Summary
在本协议中,通过在双光子激光扫描显微镜下将不同分子加权荧光示踪剂注射到 体内 测试动物模型的角静脉中来评估下颌下腺(SMG)的内皮屏障功能。
Abstract
唾液在口腔和整体健康中起着重要作用。血管完整的内皮屏障功能使唾液分泌,而内皮屏障功能障碍与许多唾液腺分泌疾病有关。本协议描述了一种 体内 细胞旁通透性检测方法,以评估小鼠下颌下腺(SMG)中内皮紧密连接(TJ)的功能。首先,将具有不同分子量(4 kDa,40 kDa或70 kDa)的荧光标记葡聚糖注射到小鼠的角静脉中。之后,在双光子激光扫描显微镜下解剖单侧SMG并将其固定在定制的支架中,然后捕获血管,腺泡和导管的图像。利用该方法,监测不同大小示踪剂从血管到腺泡基底侧甚至穿过腺泡上皮进入导管的实时动态泄漏,以评估生理或病理生理条件下内皮屏障功能的改变。
Introduction
各种唾液腺产生唾液,唾液主要作为抵御感染的第一道防线并帮助消化,从而在口腔和整体健康中发挥重要作用1。血液供应对唾液腺分泌至关重要,因为它不断提供形成主要唾液的水、电解质和分子。由紧密连接(TJ)复合物调节的内皮屏障功能严格而微妙地限制了毛细血管的渗透,毛细血管对水,溶质,蛋白质甚至从循环血管移动到唾液腺组织的细胞都具有高度渗透性2,3。我们之前发现,响应胆碱能刺激而打开内皮TJs有助于唾液分泌,而内皮屏障功能的损害与干燥综合征4中下颌下腺(SMG)的分泌不足和淋巴细胞浸润相互关联。这些数据表明,对于多种唾液腺疾病,内皮屏障功能的贡献需要引起足够的重视。
双光子激光扫描显微镜是观察体内完整组织中细胞动力学的有力工具。该技术的优点之一是,当标本被近红外激发时,近红外光(NIR)比可见光或紫外光具有更深的组织穿透力,并且在适当的条件下不会对组织造成明显的光损伤5,6。事实上,唾液腺是一种非常均匀和浅表的组织,其中表面腺泡细胞距离腺体表面仅约 30 μm7,8。已经表明,活体共聚焦显微镜可以在亚细胞分辨率8下研究活小鼠唾液腺中的外分泌和肌动蛋白细胞骨架。然而,双光子激光扫描显微镜不仅具有传统共聚焦显微镜的优势,而且还可用于更清晰地检测更深的组织和图像。在这里,荧光标记的葡聚糖经常用作细胞旁通透性示踪剂,并且具有不同尺寸的优点,可用于测试TJ孔9的大小。本研究建立了一种活体实时双光子激光扫描显微镜技术,用于小鼠SMGs内皮屏障功能的原位评价。小鼠SMG中体内血管通透性检测的每个工作步骤在当前协议中描述。这是在小鼠SMG导管结扎模型中检测内皮屏障功能的示例。
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Protocol
所有实验程序均经北京大学医学部动物研究伦理委员会批准,并符合《实验动物护理和使用指南》(NIH出版物第85-23号,1996年修订)。8-10周年龄组的雄性野生型(WT)小鼠用于本研究。实验动物经过精心治疗,以尽量减少它们的疼痛和不适。
1. 动物程序
- 准备和管理麻醉剂和示踪剂。
- 在整个研究过程中保持无菌条件,并通过高压灭菌对器械进行灭菌。将小鼠分成两组。
注意:对照组未治疗,另一组单侧SMG导管结扎1天作为实验组。分组时,需要选择体重和年龄相似的小鼠,以减少体重和年龄对血管通透性的影响。 - 选择合适的示踪剂,例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖(分子量:4 kDa;FD4)和罗丹明B标记的葡聚糖(分子量:70kDa;RD70)(参见 材料表)具有不同的激发/发射光谱,以最大限度地减少渗透性测定中荧光信号之间的干扰(分别使用FITC或罗丹明B滤光片)。
注意:FD4和RD70的激发波长分别为488nm和594nm,所选发射波长分别为511-564nm和617-669nm。 - 将示踪剂稀释在无菌磷酸盐缓冲盐水(1x PBS)中,放入100mg / mL储备液中,并将等分试样避光储存在-20°C。
