방법 논문

감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택

1.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64127

⸱

2022년 9월 7일

 ,  ,  , 
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 일반적으로 감염성 바이러스에만 결합하는 앱타머를 선택하고 소독 방법에 의해 비감염성이 된 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이것은 휴대용 및 신속한 테스트에서 감염성 상태를 결정할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

초록

바이러스 감염은 사회에 큰 영향을 미칩니다. 대부분의 검출 방법은 검출 된 바이러스가 전염성이 있는지 여부를 판단하는 데 어려움이있어 치료가 지연되고 바이러스가 더 확산됩니다. 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알려줄 수 있는 새로운 센서를 개발하면 이러한 미충족 과제를 해결할 수 있습니다. 그러나 온전한 감염성 바이러스를 인식하고 소독 방법으로 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화를 사용하여 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별할 수 있는 앱타머를 선택하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SELEX의 두 가지 기능을 활용합니다. 첫째, SELEX는 카운터 선택을 사용하여 비감염성 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스와 같은 경쟁 표적을 제거하도록 맞춤 제작할 수 있습니다. 추가로, 전체 바이러스는 예를 들어 바이러스 표면 단백질 대신에 SELEX에 대한 표적으로서 사용될 수 있다. 전체 바이러스 SELEX는 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 따라서이 방법은 사전에 알 필요가없는 병원체 표면의 기능적 차이에 기초하여 인식 제제를 얻을 수있게한다.

서론

바이러스 감염은 최근 COVID-19 대유행으로 인해 점점 더 분명해진 바와 같이 전 세계적으로 막대한 경제적, 사회적 영향을 미칩니다. 시기 적절하고 정확한 진단은 건강한 사람들에게 바이러스가 퍼지는 것을 방지하면서 바이러스 감염을 치료하는 데 가장 중요합니다. PCR 검사1,2 및 면역검사3와 같은 많은 바이러스 검출 방법이 개발되었지만, 현재 사용되는 대부분의 방법은 검출된 바이러스가 실제로 감염되는지 여부를 판단할 수 없습니다. 이는 바이러스 핵산이나 단백질과 같은 바이러스 단독의 성분의 존재가 손상되지 않은 감염성 바이러스가 존재한다는 것을 나타내지 않고 이러한 바이오마커의 수준이 감염성과 빈약한 상관관계를 나타내기 때문입니다 4,5,6. 예를 들어, 현재 PCR 기반 COVID-19 검사에 일반적으로 사용되는 바이러스 RNA는 환자가 전염성이 있을 때 감염 초기 단계에서 매우 낮은 수준을 갖는 반면, 환자가 감염에서 회복되어 더 이상 전염성이 없을 때 RNA 수준은 여전히 매우 높은 경우가 많습니다 7,8. 바이러스 단백질 또는 항원 바이오마커는 유사한 경향을 따르지만 일반적으로 바이러스 RNA보다 훨씬 늦게 나타나므로 감염 가능성을 예측할 수 훨씬 적습니다 6,9. 이러한 한계를 해결하기 위해, 바이러스의 감염성 상태를 알려줄 수 있는 몇 가지 방법이 개발되었지만, 결과를 얻기 위해 오랜 시간(일 또는 몇 주)을 필요로 하는 세포 배양 미생물학 기술을 기반으로 한다 4,10. 따라서 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알릴 수 있는 새로운 센서를 개발하면 치료 지연 및 바이러스의 추가 확산을 방지할 수 있습니다. 그러나 손상되지 않은 감염성 비리온을 인식하고 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다.

이러한 맥락에서, 앱타머는 독특한 생체 분자 도구로서 특히 매우 적합하다(11,12,13,14). 앱타머는 특정 뉴클레오티드 서열을 가진 짧은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자로, 높은 친화력과 선택성을 가진 표적을 인식하기 위해 특정 3D 형태를 형성할 수 있습니다15,16. 이들은 10 14-10 15 서열17,18,19의 큰 무작위 DNA 샘플링 라이브러리를 가진 시험관에서 수행되는 시험관 내 선택으로도 알려진 지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화 (SELEX)라고하는 조합 선택 과정에 의해 얻어진다. 이 반복 과정의 각 라운드에서 DNA 풀은 먼저 원하는 조건에서 표적과의 배양을 통해 선택 압력을 받습니다. 그런 다음 대상에 바인딩되지 않은 모든 시퀀스가 제거되고 주어진 조건에서 바인딩할 수 있는 몇 개의 시퀀스만 남게 됩니다. 마지막으로, 이전 단계에서 선택된 서열은 PCR에 의해 증폭되어 다음 선택 라운드를 위해 원하는 기능 서열로 풀의 모집단을 풍부하게 하고 프로세스가 반복됩니다. 선택 풀의 활성이 고원에 도달하면(일반적으로 8-15라운드 후) 라이브러리를 DNA 시퀀싱으로 분석하여 가장 높은 친화도를 나타내는 우승 서열을 식별합니다.

