyse tamamen ortadan kaldırır.

Bağlayıcıların akış hücrelerine bağlanması, akış hücresi kullanımında genellikle hız sınırlayıcı adımdır. İki tip konektörün kullanımını tanımlıyoruz: prese sığdırma ve kalıcı olanlar (nanoport montajları) olarak bilinen çıkarılabilir. Çıkarılabilir konektörlerin bir akış hücresine yapıştırılması kolaydır ve önerilen PTFE'ye ek olarak farklı esnek boru tipleri bu konektörlerle test edilebilir. Bu, daha pahalı cam akış hücrelerinden ödün vermeden boru ve konektörleri test etmenin hızlı ve uygun maliyetli bir yoludur. Buna karşılık, nanoport tertibatları kalıcı olarak bağlanır, 1.000 psi'ye kadar basınçlara dayanır ve elimizde kullanımları farklı çaplardaki PEEK boruları ile sınırlıdır. PEEK boruları tercihen kullanıldığından bu bir dezavantaj değildir. Kalıcı montajlara sahip tek bir cam akış hücresi, dikkatli kullanımla 1 yıldan fazla bir süre boyunca tekrar kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lazer tuzak hizalama ve polistiren boncuklarla test

NOT: Kurulum için Şekil 1A,B'ye bakın.

DİKKAT: Deneyci, lazer ışını hizalaması sırasında uygun koruyucu gözlük veya lazer güvenlik gözlüğü takmalıdır. Burada açıklanan optik cımbız sistemi hem HeNe hem de IR ışınlarını kullandığından, iki ayrı lazer güvenlik cam eşyası seti gereklidir.