注意:分子量如4 kDa的葡聚糖即使没有病理状况,也会从小鼠SMG的血液中迅速泄漏10。 - 腹膜内注射三溴乙醇(25g小鼠的剂量约为600μL)以麻醉小鼠。按照当地动物伦理委员会的建议提供镇痛。
注意:麻醉诱导后,在眼睛上使用兽医软膏以防止干燥。照顾好动物11.等到鼠标忍受机械刺激,例如脚趾捏没有运动反应。 - 将两种具有不同分子量(FD4和RD70)的副细胞通透性示踪剂的混合物注入角静脉(0.5mg / g体重)。向每只小鼠注入 100 μL 示踪剂溶液混合物,每种染料 50 μL 以 1:1 的比例混合。
- 麻醉后,轻轻握住小鼠的头部和颈部,使眼球的一侧略微突出。将含有荧光示踪剂的胰岛素注射器(注意不要将任何空气引入注射器)沿着眼睛的角落与眼睛成直角。
注意:如果正确插入角静脉,染料溶液将很容易注入静脉,并且在注射过程中不会有阻力。此外,小鼠尾静脉注射也可能是静脉注射示踪剂分子的候选者。
- 麻醉后,轻轻握住小鼠的头部和颈部,使眼球的一侧略微突出。将含有荧光示踪剂的胰岛素注射器(注意不要将任何空气引入注射器)沿着眼睛的角落与眼睛成直角。
- 在整个研究过程中保持无菌条件,并通过高压灭菌对器械进行灭菌。将小鼠分成两组。
- 按照以下步骤执行 SMG 隔离。
注意:使用无菌工具,包括组织剪刀和分离镍,进行手术。- 小心地分离单侧腺体,以免在立体显微镜下损坏周围的血管和神经。
- 注射细胞旁通透性示踪剂后,迅速将小鼠放在纸板上,并将它们置于仰卧位,四肢和头部贴上胶带。在颈部皮肤上涂抹脱毛霜以去除老鼠的毛发。手术前使用75%乙醇对皮肤进行消毒。
- 然后,在体视显微镜下,用一般组织剪刀切割颈部的表皮,以暴露SMG的两侧(在本实验中处理右腺体)。接下来,使用钝性组织分离镍(见 材料表)轻轻地将胶囊与腺体表面分开,注意不要损坏腺体组织和血管。
- 在不损坏腺体结构的情况下将胶囊与腺体表面分开。此外,确保小鼠约束和腺体分离的整个过程在10分钟内完成。
- 小心地分离单侧腺体,以免在立体显微镜下损坏周围的血管和神经。
2. 双光子显微镜设置
- 将定制的支架连接到负压装置上,并提前检查负压效果是否正确实现。
注意:支架的形状像微型放大镜,中间有一块扁平的圆形玻璃(直径:4.32 毫米, 图 1)。负压装置是内部设计的,将支架连接到与排水瓶连接的橡胶管上,瓶子通过短橡胶管连接到负压控制器上。通过这种方式,负压控制器可以调节压力,以确保组织被吸入支架。- 将支架的一侧与负压装置连接。要测试负压装置是否完好无损,请将支架倒置,加一滴水,并将负压值设置为 20 个单位。如果水被完全快速吸走,负压装置与支架一起安装成功。
- 将鼠标裸露的SMG轻轻放在定制的支架上,并通过负压吸力吸起组织,尽可能远离小鼠身体,以减少呼吸和其他条件引起的运动伪影。
- 在25x/NA 1.0水浸物镜(NIR专用)下对附着在压盖上的支撑材料进行成像。
注意:在本实验中使用正置双光子显微镜(见 材料表)。注射示踪剂后,血管必须立即可见,并具有明显的荧光。
3. 容器成像和渗透率检测
- 选择看到腺体后不久开始成像。
注意:通常,根据实验设计,通常会在20秒或更长时间内捕获45-50张图像的时间序列。 - 沿 Z 轴采集连续图像,相距 2 μm,从腺体表面进入组织 70-140 μm,以生成三维 (3D) 结构。
- 获取血管的延时成像以测量SMG中的血管通透性。
注意:运行显微镜软件后,按如下方式设置程序菜单的条件(参见 材料表)。- 在“资源管理器”对话框中,单击“ 添加新文件夹 ”并更改文件名。
- 返回到 “流量获取” 列。在 XY 中,格式为 512 x 512,速度为 400 Hz。打开 双向 X 。
- 将缩放 系数 设置为 0.75 ,将缩放系数设置为 1.5 。