SELEX는 바이러스(22)의 감염성 상태와 같은 다른 유사한 표적(20,21)에 대해 증가된 선택성을 얻기 위해 이용될 수 있는 독특한 이점을 갖는다. 첫째, 소분자 및 단백질로부터 전체 병원체 및 세포에 이르기까지 매우 다양한 유형의 표적이 선택에 사용될 수 있다16. 따라서, 감염성 바이러스에 결합하는 앱타머를 얻기 위해, 바이러스 표면 단백질19 대신에 온전한 바이러스를 표적으로 사용할 수 있다. 전체 바이러스 SELEX를 사용하면 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 둘째로, SELEX는 선택(22)의 각 라운드에서 카운터 선택 단계들을 사용하여, 다른 유사한 바이러스 또는 비감염성 불활성화 바이러스와 같은 경쟁 타겟(21, 23)을 제거하도록 맞춤형으로 제작될 수 있다. 카운터 선택 단계 동안, DNA 풀은 결합이 바람직하지 않은 표적에 노출되고, 결합하는 임의의 서열은 폐기된다.

이 작업에서 우리는 감염성 바이러스에 결합하지만 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스 또는 다른 관련 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택하는 데 일반적으로 적용할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 사전에 알 필요가 없는 바이러스 표면의 기능적 차이를 기반으로 인식 제제를 얻을 수 있으므로 새로 출현한 병원체의 검출 또는 연구가 부족한 질병에 대한 추가적인 이점을 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 시약 및 완충액의 제조

  1. 0.9 M 트리스-염기, 0.9 M 붕산, 20 mM EDTA (디소듐 염) 및 탈이온수를 1 L의 최종 부피에 첨가하여 10x 트리스-보레이트 EDTA(10x TBE)를 준비한다.
  2. 다음과 같이 10% 변성 폴리아크릴아미드 원액을 준비한다. 250mL 유리병에 요소(8M) 120g, 10x TBE 25mL, 40% 아크릴아마이드/비스아크릴아미드(29:1) 용액 62.5mL, 최종 부피 250mL에 도달할 때까지 충분한 증류수를 넣습니다. 모든 성분이 녹을 때까지 섞는다.
  3. 다음과 같이 2x 로딩 버퍼를 준비합니다. 50mL 튜브에 요소(8M) 21.636g, EDTA(1mM) 1.675g, 10x TBE 4.5mL를 넣습니다. 증류수로 45mL를 채우고 모든 성분이 녹을 때까지 섞는다.
  4. 100 mM 소듐 아세테이트와 1 mM EDTA(디소듐 염)를 가하여 추출 완충액을 준비한다. 최종 pH를 5로 설정합니다.
  5. 다음과 같이 에탄올 침전 용액을 준비한다. 3M 아세트산나트륨을 준비하고 pH 5.2로 조정한 후 4°C에서 보관합니다. 70% 에탄올 v/v를 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 100 % 에탄올을 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오.
  6. 1x PBS, 2.5mM MgCl2 및 0.5mMCaCl2를 포함하는 500mL의 SELEX 완충액을 준비합니다. pH 7.4로 조절합니다. 1x PBS, 2.5mM MgCl2, 0.5mMCaCl2 및 8M 요소를 첨가하여 8M 요소로 100mL의 SELEX 완충액을 준비합니다. pH 7.4로 조절합니다.
    알림: SELEX 버퍼의 선택은 선택한 앱타머가 최종 샘플에서 작동하는지 확인하는 데 중요합니다.amp앱타머가 적용될 위치. 예를 들어, SARS-CoV-2에 특이적인 앱타머는 생물학적 샘플(예: 타액 또는 비인두 면봉)에 사용됩니다. 따라서 의도한 생물학적 샘플에서 이러한 조건을 밀접하게 모방하는 이온 농도, pH 및 완충액을 선택하는 것이 중요합니다.
  7. 다음과 같이 바인딩 및 세척 버퍼를 준비합니다. 50mL 튜브에서 5mM Tris, 0.5mM EDTA(이나트륨염) 및 2M NaCl을 준비합니다. pH 7.5로 조정하십시오.

2. DNA 라이브러리 및 프라이머의 설계 및 합성

  1. 다음 기준에 따라 초기 ssDNA 라이브러리 및 프라이머를 설계합니다(예시 ssDNA 라이브러리 및 프라이머 세트는 표 1 참조, 여기서 N은 무작위 뉴클레오티드 위치를 나타냄).
    1. 라이브러리에 증폭을 위한 프라이머 영역 역할을 하는 3' 및 5' 말단에 2개의 상수 서열이 있는 35-60개 뉴클레오티드의 중앙 무작위 영역이 포함되어 있는지 확인합니다. 일반적인 라이브러리 길이는 45개의 무작위 뉴클레오티드입니다.
    2. 시험관 내 선택 과정에서 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 증폭된 이중 가닥 PCR 산물에서 ssDNA를 분리하기 위한 역방향 프라이머에 비오틴 변형이 포함되어 있는지 확인합니다.
  2. 표준 탈염 정제를 통해 상업적 공급원에서 DNA 올리고를 구입하십시오. ssDNA 라이브러리 및 프라이머를 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (dPAGE)에 의해 정제하고, 이어서 표준 절차24에 따라 에탄올 침전시켰다.
    주의: 아크릴아마이드 모노머와 브롬화 에티듐은 유해 화학 물질(인체 발암 물질)이므로 PAGE를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 보안경)를 사용하십시오. 가능하면 브롬화 에티듐 사용을 피하고 더 안전한 염료로 교체하십시오.
    참고: 이 정제 단계를 수행하지 않도록 HPLC 정제로 올리고를 주문할 수 있지만 짧은 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 제거하지는 않습니다.
  3. 에탄올 침전 후 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 원하는 농도(100μM)까지 ssDNA를 재현탁합니다. ssDNA 라이브러리 및 프라이머의 농도를 λ = 260 nm에서 UV 흡수로 측정한다. -20 °C에서 보관하십시오.
  4. 고처리량 염기서열분석 라이브러리 준비 및 qPCR 정량화에 사용할 변형되지 않은 역방향 프라이머를 구입하십시오.