  1. HeNe Kiriş hizalaması
    1. Tüm optik bileşenleri breadboard üzerine yerleştirin. Breadboard'u, mikroskopa göre mümkün olduğunca 90° açıya yakın olacak şekilde hizalayın.
    2. Objektif ve telan lensi içeren çiftleşme tüpünü mikroskopa takın (Şekil 1A-11,12).
      NOT: Telan lens, görüntüyü göz merceklerindeki ara görüntü düzlemine odaklamak için kullanılan bir lens sistemidir.
    3. HeNe lazeri açın ve deklanşörü açın (Şekil 1A-18). Işın, ışığın %50'sini ayna 5'e yansıtan 54 mm yükseklikte filtreye (Şekil 1A-3) çarpmalıdır (Şekil 1A-5). Kirişin geri kalan %50'si ayna 4'e (Şekil 1A-4) ayna 3 ile aynı yükseklikte çarpar.
    4. Ayna 4'ü (Şekil 1A-4), ışın ayna 6'ya (Şekil 1A-6) 51 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın.
    5. Ayna 6'yı (Şekil 1A-6), kiriş alt galvanik aynaya 51 mm yükseklikte yönlendirilecek şekilde ayarlayın. Üst Galvanik aynadan çıkan kiriş 57,5 mm'de olacaktır.
    6. Ayna 3'ü (Şekil 1A-3), bu ışın ayna 5'e (Şekil 1A-5) 57,5 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın. Ayna 5'ten yansıdıktan sonra, ışın ayna 9'a (Şekil 1A-9) aynı yükseklikte çarpmalıdır. Işın ayna 9'da etkili bir şekilde yeniden birleştirilir, hedeften geçer ve telan lens sistemi ayna 21'e (Şekil 1A-21) yansır ve bu da onu hedefe yansıtır.
    7. Mikroskop sahnesine temiz bir mikroskop slaytı yerleştirin. Kamerayı açın ve sabit ve tarama ışınlarının ışınlarını ekranda ayrı ayrı görüntüleyin. Ayna 3, ardından 5 ve 9, son olarak 21 ile başlayarak, sabit kirişi ekranın ortasına yerleştirmek için küçük ayarlamalar yapın.
    8. Ayna 21'den çıkan ışının açısının 90° olduğundan emin olmak için, mikroskobun Z-yüksekliğini değiştirin ve görüntülenen kirişi kızağın üst ve alt yüzeylerine yerleştirin. Aynı olduklarında, kiriş sahneye dik olan doğru konumdadır. Bu ışını deklanşör 19'u kullanarak kapatın (Şekil 1A-19).
    9. Ayna 4 ve 6'dan başlayarak, sabit kirişi ekranın ortasına yerleştirmek için küçük ayarlamalar yapın. Bu ışını kapatın.
  2. Kızılötesi (IR) Işın hizalaması
    DİKKAT: Güvenlik nedenleriyle tüm adımları düşük lazer gücünde gerçekleştirin.
    1. Işın ayırıcı 2'de bölünen iletilen ve yansıyan ışınların oranını ayarlamak için dalga plakası 14'ü (Şekil 1A-14) ayarlayın (Şekil 1A-2). Işın ayırıcı 2, lazer ışınının s-bileşenini yansıtır ve p-bileşenini iletir.
    2. 2'den geçen ışın, kirişi alt galvanik aynaya saptıran ayna 7'ye (Şekil 1A-7) çarpar. HeNe ışınının ayna 21'e giden yolunu izlemelidir. Bu konumlandırmayı elde etmek için ayna 7'nin küçük hareketlerini gerçekleştirin.
    3. Ayna 2'yi, ayna 2 tarafından yansıtılan kiriş, ayna 10'a (Şekil 1A-10) 57,5 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın.
    4. Işın, ayna 10'dan ayna 8'e (Şekil 1A-8) 57,5 mm yükseklikte yansıtılır. Sonraki ışın ayna 9'a aynı yükseklikte çarpmalıdır. Değilse, aynalar 10 ve 8'de gerektiği gibi küçük ayarlamalar yapın.
    5. Hedefi çıkarın ve güç ölçerin kafasını hedef taretindeki bağlantı noktasının üzerine yerleştirin.
    6. Her lazer ışınının gücünü Şekil 1C'de gösterildiği gibi eşit olacak şekilde ayarlamak için plaka 14, 15 ve 16'yı (Şekil 1A-14,15,16) kullanın.
    7. Kiriş genişletici 1'i (Şekil 1A-1) yerine yerleştirin. Genişletilmiş lazer ışınını herhangi bir koma veya astigmatizm olmadan dairesel olacak şekilde ayarlayın.
    8. Optik tuzakları test etmek için, suya asılı 1 μm polistiren boncuklardan oluşan bir çözelti yapın. Daha sonra, bu çözeltinin 10 μL'sini bir mikroskop slaydına yerleştirin, üstüne bir kapak kayması yerleştirin ve oje ile kapatın. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve bu 1 μm boncukları yakalayarak optik tuzakları test edin. Boncukların tuzaklara emildiğinden ve sahne hareket ettirildiğinde sabit bir şekilde tutulduğundan emin olun. Tuzaklama, tuzağın her tarafından eşit derecede verimli bir şekilde gerçekleşmelidir.

2. Mikroakışkan oda hazırlığı

  1. Akış hücresi, bir kapak kapağı üzerinde polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış ticari olarak inşa edilmiş bir cihazsa, adım 3'e geçin. Konektörleri takılı bir cam cihazsa, adım 4'e geçin.
  2. Akış hücresinde konektörler takılı değilse, önce bunları mikroskop slaytındaki giriş deliklerine bağlayın. Bağlayıcı takma adımları için adım 3'e bakın.

3. PDMS akış hücresi kullanarak akış hücresi bağlantıları

NOT: Kurulum için Şekil 2B'ye bakın.