- 要获取延时成像,请在采集模式下选择 xyt。根据实验需要将持续时间设置为 20 秒、30 分钟或更长。
- 要进行 3D 构造,请将 采集模式 设置为 xyz。Z步大小可根据实际情况设置。
- 设置条件后,单击 实时 以观察照片形成框中两个通道和重叠通道的血管成像,然后选择感兴趣的区域。
- 单击“开始” 开始 映像。
注意:在麻醉下的成像过程中,鼠标不得无人看管。
4. 数据分析
- 要评估血管通透性,请使用图像J软件计算血管内外FD4和RD70的荧光强度比,并将其表示为血管外和血管内强度4。
注意:通过追踪葡聚糖转运来改变血管通透性反映了内皮屏障功能的变化。此外,通过计算血管变化的直径和数量来观察血管形态和密度。- 运行 映像 J 软件(请参阅 材料表)。
- 单击“ 文件 ”并选择 “ 打开”以打开在双光子显微镜下捕获的血管图像。
- 选择 “ 图像”并将“ 类型 ”设置为 “16 位 ”以转换图像格式。
- 选择分析,然后在设置测量值下选择面积、平均值、IntDen。单击“确定”进行确认。
- 在“ 分析”下,选择 “工具”,打开“ ROI 管理器”,然后选择“ 全部显示 和 标签”。
- 测量血管内荧光强度值:单击主界面上的套索工具以勾勒血管的轮廓。单击ROI管理器中的添加。按照此步骤继续选择多个容器。选择ROI管理器的所有对象,然后单击“度量”。
- 测量总荧光强度值:勾勒出整个图像,点击 测量,结果就是图像的总荧光强度值。
- 计算血管外荧光强度值。将数据复制到 Excel 进行计算。血管外荧光强度比=(1 −血管内荧光强度值/总荧光强度值)×100%。
5. 下游应用
- 在实验过程中,通过测量红细胞(在双光子显微镜下显示为黑点)4 在一段时间内经历的距离来计算血流速率。
- 为了可视化血细胞在内皮细胞中的运动,请通过荧光标记血细胞。然后,通过小鼠尾静脉用FD4或RD70注射荧光标记的细胞。循环5分钟后,追踪感兴趣的细胞一段时间。
注意:总共2 x 106 CFSE (羧基荧光素琥珀酰亚胺酯,一种透膜荧光染料)标记的来自供体小鼠脾脏的淋巴细胞通过尾静脉注射转移到受体中,并在实验动物模型中研究了淋巴细胞浸润到SMG中4。
6. 动物护理和恢复
- 在整个实验过程中照顾好动物。
注意:确保接受手术的动物在实验过程中完全康复之前不会回到其他动物的陪伴下。 - 在动物恢复足够的意识之前,不要让动物无人看管。
注意:连续观察小鼠的呼吸状态,并通过将它们放在动物加热垫上来保持温暖。根据当地动物伦理委员会的建议,提供术后疼痛恢复住房和镇痛。
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Representative Results
按照协议,将单侧SMG连接到定制的支架上,并且腺体尽可能远离小鼠身体,以防止呼吸引起运动伪影。在显微镜下观察到血管中红细胞(黑点)的快速流动。在发现人工晶状体下的组织区域后,必须切换到操作显微镜软件。在对照组中,两种示踪剂都存在于小鼠SMG的血管中。特别是,由于其分子量小,FD4能够从血管泄漏到腺泡和导管的基底侧,从而清楚地描绘出腺泡和导管的形状(如图2A中的A和D所示)。相比之下,具有较高分子量的葡聚糖,如40 kDa和70 kDa,无法区分SMG形态。事实上,RD70主要分布在大血管和微血管中。在导管结扎组中,FD4和RD70均外渗至腺泡基底侧,表明导管结扎可破坏内皮屏障功能,进而增加对大分子的通透性。半定量FD4和RD70荧光强度结果也证实了上述现象(图2B)。此外,血管直径增加,表明导管结扎1天可引起血管扩张。此外,3D图像显示结扎组血管周围FD4和RD70的荧光更加模糊(图2C)。
图 1:显示定制支架的示意图。 支架的形状像一个微型放大镜,中间有一块扁平的圆形玻璃(直径:4.32毫米)。支架的一侧与负压装置连接以吸走玻璃下的组织,而支架的另一侧则死了。 请点击此处查看此图的大图。
图2: 小鼠 下颌下腺(SMG)中血管的体内血管通透性测定和3D图像。 将小鼠分为对照组和导管结扎组。两组单侧腺体均暴露观察。(A)通过将4 kDa FITC标记的葡聚糖(FD4)和70 kDa罗丹明B标记的葡聚糖(RD70)注入角静脉来进行 体内血管通 透性测定。箭头表示SMG中示踪剂分布的变化。A,阿西尼。D、风管。比例尺 = 100 μm。 (B)对于上述图像的半定量分析,使用Image J软件测量荧光强度,包括血管内(血管内)和血管外(血管外)的FD4和RD70。(C)SMG中血管和微血管的3D图像。箭头表示SMG中示踪剂分布的变化。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
维持和调节内皮屏障功能对于血管稳态至关重要。内皮细胞及其细胞间连接在维持和控制血管完整性方面起着关键作用12。血流、生长因子和炎症因子的剪切力可引起血管通透性的变化,从而参与高血压、糖尿病和自身免疫性疾病等全身性疾病的发生和发展13,14,15。唾液腺的血管分布和血流是所有器官和组织中最丰富的之一,但对唾液腺血管系统的研究尚未广泛开展。对唾液腺血管,特别是内皮屏障功能更深入、更全面的了解,将为唾液分泌机制提供新的线索,促进血管生物学研究。
体内双光子激光扫描显微镜技术可以通过静脉注射荧光染料来量化血管通透性,而不会牺牲动物。荧光标记的葡聚糖与不同分子量或大小的微球可以更好地评估内皮损伤的程度。同时,利用血管通透性活体评价系统实时测定血管通透性的动态动力学。另一个优点是很容易区分血管的类型,例如小动脉,小静脉和毛细血管16。此外,血管内皮屏障的破坏和免疫细胞的迁移不可避免地与炎症有关,但有许多研究调查单一因素,只有少数研究集中在这两个方面之间的联系17,18。Uhl等人最近建立了一种研究方法,通过在体内同时注射具有不同荧光标记物的荧光标记的葡聚糖和免疫细胞特异性抗体来分析不同致病因素在唾液腺疾病中的作用19。在这里,荧光标记的免疫细胞也可以通过尾静脉注射来追踪,以探索当前工作模型中的发病机制。因此,本实验方法可为研究SMG疾病动物模型中白细胞外渗与体内内皮屏障完整性的相互作用提供独特的系统。
但不可忽视的是,小鼠对麻醉剂的反应是不同的,成像时间越长,需要的麻醉时间越长,小鼠恢复的难度也就越大。因此,该实验最好用于成像后不需要后续 体内 实验时的研究。此外,另一个限制是该技术不适用于时间跨度较长的实验。葡聚糖是水溶性的,易于代谢,导致荧光较弱,成像时间较长,因此,最好将成像时间保持在30分钟内。
总之,该研究的重点是细胞旁通透性示踪剂和细胞从血管和微血管渗透到腺组织中,并严格建立了对比增强活体动态双光子激光扫描显微镜作为测量血管通透性的先进方法,以评估小鼠SMG的内皮屏障功能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了中国国家自然科学基金(31972908,81991500,81991502,81771093和81974151)和北京自然科学基金(资助7202082)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
Depilatory cream | Veet | ||
Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
Image J software | National Institutes of Health | ||
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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