3. 감염성 및 비감염성 바이러스 샘플

주의 : 감염성 및 비감염성 바이러스 샘플은 생물 안전 레벨 2(BSL2) 샘플로amp안전하고 적절하게 취급하기 위해 각별한 주의가 필요합니다. 이러한 샘플을 포함하는 절차의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행되거나 바이러스 용액이 밀봉된 용기(예: 캡이 있는 플라스틱 튜브)에 있어야 합니다.

  1. 감염성 바이러스의 원액을 얻거나 각 바이러스에 해당하는 프로토콜에 따라 준비하십시오. 여기에 사용된 SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 및 H5N1 유사바이러스는 PBS 버퍼에서 Lijun Rong 교수의 연구실(UIC)에서 제공되었으며 보고된 프로토콜22,25,26에 따라 준비되었습니다.
    참고: 손상되지 않은 감염성 바이러스를 처리하기 위해 생물학적 안전성 레벨 3 시설이 필요한 바이러스의 경우 유사 바이러스와 함께 작업할 수 있습니다. 유사형 바이러스는 바이러스 외피 내에서 바이러스의 표면 단백질을 표시하는 렌티바이러스(HIV)에서 생성되므로 바이러스의 표면 및 진입 메커니즘을 밀접하게 모방하지만 지속적인 바이러스 복제에는 결함이 있습니다.
  2. 비감염성 바이러스 원액을 얻거나 소독 절차에 따라 준비하십시오. 여기에 사용된 UV-불활성화 SARS-CoV-2 유사바이러스(p-SARS-CoV-2) 스톡은 PBS 완충액의 Rong 연구실(UIC) 교수에 의해 제공되었으며, 이전에 보고된 프로토콜은 UV-불활성화에 사용되었습니다22.
    참고: 가능하면 분석을 수행하여 바이러스의 감염성을 테스트하여 바이러스가 완전히 비활성화되었는지 확인하십시오.
  3. 바이러스 재고 정량화
    1. 표준 절차27,28,29에 따라 플라크 검정을 사용하여 바이러스를 정량화한다. 이 분석은 바이러스의 정량화를 가능하게 할 뿐만 아니라 바이러스의 감염 상태를 나타내어 감염성 바이러스의 농도를 확인합니다.
    2. 플라크 분석을 사용할 수 없는 유사바이러스 또는 바이러스의 경우 시중에서 판매되는 정량적 렌티바이러스 ELISA 키트를 사용하여 바이러스를 정량화합니다.
    3. p-SARS-CoV-10, p-SARS-CoV-2 및 p-H1N1에 대한1 x 1 copies/mL의 원액을 준비합니다. 각 원액을 각각 50 μL씩 함유된 분취액으로 분리하고 -80°C에서 유지한다. 각 실험 전에 새 부분 표본을 해동합니다.

4. 시험관 내 선택 또는 SELEX 공정 : 초기 라운드

알림: 감염성 바이러스를 사용하는 모든 단계에 대해 BSL2 캐비닛에서 작업하십시오.

  1. ssDNA 라이브러리를 변성시킵니다. 10μL의 ssDNA 라이브러리(1nmol) 100μL를 취하여 240μL의 SELEX 완충액과 혼합합니다. 건조에서 95°C에서 15분 동안 가열한 다음 튜브를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
  2. 감염성 바이러스와 함께 ssDNA 라이브러리를 배양(양성 선택 단계)하여 다음과 같이 한다. 4.1단계의 SELEX 버퍼에 있는 250μL의 ssDNA 라이브러리를 50μL의 감염성 바이러스(1 x 108 copies/mL)와 혼합합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
  3. 다음과 같이 원심분리기 필터에서 비특이적 부위를 차단합니다. 4.2단계를 기다리는 동안 다음 단계를 위해 원심분리기 필터를 준비합니다.
    1. 400μL의 1mM T20 시퀀스(표 1)를 사용할 각 0.5mL 원심분리기 필터(컷오프가 100kDa인 원심분리기 필터 1개와 컷오프가 10kDa인 필터 1개)에 추가합니다.
    2. 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 필터에서 T20 용액을 제거하였다. SELEX 버퍼로 3x 세척하여 과도한 T20 서열을 제거합니다.
  4. 바인딩되지 않은 시퀀스를 다음과 같이 세척합니다. 단계 4.2에서 인큐베이션된 혼합물을 블록화된 100 kDa 원심분리 필터에 첨가하고, 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 400 μL의 SELEX 완충액을 첨가하고 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 3x 세척한다. 필터에 분획을 유지하고 플로우 스루를 버립니다.
  5. 아래에 설명된 대로 결합된 시퀀스를 용리합니다.
    1. 원심분리기 필터의 수집 튜브를 교체하고 300단계에서 8M 요소가 포함된 SELEX 버퍼 4.4μL를 원심분리기 필터에 추가합니다. 원심분리기 필터를 95°C의 건식 수조에서 15분 동안 가열한 다음 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
    2. 용리된 염기서열을 포함하는 필터를 통해 흐른 분획을 수집합니다. 세 번 더 반복하십시오. BSL2 캐비닛에서 작업하고 재료를 폐기하기 전에 바이러스를 비활성화하기 위해 10% 표백제로 모든 재료를 씻으십시오.
  6. 다음과 같이 농축하고 탈염하십시오. 4.5에서 수집된 용액을 차단된 10kDa 원심분리기 필터에 추가합니다. 14,000 x g 에서 15분 동안 원심분리기 필터를 통과한 분획을 버립니다.
    알림: 이전 단계에서 필터에 8M 요소로 바이러스가 유지되고 비활성화되므로 생물 안전 캐비닛에서 이 단계와 다음 단계를 수행할 필요가 없습니다. 이 절차는 0.5 단계에서와 같이 모든 용액이 수집 될 때까지 4.5 mL 원심 분리 튜브를 사용하는 경우 1.2 mL가 필터를 통해 흐릅니다.
  7. 300 μL의 SELEX 완충액으로 3x 세척하여 14,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 요소를 제거하였다. 필터를 통과한 분획을 버립니다. 깨끗한 수집 튜브에서 거꾸로 뒤집고 5분 동안 원심분리하여 필터의 용액을 회수합니다.
  8. 플라스틱 튜브에서 피펫을 사용하여 4.7에서 회수된 용액의 최종 부피를 측정합니다. 이 해의 이름은 R i a이며, 여기서i는 라운드 번호에 해당합니다. 전형적으로, 30 μL 내지 50 μL 사이의 부피가 얻어진다. 용출된 ssDNA 1μL를 취하여 qPCR로 DNA의 양을 정량합니다.
    참고: 이것은R1a 샘플을 -20°C에서 보관하여 다른 시간에 계속할 수 있는 가능한 일시 중지 지점입니다.
  9. 아래에 설명된 대로 PCR 증폭을 수행합니다.
    1. 첫 번째 라운드에서R1a 샘플의 90%를 PCR 템플릿으로 사용합니다. 다음 라운드에서 4.8단계에서 총 부피의 60%를 취하여 PCR을 수행하고 나머지 분획을 -20°C에서 보관합니다.
    2. 지정된 최종 농도를 갖는 50μL PCR 반응을 설정합니다: 1x PCR 반응 완충액, 200μM dNTP, 10μL의 DNA 주형(R 1 a 샘플), 200nM 각 프라이머 및 1.25U 중합효소(2.5U/μL 스톡).
    3. 각 프라이머 세트와 ssDNA 라이브러리에 대한 사이클 수 및 어닐링 온도를 포함한 PCR 조건을 최적화합니다. 프라이머-다이머와 같은 원치 않는 PCR 하위 산물을 생성하는 너무 많은 사이클을 사용하지 마십시오. 프라이머의 용융 온도에 따라 다양한 어닐링 온도를 테스트합니다.
    4. 95°C에서 5분 동안 최적화된 조건을 사용하여 PCR을 실행한 후 95°C에서 1분, 52°C에서 30초, 72°C에서 1분의 18사이클을 실행하고 72°C에서 10분 동안 최종 확장 단계를 수행하여 dsDNA 풀을 얻었습니다.
      참고: 이것은 PCR 산물을 -20°C에서 보관하여 다른 시간에 계속할 수 있는 또 다른 가능한 일시 중지 지점입니다.
  10. 스트렙타비딘 변형 마그네틱 비드를 사용하여 ssDNA를 회수합니다.
    1. PCR 산물의 80 %를 섭취하십시오. 나머지 분획을 -20°C에서 보관한다.
    2. PCR 산물을 50μL의 분취량으로 분할하고 50μL의 스트렙타비딘 변형 자기 비드(MB)가 들어 있는 마이크로분리기 튜브에 추가합니다. 실온에서 가벼운 교반(예: 회전식 셰이커 사용)으로 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로퍼지 튜브를 마그네틱 랙에 놓아 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다(투명한 용액이어야 함).
    3. 200 μL의 결합 및 세척 완충액을 튜브에 첨가하여 세척한다. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 튜브를 두드린 다음 피펫팅을 통해 MB를 균질 용액에 다시 일시 중단합니다. 마이크로퍼지 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓아 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다.
    4. 세척이 완료되면 총 100μL의 SELEX 완충액에 MB를 재현탁하고 용액을 10분 동안 95°C로 가열합니다. 튜브가 냉각되기 전에 즉시 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 ssDNA 풀이 포함된 상층액을 채취합니다. 50 μL의 SELEX 버퍼를 추가하면서 이 회수 단계를 반복한다.
  11. 피펫을 사용하여 4.10에서 회수된 분획의 최종 부피를 측정합니다. 이 분수의 이름은 R ix이며, 여기서 i는 라운드 번호에 해당합니다. 일반적으로, 140 내지 150 μL 사이의 부피가 얻어진다. 1 μL의R1x를 취하여 qPCR로 DNA의 양을 정량화한다.

5. 후속 선발 라운드

  1. ssDNA 풀을 변성시킵니다. 샘플 R1x의 60 %를 취하여 50 μL의 SELEX 완충액과 혼합하십시오. 건조한 수조에서 95°C로 15분 동안 가열합니다. 튜브를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
  2. ssDNA 풀을 비감염성 바이러스 및 기타 잠재적인 간섭 바이러스와 함께 배양합니다(카운터 선택 단계). 5.1의 SELEX 완충액에서 변성된 ssDNA 풀을 각 바이러스 50μL(5 x 109 copies/mL, 예: 비감염성 p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 및 p-H5N1)와 혼합합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 원심분리기 필터에서 비특이적 부위를 차단합니다. 5.2 단계를 기다리는 동안 다음 단계를 위해 원심 분리기 필터를 준비합니다. 일반적으로 차단 필터가 100kDa이고 차단 필터가 10kDa인 두 개의 원심분리기 필터를 사용합니다. 4.3에서와 동일한 절차를 따르십시오.
  4. 비표적 바이러스에 결합된 서열을 씻어냅니다. 단계 5.2에서 배양된 혼합물을 블록된 100 kDa 원심분리 필터에 추가한다. 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 원심분리기 필터를 통해 흐르는 분획을 회수합니다. 100 μL의 SELEX 완충액을 첨가하고 14,000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 2 배 세척한다. 필터를 통과한 분획을 유지합니다.
  5. 감염성 바이러스와 함께 ssDNA 풀을 배양합니다(양성 선택 단계). 5.4단계에서 300μL의 분획을 취하여 50μL의 감염성 바이러스(1 x 108 copies/mL)와 혼합합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 4.4 - 4.11 단계를 따릅니다.

6. SELEX 프로세스 모니터링

참고: 풀의 농축을 모니터링하기 위해 qPCR은 두 가지 방법으로 사용됩니다. 첫째, 절대적인 정량화에 의해, 풀의 농축도(용출 수율)를 시험할 수 있다. 둘째, 용융 곡선을 모니터링하여, 풀의 다양성(압타머 종의 수렴)을 평가할 수 있다(30).

  1. qPCR용으로 설계된 96웰 플레이트에서 10μL 반응 부피로 모든 qPCR 분석을 수행합니다.
  2. 5 μL의 마스터 믹스, 0.3 μL의 500 nM의 각 표지되지 않은 프라이머, 3.4 μL의H2O, 및 1 μL의 DNA 주형을 함유하는 표준 qPCR 혼합물을 준비한다.
    1. 표준 곡선을 실행하기 위해 정제된 ssDNA 라이브러리의 희석액(단계 2.3)을 준비합니다.
    2. DNA 샘플을 희석하여 농도가 표준 곡선에 맞도록 합니다. Ria 샘플의 경우, 희석하지 않은 샘플 1 μL과 1:10 희석 1 μL를 qPCR 혼합물에 첨가하십시오. Rix 샘플의 경우, 1:10 또는 1:100 희석을 포함한다.
  3. 다음 프로토콜을 설정하여 qPCR을 실행합니다. 먼저, 초기 변성 단계를 98°C에서 2분 동안 설정합니다. 그런 다음 98°C에서 5초 동안 변성 40주기를 설정하고 52°C에서 10초 동안 어닐링 및 연장합니다. 최종적으로 용융곡선 해석을 65°C에서 95°C로 설정하였다. 자동화된 임계값 분석을 통해 임계값 주기(Ct) 값을 결정합니다.
  4. 표준 곡선을 사용하여, Ri 및Rix샘플 중의 ssDNA의 양을 정량화한다.
  5. 용출 수율을 결합된 DNA의 양(Ri a의몰수)을 초기 DNA의 양(Ri-1x의 몰수)으로 나눈 값으로 계산한다. 용출 수율 대 라운드 수를 플로팅하여 라운드에 걸친 농축이 관찰되는지 확인합니다.
  6. 여러 라운드에 대한 용융 곡선을 플로팅합니다. 라운드 수가 증가함에 따라 75/85 °C 근처의 피크에서 더 높은 용융 온도로의 전환이 예상됩니다. 이것은 풀의 다양성이 감소한다는 것을 의미합니다.

7. 고처리량 시퀀싱

  1. 라이브러리 준비 방법을 결정할 수 있는 시퀀싱 유형 및 스케일에 대해 고처리량 시퀀싱 시설에 문의하십시오.
    참고: 이 결정은 시퀀싱할 풀의 길이(프라이머 포함)와 제출할 풀 수(일반적으로 풀당 최소 1 x 105-10 6 시퀀스를 목표로 함)를 모두 고려합니다. 특정 시퀀싱 스케일이 풀의 전체 길이를 읽을 수 없는 경우 한쪽 끝에서만 읽는 단일 끝과 달리 쌍 끝 시퀀싱을 사용하여 시퀀스의 양쪽 끝에서 읽을 수 있습니다.
  2. 시퀀싱 시설과 상의하여 시퀀싱 유형에 따라 시중에서 판매되는 적절한 키트를 선택하십시오. 하나의 레인을 사용하여 모든 라운드의 샘플 분석을 허용하는 각 풀의 어댑터에서 서로 다른 인덱스 쌍을 사용하여 높음, 중간 및 낮음 농축을 나타내는 여러 선택 라운드 풀과 최종 풀을 준비합니다.
    참고: PCR 증폭은 고처리량 염기서열 분석에 필요한 어댑터와 인덱스를 통합하는 데에도 사용할 수 있지만 일반적으로 상용 키트와 비용이 비슷하고 성능이 더 좋지 않습니다.
    1. 다음 단계에 따라 라이브러리 준비를 수행합니다: 단편화된 DNA의 최종 복구, 어댑터 결찰 및 최종 라이브러리를 생성하기 위한 PCR 증폭.
    2. 제조업체의 지침에 따라 자기 DNA 클린업 비드로 PCR 산물을 정제합니다.
    3. 형광 기반 정량 키트를 사용하여 DNA를 정량합니다. 소량의 UV 측정과 같이 덜 정확한 방법을 사용하지 마십시오.
    4. 특정 인덱스를 포함하는 각 풀 라이브러리의 거의 동일한 양(부피가 아닌 DNA의 양에 따라)을 혼합합니다.
    5. qPCR 정량 분석 및 DNA 단편 분석기로 최종 라이브러리의 품질을 확인합니다. 이 단계는 종종 시퀀싱 시설에 의해 수행됩니다.
      참고: 시퀀싱 시설 직원은 라이브러리를 준비하는 방법과 제안된 품질 관리에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 라이브러리를 준비하기 전에 그들과 논의해야합니다.
  3. 준비된 최종 라이브러리를 요구 사항에 따라 시퀀싱 시설로 보냅니다.

8. 염기서열 분석

  1. 시퀀싱 분석에 사용할 수 있는 대부분의 소프트웨어는 Linux 운영 체제의 명령줄에서 실행되도록 설계되었습니다. 작은 데이터 세트의 경우 원하는 Linux 운영 체제를 설정하고 개인용 컴퓨터에 필요한 프로그램을 설치합니다. 더 큰 데이터 세트의 경우 HTS 분석은 고성능 컴퓨팅 리소스 또는 슈퍼 컴퓨터(권장)에서 실행됩니다.
    참고: 고성능 컴퓨팅 리소스를 사용하려면 액세스 및 교육이 필요하며, 이를 얻는 데 다소 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한 UNIX 명령줄 사용에 대한 기본 지식이 필요합니다. 기본 명령줄 사용에 대한 많은 무료 리소스를 온라인에서 사용할 수 있으며 컴퓨팅 리소스는 해당 시스템 사용에 대한 추가 정보를 제공할 수 있습니다.
  2. 시퀀싱 기능에서 제공하는 정보를 사용하여 일반적으로 압축된 FastQ 파일 형식의 시퀀싱 파일에 액세스합니다.
    1. FTP 클라이언트를 사용하여 파일을 자신의 컴퓨터 및/또는 고성능 컴퓨팅 리소스로 전송합니다. 많은 시퀀스 분석 프로그램은 압축 파일을 직접 사용할 수 있으므로 가능하면 파일을 압축된 상태로 유지하여 파일 크기를 제한합니다(압축되지 않은 경우 50M+ 시퀀스의 큰 시퀀스 읽기는 100Gb+의 파일 공간을 차지할 수 있음).
    2. 시퀀스 파일의 압축을 풀어야 하는 경우 대부분의 Linux 설치에서 표준인 gzip 함수를 사용합니다. 명령줄에 "man gzip"을 입력하여 설치된 설명서에서 gzip 및 해당 옵션에 대한 추가 정보를 얻으십시오.
  3. 역다중화, 시퀀싱 어댑터 제거, 저품질 판독 제거, 순방향 및 역방향 판독을 모두 포함하여 분석 전에 시퀀스를 정리합니다.
    1. 각 정화 단계의 효과를 평가하기 위해 시퀀스에 대한 기본 품질 관리 정보를 얻기 위해 다음의 각 단계 후에 FastQC 프로그램(31 )을 사용한다.
    2. 시퀀스를 역멀티플렉싱하여 단일 읽기 파일의 모든 시퀀스를 시퀀싱 어댑터에 포함된 인덱스에 따라 다른 풀로 분리합니다. 이 단계는 종종 시퀀싱 시설에서 수행하며, 정확한 절차는 사용되는 시퀀싱 기계에 따라 다르므로 시퀀싱 시설과 상의해야 합니다.
    3. 명령줄 프로그램인 Cutadapt32를 사용하여 시퀀싱 어댑터를 제거합니다. 선택 프라이머(시퀀싱 어댑터 대신)를 연결된 어댑터 모드의 입력으로 사용합니다. --discard-untrimmed 옵션을 사용하여 선택 프라이머가 포함되지 않은 시퀀스를 삭제합니다.
    4. 어댑터와 일치하도록 최대 오류율에 대한 옵션과 허용할 시퀀스의 최소 및 최대 길이를 설정합니다. 쌍을 이루는 끝 읽기를 사용하는 경우 사용 가능한 특정 매개 변수를 입력하고 읽기 1 및 읽기 2 시퀀싱 파일을 모두 제공합니다. Cutadapt 매뉴얼32를 참조하여 필요에 따라 추가 매개변수를 설정합니다.
      참고: 풀에 대한 시퀀싱 어댑터의 결찰은 방향에 독립적이며 시퀀스의 약 50%를 순방향으로, 50%를 역방향으로 통합합니다. 역방향으로 시퀀스의 50%가 손실되는 것을 방지하기 위해 선택 프라이머의 역보수를 입력으로 사용하여 Cutadapt를 두 번째로 실행할 수 있습니다.
    5. (선택 사항) 쌍단 시퀀싱을 사용하는 경우 Read 1 및 Read 2 파일을 PEAR33 프로그램과 병합합니다.
    6. FASTX-툴킷 프로그램(34 )을 사용하여 임의의 뉴클레오티드에서 특정 임계치 미만의 품질을 갖는 저품질 서열을 제거한다. 품질 컷오프 점수 30점은 좋은 출발점입니다. 전반적인 품질이 일반적으로 양호한 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
    7. 역방향의 시퀀스 파일과 정방향의 시퀀스 파일을 병합하려면 역방향 파일에서 FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement 함수를 사용합니다. 그런 다음 내장 cat 프로그램 (대부분의 Linux 설치에서 표준)을 사용하여 정방향 및 역방향 보완 - 역방향 파일을 단일 파일로 병합합니다.
  4. 상이한 선택 풀에 걸친 서열의 농축을 분석하기 위해, FASTAptamer 분석 툴킷(35)을 사용한다.
    1. FASTAptamer-Count를 사용하여 각 시퀀스가 나타나는 횟수를 계산합니다. 그런 다음 시퀀스의 순위를 매기고 풍부하게 정렬합니다. 카운트 출력 파일은 다른 모든 FASTAptamer 프로그램에 대한 입력으로 필요합니다.
    2. FASTAptamer-Clust를 사용하여 파일의 모든 시퀀스를 밀접하게 관련된 시퀀스의 클러스터로 그룹화합니다. "distance" 파라미터를 사용하여 클러스터로 그룹화할 수 있는 단일 뉴클레오티드 돌연변이 또는 인델의 수를 정의합니다.
      참고: FASTAptamer-Clust 프로그램은 많은 수의 고유 시퀀스가 있는 경우(특히 초기 라운드의 경우) 계산 비용이 매우 많이 들 수 있으며, 완전히 완료하는 데 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 컷오프 필터 파라미터는 클러스터링에서 낮은 존재비의 시퀀스를 제외하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로 10 또는 5 백만당 읽기 수(RPM)와 같이 더 높은 컷오프로 시작하여 프로그램이 빨리 끝나면 줄이는 것이 좋습니다. 풀이 매우 이질적인 경우 적절한 시간 내에 시퀀스를 클러스터링하는 것이 불가능할 수 있습니다.
    3. FASTAptamer-Enrich를 사용하여 두 개 이상의 선택 라운드에 있는 각 시퀀스의 보강을 계산합니다. 한 모집단의 시퀀스 RPM과 다른 모집단의 RPM을 비교합니다. Count 또는 Cluster 파일에서 보강 프로그램을 사용합니다. 출력은 탭으로 구분된 값(.tsv) 파일로, 추가 분석 및 쉬운 정렬을 위해 모든 스프레드시트 소프트웨어에서 열 수 있습니다.
      참고: FASTAptamer-Enrich 프로그램은 고유한 시퀀스 수가 많은 경우 계산 비용이 매우 많이 들 수도 있습니다. 컷오프 필터 파라미터를 사용하면 너무 커서 스프레드시트 소프트웨어에서 열 수 없는 파일을 방지하기 위해 출력에서 낮은 존재비 시퀀스를 제외할 수 있습니다.
    4. (선택 사항) 많은 풀이 너무 이질적인 경우(고유한 시퀀스가 많고 중복 시퀀스가 거의 없음) Clust 또는 Enrich 프로그램을 사용하지 못할 수 있습니다. 이 경우 시퀀스를 풍부도(맨 위에 가장 많음)별로 정렬하고 RPM과 같은 중요한 정보를 포함하도록 시퀀스 식별자의 이름을 바꾸는 Count 출력 파일을 사용하여 수동 보강 검사를 수행합니다.
      1. Count 파일의 표준 Linux "head" 프로그램을 사용하여 가장 풍부한 시퀀스 목록을 가져옵니다. 그런 다음 표준 Linux "grep" 프로그램을 사용하여 다른 모든 관련 풀의 Count 파일에서 가장 풍부한 시퀀스 각각을 검색합니다. 일치하는 항목이 있는 경우 수정된 시퀀스 식별자를 사용하여 해당 풀의 RPM을 결정하고 보강 정보를 수동으로 구성합니다.
        참고: 모든 시퀀싱 분석 단계에 대한 스크립트는 보충 코딩 파일 1-11에서 찾을 수 있습니다.

9. 압타머 결합 검증 및 분석

  1. 서열 분석을 통해 얻은 농축 정보로부터, 후속 선택 라운드에서 가장 농축된 서열 및/또는 최종 선택 라운드에서 가장 풍부한 서열을 갖는 서열을 기반으로 후보 앱타머 서열을 식별한다. 추가 테스트를 위해 여러 가지 다른 후보 서열(최소 10-20개)을 선택하는데, 이는 가장 고농축된 압타머가 반드시 최고 성능의 앱타머가 아닐 수도 있기 때문입니다.
  2. 여러 샘플에 대해 신속하게 수행할 수 있는 결합 분석을 사용하여 후보 앱타머의 초기 스크리닝을 수행합니다. 컬럼-기반 한외여과 결합 분석법36 또는 효소-결합 올리고뉴클레오티드 분석법 (ELONA)은 이러한 초기 스크리닝을 위한 좋은 방법이다.
  3. 최소 2개의 독립적인 결합 분석(예: MicroScale Thermophoresis(MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay(ELONA)39, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon referometry, BLI)41)을 사용하여 초기 스크리닝에서 최상의 결합 활성을 나타내는 서열의 특이성 및 친화도를 분석합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

DNA 앱타머는 시험관(15)에서 SELEX를 사용하여 얻을 수 있기 때문에, 이 SELEX 전략은 온전한 전체 감염성 바이러스에 대한 양성 선택 단계(즉, 감염성 바이러스에 결합하는 DNA 분자를 보유함)뿐만 아니라 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스에 대한 반대 선택 단계를 모두 포함하도록 신중하게 설계되었습니다. 특히 자외선 처리는 비감염성 바이러스에 결합할 수 있는 DNA 서열을 폐기한다. 선택 프로세스의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다.

이 프로토콜의 대표적인 결과로 감염성 SARS-CoV-2에 대한 압타머 선택을 선택했습니다. 손상되지 않은 전염성 SARS-CoV-3를 처리하기 위한 생물안전 수준 3(BSL2) 작업 조건의 요구 사항으로 인해 우리는 대신 유사형 바이러스를 사용하기로 결정했습니다. 유사형 바이러스는 상대적으로 무해한 백본 바이러스(이 경...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

SELEX는 pM-nM 범위 22,43,44,45에서 높은 친화력을 가진 압타머를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 높고 조정 가능한 선택성도 제공합니다. 카운터 선택을 활용하면 선택성이 어려운 압타머를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, Li 그룹은 병원성 박테리아 균주와 비병원성 균주를 구별할 수 있는 서열을 얻을 수 있는 능력을 입증했다21. 또한, Le et al. Streptococcus pyogenes 박테리아46의 혈청형을 구별할 수 있는 압타머를 확인했습니다. 이것은 새로운 나노 기술 22,51,52와 함께 상이한 기능적 DNA 센서...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 프로토콜에 사용된 유사바이러스 샘플(SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1)을 제공한 시카고 일리노이 대학의 Ms. Laura M. Cooper와 Dr. Lijun Rong, 그리고 고처리량 시퀀싱에 도움을 주신 일리노이 대학교 어바나-샴페인에 있는 Roy J. Carver Biotechnology Center의 DNA 서비스 시설의 Dr. Alvaro Hernandez와 Dr. Chris Wright에게 감사드립니다. 그리고 시험관 내 선택 및 압타머 특성화 기술로 우리를 도운 Lu 그룹의 많은 구성원. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET 20-29215)의 RAPID 보조금과 일리노이 대학교 어 바나 샴페인 및 일리노이 – JITRI 연구소 (JITRI 23965)의 지속 가능성, 에너지 및 환경 연구소의 종자 보조금으로 지원되었습니다. ASP는 재정 지원에 대해 PEW Latin American Fellowship에 감사드립니다. 또한 오스틴에 있는 텍사스 대학교의 Lu 그룹 연구 프로그램을 지원해 주신 Robert A. Welch Foundation(보조금 F-0020)에도 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 과황산암모늄(APS)BioRad1610700
100% 에탄올Sigma-AldrichE7023
칼슘 및 마그네슘 없는 1x PBSCorning21-040-CM
40% 아크릴아미드/비아크릴아미드(29:1) 용액BioRad1610146
Agencourt AMPure XP 비드Beckman CoulterA63880DNA 클린업 비드 - 섹션 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛MerckUFC501024컷오프 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛MerckUFC510024컷오프 100 kDa
붕산Sigma-Aldrich100165
C1000 터치 열 순환기(듀얼 48/48 고속 반응 모듈 포함)BioRad1851148
염화칼슘Sigma-AldrichC4901
CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템BioRad1855201
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001스트렙타비딘 변성 마그네틱 비드 - 섹션 4.9
EDTA 디소듐 염Sigma-Aldrich
Eppendorf Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브Sigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer KitTakara Bio USA, Inc.632200렌티바이러스 정량화 키트 - 섹션 3.3.2.1
MagJET 분리 랙, 12 x 1.5 mL 튜브Thermo ScientificMR02
염화마그네슘Sigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학BioRadMSB1001Non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast GelsBioRad1658004EDU
미니 프로티안 쇼트 플레이트BioRad1653308
미니 프로티언 스페이서 플레이트(0.75mm 통합 스페이서 포함BioRad1653310
분자 생물학 등급 WaterLonza51200
멀티플레이트 96웰 PCR 플레이트, 하이 프로파일, 언스커트, 투명BioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA 중합효소New England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01고트로풋 염기서열분석 라이브러리 준비 키트 - 섹션 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 &마이크로; L, 20-200 &마이크로; L, 2-20 &마이크로; L 및 0.2-2 & 마이크로; L)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetsLabconco4261
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32850형광 기반  dsDNA 정량화  키트 - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
아세트산 나트륨, 시그마-알드리치S2889
염화나트륨시그마-알드리치S7653
소르발, 레전드 마이크로 17R 마이크로 원심분리기, 써모 사이언티픽
SsoFast, EvaGreen Supermix,BioRad1725201qPCR 마스터믹스 - 섹션 6.2.
트리스(하이드록시메틸)아미노메탄시그마-알드리치T1503
튜브 및 울트라 클리어 캡, 8미국 과학AB1183PCR 튜브
요소시그마-알드리치U5128
324503) , , , , , 75002440 개의 스트립

참고문헌

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678(2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230(2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070(2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334(2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966(2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

SELEXDNAqPCR

관련 논문