  1. Akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin. PTFE borusunu forseps ile serbest uçtan 3 mm tutun. Boruyu önceden oluşturulmuş porta itin (port 2 bar hat basıncını destekleyebilir).
  2. Kalan bağlantı noktalarının her biri için bu yordamı yineleyin. Giriş portlarını şırınga pompasına ve çıkışı bir atık şişesine bağlayın (Şekil 4A,B).
  3. Her cam şırıngayı 1 mL spektrofotometrik sınıf metanol ile doldurun. Her şırıngayı bir anahtarlama vanasına takın. Valfin çıkışın atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 μL metanol ile temizleyin (Şekil 4C, kapalı konum).
  4. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin (Şekil 4C, açık konum). Yüzeyleri ıslatmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için akış hücresinden 100 μL/s akış hızında 800 μL metanol pompalayın.
  5. Ertesi gün, 800 μL ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Akış hücresi artık kullanıma hazırdır.

4. Prese uygun boru konektörlerinin takılması

NOT: Kurulum için Şekil 2F'ye bakın.

  1. Prese takılan boru konektörleri kullanılacaksa, yapışkan bandı konektörün bir tarafından dikkatlice çıkarın ve mikroskop slaytındaki deliğin üzerine yerleştirin. Birkaç saniye boyunca aşağı basın. Kalan konektörler için işlemi tekrarlayın.
  2. Akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin. PTFE borusunu forseps ile serbest uçtan 3 mm tutun. Boruyu porttaki önceden oluşturulmuş deliğe itin ve kalan portların her biri için bu prosedürü tekrarlayın.
  3. Boruları girişlerden anahtarlama valflerine takın. 7. adıma geçin.

5. Kalıcı montajların takılması

NOT: Kurulum için Şekil 2A-C'ye bakın.

  1. Yapıştırma işlemi sırasında akış hücresini ve konektörleri yerinde tutmak için ataşmanı temiz, düz bir yüzeyde veya özel yapım bir manifoldda gerçekleştirin.
  2. Akış hücresini temiz düz bir yüzeye veya manifoldun girintili bölümüne yerleştirin (Şekil 2B). Montajın altına az miktarda cam yapıştırıcı yerleştirin ve contayı yerleştirin.
  3. Nanoportu mikroskop slaytındaki giriş deliklerinden birinin üzerine yerleştirin. Yanal hareket olmadan yavaşça aşağı doğru itin ve yerinde tutun. Kalan bağlantı noktaları için işlemi yineleyin.
  4. Manifoldda kurumaya veya kelepçelenmeye bırakın. Akış hücresini manifolddan yavaşça çıkarın ve montajların akış hücresindeki giriş portlarıyla iyi hizalandığından emin olun. Hazır olduğunuzda adım 7'ye geçin.

6. Akış hücresi bağlantıları ve hazırlanması

NOT: Kurulum için Şekil 4A,B'ye bakın.

  1. Mikroskop aşamasına bir akış hücresi yerleştirin. Parmağınızı sıkıca tutturan konektörleri kullanarak boruyu takın.
  2. Her cam şırıngayı 1 mL spektrofotometrik sınıf metanol ile doldurun. Her şırıngayı bir anahtarlama vanasına takın. Valfin çıkışın atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 μL metanol ile temizleyin (Şekil 4C, kapalı konum).
  3. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin (Şekil 4C, açık konum). Yüzeyleri ıslatmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için akış hücresinden 100 μL/s akış hızında 800 μL metanol pompalayın.
  4. Ertesi gün, 800 μL ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Akış hücresi artık kullanıma hazırdır.

7. Sıvı akışının kontrolü

  1. Anahtarlama valflerini kapalı konuma getirin (Şekil 4C). Şırıngaları çıkarın, artık suyu atın ve şırıngaları deneysel çözeltilerle, örneğin DNA boncuklarıyla doldurun; enzim; ve ATP. Şırıngaları pompaya geri döndürün ve anahtarlama valflerine bağlayın.
  2. Bu pozisyonda, herhangi bir kabarcığı çıkarmak için pistonları manuel olarak 5-10 μL aşağı doğru zorlayın. Anahtarlama valfi konumunu Açık olarak değiştirin.
  3. Tablo 1'de özetlendiği gibi yakalama ve görselleştirme için en uygun akışkan akış hızını elde etmek üzere akış hızı şemasını kullanın. Optik yakalama için en uygun sıvı akışı, boncukların kararlı bir şekilde yakalanmasını sağlamalı ve DNA gerildikten sonra, B formunda (~ 3.000 bp / μm) olmalıdır.

8. Polistiren boncukların tek DNA molekülleri bağlı olarak yakalanması

  1. 10x büyütmede, kanal giriş noktalarına yakın sıvı akışları arasındaki sınırı bulun. 100x hedefine yağ ekleyin ve daha yüksek büyütmeye geçin.
  2. Optik tuzaklar için deklanşörleri açın (her ikisi birden veya birer tane). Odaklanmış lazer ışınları boncukları yakalamalı ve DNA hemen uzanmalıdır.
  3. Bir kompleks tuzağa düşürüldükten sonra, sahneyi akışa dik olarak çevirin (Şekil 3A, C, giriş). Bu, sıkışmış kompleksi DNA boncuk çözeltisinden akış 2'ye taşıyacaktır. Daha fazla çeviri, kompleksi akış 3'e taşıyacaktır.

9. Akış hücresi temizliği

NOT: Bunu günlük olarak gerçekleştirin.

  1. Deney tamamlandığında pompayı kapatın. Anahtarlama valflerini kapalı konuma getirin (Şekil 4C).
  2. Şırıngaları çıkarın ve boşaltın. Filtrelenmiş damıtılmış su ile üç kez durulayın.
  3. Şırıngaları temizleme solüsyonu ile doldurun. Şırıngaları pompaya yerleştirin ve anahtarlama vanalarına bağlayın.
  4. Anahtarlama valflerini boşaltın ve konumu açmak için değiştirin. Tipik olarak gece boyunca 100 μL/s akış hızında 800 μL temizleme çözeltisi pompalayın.
  5. Ertesi gün, anahtarlama valflerini kapatın ve ardından şırıngaları suyla çıkarın ve durulayın. Akış hücresini ve hatlarını 400-800 μL su ile 400-800 μL / s akış hızında durulayın. Akış hücrelerinin daha yorucu bir şekilde temizlenmesi gerekiyorsa, temizleme çözeltisini 6 M guanidium hidroklorür ile değiştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tuzak hizalamasının ve mukavemetinin ilk testi 1 μm, floresan olmayan polistiren boncuklarla yapılır. Laboratuvarda yapılan araştırmaların çoğu floresan kullandığından, 1 μm, Dragon yeşil polistiren boncuklar kullanarak tuzak mukavemetini daha da test ediyoruz (Şekil 1D, E). Bundan sonra çalışma, DNA'nın bis-intercalating boya YOYO-114,29 ile boyandığı DNA-boncuk komplekslerinin optik yakalamasına dönüşür. Bu kompleksler, mikroakışkan bir akış hücresinde örtü kayma yüzeyinin 10-15 μm üzerinde sıkıştığında, boncuktan geçen sıvı akışı DNA'yı uzatır (Şekil 3B, C). Sıvı gerilmiş DNA'nın uzunluğunu, beklenen uzunluk olan B formu uzunluğuna gerildiğinden emin olmak için ölçmek önemlidir. Örneğin, bakteriyofaj lambda DNA'sı için, tam uzunluk 16 μm'den biraz daha uzundur, bu da 48.504 bp14'e karşılık gelir.

Sıvı akışını karakterize etmek için, floresan boncuklar, farklı pompa hızları kullanılarak ve farklı viskoziteli çözeltiler kullanılarak, kapak kayma yüzeyinin 15 μm üzerinde odak yüksekliğine sahip akış hücrelerine sokuldu. Boncuk pozisyonuna ait filmler yakalandı ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak boncuk pozisyonu izlendi. Sonuçlar, 1 μm çapındaki boncuklar için lineer hızın, %10-%50 arasında değişen sakkaroz çözeltilerinde 100 μL/s'lik bir pompa akış hızında doğru bir şekilde izlenebileceğini göstermektedir (Şekil 5A). Benzer koşullar altında, boncuk üzerindeki kuvvet hesaplanabilir ve pompa akış hızına ve çözelti viskozitesine bağlı olarak 10 ila 400 pN arasında değişebilir (Şekil 5B). Son olarak, 120 ila 970 nm arasında değişen boncuk çapının kuvvet üzerindeki etkisi, farklı sakkaroz konsantrasyonlarında değerlendirilmiştir. Veriler, 1-27 pN arasında değişen kuvvetlerin, bir motor proteinine farklı çaptaki boncukların bağlanması ve motordan bu boncuğu sıvı akışına karşı çekmesini isteyerek ölçülebileceğini ortaya koymaktadır (Şekil 5C).

Figure 1
Şekil 1: Optik düzen ve yakalama aktivitesinin gösterilmesi. (A) IR ışını kırmızı ve HeNe ışını siyah olan optik düzenin şeması. (B) Bir breadboard üzerine monte edilmiş optik bileşenlerin fotoğrafı. A ve B panellerindeki bileşen numaraları aşağıdaki gibidir: 1), Kiriş genişletici; 2), Girişim aynası (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), Girişim aynaları (633 nm; R = %50; T = %50); 4-6), Girişim aynaları (Rmax = 633 nm); 7), Girişim aynası (Rmax = 1064 nm; Tmax= 633 nm); 8), Girişim aynası (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), Girişim aynası (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), Girişim aynası (Rmax = 1064 nm); 11), Objektif lens, f = 110 nm; 12), Telan lens; 13), Galvanik aynalar; 14-16), Rotatörler (/2); 17), IR tarama kanalı deklanşörü; 18), Görünür kanal deklanşörü; 19), IR Sabit kanal deklanşörü; 20), Işın durur ve 21), Girişim aynası (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Güç çıkışının ölçülmesi. Lazerden gelen güç çıkışı, lazer kafasını optik düzene takmadan önce ölçülür. Tuzak hizalaması yapıldıktan sonra, ışın gücü her tuzak için 100x hedefinden sonra ölçülür. (D) ve (E) 1 μm floresan boncukların kararlı, optik olarak yakalandığını gösteren görüntüler. F, sabit tuzak ve M, tarama modunda mobil tuzak ile 30 mHz'de küçük (D) veya büyük (E) bir daire boyunca hareket eden mobil tuzak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Mikroakışkan akış hücreleri. (A) Borosilikat camdan yapılmış üç kanallı bir akış hücresinin montajı. (B) Konnektör bağlama sırasında akış hücrelerini sabit bir şekilde konumlandırmak için bir manifold. Üstte, akış hücresini yanal olarak konumlandırmak için 1 mm'lik gömme bölüme sahip alüminyum manifoldun tabanı. Dört direk (her köşede bir tane) manifoldun kapağını yerine yönlendirirken, kapağı yerinde sıkıştırmak için daha merkezi olarak yerleştirilmiş dişli cıvatalar kullanılır. Altta, manifold tabanındaki direklere ve cıvatalara uyacak şekilde delinmiş delikli manifold kapağı. (1), manifold taban cıvatalarına tutturulmuş somunlar; (2) yapıştırma işlemi sırasında hafif gerilim sağlamak için somunlar ve manifold kapağı arasına yerleştirilen yaylar. (C) Giriş kanallarının, konektörleri zaten bağlı olan bir cam akış hücresindeki ortak bir tek sıvı akışına yakınsamasının yakından görünümü. Referans olarak akış hücresinin yanına bir çeyrek yerleştirilir. (D) PDMS akış hücresinin görüntüsü. PDMS katmanları 3 mm kalınlığındadır. (E) Luer konektörlü kaynaşmış bir silika akış hücresi. (F) Prese oturan konektörleri yerinde olan bir borosilikat cam akış hücresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Bir cam akış hücresinden akışkan akış özellikleri. (A) Akış hücresi içindeki sıvı akışı laminerdir. Şema, kanallar arası difüzyonun bitişik sıvı akışları arasındaki karıştırmanın ana kaynağı olduğunu göstermek için akış hücresini yukarıdan gösterir. Akış yönü mavi oklarla gösterilir ve tek tek akışlar beyaz, açık gri ve beyaz renklidir. Kanallar arasındaki enine difüzyonun genişleyen bölgeleri kırmızı renkle gösterilir. İç kısım, alt akışta floresan etiketli DNA boncuk kompleksleri ve yalnızca üst akışta tampon ile 10x büyütmede bitişik sıvı akışlarının floresan görüntüsünü gösterir. Üst akıştaki beyaz noktalar CCD kameradan gelen çekim gürültüsüdür. (B) Laminer akış hücrelerindeki akış profili (açık mor) paraboliktir. Akış hücresi yandan görüntülenir ve akışın yönü her hücrenin üzerinde gösterilir. En hızlı akışkan hızları merkezde bulunan akış hücresinde meydana gelirken, en yavaş akışkan hızları akış hücresi yüzeylerinin yanında meydana gelir. Sonuç olarak, akış hücresinin merkezine yerleştirilmiş optik olarak hapsedilmiş bir DNA boncuk kompleksi için, sıvı akışı bakteriyofaj λ DNA molekülünü (48.504 bp) 16 μm'ye (B-formu) uzatır, böylece net görselleştirme yapılabilir (sol görüntü). Buna karşılık, akış hücresinin yüzeyine yakın konumlandırılan aynı molekül düşük akış hızlarına sahiptir ve gerilemez. (C) Tek bir DNA boncuk kompleksi bir akış hücresi içine yerleştirilir. Farklı derinlik akış hücreleri kullanılabilir, ancak her durumda, ışın hizalamaları, yüzey etkilerini ortadan kaldıran ve DNA moleküllerinin B formuna gerilebilmesi için sabit akışa sahip olan kapak kayma yüzeyinin 10-20 μm üzerinde optimum yakalama gerçekleşecek şekilde ayarlanabilir. (C)'deki sol görüntüde belirtildiği gibi, DNA net görselleştirmeyi sağlamak için gerilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Mikroskop aşamasında bir akış hücresi içinde optik olarak sıkışmış DNA'nın akış ve reaksiyon kontrolü . (A) Akış hücresinin bir şırınga pompasına çiftleşmesi. Üç anahtarlama vanaları aracılığıyla bir şırınga pompasına bağlı üç kanallı bir akış hücresinin fotoğrafı sunulmuştur. Akış hücresi, ters çevrilmiş bir mikroskopta motorlu bir aşamada yerinde tutulur. Akış hücresi bir atık hattına (solda) ve anahtarlama vanalarına (kesikli camgöbeği dairesi) turuncu, 500 μm boru (yeşil bantla gösterilir) ile bağlanır. Valfler, 1 mL gaz geçirmez şırıngaları (sarı oklar pistonları sınırlar) barındıran şırınga pompası aparatına uyarlanmış özel yapım bir manifolda istikrarlı bir şekilde monte edilmiştir. Atık hatları, şırınga değişimleri sırasında anahtarlama valfinde sıkışabilecek hava kabarcıklarını gidermek için kullanılır. (B) Üç kanallı akış hücresinin yakından görünümü. Sıvı akışlarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için, dış kısımlar sadece su içeren merkezi akış ile gıda boyası ile renklendirilmiştir. Yakınlaştırılmış bölge, optik olarak hapsedilmiş bir boncuk-DNA molekül kompleksinin, aşamayı akışa dik olarak çevirerek (siyah ok) bir sıvı akışından diğerine (mavi ok) nasıl çevrildiğini gösterir. (C) Çalışma konumlarını gösteren üç anahtarlama vanalarının şemaları. F, S ve W harf atamaları yön akışkanına karşılık gelir ve sırasıyla akış hücresine, şırıngaya ve atıklara akabilir. Bir bağlantı noktası, her şemanın üstündeki siyah fiş tarafından gösterildiği gibi kalıcı olarak kapatılır. Açık veya çalışır durumda (sol panel), sıvı akışı doğrudan anahtarlama valfinden şırıngadan (S) akış hücresine (F) geçer. Kapalı konumda (sağ panel), kadran döndürülür, böylece akış hücresi ortamdan kapatılır. Bu pozisyonda, akış atığa yönlendirilir ve şırıngalar akış hücresine hava kabarcıkları sokmadan kapatılabilir. Valfler 6 μL ölü hacme sahip olduğundan, Açık konfigürasyona geri dönmeden önce hatları temizlerken çok az çözüm boşa harcanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Boncuk hareketi ve karşıt kuvvet sıvı akışından etkilenir. (A) Doğrusal boncuk hızı, pompa hızından ve sakkaroz konsantrasyonundan etkilenir. (B) Bir boncuk üzerindeki karşıt kuvvet, çözelti viskozitesinden etkilenir. (C) Boncuk çapı, akış altındaki boncuklar üzerindeki kuvveti etkiler. Tüm deneylerde floresan boncuklar kullanıldı (Dragon yeşili). (A) ve (B)'de 0.97 μm çapında boncuklar, (C)'de ise farklı çaplarda boncuklar kullanılmıştır. Sakkaroz çözeltileri ultra saf suda yapıldı, 0.2 μm filtrelerden süzüldü ve kırılma indisi elde taşınan bir refraktometre kullanılarak ölçüldü, viskozite ISCO Tabloları kullanılarak santipoise olarak belirlendi ve son olarak mPa.s'de SI birimlerine dönüştürüldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akış hızı (μL/h)b Adım başına süre (min) Dağıtılan hacim (μL)
800 5 67
400 5 33
200 5 17
100 5 8
50 5 4
25 5 2
15 5 veya daha fazla 1 veya daha fazla
a. Bunlar, şırınga pompası yazılımı tarafından hesaplanan sıvı akış hızlarıdır ve kullanılan her şırınga çapı için benzersizdir. Akış hızları, hatların ve akış odasının (800 μl/saat) hızlı bir şekilde doldurulmasını ve ardından yakalama ve görselleştirme için ideal akış hızına kademeli olarak düşürülmesini sağlar
b. Şırınga pompası, tuş takımından veya satıcı tarafından sağlanan yazılım kullanılarak kontrol edilebilir.

Tablo 1: Kabarcıkları en aza indirmek ve kararlı bir tuzak elde etmek için sıvı akış hızları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Akış sisteminin dikkatli bir şekilde monte edilmesi, deneylerin başarılı bir şekilde sonuçlanması için kritik öneme sahiptir 4,6. Protokolün en zorlu yönlerinden biri, konektörlerin cam yüzeye tutturulmasıdır. Bunun için aşağıdaki iki yaklaşımı kullanıyoruz: prese uygun boru konektörleri ve nanoport montajları. Prese takılan konektörler cama kolayca yapışır ve ardından PTFE borularının forseps kullanılarak önceden oluşturulmuş deliklere itilmesiyle takip edilir. Daha kararlı bir bağlantı gerektiğinde, nanoport montajlarının bağlanması tercih edilir. Dikkatli kullanım ve temizlik ile, kalıcı montajlara sahip tek bir cam akış hücresi 1 yıldan fazla bir süre boyunca kullanılabilir. Akış hücrelerinin daha sık değiştirilmesi gerekiyorsa, PDMS akış hücreleri mükemmel ve daha ucuz bir alternatif oldukları için kullanılabilir. Yeniden kullanılabilirler, ancak PDMS şişmeye karşı hassastır, bu da zamanla sıvı akış davranışını değiştirebilir.

Hem cam hem de PDMS akış hücreleri yok edilemez değildir. Laboratuvarda kullanılan maksimum debi 800 μL/s'dir. Bu günlük olarak ve/veya uzun süre aşılırsa, akış hücresi bükülmesi (cam akış hücreleri) ve PDMS'nin bozulması meydana gelebilir. Metanol ve su ile ilk ıslatma prosedürü zaman alırken, tüm kabarcıklar ortadan kaldırıldığı ve ayrıca konektörlerdeki sızıntılar tespit edilebildiği için buna değer. Burada açıklanan akış hücreleri, yapılan deneylere esneklik sağlar. Farklı akış hücrelerinin, boruların ve farklı konektörlerin tutturulmasının bu yaklaşımlarını kullanarak, deneysel koşullar kolayca uyarlanabilir ve optimum verilerin elde edilmesini sağlamak için hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Y şeklindeki kanal akış hücreleri sunulur, ancak çok çeşitli mikroakışkan cihaz tasarımları, konektörler takılı olmadan ve bağlı olarak birden fazla şirketten temin edilebilir. Bu, araştırmacıya deneysel tasarımda daha da fazla esneklik sağlar.

Dört yönlü anahtarlama vanalarının kullanımı, akış sistemi monte edildikten ve test edildikten sonra, kontaminasyonun minimum olduğu ve kabarcıkların ortadan kaldırıldığı kapalı bir ortam haline gelmesini sağlayan basit ve etkili bir yöntemdir. İkincisi, kabarcıklar bir deney sırasında rastgele sıkıştırma ve sıkıştırmayı açma eğiliminde olduğu için kritiktir ve bu, sıkışmış DNA moleküllerinin beklenmedik şekillerde hareket etmesine ve hatta kırılmasına neden olan sıvı akışını bozar. Sistemde oluşmalarının engellenmesi için büyük özen gösterilmelidir.

Son olarak, burada açıklanan sistem, DNA'nın, proteinlere bağlı boncukların veya floresan etiketli proteinlerin dikkatli analizinin yapılabileceği görsel biyokimya için optimize edilmiştir. Sistem, çift tuzaklar ve kadran fotodetektörlerinin eklenmesiyle kuvvet ölçümleri yapmak üzere tasarlanmamış olsa da, örneğin DNA motor proteinlerine farklı çaptaki boncuklar takılarak ve motordan bu boncuğu sıvı akışına karşı çekmesini isteyerek kuvvetler ölçülebilir. Çözelti viskozitesi, sıvı akışı ve boncuk çapı değişkenlik göstererek, motor protein fonksiyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak için çok çeşitli karşıt kuvvetler uygulanabilir (Şekil 5). Bu, biyolojik işlemlerle ilişkili kuvvetleri ölçmenin basit ve ucuz bir yoludur, ancak daha hassas yaklaşımlarla ilişkili hassasiyetten yoksundur. Görsel biyokimyasal yaklaşım hassas kuvvet algılama yöntemleriyle birleştirildiğinde, biyokimyasal reaksiyonların daha eksiksiz resimleri sağlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

Bianco laboratuvarındaki araştırmalar, NIH hibeleri GM100156 ve GM144414 tarafından P.R.B.'ye desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Tags

Biyokimya Sayı 189
Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bianco, P. R. Use of Dual Optical… More

Bianco, P. R. Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies. J. Vis. Exp. (189), e64023, doi:10.3791/64023 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter