Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Helhjerne enkeltcellebilleddannelse og analyse af intakte neonatale musehjerner ved hjælp af MR, vævsrensning og lysarkmikroskopi

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver metoder til udførelse af magnetisk resonansbilleddannelse, rydning og immunmærkning af intakte musehjerner ved hjælp af iDISCO+, efterfulgt af en detaljeret beskrivelse af billeddannelse ved hjælp af lysarkmikroskopi og nedstrømsanalyser ved hjælp af NuMorph.

Abstract

Vævsrensning efterfulgt af lysarkmikroskopi (LSFM) muliggør cellulær opløsningsbilleddannelse af intakt hjernestruktur, hvilket muliggør kvantitativ analyse af strukturelle ændringer forårsaget af genetiske eller miljømæssige forstyrrelser. Helhjernebilleddannelse resulterer i mere nøjagtig kvantificering af celler og undersøgelse af regionsspecifikke forskelle, der kan gå glip af med almindeligt anvendt mikroskopi af fysisk sektioneret væv. Brug af lysarkmikroskopi til billedrensede hjerner øger anskaffelseshastigheden betydeligt sammenlignet med konfokal mikroskopi. Selvom disse billeder producerer meget store mængder hjernestrukturelle data, er de fleste beregningsværktøjer, der udfører funktionskvantificering i billeder af ryddet væv, begrænset til at tælle sparsomme cellepopulationer snarere end alle kerner.

Her demonstrerer vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en gruppe analyseværktøjer, til at kvantificere alle kerner og nukleare markører inden for kommenterede områder af en postnatal dag 4 (P4) musehjerne efter rydning og billeddannelse på et lysarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) for at måle hjernevolumen før krympning forårsaget af vævsrensningsdehydreringstrin, vævsrensning ved hjælp af iDISCO + -metoden, herunder immunmærkning, efterfulgt af lysarkmikroskopi ved hjælp af en kommercielt tilgængelig platform til at afbilde musehjerner ved cellulær opløsning. Vi demonstrerer derefter denne billedanalysepipeline ved hjælp af NuMorph, som bruges til at korrigere intensitetsforskelle, sy billedfliser, justere flere kanaler, tælle kerner og kommentere hjerneområder gennem registrering til offentligt tilgængelige atlasser.

Vi designede denne tilgang ved hjælp af offentligt tilgængelige protokoller og software, så enhver forsker med de nødvendige mikroskop- og beregningsressourcer kan udføre disse teknikker. Disse vævsrensnings-, billeddannelses- og beregningsværktøjer muliggør måling og kvantificering af den tredimensionelle (3D) organisering af celletyper i cortex og bør være bredt anvendelig til ethvert vildtype / knockout-museundersøgelsesdesign.

Introduction

Helhjernebilleddannelse ved enkeltcelleopløsning er en vigtig udfordring inden for neurovidenskab. Hjernebilleder i cellulær opløsning giver mulighed for detaljeret analyse og kortlægning på systemniveau af hjernekredsløb, og hvordan dette kredsløb forstyrres af genetiske eller miljømæssige risikofaktorer for neuropsykiatriske lidelser, cellulær adfærd ved udvikling af embryoner samt neurale kredsløb i den voksne hjerne 1,2,3. Der er flere histologiske metoder, der giver mulighed for billeder i høj opløsning af den rekonstruerede 3D-hjerne; disse teknikker kræver imidlertid dyrt, specialiseret udstyr, er muligvis ikke kompatibelt med immunmærkning, og den todimensionale (2D) karakter af nogle metoder kan føre til vævsskade og klipning under sektionering 4,5.

Nylige fremskridt har givet en alternativ tilgang til billeddannelse af hele hjerner, der ikke kræver vævssektionering; De involverer brug af vævsrensning for at gøre hjerner gennemsigtige. Gennemsigtighed opnås i de fleste vævsrensningsmetoder ved både at fjerne lipider, da de er en vigtig kilde til lysspredning, og matche objektets brydningsindeks (RI) med RI af prøvenedsænkningsopløsningen under billeddannelse. Lys kan derefter passere gennem grænsen mellem materialer uden at være spredt 6,7,8,9.

Vævsrensningsmetoder, såsom iDISCO +, kombineres ofte med hurtig 3D-billeddannelse ved hjælp af enkeltfoton excitationsmikroskopi, såsom LSFM 6,7,10. Inden for gennemsigtigt væv mærket med en fluorophore sektionerer lysarkfluorescensmikroskopibilleder ved excitation med et tyndt lysplan11. Den største fordel ved LSFM er, at en enkelt optisk sektion belyses ad gangen, hvor al fluorescens fra molekylerne inden for dette afsnit er ophidset, hvilket minimerer fotoblegning. Desuden muliggør billeddannelse af en hel optisk skive kamerabaseret detektion af den ophidsede skive, hvilket øger hastigheden i forhold til punktscanning12. LSFM producerer ikke-destruktivt velregistrerede optiske sektioner, der er egnede til 3D-rekonstruktion.

Mens iDISCO+ metoden giver mulighed for billig vævsrensning inden for ~ 3 uger, kan dehydreringstrin inden for protokollen føre til vævskrympning og potentiel ændring af prøvemorfologien og dermed påvirke volumetriske målinger 6,10. Tilføjelse af en sekundær billeddannelsesmetode, såsom MR, der skal bruges inden vævsrensningsproceduren, kan måle graden af vævsclearing-induceret krympning på tværs af prøven. Under dehydreringstrinnene kan forskelle i mekaniske egenskaber mellem gråt og hvidt stof føre til uensartede deformationer af hjernemateriale, hvilket resulterer i forskellige vævsclearing-inducerede volumendeformationer mellem vildtype- og mutantprøver og kan forvirre fortolkninger af volumetriske forskelle i disse prøver10,13 . MR udføres ved først at perfusere dyret med et kontrastmiddel (f.eks. Gadolinium), efterfulgt af inkubation af det ekstraherede væv af interesse i en nedsænkningsopløsning (f.eks. Fomblin) før billeddannelse14. MR er kompatibel med vævsrensning og udførelse af LSFM på samme prøve.

LSFM bruges ofte til at skabe store mikroskopibilleder til kvalitativ visualisering af hjernevævet af interesse snarere end kvantitativ evaluering af hjernestruktur (figur 1). Uden kvantitativ evaluering er det vanskeligt at påvise strukturelle forskelle som følge af genetiske eller miljømæssige fornærmelser. Efterhånden som vævsrensnings- og billeddannelsesteknologier forbedres sammen med reducerede omkostninger til opbevaring og computerkraft, bliver kvantificering af celletypelokaliseringer inden for vævet af interesse mere tilgængelig, hvilket giver flere forskere mulighed for at inkludere disse data i deres undersøgelser.

Med over 100 millioner celler i musehjernen15 og billeddannelsessessioner i hele hjernen, der kan generere terabyte data, er der øget efterspørgsel efter avancerede billedanalyseværktøjer, der muliggør nøjagtig kvantificering af funktioner i billederne, såsom celler. Der findes et væld af segmenteringsmetoder til vævsryddede billeder, der anvender tærskelværdier for nuklear farvningsintensitet og filtrerer objekter med foruddefinerede former, størrelser eller tætheder10,16,17,18. Unøjagtige fortolkninger af resultater kan dog opstå som følge af variationer i parametre som cellestørrelse, billedkontrast og mærkningsintensitet. Dette papir beskriver vores etablerede protokol til kvantificering af cellekerner i musehjernen. Først beskriver vi trin til vævsindsamling af P4-musehjernen efterfulgt af en vævsrensnings- og immunmærkningsprotokol optimeret fra den offentligt tilgængelige iDISCO+ metode10. For det andet beskriver vi billedoptagelse ved hjælp af MR og lysarkmikroskopi, herunder de parametre, der bruges til optagelse af billeder. Endelig beskriver og demonstrerer vi NuMorph19, et sæt billedanalyseværktøjer, som vores gruppe har udviklet, der muliggør celletypespecifik kvantificering efter vævsrensning, immunmærkning med nukleare markører og lysarkbilleddannelse af kommenterede regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus blev brugt i overensstemmelse med og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Chapel Hill.

1. Musedissektion og perfusion

BEMÆRK: Følgende dissektioner blev udført på P4- og P14-mus ved hjælp af en sprøjte. Volumenet af perfusionsvæske vil variere afhængigt af dyrets alder.

  1. Perfusion
    FORSIGTIG: Paraformaldehyd (PFA) er et farligt kemikalie. Udfør alle perfusionstrin i en kemisk røghætte.
    1. Før operationen administreres pentobarbital via intraperitoneal injektion (100 mg/kg), og bedøvelsen får virkning fra operationen.
    2. Når dyret har nået et kirurgisk anæstesiplan, skal du bruge tåklemmende responsmetode til at bekræfte manglende reaktion.
    3. Lav et lateralt snit under brystkassen for at udsætte dyrets brysthule.
    4. Brug buet, kirurgisk saks til forsigtigt at skære gennem brystkassen op til kravebenet på den ene side af dyret og lave et identisk snit på den modsatte side, så brystbenet kan løftes væk og udsætte hjertet.
    5. Uden at beskadige den faldende aorta, skal du omhyggeligt trimme ethvert væv, der er forbundet med hjertet, før du laver et lille snit på højre atrium for at lade blod strømme ud af vaskulaturen.
    6. Ved hjælp af en sprøjtebaseret metode perfuses musen gennem venstre ventrikel med 10 ml og 7 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) til henholdsvis P14 og P4 med en perfusionshastighed på 1,5 ml / min gennem systemet.
    7. Når blodet er renset, perfuses igen med 10 ml PBS + 4% PFA og 7 ml PBS + 4% PFA for henholdsvis P14 og P4 ved 4 °C med en perfusionshastighed på 1,5 ml/min for at fiksere dyret.
      BEMÆRK: Fikseringsrystelser vil blive observeret, og dyret vil være stift efter afslutningen. Hvis du bruger MR på prøver, perfuse med lignende mængder PBS og PFA for hvert tidspunkt + 20% gadoliniumbaseret MR-kontrastmiddel i PFA-opløsningen.
    8. Fjern hovedet ved hjælp af kirurgisk saks og drop-fix med PBS + 4% PFA i 24 timer ved 4 °C for fuldstændig fiksering.
      BEMÆRK: På dette stadium forbliver hjernen intakt med kraniet på (se afsnit 2). Pausepunkt: Hjerner kan opbevares i flere måneder på dette stadium i PBS + 0,1% natriumazid ved 4 °C.

2. MR-baseret brutto hjernestruktur billeddannelse med intakt kranium og analyse

BEMÆRK: Hjernen skal perfunderes og inkuberes i gadolinium som beskrevet ovenfor uden at blive fjernet fra kraniet. Al MR forekommer før fjernelse af hjernen fra kraniet for at undgå utilsigtet vævstab under dissektion. Billeddannelse med et intakt kranium giver også støtte til hjernen i prøveholderen (dvs. sprøjte) under prøveforberedelse og billeddannelse.

  1. Forberedelse af prøver
    BEMÆRK: Følgende trin er optimeret til P4- og P14-musehjerneprøver. Den nødvendige sprøjtestørrelse afhænger af prøvens fysiske størrelse.
    1. Hvis der udføres MR på prøven, fjernes huden fra kraniet og inkuberes i PBS + 3% gadolinium i 23 dage ved 4 °C før billeddannelse14. Efter 23 dage skylles prøverne hurtigt i PBS.
    2. Brug 5 ml sprøjter til at skabe en prøveholder til MR ved hjælp af sprøjtestempler til at lukke hver ende af holderen lavet med sprøjten20. Brug plaststykker til at holde kraniet tæt på plads i holderen (figur 2A). Fjern markeringerne på sprøjten med ethanol for at forhindre artefakter ved billeddannelse.
    3. Anbring kraniet sikkert i prøveholderen, og fyld med en nedsænkningsopløsning, der er kompatibel med MR (se materialetabellen). Luk holderen, og fjern alle luftbobler med en sprøjte.
      BEMÆRK: Pausepunkt: Kraniet kan opbevares i nedsænkningsopløsningen i flere måneder før billeddannelse.
  2. Grov hjernestruktur billeddannelse (MR)
    1. Billede prøverne med et 9,4T/30 cm vandret MR-system med dyreknogler ved hjælp af en 15 mm volumenspole og en spin-ekko-baseret sekvens med følgende parametre: Rumlig opløsning: 60 μm x 60 μm x 60 μm; Samlet scanningstid: 7 h 12 min; tid til ekko (TE): 6,83 ms; gentagelsestid (TR): 40 ms; excitation/refokusering af flipvinkler: 90/180 grader; billedstørrelse: 166 x 168 x 209 voxels; Synsfelt (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; båndbredde: 100.000 kHz.
  3. Beregningsmæssig brutto hjernestruktur analyse
    1. Fjern det omgivende kranium fra rå MR-billeder ved manuelt at spore musehjernen ved hjælp af segmenteringssoftware. Anvend derefter den voxel-vise multiplikationsoperation mellem maskebilledet og det rå MR-billede for at generere det kranie-strippede hjerne-MR-billede.
      BEMÆRK: Outputtet er et binært maskebillede, hvor intensiteten for hjernevoxels ellers er indstillet til 1 og 0.
    2. Anvend stiv billedregistrering (estimering kun oversættelse og rotation) ved hjælp af 'flirt' i FSL-pakke21,22 for at justere det kraniestrippede MR-billede (bevægeligt billede) til det tilsvarende lysarkmikroskopibillede (referencebillede).
    3. Anvend ikke-stiv registrering (ved hjælp af 'SyN' i ANTS-software23) for at finde punkt-til-punkt-korrespondancerne mellem det stivjusterede MR-billede i trin 2.3.2 til lysarkbilledet (samme referencebillede i trin 2.3.2).
      BEMÆRK: Outputtet inkluderer det skæve MR-billede og deformationsfeltet, der er forbundet med volumenændringerne fra MR til lysarkbillederne.
    4. Beregn den jakobinske determinant på deformationsfeltet genereret i trin 2.3.3, som kvantificerer volumenændringen i et 3 x 3 x 3 voxel lokalt kvarter.
    5. Juster kraniefjernede billeder til Allen Developmental Mouse Brain Atlas ved hjælp af deformerbar billedregistrering.
      BEMÆRK: Den etablerede rumlige punkt-til-punkt-korrespondance tillader automatisk annotering af hjerneområder af interesse i det nye musebillede (figur 2C-H).

3. Hjernedissektion fra kraniet

  1. Lav et midterlinjesnit langs toppen af kraniet fra halsen til næsen for at udsætte kraniet.
  2. Udsæt bunden af kraniet ved at trimme den resterende nakkemuskel og alle andre resterende muskler.
  3. Brug en skarp kirurgisk saks til forsigtigt at skære langs kraniets indre overflade og passe på ikke at beskadige hjernen ved at opretholde et blidt opadgående tryk, mens du skærer med det skarpe kirurgiske udstyr.
  4. Brug pincet til at skrælle de to afskårne halvdele af kraniet væk fra hjernen og forsigtigt trimme overskydende fedt væk, der er fastgjort til hjernen.
  5. Brug en kirurgisk saks til at trimme enhver dura, der forbinder hjernen med kraniet, og brug derefter en spatel til forsigtigt at fjerne hjernen fra hovedet.
  6. Fjern hjernen, vask med PBS, og skift derefter til PBS med 0,1% natriumazid og hold ved 4 °C til langtidsopbevaring.

4. Vævsrensning

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra iDISCO+ protokollen til P4 mus6, med mindre ændringer. Nogle detaljer kan ændre sig for forskellige tidspunkter / arter / eksperimenter). FORSIGTIG: Methanol, dichlormethan (DCM) og dibenzylether (DBE) er farlige kemikalier. Disse vævsrensningstrin udføres i en kemisk røghætte.

  1. Validering af antistoffer
    BEMÆRK: Methanolkompatibilitet af uprøvede antistoffer skal kontrolleres, da de kan blive negativt påvirket af de hårde methanolvasker, der kræves i iDISCO+ protokollen. For en liste over antistoffer, der har vist sig at virke i iDISCO+, se hjemmesiden24.
    1. Høst 10 μm frosne sektioner af PFA-fikservævet af interesse på stereologiske dias.
    2. Inkuber sektionerne i 100% methanol i 3 timer ved stuetemperatur.
    3. Rehydrere i PBS, før du fortsætter med standard immunohistokemiske protokoller for at afgøre, om antistoffet viser det forventede fluorescensmønster efter vask af methanol. For positiv kontrol skal du bruge et dias, der ikke er behandlet med methanol.
  2. Forberedelse af buffer
    1. Forbered buffere i henhold til den officielle iDISCO-protokol. Se materialetabellen for sammensætning af buffere og andre opløsninger, der anvendes i denne protokol.
  3. Forbehandling
    1. Dehydrere prøven med methanol/PBS-serier: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 time hver ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Brug af PBS under dehydrering hjælper med at forhindre revner i prøverne i methanolvask.
    2. Prøven vaskes i 100% methanol i 1 time, og afkøles derefter ved 4 °C i 1 time, inden den inkuberes natten over med omrystning i 66% DCM/33% methanol ved stuetemperatur.
    3. Prøven vaskes 2x i 100% methanol ved stuetemperatur, og afkøles derefter ved 4 °C.
    4. Brug frisk 5% H2O2i methanol til at blege prøven natten over ved 4 °C.
    5. Rehydrere prøven med methanol/PBS-serien: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 time hver ved stuetemperatur og vaskes 2x i 1 time i PTx.2 ved stuetemperatur.
    6. Prøven inkuberes i 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO ved 37 °C natten over.
    7. Prøven inkuberes i 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Deoxycholat/0,1% NP40/20% DMSO ved 37 °C natten over.
    8. Vask i PTx.2 ved stuetemperatur i 1 time to gange.
  4. Immunmærkning
    1. Prøverne inkuberes i permeabiliseringsopløsning ved 37 °C i 2 dage (~48 timer).
    2. Prøverne blokeres i blokeringsopløsning ved 37 °C i 2 dage (~48 timer).
    3. Inkubere prøverne med primært antistof i PTwH / 5% DMSO / 3% Serum ved 37 ° C i 4 dage (~ 96 timer) (f.eks. Kanin (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) og anti-Ctip2 rotte (Rt) antistof (1:400) (Materialetabel).
    4. Vask 3 x 1 time i PTwH. Vask i yderligere 2 timer i PTwH. Lad den stå i vaskeopløsningen natten over ved stuetemperatur.
    5. Inkubere prøverne med sekundært antistof og et nukleart farvestof, såsom TO-PRO-3, i PTwH / 3% Serum ved 37 ° C i 4 dage (~ 96 timer; f.eks. Gedebekæmpelse (1:50) og (gedebekæmpelse (1:200)) (Materialetabel).
    6. Vask 3 x 1 time i PTwH Vask i yderligere 2 timer i PTwH. Lad vaskeopløsningen stå natten over ved stuetemperatur.
  5. Clearing
    1. Dehydrere i methanol/PBS-serier-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 time hver ved stuetemperatur. Inkuberes i 3 timer med omrystning i 66% DCM / 33% methanol ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Prøven kan efterlades natten over ved stuetemperatur umiddelbart efter dehydrering i 100% methanol.
    2. Inkuberes i 100% DCM i 15 minutter to gange ved stuetemperatur (med omrystning) for at vaske MeOH.
    3. Inkuberes i dibenzylether (DBE) uden at ryste ved stuetemperatur. Sørg for, at røret er fyldt næsten fuldstændigt med DBE for at forhindre oxidation af prøven. Afslut blandingen af opløsningen ved at invertere et par gange før billeddannelse.

5. Billeddannelse af lysark

BEMÆRK: iDISCO-vævsrensede hjerner blev afbildet med et lysarkmikroskop, udstyret med et 2X / 0.5 NA-mål, et komplementært metaloxid halvlederkamera og mikroskopdrifts- og billedoptagelsessoftware ved 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel for P4-tidspunktet, da dette tillod enkeltcelleopløsning i cortex (figur 3A, B).

  1. Prøvemontering
    1. Prøveemnet monteres forsigtigt i den korrekte prøvestørrelsesholder, således at prøveemnet er orienteret med z-dimensionen højst 5,2 mm i dybden på grund af lysarkmikroskopets nominelle arbejdsafstand (5,7 mm minus 0,5 mm sikkerhedsmargen)25.
    2. Placer holderen i prøveholderen med holderens skrue i en vinkel på 45° i forhold til vuggestøtterne (figur 1B). Holderen placeres, så lysbanen er vinkelret på prøven (figur 1C).
  2. Billeddannelsesparametre
    1. Indstil zoomlegemet på mikroskopet til 4x forstørrelse eller højere med et udbytte på 0,75 μm / pixel.
      BEMÆRK: Enkeltcelleberegningsanalyser på P4-lysarkbilleder kan udføres med ethvert kommercielt tilgængeligt lysarkmikroskop, der tillader opløsning på 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel eller højere. En lavere opløsning er tilstrækkelig for hjerner på senere tidspunkter, hvor kerner er mere sparsomt fordelt.
    2. I billedoptagelsessoftwaren skal du vælge et enkelt lysark med en NA = ~ 0,08 (9 μm tykkelse / 4 μm z trin).
      BEMÆRK: Denne indstilling kombineret med vandret dynamisk fokusering tillader helhjernebilleddannelse ved en enkeltcelleopløsning af en musehjerne inden for en rimelig tid. For en postnatal dag 4 (P4) hjerne anslås billedoptagelsestiden at være 11-15 timer for tre kanaler afhængigt af hjernens størrelse.
    3. For at sikre, at aksial opløsning opretholdes langs billedets bredde, skal du vælge Vandret dynamisk fokusering og anvende det anbefalede antal trin afhængigt af laserbølgelængden. For en hel P4-musehjerne skal du indstille den vandrette dynamiske fokusering til 11. Juster Finfokus for hver kanal med hensyn til registreringskanalen.
      BEMÆRK: Her er TO-PRO-3-kanalen (647 nm) registreret til Allen Developmental Mouse Brain Atlas, da dette mærker alle kerner.
    4. Juster lasereffekten pr. kanal i forhold til kanalegenskaberne.
      BEMÆRK: Længere bølgelængder kræver højere lasereffekt sammenlignet med kortere bølgelængder. For eksempel skal 780 nm afbildes ved en høj lasereffekt (70% - 75%) og lav eksponering (50 ms), mens 647 nm-kanalen kræver en gennemsnitlig lasereffekt (40% - 45%) og lav eksponering (50 ms).
    5. Juster lysarkbredden til ~50 % for at sikre, at arkeffekten fordeles optimalt i y-dimensionen for denne prøvestørrelse.
      BEMÆRK: I kombination med den vandrette dynamiske fokusering giver en arkbredde på 50 % en gennemsnitlig effektfordeling på tværs af billedet med en reduceret risiko for fotoblegning25.
    6. Angiv antal felter i forhold til prøvens størrelse med en anbefalet overlapning på 15 % mellem fliser, og tag billeder for hver kanal sekventielt for hver stak på en given feltposition.

6. Billedbehandling ved hjælp af NuMorph

BEMÆRK: NuMorph-pipelinen har tre hoveddele til 3D-billedanalyse: forbehandling, analyse og evaluering. Disse dele er organiseret i henholdsvis NMp_template.m, NMa_template.m og NMe_template.m, som diskuteres nedenfor. Derudover tilføjes NM_setup.m for at downloade og installere softwarepakker, der er nødvendige for, at NuMorph kan køre problemfrit. NM_samples.m indeholder også en skabelon til indtastning af billedoptagelsesoplysninger.

  1. NuMorph opsætning
    1. Download og installer conda-miljøadministratoren til Linux26. Download og installer NuMorph19 billedbehandlingsværktøjer.
    2. Kør Matlab på kommandolinjen . Kør NM_setup.m fra NuMorph for at downloade og installere softwarepakker til billedanalyser, der er nødvendige til analyser.
      BEMÆRK: Dette trin sikrer, at conda-miljøet er konfigureret korrekt, samt sikrer, at alle værktøjer og tilføjelser, der er nødvendige for, at Matlab kan køre hver af de tre rørledninger, downloades og installeres korrekt. Mest bemærkelsesværdige her er Elastix til løbende registrering og 3D-Unet til celledetektion og tælling.
  2. Angiv eksempelnavne, input- og outputmapper, kanaloplysninger og lysarkbilledparametre ved at redigere filen NM_samples.m.
    BEMÆRK: Her anbefales det at dobbelttjekke for at sikre, at de rigtige oplysninger, især billedinputmappe, er angivet korrekt. Fejl kaldes normalt ikke her, før de kører efterfølgende trin.
  3. Forbehandling af billeder
    1. Justering af intensitet
      1. I NMp_template skal du indstille intensitetsjustering = sand.
        BEMÆRK: Indstil til true, hvis intensitetsjustering er påkrævet. Hvis ikke, skal du indstille intensitetsjustering = falsk. Der er også mulighed for at bruge 'opdatering' til at overskrive tidligere justeringsparametre.
      2. Indstil brug behandlede billeder = falsk , når du arbejder med et nyt sæt billeder. Ellers skal du angive eventuelle tidligere gemte billeddatasæt i outputmappen (f.eks. "justeret", "syet") til brug for efterfølgende behandlingstrin.
        BEMÆRK: Denne mulighed leveres i tilfælde, hvor inputbilleder allerede er blevet forbehandlet. I dette tilfælde vil forbehandlede billeder blive brugt som inputbilleder, og indstillingen indstilles til navnet på undermappen i outputmappen.
      3. Indstil gem billeder = true.
        BEMÆRK: Brug af denne indstilling sikrer, at behandlede billeder gemmes i outputmappen; Ellers beregnes og gemmes kun parametre.
      4. Indstil gem prøver = sand.
        BEMÆRK: Denne indstilling sikrer, at prøveresultater gemmes for hvert større trin.
      5. Indstil juster fliseskygge = grundlæggende for at anvende skyggekorrektion ved hjælp af BaSiC-algoritmen27 eller manual til at anvende korrektion af feltskygge ved hjælp af målinger fra lysarkmikroskopet ved specifikke lysarkbredder.
        BEMÆRK: Denne indstilling korrigerer for den ujævne belysning langs y-dimensionen forårsaget af formen på arkets talje.
    2. Justering af billedkanal
      1. I NMp_template skal du indstille kanaljustering = sand. Angiv denne indstilling til true, hvis kanaljustering er påkrævet. Hvis ikke, skal du indstille til falsk. Indstil kanaljusteringsmetode til enten oversættelse (stiv) eller elastix (ikke-stiv).
        BEMÆRK: Oversættelsesmetoden bruger stive 2D-registreringsmetoder til at justere flere kanaler, mens elapix-metoden bruger ikke-stive B-splines28 til at korrigere for rotationsdrift, som kan forekomme under lang billedoptagelse19.
    3. Iterativ billedsyning
      1. I NMp_template skal du indstille stingbilleder = true.
        BEMÆRK: Angiv denne indstilling til sand, hvis syning er påkrævet.
      2. Indstil sigteforfining = sand.
        BEMÆRK: Denne indstilling bruges til yderligere at forfine oversættelsen i xy ved hjælp af Scale Invariant Feature Transform29.
      3. Indstil belastningsjusteringsparametre = sand.
        BEMÆRK: Denne indstilling bruger kanaljusteringsoversættelserne under syning. Denne indstilling anbefales med multikanalsbilleddannelse. Ellers skal du indstille til falsk.
      4. Indstil overlapning = 0,15 for at matche fliseoverlapninger under billeddannelse.
    4. For at køre et af disse forbehandlingstrin skal du køre følgende i Matlab uden for NMp_template miljø:
      1. Angiv eksempelnavn. Indstil config = NM_config(proces,eksempel).
      2. Kør et af forbehandlingstrinnene ved at angive NM_process(config,stage), og angiv trinnet ved hjælp af intensitet, justering eller søm for en af processerne. Kontroller outputmappen for outputfiler for hvert af trinene (figur 3 og figur 4).
  4. Billedanalyse
    1. Før NuMorph
      1. Start med et 3D-atlasbillede og et tilhørende annoteringsbillede, der tildeler hver voxel til en bestemt struktur.
        BEMÆRK: P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas genereret fra MagellanMapper30 bruges her.
      2. Juster både atlasbilledet og annoteringsfilen for at sikre, at de matcher korrekt i den rigtige retning.
    2. Inden for NuMorph
      BEMÆRK: Nu hvor atlasset og dets annoteringer er justeret korrekt, skal filerne "munges" eller behandles i NuMorph, så de kan gemmes til senere brug. For at gøre dette skal du bruge funktionen munge_atlas til at angive input som vist nedenfor.
      1. Angiv Atlas_file: (streng). Angiv den fulde sti til atlasfilen.
      2. Angiv Annotation_file: (streng). Angiv den fulde sti til de tilknyttede anmærkninger.
      3. Angiv opløsning: (1x3 numerisk). Angiv atlasopløsningen y,x,z som mikron pr. pixel.
      4. Angiv retning: (1 x 3 tegn). Angiv atlasretningen, og sørg for, at den matcher opsætningen af prøven i vuggen (anterior(a)/posterior(p),superior(s)/inferior(i),left(l)/right(r)).
      5. Angiv halvkugle: Angiv, hvilken hjernehalvdel der blev afbildet ("venstre", "højre", "begge", "ingen").
      6. Angiv out_resolution:(int). Angiv den isotropiske opløsning af atlasoutput i mikron. (standard: 25).
      7. Kør kommandoen "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, opløsning, orientering, halvkugle)" for at generere munged annoteringer i /data/annotation_data og en kopi af atlasbilledet i /data/atlas.
      8. Læs Matlab-strukturen og atlasfilen for at kontrollere, at begge filer er munged korrekt i den rigtige retning.
        BEMÆRK: Et yderligere celleklassificeringstrin kan udføres for at kvantificere celletyper baseret på co-lokalisering af immunmærkede proteinmarkører.
    3. Gensampling
      1. I NMa_template skal du indstille resamplede billeder = true, hvis du udfører billedregistrering for at henvise til atlaset eller for at generere nedsamplede mængder datasæt med høj opløsning.
        BEMÆRK: NMa_template.m vil blive brugt til at indstille parametrene til resampling, registrering, kernedetektion og celletælling.
      2. Indstil resampleopløsningen, så den passer til atlasset.
        BEMÆRK: Her anvendes 25 μm3/voxel isotrop opløsning, fordi referenceatlasset er ved denne opløsning.
      3. Angiv det kanalnummer, der skal gensamples ved hjælp af resample-kanaler = [ ].
        BEMÆRK: Her er kanalnummeret indstillet til at matche den nukleare kanal. Hvis denne indstilling er tom, er det kun registreringskanalen, der bliver samplet igen.
    4. Registrering
      1. I NMa_template skal du indstille registerbilleder = true. Indstil til sand, hvis registrering er påkrævet. Hvis ikke, skal du indstille registrering = falsk.
      2. Angiv atlasfilen, så den svarer til filen i atlasmappen.
      3. Indstil registreringsparametre = standard.
        BEMÆRK: Denne indstilling bruger en affin efterfulgt af B spline-transformation til at estimere rumlig korrespondance. Ellers skal du definere et nyt sæt registreringsparametre via Elastix i /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Indstil gem registrerede billeder = true.
        BEMÆRK: Outputfiler fra registrering og resampling kan downloades og inspiceres visuelt i Matlab eller andre visualiseringsværktøjer såsom FIJI31.
    5. Påvisning af kerner, celletælling og klassificering
      BEMÆRK: Fejl, der opstår her, kan skyldes, at annoteringsfilen ikke er angivet korrekt, eller at den ikke matcher prøvens alder med den rigtige anmærkning.
      1. I NMa_template skal du indstille både tællekerner og klassificere celler = sandt.
      2. Indstil optællingsmetode = 3dunet.
        BEMÆRK: Denne indstilling tillader brug af den trænede 3D-Unet model19. Ellers skal du vælge Hessian, der bruger den hessiske blob-detektionsmetode.
      3. Indstil min_intensity til at definere en minimumsintensitetstærskel for registrerede objekter.
        BEMÆRK: En passende tærskel bestemmes empirisk baseret på signal-støj-forholdet mellem nuklear mærkning.
      4. Indstil classify_method til enten tærskel, som er baseret på en uovervåget fluorescensintensitet ved centroidpositioner eller svm, som modellerer en overvåget lineær Support Vector Machine (SVM) klassifikator.
        BEMÆRK: Dette trin klassificerer alle de detekterede celler i fire hovedklasser med 3-kanals billeddannelse. Med denne protokol genereres Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- og Outliers.
    6. Analyse trin
      1. Angiv eksempelnavn. Indstil config =NM_config(analyser,prøve).
      2. Kør et af analysetrinnene ved at angive NM_analyze (config,stage), og angiv fasen ved hjælp af resample, register, count eller classify. Kontroller outputmappen for outputfiler for hvert af trinene (figur 5).
    7. Celletypeklassifikation og gruppeanalyse
      1. I NMe_template skal du indstille opdatering = sand og overskrive alle tidligere beregnede statistikker.
        BEMÆRK: NMe_template.m giver mulighed for at udføre celletypegruppeanalyse på tværs af hjerneområder i den samme hjerne, der analyseres.
      2. Indstil compare_structures_by til enten indeks for at sammenligne med alle unikke annoteringer eller tabel for at sammenligne strukturer i henhold til tabellen.
      3. Indstil template_file, som angiver alle mulige strukturindekser og skal findes i /annoteringer.
      4. Angiv structure_table , og angiv strukturer, der skal evalueres.
      5. Angiv celletælling og celletypeklassificering som beskrevet i NMa_template.m.
      6. Indstil compare_groups til at angive grupper, der skal sammenlignes.
      7. Indstil parret til enten sand eller falsk for enten at udføre parret t-test eller to-prøve t-test.
    8. Kør analyse.
      BEMÆRK: For at udføre dette trin skal du køre følgende i Matlab uden for NMe_template.m-miljø.
      1. Angiv eksempelnavn. Indstil config =NM_config(evaluere,prøve).
      2. Kør analysetrinnet ved at angive NM_evaluate(config,stage) og angive fasen. Kontroller outputmappen for outputfiler til gruppeanalysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Da iDISCO+ protokollen introducerer signifikant vævskrympning, som let kan mærkes af øjet (figur 2B), tilføjede vi et MR-trin til denne rørledning før vævsrensning for at kvantificere krympningen induceret af vævsrensning. Arbejdsgangen starter med fjernelse af ikke-hjernevævet fra MR-billedet (figur 2C). Derefter anvendes en stiv transformation (3 oversættelses- og 3 rotationsvinkler) for at justere MR-billedet til lysarkbilledet (figur 2D). Ved at gøre dette observerede vi et samlet volumentab på 60% induceret af vævsrensningsproceduren (figur 2E), hvilket var i overensstemmelse med volumenændringsestimater efter øje (figur 2B). Dette resultat er helt anderledes end en tidligere rapport, hvor der blev rapporteret et svind på 5%-10%10,32. Forskellen i krympning kan skyldes forskellen i dyrs alder mellem de to undersøgelser (P4 vs. voksne hjerner) eller på grund af tidsforskelle i methanolvasken i rydningstrinnet i iDISCO+ protokollen (16 timer vs. 2 timer). For at kortlægge grader af vævskrympning på tværs af forskellige områder af hjernen implementerede vi yderligere en deformerbar billedregistrering, hvor lysarkbilledet bruges som reference. Det registrerede MR-billede er vist i (figur 2F). Den estimerede volumenændring på grund af vævsrensningsproceduren er farvekodet, hvor der observeres en større grad af krympning i cortex sammenlignet med andre hjerneområder (figur 2G).

For at måle mængder af hjerneområder udførte vi segmentering af MR gennem registrering til et kommenteret atlas. Segmentering af MR-afbildede hjerner blev betragtet som vellykket, hvis referenceatlasoverlejringen nøje matchede de anatomiske grænser, der blev identificeret ved forskelle i kontrast i de rå MR-billeder (figur 2H). Overlejringen under registrering er afhængig af god prøveforberedelse (figur 2A), billedoptagelse og kraniestribning. Kraniet stripping trin er afgørende for gode registreringsresultater, da registreringen vil forsøge at vride referencebilledet fra atlaset til hele MR-billedet, inklusive ethvert kranium, der forbliver i billedet. Skull inklusion i registrering kan forvrænge resultaterne og producere en forkert registreret 3D-volumengengivelse af segmenteringen. Den endelige gengivelse af 3D-diskenhed kan derefter visualiseres ved hjælp af ITK-SNAP33 (figur 2H). Denne metode bruges til at vurdere brutto hjernevolumenforskelle på tværs af prøvegrupper. Det cellulære grundlag, der ligger til grund for volumenforskelle, der opdages med MR, kan forfølges ved hjælp af celletælling med vævsrensning, lysarkmikroskopi og NuMorph.

Målet med vævsrensning og analyse er at vurdere forskellige celletypers bidrag til forskelle på tværs af eksperimentelle betingelser (f.eks. Genotype, miljøeksponering) ved at tælle individuelle kerner ved hjælp af NuMorph. Vævsrensning ved hjælp af iDISCO + -protokollen og neuronale lagspecifikke kernemarkører resulterede i klart definerede cellegrupper af øvre og nedre lag neuroner i isocortex (figur 3).

Celletælling ved hjælp af NuMorph er afhængig af vellykkede forbehandlingstrin, der involverer intensitetsjustering, kanaljustering og syning (figur 4A). Fejl, der opstår i et af disse trin, kan resultere i forkert syning (figur 4B, C). For eksempel kan forkert billedoptagelse resultere i billeder med in-focus og out-of-focus mønstre under forbehandling (figur 4C). For at tælle kerner fra bestemte hjerneområder kommenteres de syede billeder ved hjælp af et offentligt tilgængeligt atlas. Vi registrerede vores syede billeder til en korrigeret version af P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34. Her blev de syede billeder nedsamplet fra en høj opløsning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) til en lavere opløsning (25 μm³/voxel isotrop opløsning) for at matche atlassets opløsning. Matchning af atlasets opløsning sikrer korrekt registrering af billederne til atlaset og giver regionale kommentarer i de erhvervede billeder (figur 5A).

For at udføre specifik celletypespecifik tælling mærkede vi øvre lag neuroner, der udtrykker Brn2, nedre lag neuroner, der udtrykker Ctip2, og alle kerner med TO-PRO-3 (figur 3B). Billeddannelse udføres med tilstrækkelig rumlig opløsning til at adskille individuelle kerner (0,75 x 0,75 x 4 μm3 / voxel). Centroider af kerner detekteres med en trænet 3D-Unet-model i NuMorph (figur 5B, C). Vi opdagede ~12 × 10 6 samlede kerner, der var To-Pro-3+ i isocortex, herunder ~2,6 × 10 6 Brn2+ og 1,6 × 10 6 Ctip2+ kerner. Vi opdagede også ~ 3,7 × 10 6 og 2,9 × 106 To-Pro-3+ totale kerner i henholdsvis basalganglierne og hippocampal allocortex. Ca. 1,5 × 10 6 og <1 × 106 Ctip2+ celler blev talt i henholdsvis basalganglierne og hippocampal allocortex, selvom der blev påvist et ubetydeligt antal Brn2+ celler (figur 5D). De samlede kernetal i isocortex og hippocampal allocortex kombineret (~ 15 millioner celler) svarer til tidligere rapporterede samlede celletal i musens hjernebark15. Disse resultater demonstrerer nytten af MR-billeddannelse, iDISCO + vævsrensningsmetode og NuMorph-beregningsanalyse til at afsløre volumetriske, samlede celletal og celletypespecifikke tællinger, der ligger til grund for forskelle i musehjernestruktur på tværs af eksperimentelle grupper.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over helhjerne enkeltcelleanalyse af intakte neonatale 3D-vævsrensede musehjerner. (A) Oversigt over iDISCO+ vævsrensning, lysarkbilleddannelse og 3D-billedanalyse. (B) Billeder, der viser korrekt prøvemontering på lysarkmikroskopet. (C) Tegneserie, der viser prøvemontering i forhold til lysarksti. Forkortelse: ab = antistof. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Brutto hjernestruktur målinger med MR. (A) Billede, der viser prøveforberedelse til MR. (B) Billeder af repræsentative P4-hjerner før og efter iDISCO+ vævsrensning. Skalastang = 5,0 cm. (C) Rå MR-billede med kraniet fastgjort ved 60 x 60 x 60 μm³. Skalabjælke = 800 μm. (D) Lysarkbillede af musehjerne ved 25 x 25 x 25 μm³. Samlet volumen = 68,7 mm3. Bemærk, at en lille del af dorsal isocortex utilsigtet blev fjernet under dissektion markeret med pilespids (hvid). Skalabar = 800 μm. (E) MR-billede af musehjerne efter kraniestripping og stiv registrering. Samlet volumen = 171,9 mm3. Indsæt (gul) viser hjernekontur fra lysarkbilledet. Skalabjælke = 800 μm. (F) Registreret MR-billede med henvisning til lysarkbillede for at vurdere deformation. Skalabjælke = 800 μm. (G) Voxel-klog hjernekortlægning for at vurdere volumenændringer mellem lysarkbillede og MR-billede, hvor blå og rød angiver henholdsvis krympning og udvidelse fra MR-billede til lysarkbillede. Samlet set var der et volumentab på 60%, men nogle regioner som isocortex viste større krympning i forhold til andre. (H) Venstre panel: Aksial visning af MR-billede med registrerede segmenteringer fra Allen Developmental Brain Atlas overlejret. Højre panel: 3D-volumengengivelse af segmentering. Skala bar = 800 μm. Forkortelser: OB = olfaktorisk pære; Dpall = dorsal pallium/isocortex; Mb = mellemhjerne; Cb = lillehjernen. Orientering: R = Rostral; L = Lateral; D = Dorsal. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Billeder i mobilopløsning og kanaljustering. (A) Optisk aksial sektion af TO-PRO-3 (TP3) nuklear farvning og immunmærkning for Ctip2 (nedre lag neuron) og Brn2 (øvre lag neuron) markører i P4 musehjerne. Skalabjælke = 1 mm. (B) Forstørret indsæt af kortikale områder i A (boks), der viser korrekt kanaljustering med forventet lokalisering af Brn2-immunmærkede øvre lag og Ctip2-immunmærkede neuroner i det nedre lag. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på billedsyning . (A) Prøveresultater fra et 2D iterativt, korrekt syet billede. Skalastang = 1 mm. Indsæt viser et eksempel på korrekt syning, der er zoomet ind på. Skalabjælke = 500 μm. (B) Eksempelresultater fra et 2D iterativt, forkert syet billede. Skalastang = 1 mm. Indsæt viser et eksempel på forkert syning, der er zoomet ind (udhæng). Skalabjælke = 100 μm. (C) Prøveresultater fra et 2D iterativt forkert syet billede. Skalastang = 1 mm. Indsæt viser et eksempel på forkert syning, der er zoomet ind på (ude af fokus). Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Billedregistrering i lav opløsning, detektion af kerner i høj opløsning og celletælling i P4-musehjernen. (A) Venstre panel: Et eksempel på en z-skive fra hele hjernens lysark 3D-billeder resamplet til 25 μm isotrop opløsning. Skalastang = 1 mm. Midterste panel: Anmærkninger fra Allen Developmental Brain Atlas (P4) registreret til mikroskopibilledet. Skalastang = 1 mm. Højre panel: Overlejring af venstre og midterste panel. Skalabjælke = 1 mm. (B) Eksempel på et intensitetsjusteret syet billede i aksial visning. Det indrammede område er vist i (C). Skalastang = 1 mm. (C) Automatisk detektion af kerner (rød). Skalabar = 50 μm. (D) Kvantificering af celletyper i forskellige hjerneområder i P4-hjernen (Basalganglier, Hippocampal Allocortex og Isocortex). Rød = Øvre lag neuroner mærket med Brn2, Grøn = Nedre Lag neuroner mærket med Ctip2 og Blå = alle kerner mærket med To-Pro-3 farvestof. Forkortelser: DPall = Dorsal pallium (isocortex); MPall = Medial pallium (hippocampal allocortex); CSPall = Central subpallium(klassiske basale ganglier). Klik her for at se en større version af denne figur.

NuMorph-analysefase Anslået tid
Justering af intensitet 1 time
Kanaljustering 2 minutter
2D iterative syninger 12 timer
Gensampling 3 minutter
Registrering 3 minutter
Celletælling 5 timer
Celle klassificering 10 minutter

Tabel 1: NuMorph-analysetider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vævsrensningsmetoder er nyttige teknikker til måling af 3D-cellulær organisering af hjernen. Der er et væld af vævsrensningsmetoder beskrevet i litteraturen, hver med sine fordele og begrænsninger 6,7,8,9. Mulighederne for beregningsværktøjer til at analysere celletyperne i de vævsryddede billeder er relativt begrænsede. Andre tilgængelige værktøjer er blevet implementeret til sparsomme cellepopulationer, hvor segmentering er mindre vanskelig 10,35 eller har udnyttet vævsudvidelsen16. Dette papir beskriver forberedelsen af en musehjerne til billeddannelse med iDISCO + vævsrensning og demonstrerer NuMorph, en beregningspipeline til behandling og kvantificering af kerner inden for strukturer af en musebark fanget af LSFM. Det er designet til at finde en passende balance mellem længden af billeddannelsestid, detektionsnøjagtighed af cellekerner og beregningsressourcer. Denne pipeline står i kontrast til andre aktuelt tilgængelige værktøjer ved pålideligt at segmentere alle kerner i stedet for sparsomme populationer af mærkede celler 10,36,37. Vi har tidligere vist, at celledetektionsnøjagtigheden er høj med betydeligt kortere billeddannelsestider og meget reducerede erhvervede datastørrelser til helhalvkugleopsamling sammenlignet med andre metoder19. NuMorph adresserer en række vigtige udfordringer for analysen af flerkanals lysarkbilleder, såsom at levere værktøjer til kanaljustering, korrigere for scenebevægelser med et syningsværktøj og korrigere signalets lysstyrke i billedfliserne. Arbejdsgangen, der præsenteres i dette papir, er nyttig for det bredere videnskabelige samfund og tilgængelig for alle grupper i forskningsinstitutioner. En oversigt over processen kan ses i figur 1.

Der er flere kritiske trin i hele denne proces fra museperfusionen til beregningsanalysen, der kan påvirke nedstrømskvaliteten af billeder, kvantificering og resultater. Det er vigtigt, at perfusionen udføres således, at alt blodet fjernes fra hjernen, da blodkarrene har en naturlig autofluorescens, der vil påvirke intensiteten i billederne og vil kræve justeringer i rørledningen, hvilket påvirker resultaterne negativt. Varigheden af PFA-fikseringen er også afgørende, da det at lade hjernen være nedsænket i 4% PFA i mere end 24 timer kan resultere i 'overfiksering' af prøven og føre til revner i hjernen, som bliver skør under iDISCO+ processen. Den ovenfor beskrevne iDISCO-protokol er blevet ændret lidt fra den officielle protokol, der findes på hjemmesiden24. En vigtig ændring er tilføjelsen af PBS til methanol/PBS-serien i stedet for vand i den oprindelige protokol. Dette er for at forhindre kortikal revner i de embryonale og tidlige postnatale hjerner, som sandsynligvis opstår på grund af den ufuldstændige udvikling af gliaceller, aksonale fremskrivninger og ekstracellulær matrix. Afhængigt af det væv, der anvendes i denne protokol, skal der muligvis foretages ændringer på hvert trin i iDISCO+-protokollen, såsom ændring af antistofkoncentrationer og stigende inkubationstider for større vævsprøver, for at optimere de ideelle parametre til at fange den valgte markør og analysere den nøjagtigt.

Vævskrympning er kendt for at forekomme under iDISCO+ vævsrensningsprocessen, som derefter kan ændre volumetriske målinger nedstrøms 6,10. Alternative metoder, såsom MR udført før vævsrensning, kan anvendes til at bestemme omfanget af enhver ændring i vævsstørrelse i kontroller versus forsøgsdyr for at afgøre, om eventuelle volumetriske forskelle skyldes undersøgt fænotype og ikke fra vævsrensningsprocessen. Heterogene ændringer i mængderne af mutanternes kortikale regioner kan variere afhængigt af det regionale cellulære indhold, da hjernens grå og hvide stof kan påvirkes forskelligt af methanoldehydreringerne. MR-dataene kan bruges til at bestemme, om vævskrympning ikke er ensartet i hele hjernens underregioner (figur 2G), og eventuelle ændringer som følge af clearingprotokollen kan justeres for i downstream-beregningsanalysen. Desuden bruger iDISCO+ processen hårde methanolvaske til at dehydrere prøven, hvilket kan resultere i beskadigelse eller ændringer i visse antigener på kerneoverfladerne. Det anbefales, at alle antistoffer, der anvendes, først testes på hjernevævssektioner, der er blevet vasket i ~ 3 timer i 100% methanol for at sikre, at antistoffet er kompatibelt med iDISCO + -protokollen.

For store datasæt, der kræver lange behandlingstider, anbefaler vi at bruge no-window-versionen af MATLAB i Linux, der tillader strategier som implementering af kommandoen "nohup", som vil fortsætte med at køre en proces, selv efter at forbindelsen til en server er gået tabt. Desuden kræver NuMorph høj computerkraft, så vi anbefaler mindst 10 GB hukommelse til analyser. Vi analyserer prøverne ved hjælp af en Linux-arbejdsstation, der kører CentOS 7, som er udstyret med en 2.6 GHz 14-core processor, 8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM-hukommelse, 4 x 11 GB GPU'er og 2 x 4 TB eksterne SSD'er. De rå lysarkdata, der blev brugt her, var 620 GB, og hukommelseskravet til processerne var 10 GB. Her har vi inkluderet en tabel med de estimerede tidspunkter for at gennemføre hvert trin i NuMorph-analyserne som vist i tabel 1.

Billedforbehandlingstrinnene involverer intensitetsjustering i xy-dimensionen for hvert z-plan, kanaljustering og syning. Billedintensiteten justeres for at tage højde for forskelle i intensitet mellem fliser og ujævn belysning langs y-dimensionen. Forskellen i intensitet opstår på grund af lysarkets iboende tekniske egenskaber, da det billeder mellem fliser25. Derefter udføres kanaljustering for at sikre, at billedkanaler justeres korrekt i en multikanalbilleddannelse. Dette trin anbefales, da hver kanal i multikanalbilleddannelse erhverves individuelt, og subtile bevægelser af scenen kan forårsage prøvedrift og resultere i rumlig forskydning19. Til sidst sys fliserne pr. z-plan sammen til et enkelt billede i hvert z-plan. I sidste ende vil der være en stak syede billeder pr. kanal, der repræsenterer hele prøvens volumen. Den iterative billedsyning er baseret på en brugerdefineret metode til at organisere alle 2D-billeder pr. kanal i en 3D-diskenhed af prøven19. Metoden implementerer først en parvis z-korrespondance i aksial retning for at matche fliseområder, der overlapper hinanden i både vandret og lodret retning. Den endelige z-forskydning af hver flise bestemmes ved hjælp af det mindste spændetræ38. 2D iterativ syning udføres i en stak, der starter på et sted i midten af stakken med mindre baggrundssignal. Den øverste venstre flise placeres først for hver syning iteration for at forhindre subtile skift af billeder i z-dimensionen.

Vi anbefaler, at du kører hver af forbehandlingspipelinen sekventielt, især når du optimerer for at korrigere for fejl. De største problemer opstår ofte under syningstrinnene. Et problem, der kan opstå, er den forkerte billedoptagelse på lysarket. Dette problem kan opstå, når den vandrette dynamiske fokusering er forkert indstillet på lysarket og kan resultere i skiftevis ind-/ud-af-fase-mønstre i billederne (figur 4B,C). Yderligere fejl kan opstå, hvis prøven ikke var tæt sikret, og der opstod betydelige prøvebevægelser under erhvervelsen. I disse tilfælde er nøjagtig syning muligvis ikke mulig på grund af manglende parvis korrespondance mellem tilstødende fliser. Andre potentielle fejl kan stamme fra stingstartstedet. NuMorph bestemmer stingstartstedet omtrent midt i stakken. Men når der er betydelig baggrund i startudsnitsstedet, kan der opstå fejl i parsammenligningen i billedfelter. Det anbefales her at vælge et startsted, der har et højt signal-støj-forhold.

Den billedanalyse, der er beskrevet her, omfatter billedgensampling af syede billeder fra høj opløsning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) til en lavere isotrop opløsning på 25 μm³/voxel. Vi prøver de syede billeder fra atomkanalen igen for at registrere de syede billeder til Allen Developmental Mouse Brain Atlas i næste trin34. Celler tælles derefter for hver kanal i kommenterede områder af billederne med henvisning til atlasset i høj opløsning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) ved hjælp af en trænet 3D-Unet model19. Denne metode kan også bruges til at registrere og tælle blob-objekter. Da vi udviklede NuMorph, testede vi segmenteringsnøjagtighed i forhold til helt nye billeder, der aldrig blev set under træning, der var fra den samme vævsrensningsprocedure, samme mikroskop og samme nukleare etiket, der fandt præcision på 0,99 og tilbagekaldelse af 0,9419. NuMorph-nøjagtighed er endnu ikke testet på forskellige vævsrensningsprocedurer, mikroskoper eller markører; Derfor er nøjagtigheden af segmentering i andre eksperimentelle designs ukendt. Standardatlasset i NM_setup.m er det voksne Nissl-farvede Allen Reference Atlas39 med den tredje iteration af Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework (CCFv3) som den brugerdefinerede kommentar.

Selvom NuMorph effektivt analyserer væv, som er forholdsvis tæt, såsom den voksne musebark, kan mere udfordrende eksperimentelle designs (såsom embryonale musehjerner eller meget tætte strukturer såsom lillehjernen) kræve udvikling af yderligere beregningsværktøjer. Den nuværende samfundsbaserede indsats forsøger at producere tilstrækkelige annoteringsdata til træning af deep learning-modeller, der bruges til at segmentere disse vanskeligere tilfælde40. Fremskridt inden for lysarkbilleddannelsesteknologier muliggør kvantitativ undersøgelse af subcellulære strukturer med høj kapacitet med nye tilgange såsom dual-view inverteret selektiv planbelysningsmikroskopi (diSPIM), der fører til øget opløsning og nøjagtighed i cellulære tætte hjerneområder40,41. Efterhånden som fremskridt inden for vævsrensning, billeddannelse og beregningsværktøjer, der er involveret i denne forskning, udvikler sig, håber vi, at de vil føre til bredere anvendelse af vævsrensningsmetoder til kvantitative analyser af, hvordan neuropsykiatriske lidelser kan stamme fra ændringer i hjernestruktur induceret af genetiske eller miljømæssige risikofaktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH (R01MH121433, R01MH118349 og R01MH120125 til JLS og R01NS110791 til GW) og Foundation of Hope. Vi takker Pablo Ariel fra Microscopy Services Laboratory for at hjælpe med prøvebilleddannelse. Microscopy Services Laboratory i Institut for Patologi og Laboratoriemedicin støttes delvist af Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 til University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core er støttet af bevilling P30 NS045892. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist støttet af North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Tags

Neurovidenskab udgave 186
Helhjerne enkeltcellebilleddannelse og analyse af intakte neonatale musehjerner ved hjælp af MR, vævsrensning og lysarkmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., … More

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter