Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En rørledning for å undersøke strukturer og signalveier for sfingosin 1-fosfatreseptorer

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

S1P utøver sine forskjellige fysiologiske effekter gjennom underfamilien S1P-reseptorer (S1PRs). Her beskrives en rørledning for å forklare strukturene og funksjonen til S1PRs.

Abstract

Lysofosfolipider (LPL) er bioaktive lipider som inkluderer sfingosin 1-fosfat (S1P), lysofosfatidinsyre, etc. S1P, et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er en av de best karakteriserte LPL-ene som regulerer en rekke cellulære fysiologiske responser via signalveier mediert av sfingosin 1-fosfatreseptorer (S1PRs). Dette impliserte at signalsystemet S1P-S1PRs er et bemerkelsesverdig potensielt terapeutisk mål for lidelser, inkludert multippel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kreft, betennelse og til og med COVID-19. S1PRs, en liten delmengde av klasse A G-proteinkoblet reseptor (GPCR) familie, består av fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Mangelen på detaljert strukturell informasjon hindrer imidlertid narkotikaoppdagelsen rettet mot S1PR. Her brukte vi kryo-elektronmikroskopimetoden for å løse strukturen til S1P-S1PRs-komplekset, og belyste mekanismen for aktivering, selektiv legemiddelgjenkjenning og G-proteinkobling ved å bruke cellebaserte funksjonelle analyser. Andre lysofosfolipidreseptorer (LPLR) og GPCR kan også studeres ved hjelp av denne strategien.

Introduction

Sfingosin-1-fosfat (S1P), et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysofosfatidisk signalmolekyl som involverer ulike biologiske aktiviteter, inkludert lymfocytthandel, vaskulær utvikling, endotelintegritet og hjertefrekvens 1,2,3. S1P utøver sine ulike fysiologiske effekter gjennom fem S1P-reseptorundertyper (S1PRs 1-5); S1PR finnes i en rekke vev og viser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi-proteinet, som senere hemmer cAMP-produksjonen; S1PR2 og S1PR3 er koblet sammen med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduserer signal gjennom Gi og G12/136.

S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sykdommer, inkludert autoimmune lidelser7, betennelse8, kreft9 og til og med COVID-1910. I 2010 ble fingolimod (FTY720) lisensiert som et førsteklasses legemiddel rettet mot S1PR for å behandle residiverende multippel sklerose (MS)11. Det er imidlertid i stand til å binde seg til alle S1PR unntatt S1PR2, mens ikke-spesifikk binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronkial innsnevring og lungeepitellekkasje12. Som en alternativ strategi for å øke terapeutisk selektivitet er det produsert subtypespesifikke ligander for reseptoren. Siponimod (BAF312) ble godkjent i 2019 for tilbakefall MS-behandling13; det retter seg effektivt mot S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har noen affinitet for S1PR3, og viser færre bivirkninger i klinisk praksis14. I 2020 godkjente US Food and Drug Administration ozanimod for MS-terapi15. Det har blitt rapportert at ozanimod har en 25 ganger større selektivitet for S1PR1 enn for S1PR516. Spesielt i sammenheng med den nåværende COVID-19-pandemien har det blitt oppdaget at agonistmedisiner rettet mot S1PR kan brukes til å behandle COVID-19 ved å bruke immunmodulerende terapiteknikker17. Sammenlignet med fingolimod har ozanimod vist overlegenhet i å senke symptomene hos COVID-19-pasienter og gjennomgår nå kliniske studier10. Å forstå det strukturelle grunnlaget og funksjonen til S1PRs legger et betydelig grunnlag for å utvikle et stoff som selektivt retter seg mot S1PRs18.

Mange teknikker brukes til å undersøke strukturell informasjon om biomacromolecules, inkludert røntgenkrystallografi, kjernemagnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra mars 2022 er det mer enn 180 000 strukturer deponert på Protein Databank (PDB), og de fleste av dem er løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første nær-atomiske oppløsningsstrukturen til TPRV1 (3.4 Å-oppløsning) rapportert av Yifan Cheng og David Julius i 201319, har kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blitt en vanlig teknikk for proteinstrukturer, og det totale antallet EM PDB-strukturer var mer enn 10.000. De kritiske gjennombruddsområdene er utviklingen av nye kameraer for bildebehandling kjent som direkte elektrondeteksjonskameraer og nye bildebehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolusjonert strukturbiologi og strukturbasert legemiddeloppdagelse det siste tiåret20. Ettersom forståelse av hvordan makromolekylære komplekser oppfyller sine kompliserte roller i den levende cellen er et sentralt tema i biologiske, har cryo-EM potensial til å avsløre konformasjoner av dynamiske molekylære komplekser, spesielt for transmembranproteiner21. G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) er den største superfamilien av transmembranproteiner og målene for mer enn 30% av dagens markedsførte legemidler22. Utviklingen av cryo-EM har bidratt til et utbrudd av høyoppløselige strukturer av GPCR-G-proteinkomplekser, noe som muliggjør strukturell bestemmelse for "ugjennomtrengelige" mål som fortsatt ikke er tilgjengelige for røntgenkrystallografisk analyse i legemiddeldesign23. Derfor gir cryo-EM-applikasjonen en sjanse til å bestemme den tredimensjonale strukturen til GPCR under nær-innfødte forhold ved nær atomoppløsning24. Fremskritt i cryo-EM gjør det mulig å visualisere mekanistiske underlag av GPCR-stimulering eller inhibering, og ytterligere nytte i å avdekke de nye bindingsstedene for GPCR-målrettet narkotikaopprettelse25.

Ved å stole på de enorme fremskrittene med kryo-EM-teknologi, har vi identifisert strukturer av forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser nylig26,27. Hos mennesker finnes S1PR i forskjellige vev og utviser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi protein, som senere hemmer 3′,5′-syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) produksjon. S1PR3 og S1PR5 er også i stand til å koble til Gi 6,28. Siden Gi-koblet reseptoraktivering reduserer produksjonen av cAMP29, ble en Gi-hemming cAMP-analyse introdusert for å måle cAMP-hemmingseffekter for å fange funksjonelle endringer26,27. Ved å bruke en mutert versjon av Photinus pyralis luciferase hvor en cAMP-bindende proteindel er satt inn, tilbyr denne cAMP-analysen en enkel og pålitelig metode for å overvåke GPCR-aktivitet gjennom endringer i intracellulær cAMP-konsentrasjon30. Det er en sensitiv og ikke-radioaktiv funksjonell analyse og kan brukes til å overvåke sanntids nedstrøms signalering av et bredt spekter av GPCR for narkotikaoppdagelsesformål31.

Her gis et sammendrag av de kritiske metodene for å løse aktiverings- og legemiddelgjenkjenningsmodusene til S1PR, primært inkludert kryo-EM-manipulasjoner og en Gi-hemming cAMP-analyse. Denne artikkelen tar sikte på å gi omfattende eksperimentell veiledning for videre utforskning av strukturer og funksjoner i GPCRs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensing av S1PRs-G proteinkompleks

  1. For å rense det humane S1PRs-G-proteinkomplekset, kloner du cDNA-ene til S1PR1 som mangler C-terminale rester 338-382, villtypen S1PR3, S1PR5 avkortet med 345-398 ved C-terminalen, og villtypen Gi1 inn i pFastBac1-vektoren og cDNA-ene til villtypen Gβ1 og Gγ2 inn i pFastBacdual-vektoren (Table of Materials).
    MERK: Alle konstruksjoner for S1PRs inneholder også hemagglutinin (HA) signalsekvens etterfulgt av en Flag-epitop-tag ved N-terminalen og en 10x hans tag ved C-terminalen. Også en syntetisk DNA-sekvens (Table of Materials) for å oversette T4 lysozym (T4L) ble satt inn i N-terminalen til S1PRs for å lette reseptoruttrykk og rensing.
  2. Fremstilling av baculoviruskodingen S1PRs, Gi1 og Gβ1γ2
    1. Tilsett de rekombinante vektorene til 50 μL DH5α-kompetent Escherichia coli (E. coli) lagret i et 1,5 ml rør ved -80 °C, og rug på is i 30 minutter.
    2. Varmesjokk cellene ved 42 °C i 90 s, overfør dem til isen umiddelbart og avkjøl dem i 2 minutter.
    3. Rist tuben ved 37 °C i 3-5 timer etter å ha supplert med 300 μL lysogenibuljong (LB) medium. Plate 100 μL celler til LB-agarplaten og inkuber ved 37 ° C ved å holde seg mørk i 48 timer.
    4. Inokuler den hvite kolonien i 5 ml LB-medium inneholdende 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin og 7 μg/ml gentamicin, og kultur ved 37 °C i 16 timer.
    5. Isoler det rekombinante bacmidet med plasmid miniprep-settet (materialtabell) etter produsentens instruksjoner, for å produsere P0-baculoviruset.
      MERK: Før bruk ble det rensede bacmidet analysert ved PCR med pUC / M13 fremover og bakover primere. For PCR er antall sykluser = 30 sykluser, smeltetemperatur = 58 °C og forlengelsestid = 1 min per 1 Kb.
    6. Forbered P0 baculovirus som beskrevet i en tidligere protokoll32.
      1. Dyrk sf9-cellene (ESF921 medium) i seksbrønnsplater og kontroller at cellene er i loggfasen (1,0-1,5 x 106 celler/ml).
      2. Fortynn 8 μL baculovirustransfeksjonsreagens i 100 μL av Graces medium, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Fortynn 10 μg av det rekombinante bacmidet i 100 μL av Graces medium, og bland forsiktig. Kombiner det fortynnede bacmidet med fortynnet baculovirustransfeksjonsreagens, bland forsiktig og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
      3. Tilsett blandingen (bacmid og reagens) på cellene (trinn 1.2.6.1), og legg dem ved 27 °C i 3 timer.
      4. Fjern Graces medium og erstatt det med 2 ml ESF921 cellekulturmedium. Plate de seks brønnplatene ved 27 ° C og samle ESF921 cellekulturmedium etter 5 dager etter transfeksjon.
      5. Sentrifuge ved 500 x g ved 4 °C i 10 minutter for å fjerne celler og rusk. Overfør supernatanten til 2 ml rør. Dette er P0 baculovirus lager.
    7. Isoler P1-viruslager
      1. Overfør 30 ml sf9-celler til en konisk flaske, kultur ved 27 ° C med risting ved 270 o / min, og kontroller at cellene når en loggfase (1,0-1,5 x 106 celler / ml).
      2. Tilsett 2 ml P0-viruslager i flasken og rist ved 270 o / min i 4 dager ved 27 ° C.
      3. Overfør cellene til et 50 ml rør, sentrifuger ved 1,800 x g i 10 minutter ved 4 ° C for å fjerne celler og rusk, og overfør supernatanten til 50 ml rør. Dette er P1 baculovirus lager.
    8. Forsterk baculoviral bestand
      1. Gjenta trinn 1.2.7 ved å bruke 50 ml sf9-celler i loggfasen (1,0-1,5 x 106 celler/ml) og 1 ml P1-lager.
      2. Oppbevar den resulterende P2-baculovirusstammen ved 4 °C, og beskytt den mot lys.
        MERK: Ikke forsterk baculoviruset på ubestemt tid, da de skadelige mutantene ble produsert med hver passasje.
  3. Ekspresjon av S1PRs-G proteinkompleks
    1. Kultur sf9 insektceller for å nå 2,5 x 106 celler / ml tetthet, co-infisere med P2 baculovirus koding S1PRs, Gi1 og Gβ1γ2 ved et volumforhold på 1: 2: 1, og kultur igjen ved 27 ° C i 48 timer.
    2. Samle cellene ved sentrifugering ved 700 x g ved 4 °C i 15 minutter, frys dem ned i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C for bruk.
  4. Protein rensing
    1. Tine cellepelleten oppnådd i trinn 1,3 ved romtemperatur, og deretter resuspendere den i lysisbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl2) supplert med 100 μg / ml benzamidin, 100 μg / ml leupeptin, 100 μg / ml aprotinin, 25 mU / ml apyrase og 10 μM agonist. Rør cellesuspensjonen ved romtemperatur i 2 timer for å indusere dannelsen av S1PRs-G-proteinkomplekset.
      MERK: Apyrase er en ATP difosfohydrolase. Det katalyserer fjerning av gammafosfat fra ATP og betafosfat fra ADP.
    2. Overfør løsningen til rørene, sentrifuger ved 70 000 x g i 10 minutter, og fjern supernatanten forsiktig. Resuspendere pelleten i løsemiddelbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl2, 0,5 % (w/v) LMNG, 0,1 % (w/v) CHS, 1 % (w/v) natriumkolat, 10 % (v/v) glyserol).
    3. Overfør suspensjonen til et glass Dounce og homogeniser pelleten fullt ut. Tilsett 10 μM agonist, 4 mg scFv16, 100 μg/ml benzamidin, 100 μg/ml leupeptin, 100 μg/ml approtinin og 25 mU/ml apyrase til suspensjonen, og rør ved 4 °C i 2 timer.
      MERK: Trinnene for homogenisering av pellets er avgjørende for produksjonen av GPCR-G-proteinkomplekset.
    4. Overfør oppløsningen til rørene, og sentrifuger ved 100 000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
    5. Balansere flaggharpiksen med vaskebufferen (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl2, 10 μM agonist, 0,0375 % (w/v) LMNG, 0,0125 % (w/v) GDN, 0,01 % (w/v) CHS).
    6. Overfør supernatanten til rørene, og inkuber med flaggharpiksen ved 4 °C i 2 timer.
    7. Legg blandingen ovenfor på glasssøylen og vask kolonnen med 50 ml vaskebuffer supplert med 100 μg / ml benzamidin, 100 μg / ml leupeptin og 100 μg / ml aprotinin.
    8. Eluter kolonnen med 10 ml av elueringsbufferen som inneholder 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/ml Flag-peptid, 10 μM-agonist, 0,0375 % (w/v) LMNG, 0,0125 % (w/v) GDN, 0,01 % (w/v) CHS, 100 μg/ml benzamidin, 100 μg/ml leupeptin og 100 μg/ml aprotinin.
    9. Samle S1PRs-G-proteinkomplekset og konsentrer deg til 1 ml ved hjelp av en 100 kDa cut-off konsentrator ved 1,300 x g ved 4 ° C. Filtrer gjennom et 0,22 μM filter, og sentrifuger ved 13 000 x g i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne aggregatene.
    10. Last S1PRs-G-proteinkomplekset på en størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) gelfiltreringskolonne forhåndslikestilt med SEC-bufferen som inneholder 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 μM agonist, 100 Μm TCEP, 0,00375% (w / v) LMNG, 0,00125% (w / v) GDN og 0,001% (w / v) CHS ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min ved 4 ° C.
    11. Samle toppfraksjonene og konsentrer deg ved hjelp av en 100 kDa cut-off konsentrator ved 1,300 x g ved 4 °C for cryo-EM.

2. Elektronmikroskopi for å løse S1PRs-strukturen

  1. Innsamling av data
    1. For å klargjøre kryo-EM-ristene, hold 300-mesh Au R1.2/1.3-rister i 10 s og glødutladning i 60 s ved 15 mA ved hjelp av et glødutladningsrengjøringssystem.
    2. Utfør prøvevitrifisering som beskrevet tidligere33,34. I støpefrysingskonsollen setter du temperaturen til 4 °C og relativ fuktighet til 100 % for arbeidsmiljøet i kammeret. Bruk blot force for 0, ventetid på 0 s, blot tid på 2 eller 3 s, og dreneringstid på 0 s. Det krever vanligvis bare 3 μL av prøven i konsentrasjoner på 5-10 mg / ml for enkel vitrifisering.
    3. Klipp og last rutenett i automatisk rutenettmontering, last automatisk rutenettmontering i Nanocab, og last Nanocab inn i mikroskopet med autoloader som beskrevet tidligere35. Skjermprøvekvalitet med EPU2-programvare34. Vanligvis var dataene samlet inn i områdene med passende istykkelse bedre.
    4. Samle inn kryo-EM-data som beskrevet i detalj tidligere35. For S1P-reseptoren, sett defokusforskyvningen mellom -1,0 μm og -1,8 μm med eksponeringselektrondosen på 50-65 e-/Å2. For S1PR1-Gi-kompleksene samler du inn filmstakken automatisk ved hjelp av EPU2-programvaren i tellemodus med K2-detektoren ved en total eksponeringstid på 2 s, en opptakshastighet på fem råbilder per sekund og en total dose på 56 e-/Å2 for å produsere 35 bilder per stabel.
      MERK: Vanligvis er det behov for mer enn 5000 filmer for å gjenoppbygge reseptorstrukturen.
  2. Behandle dataene ved hjelp av en kombinasjon av RELION36 og cryoSPARC37 for å oppnå et ideelt cryo-EM tetthetskart. Bruk RELION-3.1_gpu_ompi4 til å behandle dataene i utgangspunktet som involverer lignende operasjoner som beskrevet tidligere34.
    1. I Linux-systemterminalen skriver du inn den overordnede katalogen til datalagringskatalogen.
    2. Skriv inn relion-kommandoen i terminalen for å åpne RELION grafisk brukergrensesnitt (GUI).
      MERK: Hvis dette er første gang en RELION GUI har blitt åpnet i denne katalogen, vil et raskt vindu dukke opp; klikk på Ja.
    3. Klikk på Importer i funksjonslinjen på høyre side av RELION GUI for å importere rådataene til RELION.
      1. I alternativet Filmer/mikrofoner velger du Ja for Importer rå filmer/mikrografer?, skriver inn databanen i feltet Rå inndatafiler (jokertegn anbefales), og velger Ja for Er dette flerbildefilmer?. Skriv inn pikselstørrelsen på filmer i feltet Pikselstørrelse (Angstrom), mikroskopets driftsspenning (i kV) i feltet Spenning (kV) og sfærisk aberrasjon av mikroskopet i feltet Sfærisk aberrasjon (mm). Dette er parametrene som ble registrert på tidspunktet for datainnsamlingen.
      2. I alternativet Kjører endrer du kønavnet i henhold til serveren der programmet kjører (andre funksjoner må også endre denne parameteren). La de andre parameterne være på standardverdiene som er angitt av RELION. Til slutt, når alle parametere oppdages riktig, klikker du KJØR! for å kjøre programmet.
    4. Bruk bevegelseskorrigeringsfunksjonen for justering av alle rammer38.
      1. I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom og velger utdataene fra Import-funksjonen kalt movies.star som input av Input movies STAR-fil. Angi dose per ramme i feltet Dose per ramme (e/A2), som er lik den totale dosen delt på antall bilder. Velg Nei for Lagre summen av strømspektra?.
      2. I bevegelsesalternativet skriver du inn 250 for B-faktor, 5,5 for antall patcher X, Y og 2 for grupperammer (sørg for dosen av gruppe >3). Hvis data ikke ble referert til i løpet av innsamlingsperioden, er det nødvendig med et forsterkningsreferansebilde som kan oppnås ved å skaffe et tomt rutenettområde. Velg Nei for bruk RELIONs egen implementering? og skriv inn katalogen som inneholder den kjørbare filen til MOTIONCOR2 39i det kjørbare feltet MOTIONCOR2.
      3. I Kjører-alternativet velger du riktig MPI og trådnummer i henhold til serverens datakraft; her ble MPI = 8 og tråder = 3 brukt.
    5. Bruk CTF-estimeringsfunksjon for modulering av kryo-EM-bildet av vitrifisert prøve40. I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom og velger utgangen av Motion cor kalt korrigert micrographs.star som input av Input movies STAR-fil. I Gctf-alternativet velger du Ja for UseGctf i stedet?.
    6. Bruk Delmengdevalgfunksjon til å fjerne mikrografer med verdien rlnCtfMaxResolutin >4.
      1. I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom til høyre for OR velg fra micrographs.star og velg utgangen fra CtfFind kalt micrographs_ctf.star som inngang. I alternativet Delsett velger du Ja for Velg basert på metadataverdier? og angir 4 for verdien Maksimalt metadata for å fjerne skadede data.
    7. Manuell plukking: Velg noen bilder manuelt for foreløpig plukking og klassifisering.
      1. I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom og velger micrographs_selected.star fra forrige Select-katalog (trinn 2.2.6) som inngang.
      2. Klikk på RUN! (et vindu dukker opp). Klikk på Fil øverst til venstre i det nye vinduet og klikk på Inverter valg for å avbryte valget av alle bilder. Merk av i valgboksen lengst til venstre i den tilsvarende raden i hver oppføring, og klikk på velg for å sjekke bildene og velg ~ 500 gode bilder. Klikk på Fil > Lagre valg for å lagre de valgte bildene og lukke vinduet.
    8. Automatisk plukking: automatiserte programvarepakker for partikkelplukking er nyttige og kraftige41.
      1. I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom til høyre for Input micrographs for autopick og velger micrographs_selected.star fra forrige ManualPick-katalog (trinn 2.2.7) som input. Laplacian-of-Gaussian-algoritmen brukes i begynnelsen, så velg Ja for OR: bruk Laplacian-of-Gaussian.
      2. I alternativet Laplacian setter du Min.diameter for LoG-filter (A) til 80 og Max.diameter for LoG-filter (A) til 130. I alternativet Automatisk plukking angir du Minimum avstand mellom partikler (A) til 65, og velger Ja for Bruk GPU-akselerasjon hvis GPU er tilgjengelig.
    9. Trekk ut partikler for de neste trinnene.
      1. I I / O-alternativet klikker du på Bla til høyre for micrograph STAR-filen og velger micrographs_selected.star fra trinn 2.2.6. Klikk på Bla gjennom til høyre for Inndatakoordinater og velg cords_suffix_autopick.star fra trinn 2.2.8.
      2. I alternativet Trekk ut velger du Ja for skaler partikler på nytt og setter skalert størrelse på nytt (piksler) til 128 for å øke hastigheten på senere trinn.
    10. 2D-klassifisering for foreløpig klassifisering av partikler
      1. I I / O-alternativet klikker du på Bla til høyre for Input images STAR-filen og velger particles.star fra trinn 2.2.9. I alternativet Optimalisering angir du Antall klasser til 100 og Maskediameter (A) til 140.
      2. I alternativet Beregn angir du Antall samlede partikler til 10, skriver inn katalogen som er på en rask lokal stasjon (f.eks. en SSD-stasjon) i feltet Kopier partikkel til skrapemappe , og velger Ja for Bruk GPU-akselerasjon? for raskere behandlingshastighet.
    11. Delmengdevalg for å velge gode 2D-resultater som maler for å velge partikler
      1. I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom til høyre for Velg klasser fra model.star og velg utgangen fra trinn 2.2.10 kalt run_it025_model.star som inngang. Klikk på KJØR!. I popup-vinduet merker du av for Sorter bilder på og Omvendt sortering? og klikker på Skjerm!.
      2. Velg gode representative 2D-resultater som referanse for Referanse for funksjonen Automatisk plukking .
        MERK: De valgte resultatene er merket med rødt. Resultatene fra 2D-klassifisering vises senere.
      3. Høyreklikk og velg Lagre valgte klasser.
    12. Bruk malen for den andre runden med automatisk plukking. I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom til høyre for Input micrographs for autopick og velger micrographs_selected.star fra trinn 2.2.6. Klikk på Bla til høyre for 2D-referanser, velg class_averages.star fra trinn 2.2.11, og velg Nei for OR: bruk Laplacian-of-Gaussian.
    13. Utfør partikkelutvinning igjen ved å bruke coord_suffix_autopick.star fra trinn 2.2.12 og micrographs_selected.star fra trinn 2.2.6.
    14. Utfør 2D-klassifisering igjen ved hjelp av particles.star fra trinn 2.2.13.
    15. Utfør valg av delmengde på nytt ved hjelp av run_it025_optimiser.star fra trinn 2.2.14.
      MERK: Alle 2D-bilder med klare konturer og riktige former må velges.
    16. Utfør partikkelutvinning som følger. I I / O-alternativet klikker du på Bla til høyre for mikrograf STAR-fil, velger micrographs_selected.star fra trinn 2.2.6, og velger Ja for ELLER pakke ut raffinerte partikler på nytt?. Klikk på Bla til høyre for STAR-filen Raffinerte partikler og velg particles.star fra trinn 2.2.15.
    17. 3D-første modell og generering av et referansekart: I I / O-alternativet klikker du på Bla gjennom til høyre for Input images STAR-filen og velger particles.star fra trinn 2.2.16. Angi Antall klasser til 1 og Maskediameter (A) til 140 i alternativet Optimalisering .
    18. 3D-klassifisering og generering av et foreløpig 3D-kart: I I / O-alternativet klikker du på Bla til høyre for Input images STAR-filen og velger particles.star fra trinn 2.2.16. Klikk på Bla til høyre for referansekartet og velg initial_model.mrc fra trinn 2.2.17. Angi Antall klasser til 4–6 og Maskediameter (A) til 140 i alternativet Optimalisering .
    19. Maskegenerering: Velg gode 3D-kart fra trinn 2.2.17 som inndata i I/U-alternativet . Sett terskelen for innledende binarisering til 0,05 (juster basert på utdataene), Utvid binærkartet så mange piksler til 3, og legg til myk kant av så mange piksler til 8 i maskealternativet .
    20. Bruk cryoSPARC til neste behandling.
    21. Opprett et nytt arbeidsområde og klikk på Job Builder for den første jobben.
    22. Hvis du vil importere partikkelstakken, skriver du inn partikkelbanen (trinn 2.2.16) i feltet Partikkelmetabane og filmens bane (trinn 2.2.16) i feltet Partikkeldatabane .
      MERK: Parametrene Akselererende spenning (kV), Sfærisk aberrasjon (mm) og Pikselstørrelse (Angstrom) er de samme som før. Amplitudekontrastverdien (brøk) er 0,1.
    23. Importer 3D-volumer ved å angi banen til det beste 3D-volumet i trinn 2.2.18 i volumdatabanen og velge Kart for Type volum som importeres.
    24. Importer maske ved å angi maskebanen (trinn 2.2.19) i volumdatabanen og velge Maske for Type volum som importeres.
    25. Ikke-uniform forbedring: Bruk utdataene fra trinn 2.2.22, 2.2.23 og 2.2.24 som inndata.
      MERK: Denne funksjonen er veldig nyttig for membranproteiner.
      1. Dra utgangen fra trinn 2.2.22 (imported_particles) som inngang for ikke-uniform raffinementpartikler (partikkel), utgangen fra trinn 2.2.23 (imported_volume_1) som inngang for ikke-uniform raffineringsvolum (volum) og utgang fra trinn 2.2.24 (imported_mask_1) som inngang til ikke-uniform raffineringsmaske (maske).
        MERK: Noen ganger kan bedre resultater oppnås uten maske.
      2. Klikk Kø for å starte behandlingen.
    26. Kjør trinn 2.2.18-2.2.25 for bedre resultater. Gjennom ovennevnte serie behandling kan man få et S1PR-Gi 3D-kart med god oppløsning.

3. S1PRs-Gi mediert cAMP-hemmingsanalyse

MERK: S1PRs-Gi mediert cAMP-hemmingseksperiment ble delt inn i flere deler, og følgende er detaljerte eksperimentelle prosedyrer. Det eksperimentelle prinsippet og den generelle eksperimentelle prosessen er vist i form av et flytskjema i figur 1.

  1. Plasmider konstruksjon
    1. Sub-klone cDNA-ene til villtype S1PR1, S1PR3 og S1PR5 inn i vektoren pcDNA3.1+ med en HA-signalsekvens etterfulgt av en flaggkode ved N-terminalen (Table of Materials).
      MERK: Mutasjoner for alle reseptorene ble generert ved hjelp av mutagenesesettet (Table of Materials).
  2. Fremstilling av plasmidet
    1. Tilsett de rekombinante pcDNA3.1+-vektorene eller sensorplasmidet (materialtabell) til 50 μL DH5α-kompetent Escherichia coli (E. coli) lagret i et 1,5 ml rør ved -80 °C separat, og inkuber på is i 30 minutter. Varmesjokk cellene ved 42 °C i 90 s, overfør dem til isen umiddelbart og avkjøl dem i 2 minutter.
      MERK: Sensorplasmidet levert av Gi-inhibition cAMP-analysesettet (Table of Materials) uttrykker et modifisert luciferase-gen smeltet sammen med et cAMP-bindingsdomene og øker luminescensaktiviteten når cAMP er bundet.
    2. Rist tuben ved 37 °C i 1 time etter å ha supplert med 300 μL lysogenibuljong (LB) medium. Plate 100 μL celler til LB-agarplaten og inkuber ved 37 ° C ved å holde seg mørk i 48 timer. Inokuler den hvite kolonien til 5 ml LB-medium inneholdende 100 μg / ml ampicillin, og kultur ved 37 ° C i 16 timer.
    3. Isoler DNA ved hjelp av plasmid miniprep-settet (materialtabell) etter produsentens instruksjoner; plasmidet var i en konsentrasjon på over 350 ng/μL med verdien A260/A280 mellom 1,7 og 1,9.
  3. Cellekultur
    1. Plate CHO-K1-cellene i en 10 cm petriskål, dyrk dem i en 37 ° C inkubator med 5% CO2, og høst dem når monolaget er ved 80% -90% sammenløp.
    2. Aspirer CHO-K1-cellenes vekstmedium, tilsett 4 ml 0,05 % trypsin-EDTA forvarmet ved 37 °C på petriskålen forsiktig, og inkuber i 15 s. Deretter legger du til 4 ml vekstmedium bestående av F12 medium + 10% FBS.
    3. Fjern cellene fra petriskåloverflaten ved å svaie forsiktig og tappe på siden av petriskålen. Fyll et konisk rør med cellesuspensjon. Rør og pipette sakte for å fjerne celleklumper forsiktig.
    4. Sentrifugeceller ved 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur, aspirerer supernatant og gjenopplivning med 3 ml PBS. Gjenta dette trinnet.
    5. Bestem cellenummer med hemacytometeret og sentrifugeceller ved 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    6. Aspirate PBS buffer og resuspendere CHO-K1 celler med 3 ml vekstmedium bestående av F12 medium og 10% FBS.
    7. Tilsett 2 ml av vekstmediet bestående av F12 medium og 10% FBS i hver brønn i seksbrønnsplaten, og frø 150 μL cellesuspensjon i hver brønn for å holde cellene i tettheten på 1,5 x 105 celler / ml. Inkuber seksbrønnsplaten i en 37 °C vevskulturinkubator med 5% CO2 i ca. 24 timer.
  4. Forbigående transfeksjon
    1. Fortynn 2 μg DNA (trinn 3.2.3) til 200 μL transfeksjonsreagensbuffer (materialtabell). Bland ved vortexing i 10 s og kort spinning før bruk.
      MERK: Her inneholder 2 μg DNA 0,5 μg reseptorvektor (S1PR1, S1PR3 eller S1PR5) og 1,5 μg av sensorplasmidet.
    2. Tilsett 4 μL av transfeksjonsreagenset (materialtabell), virvel i 10 s, og spinn kort før bruk. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
    3. Slipp sakte 200 μL transfeksjonsblanding i hver brønn (som inneholder CHO-K1-celler) for å fordele jevnt. Rist forsiktig platen med seks brønner for å sikre grundig blanding.
    4. Bytt transfeksjonsmediet etter 4-6 timer med cellevekstmediet bestående av F12 medium + 10% FBS, og returner seksbrønnsplaten til inkubatoren.
    5. Høst celler 24-48 timer etter transfeksjon.
      1. Fordøye CHO-K1-cellene på brønnen med 500 μL 0,05% trypsin-EDTA (forvarmet ved 37 °C) i 15 s og legg til 1 ml vekstmedium bestående av F12 medium + 10% FBS. Fjern cellene fra brønnoverflaten ved å gynge og forsiktig tappe siden av brønnen.
      2. Overfør cellesuspensjon til et konisk rør, og sentrifuger ved 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Hell av supernatanten og høst de transfiserte cellene.
        MERK: Før fluorescenssignalbestemmelsen, kontroller celleoverflateuttrykksnivåene av reseptorer av ELISA som beskrevet tidligere26.
  5. Likevekt med D-Luciferin-kaliumsalt (materialtabell)
    1. Suspender de høstede cellene (24-48 timer etter transfeksjon) med 3 ml analysebuffer umiddelbart (dvs. Hanks balanserte saltløsning (HBSS) som inneholder 10 mM HEPES pH 7,4), med ytterligere 3% v / v fortynning av D-Luciferin-kaliumsaltet.
    2. Tilsett 90 μL cellesuspensjon per brønn av en 96-brønns plate ved hjelp av en flerkanals pipette og bland forsiktig.
    3. Inkuber i 40 min ved romtemperatur.
  6. Bestemmelse av fluorescenssignal
    1. Forbered på forhånd 10 mM stamløsninger av Siponimod oppløst i DMSO og foreta en seriell fortynning ved bruk av HBSS-buffer inneholdende 25 μM forskolin før ligandstimulering.
      MERK: Bortsett fra kontrollgruppen uten ligand, har de resterende et konsentrasjonsgradientområde på 10-11-10-5 mol / L.
    2. Stimulere med 10 μL (per brønn) agonistoppløsning i forskjellige konsentrasjoner i 30 minutter.
    3. Tell luminescenssignalene på en mikroplateleser ved hjelp av tilhørende programvare (materialtabell) parametere som følger. Velg Luminescens for deteksjonsmetode, endepunkt for lesetype og luminescensfiber for optikktype. Sett optikkforsterkningen til 255.
      MERK: Hver måling ble gjentatt i minst tre uavhengige eksperimenter, hver i tre tredobler.
    4. Få verdiene til fluorescenssignalet, importer dataene til et regnearkprogram, og behandle dataene ved hjelp av den ikke-lineære regresjonsfunksjonen (kurvetilpasning).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av eksperimentet. En detaljert trinnvis veiledning for eksperimentell oppsett og utførelse. Kort fortalt ble reseptoren og modifisert luciferase forbigående uttrykt i CHO-K1-celler ved å transfektere reseptoren og sensorplasmidet inn i cellene med transfeksjonsreagens. Cellene ble suspendert i HBSS-løsning med D-Luciferin-kaliumsalt, luciferase-substratet, og sådd i en 96-brønnplate etter 24 timer. For å tillate gjennomtrengning i cellene, må D-luciferin være pre-likevektet med cellene. Det oksidative enzymet luciferase forvandler luciferin til oksyluciferin og avgir lys. Den modifiserte luciferase, derimot, genererer lys via en kjemisk reaksjon bare når den er bundet til cAMP, og lysets intensitet har en positiv tilknytning til cAMP-nivåer i celler. Nivåene av cAMP ble regulert med GPCR aktivert av agonist. Gi-koblede reseptorer reduserte nivåene av cAMP, noe som nødvendiggjorde tilsetning av forskolin for å aktivere adenylylsyklasen i Gi-inhibition cAMP-eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før frysing av prøven av S1PRs-Gi-komplekset, må den rensede prøven separeres ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og analyseres med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 viser S1PR3-Gi-komplekset som et eksempel. Toppfraksjonen av det homogene GPCR-G-proteinkomplekset var vanligvis lokalisert ved ~10,5 ml av størrelseseksklusjonskromatografien (figur 2A). SDS-sideanalyse av S1PR3-Gi-komplekset (figur 2B) avslører fire bånd som tilsvarer de teoretiske båndene til S1PR3, Gαi, Gβ og scFv16, og antyder dermed at komplekset ble vellykket renset. Reseptorbåndet ble ofte funnet diffust på grunn av forskjellige grader av modifikasjon (glykosylering eller palmitoylering), og Gγ-båndet ble ikke funnet.

Figure 2
Figur 2: Analyse av proteinrensingsresultater (A) Gelfiltreringskromatogram som viser toppfraksjonen som tilsvarer proteinet. (B) SDS-side gelelektroforese mønster. Dette tallet er tilpasset fra referanse27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De komplekse fraksjonene av S1PR3-Gi-komplekset ble samlet og konsentrert for elektronmikroskopi. Prosedyrene for og representative resultater av grid vitrification og prøvescreening ble diskutert tidligere34. Et flytskjema (figur 3) presenteres for å oppnå en høyoppløselig struktur av S1PRs-G-proteinkomplekset ved bruk av to forskjellige prosesseringsplattformer: RELION-3 og cryoSPARC v3.

Figure 3
Figur 3: Databehandlingsarbeidsflyt for de pFTY720-bundne S1PR3-Gi-scFv16-kompleksene. Cryo-EM-databehandlingsflytskjema for pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-komplekset er vist. Representativ kryo-EM mikrograf automatisk plukking, 2D-klassifikasjonsgjennomsnitt, 3D-rekonstruksjoner og ikke-uniform raffinement av pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-komplekset er vist i figuren. Dette tallet er endret fra referanse27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Filmer ble først importert til RELION-3, og deretter ble bevegelseskorreksjon og CTF-estimering utført for å generere gjennomsnittlige mikrografier. Ved å plukke partikler og iterativ 2D-klassifisering ble bedre partikler oppnådd for videre behandling. Det er kritisk å velge partikler med veldefinerte 2D-klasser som tydelig representerer den sekundære strukturelle informasjonen til S1PR3-Gi-komplekset (figur 4A), da partikler av dårlig kvalitet kan hindre påfølgende prosesseringstrinn (figur 4B), noe som resulterer i en rekonstruksjon med lavere oppløsning. Ved hjelp av 3D-klassifisering ble partiklene videre klassifisert for å utelukke støypartikler, skille forskjellige mulige konformasjoner og gi flere 3D-rekonstruksjoner. Til slutt ble et S1PR3-Gi komplekst EM-kart (figur 5A) produsert med god oppløsning via Fourier Shell Correlation (FSC) (figur 5B), gjennom Non-uniform Refinement.

Figure 4
Figur 4: Velge 2D-klasser. (A,B) Resultater fra 2D-klassifikasjon. (A) Velg 2D-klasse gjennomsnitt som inneholder veldefinerte klasser for videre behandling, og (B) avvise partielle partikler eller partikler med lav oppløsning og støy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Høyoppløselig struktur for pFTY720-bundne S1PR3-Gi-scFv16-komplekser. (A) Den høyoppløselige strukturen til pFTY720-bundet S1PR3-kompleks viser veldefinert kryo-EM-tetthet som representerer S1PR3- og Gi-proteinstrukturelementer. (B) Gold-standard Fourier shell correlation (FSC) kurve for pFTY720- bundet S1PR3-Gi kompleks. Dette tallet er tilpasset fra referanse27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ved å løse strukturene til S1PRs-G-proteinkomplekset med cryo-EM, belyste vi mekanismen for aktivering, selektiv legemiddelgjenkjenning og G-proteinkobling ved å bruke funksjonelle analyser i cellen. Gi-inhiberings-cAMP-analysen måler endringene i nivået av cAMP-konsentrasjon i celler (figur 1), og den ble ofte brukt til å validere aktiveringsstyrken til reseptorer kombinert med Gs eller Gi.

Konsentrasjonsforholdet mellom reseptor og sensorplasmid i eksperimentsystemet er avgjørende for eksperimentell levedyktighet. Så, for å utføre funksjonell analyse effektivt og presist, må man velge et plasmidkonsentrasjonsforhold med en maksimal Emaksverdi. I dette eksperimentet ble tre konsentrasjonsforhold (1: 1, 1: 3 og 1: 9) av reseptor til sensorplasmid undersøkt. Resultatene viste at maksimal E-maksverdi ble oppnådd når konsentrasjonsforholdet mellom reseptor og sensorplasmid var 1:3 (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Effekten av ulike konsentrasjonsforhold mellom S1PR3 og sensorplasmid på vindusperiode ble utforsket i CHO-K1-cellelinjen. Data presenteres som middel ± SEM av tre uavhengige eksperimenter utført i tre tredobler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I tillegg til konsentrasjonsforholdet mellom reseptoren og sensorplasmidet, var cellelinjene som ble brukt i dette eksperimentet også viktige. Det var ingen vesentlig forskjell mellom HEK293- og CHO-K1-cellelinjer for de fleste reseptorer. CHO-K1-cellelinjer hadde derimot en mer realistisk totalkurve enn HEK293-celler for S1PR3 (figur 7). Derfor ble CHO-K1-celler valgt for funksjonell eksperimentverifisering av S1PR3.

Figure 7
Figur 7: Effekten av forskjellige konsentrasjonsforhold mellom S1PR3 og Sensorplasmid på vindusperioden ble utforsket i HEK293-cellelinjen. Data presenteres som middel ± SEM av tre uavhengige eksperimenter utført i tre tredobler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en primær rørledning for å bestemme strukturene til S1PR ved kryo-EM og måle aktiveringsstyrken til S1PR ved Gi-mediert cAMP-hemmingsanalyse. Noen trinn er avgjørende for eksperimentets suksess.

For å rense S1PRs-Gi-komplekset, bør kvaliteten på viruset og helsen til sf9-celler være mer oppmerksom på. Uttrykket av reseptoren reduseres dramatisk i dårlige sf9-celler . Helsen til sf9-celler ble vurdert ved å måle diameteren. Den sunne sf9-cellen har en diameter på omtrent 15 μm. Utbyttet av S1PRs-Gi-komplekset påvirkes av volumforholdet mellom reseptor-, Gi- og Gβγ-virusene som kan overvinnes ved å montere S1PRs-G-proteinkomplekset in vitro42. I tillegg er GPCR-G-proteinkomplekser ikke alltid stabile, og dermed ble NanoBiT-strategien utviklet og har ofte blitt brukt for å stabilisere komplekset43.

Kvaliteten på prøven er grunnlaget for alt i cryo-EM-eksperimentet. Et aggregerings- eller dissosiasjonsfenomen er hyppig observert ved prøvescreening. Noen tilnærminger kan være nyttige i stabilisering av GPCR-G-proteinkompleks. C-terminalrester av S1PR kan forårsake prøveaggregering i S1PRs-Gi-kompleksprosjektet26. Signalveianalysen må brukes til å velge en akseptabel C-terminalende for S1PR26,27. Konsentrasjonen av LMNG er den nest viktigste faktoren; for høye vaskemiddelkonsentrasjoner kan stabilisere GPCR-G-proteinkomplekset, men de kan også redusere oppløsningen, mens lave konsentrasjoner kan gjøre det motsatte. Det avgjørende aspektet ved å stabilisere komplekset er en optimal vaskemiddelkonsentrasjon som er så lav som mulig. Dessuten kan konsentrasjonen av prøven av og til påvirke mengden data som samles inn. Når vi vitrifiserer en prøve, lager vi ofte en gradient. I databehandling er valg av algoritmer i partikkelvalg og 2D- eller 3D-klassifisering viktig for å løse S1PRs-G-proteinkompleksene, spesielt for modellering av ligander og ECL; tettheten av ECLer ble funnet kontinuerlig i S1PR1-strukturen løst i litteraturen beskrevet av Shian Liu et al.42 og funnet diskontinuerlig i S1PR5-strukturer26. Selv om det ikke er noen universell løsning på dette problemet for alle GPCR-komplekser, bør enhver strategi som forbedrer EM-tetthetskartet prøves. De avgjørende trinnene for vitrifisering, datainnsamling og bildebehandling ble beskrevet tidligere34,44.

En analyse er nødvendig for å evaluere aktiverings- eller inhiberingsstyrken til S1PR-ligander etter at strukturene til S1PR er bestemt av cryo-EM. Mange tilnærminger kan brukes. Gi-hemming cAMP-analyse evaluerer reseptoraktiveringsstyrken ved å overvåke endringer i cAMP-nivåer i celler forårsaket av agonister regelmessig. a) Cellekultur, b) transfeksjon, c) molforholdet mellom plasmidreseptor (eller mutasjoner) og sensorplasmid, og d) valg av celletype er alle avgjørende for et vellykket eksperiment. Helsen til cellene kan påvirke transfeksjonseffektivitet og reseptor- eller sensoruttrykk, noe som kan ha en betydelig innvirkning på eksperimentets signal-til-støy-forhold. Celler er generelt sunne etter 20 generasjoner, selv om dette ikke alltid er tilfelle. Det er viktig å alltid holde øye med tilstanden til cellene. Trypsinfordøyelsesperioden under cellepassasje må styres tett fordi tilstanden til cellen har en betydelig innvirkning over tid. Transfeksjonsreagenser påvirker reseptoruttrykk i flere celletyper, og et passende cellemerke må velges. Føflekkforholdet mellom plasmidreseptor og sensorplasmid i Gi-inhiberings-cAMP-analysen må optimaliseres. Vi velger ofte en serie molforhold mellom reseptor og sensorplasmid og identifiserer den høyeste variasjonen av fluorescensintensitet for å sikre datanøyaktighet for Gi-inhibering cAMP-analyse med reseptormutanter.

Noen andre analyser brukes til å overvåke cellulære cAMP-nivåer i en rekke prøvetyper, for eksempel ELISA-analyse45 og NanoBiT46. cAMP ELISA-analysen brukes til å måle mengden av cAMP bundet til det spesifikke antistoffet. Det cAMP-spesifikke antistoffet er forankret på en mikrotiterplate og peroksidase cAMP-traceren konkurrerer med cAMP om binding med antistoffet. Mengden av peroksidase cAMP-sporstoffet bundet til platen måles ved hjelp av fluorometriske tester som er omvendt proporsjonal med mengden cAMP. I 2007 utviklet Jiang og medarbeidere en metode for å overvåke nivåene av cAMP in vivo kvantitativt og raskt ved hjelp av Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) teknologi (cAMP-sensor ved hjelp av YFP-Epac-RLuc)46. NanoBiT-basert cAMP-analyse bruker cAMP-sensoren LgBiT-Epac-SmBiT, som erstatter YFP og Rluc med henholdsvis LgBiT og SmBiT, og brukes til å måle dissosiasjonen av G-protein heterotrimeren eller koblingen mellom reseptoren og G-protein heterotrimeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dataene fra S1PRs-Gi-komplekset ble høstet ved West China Cryo-EM Center i Sichuan University og Cryo-EM Center ved Southern University of Science and Technology (SUSTech) og behandlet ved Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (32100965 til L.C., 32100988 til W.Y., 31972916 til Z.S.) og heltids postdoktorforskningsfondet ved Sichuan University (2021SCU12003 til L.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O'Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Biokjemi utgave 184
En rørledning for å undersøke strukturer og signalveier for sfingosin 1-fosfatreseptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia,… More

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter