Summary
Рыбка данио-рерио недавно использовалась в качестве модели для проверки потенциальных модификаторов радиации. В настоящем протоколе подробно описаны шаги по использованию эмбрионов рыбок данио-рерио для экспериментов по радиационному скринингу, а также некоторые наблюдательные подходы для оценки эффекта различных методов лечения и облучения.
Abstract
Рыбки данио-рерио широко используются в нескольких видах исследований, потому что они являются одной из легко поддерживаемых моделей позвоночных и демонстрируют несколько особенностей уникальной и удобной модельной системы. Поскольку клетки с высокой пролиферативностью более восприимчивы к радиационно-индуцированным повреждениям ДНК, эмбрионы рыбок данио-рерио являются передовой моделью in vivo в радиационных исследованиях. Кроме того, эта модель прогнозирует воздействие радиации и различных лекарств в течение короткого времени, наряду с основными биологическими событиями и связанными с ними реакциями. В нескольких исследованиях рака использовались рыбки данио, и этот протокол основан на использовании модификаторов излучения в контексте лучевой терапии и рака. Этот метод может быть легко использован для проверки воздействия различных лекарств на облученные и контрольные (необлученные) эмбрионы, таким образом, идентифицируя препараты как радиосенсибилизирующие или защитные препараты. Несмотря на то, что эта методология используется в большинстве экспериментов по скринингу лекарственных средств, детали эксперимента и оценка токсичности на фоне рентгеновского излучения ограничены или рассматриваются лишь вскользь, что затрудняет его выполнение. В настоящем протоколе рассматривается этот вопрос и обсуждается процедура и оценка токсичности с подробной иллюстрацией. Процедура описывает простой подход к использованию эмбрионов рыбок данио для лучевых исследований и радиационного скрининга лекарственных препаратов с высокой надежностью и воспроизводимостью.
Introduction
Рыбка данио-рерио (Danio rerio) - это хорошо известная модель животного, которая широко использовалась в исследованиях в течение последних 3 десятилетий. Это небольшая пресноводная рыбка, которую легко разводить и разводить в лабораторных условиях. Рыбка данио-рерио широко использовалась для различных исследований развития и токсикологических исследований 1,2,3,4,5,6,7,8. Рыбка данио-рерио отличается высокой плодовитостью и коротким эмбриональным образованием; Эмбрионы пригодны для отслеживания различных стадий развития, визуально прозрачны и поддаются различным генетическим манипуляциям и высокопроизводительным скрининговым платформам 9,10,11,12,13,14. Кроме того, рыбка данио-рерио обеспечивает полную и живую визуализацию, для чего процесс ее развития и различные деформации в присутствии различных токсических веществ или факторов могут быть легко изучены с помощью стерео- или флуоресцентной микроскопии 7,15,16.
Лучевая терапия является одним из основных терапевтических режимов, используемых при лечении рака 17,18,19,20,21,22,23,24. Тем не менее, лучевая терапия рака требует потенциальных радиопротекторов для защиты нормальных здоровых клеток от гибели злокачественных клеток или для защиты здоровья человека во время терапии, включающей высокоэнергетические излучения 25,26,27,28,29. С другой стороны, также исследуются мощные радиосенсибилизаторы для повышения эффективности облучения для уничтожения злокачественных клеток, особенно в таргетной и точной терапии30,31,32,33. Таким образом, для валидации мощных радиопротекторов и сенсибилизаторов настоятельно требуется модель, подходящая для скрининга лекарственных препаратов с полувысокой пропускной способностью и измеримо демонстрирующая радиационные эффекты. Несколько доступных моделей используются в радиационных исследованиях и участвуют в экспериментах по скринингу лекарств. Тем не менее, высшие позвоночные животные и даже мыши, наиболее часто используемые in vivo, не подходят для крупномасштабного скрининга лекарств, потому что разработка таких скрининговых экспериментов с этими моделями отнимает много времени, средств и затрудняет. Аналогичным образом, модели клеточных культур идеально подходят для разновидностей высокопроизводительных экспериментов по скринингу лекарств34,35. Однако эксперименты с использованием клеточных культур не всегда прагматичны, воспроизводимы или надежны, поскольку клетки в культуре могут заметно изменять свое поведение в зависимости от условий роста и кинетики. Кроме того, разновидности типов клеток демонстрируют дифференциальную радиационную сенсибилизацию. Примечательно, что 2D и 3D системы культивирования клеток не отражают сценарий всего организма, и, таким образом, полученные результаты могут не соответствовать реальному уровню радиотоксичности36,37. В связи с этим рыбка данио-рерио имеет ряд преимуществ при скрининге на новые радиосенсибилизаторы и радиопротекторы. Простота в обращении, большой размер кладки, короткая продолжительность жизни, быстрое эмбриональное развитие, прозрачность эмбриона и небольшой размер тела делают рыбок данио-рерио подходящей моделью для крупномасштабного скрининга лекарств. Благодаря вышеперечисленным преимуществам, эксперименты можно легко повторить за короткое время, а эффект можно легко наблюдать под препарирующим микроскопом в многолуночных планшетах. Таким образом, рыбка данио-рерио набирает популярность в исследованиях по скринингу наркотиков, включающих радиационные исследования38,39.
Потенциал рыбок данио-рерио в качестве подлинной модели для скрининга модификаторов излучения был продемонстрирован в различных исследованиях 40,41,42,43,44,45. Сообщалось о радиопротекторном эффекте потенциальных радиомодификаторов, таких как наночастицы DF1, амифостин (WR-2721), белки репарации ДНК KU80 и ATM, а также трансплантированные гемопоэтические стволовые клетки, а также эффекты радиосенсибилизаторов, таких как флавопиридол и AG1478, в модели рыбок данио-рерио 19,41,42,43,44,45,46. С помощью этой же системы оценивали радиопротекторный эффект DF-1 (фуллереновой наночастицы) как на системном, так и на органоспецифическом уровнях, а также дополнительно изучали использование эмбрионов рыбок данио для скрининга радиопротекторов47. Недавно сообщалось, что мед Келулут является радиопротектором для эмбрионов рыбок данио, и было обнаружено, что он увеличивает выживаемость эмбрионов и предотвращает органоспецифическое повреждение, повреждение клеточной ДНК и апоптоз48.
Аналогичным образом, радиопротекторные эффекты полимеров, полученных в результате реакции Ханча, были проверены на эмбрионах рыбок данио в ходе высокопроизводительного скрининга, и защита была в основном обеспечена защитой клетокот повреждения ДНК. В одном из предыдущих исследований липофильный статин флувастатин был обнаружен в качестве потенциального радиосенсибилизатора с использованием модели рыбок данио-рерио с таким подходом50. Точно так же наночастицы золота считаются идеальным радиосенсибилизатором и использовались во многих исследованиях51,52.
Эмбриональное развитие рыбок данио включает в себя расщепление в первые 3 часа, в течение которых одноклеточная зигота делится на 2 клетки, 4 клетки, 8 клеток, 16 клеток, 32 клетки и 64 клетки, которые легко идентифицировать с помощью стереомикроскопа. Затем он достигает стадии бластулы со 128 клетками (2,25 ч после оплодотворения, hpf), где клетки удваиваются каждые 15 минут и проходят следующие стадии: 256 клеток (2,5 hpf), 512 клеток (2,75 hpf) и достижение 1000+ клеток всего за 3 часа (рис. 1). Через 4 ч яйцо достигает стадии сферы, после чего в зародышевой массе 7,53,54 образуется куполообразная форма. Гаструляция у рыбок данио-рерио начинается с 5,25 hpf54, где она достигает стадии щита. Щиток ясно указывает на быстрое конвергентное движение клеток в одну сторону от зародышевого кольца (рис. 1) и является заметной и отчетливой фазой гаструляции эмбрионов, которую можно легко идентифицировать53,54. Несмотря на то, что радиационное воздействие на эмбрионы может быть осуществлено на любой стадии их развития, радиационное облучение во время гаструляции может иметь более отчетливые морфологические изменения, способствующие лучшему считыванию радиационно-индуцированной токсичности55; Аналогичным образом, введение препаратов эмбрионам может быть начато уже с 2 HPF54.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящее исследование было проведено с предварительного одобрения и в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по этике животных Института наук о жизни, Бхубанешвар. Все содержание и разведение данио-рерио проводилось в помещении для выращивания рыбы при температуре 28,5 °C, а эмбрионы содержались в инкубаторе биологической потребности в кислороде (БПК) при температуре 28,5 °C. Здесь был использован штамм данио-рерио AB, а стадирование проводилось в соответствии с Kimmel et al.54. Рентгеновское излучение давалось при 6 hpf (стадия щита), и наблюдались различные фенотипы до 120 hpf.
1. Организация разведения и забор эмбрионов
- Установите емкости для разведения (изготовленные из поликарбоната, емкостью 1 л, см. таблицу материалов). Налейте системную воду (рН 6,8-7,5; проводимость 500 мкСм; и температуру 28,5 °C) в резервуары для разведения, покрывая почти 40% ее объема. Поместите разделитель в аквариум, чтобы создать две камеры, одну для самок, а другую для самцов.
- Из родительских резервуаров осторожно извлеките двух здоровых самок и одного здорового самца с помощью сачка, поместите их в соответствующие половинки и держите в темноте в течение ночи (минимум 10 ч) при температуре 28,5 °C.
- На следующее утро снимите разделитель и дайте рыбам спариваться, не беспокоя аквариумы для размножения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самки начнут нереститься, и икра будет видна лежащей на дне аквариума в течение 10-15 минут после того, как рыбам будет позволено спариваться56,57,58. - После нереста рыб вернуть в аквариумы, собрать эмбрионы из аквариума для разведения с помощью ситечка, тщательно промыть их системной водой и хранить собранную икру в чашке Петри со средой E-3 (4,94 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,43 мМ CaCl 2, 0,85 мМ солей MgCl2, 1% массы метиленового синего, см. Таблицу материалов).
- Наблюдайте за яйцами под препарирующим микроскопом, удаляйте неоплодотворенные или мертвые эмбрионы с помощью пипетки Пастера и храните планшеты Петри, содержащие оплодотворенные яйца, в среде Е-3 при температуре 28,5 °C в инкубаторе для их правильного роста и поддержания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неоплодотворенные яйцеклетки могут быть идентифицированы по молочно-белому цвету с коагулированным хорионом или с разорванными клетками внутри хориона. Наряду с неоплодотворенными яйцеклетками, яйцеклетки, не подвергшиеся расщеплению, и яйцеклетки с деформациями, такими как нарушения во время расщепления, например, асимметрия, образование везикул или травмы хориона, или не развивающиеся активно, должны быть отбракованы для сохранения собранных эмбрионов здоровыми и чистотой среды 7,56.
2. Мониторинг эмбрионов и отбор для радиационных экспериментов
- Наблюдайте за растущими эмбрионами под препарирующим микроскопом, определите правильную стадию 7,54 и удалите все мертвые или нездоровые эмбрионы. Обеспечьте адекватную стадию эмбриона, так как дозы облучения и лекарства будут вводиться на определенной стадии гаструляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый день проверяйте уровень и качество сред в посуде с культурой. Меняйте носитель каждые 24 часа, одновременно удаляя мертвые эмбрионы. Пипетки Пастера предпочтительнее использовать для забора эмбрионов или смены среды. - Перед началом эксперимента осторожно распределите здоровые эмбрионы по экспериментальным планшетам с помощью пипетки Пастера. Для каждой опытной группы берут по 15-20 эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помещайте в экспериментальную планшет только здоровые эмбрионы желаемых стадий развития. Предположим, что медикаментозное лечение должно быть проведено с эмбрионами при 6 hpf, а затем начать посев их в экспериментальные планшеты по крайней мере на 30-60 минут раньше.
3. Медикаментозное лечение
- Добавьте препараты нужной концентрации в эмбрионы рыбок данио. Заблаговременно подготовьте лекарственную среду Е-3. Убедитесь, что в исходном растворе препарата нет нерастворенного препарата, прежде чем готовить рабочую среду для обработки эмбрионов рыбок данио.
- Перед добавлением любого лекарственного средства в среду для радиационного скрининга проверяют цитотоксическое действие препарата с классами концентраций препарата. Следуйте рекомендациям ОЭСР для оценки LC 50 оцениваемых препаратов 59,60,61.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при перемещении тарелок и посуды во время облучения или наблюдения. Существует большая вероятность того, что пластины будут нарушены во время этой обработки, что приведет к утечке среды из лунок или выпадению эмбрионов из соответствующих лунок, что может привести к загрязнению близлежащих скважин и разрушению эксперимента.
4. Рентгеновское облучение
- При постановке радиационного эксперимента включите контрольную/необлученную и только радиационную группу. Точно так же, проводя скрининг на наркотики, включите другую группу, где препараты будут вводиться в той же концентрации, что и в скрининговом эксперименте вместе с облучением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наклейте этикетки на крышку и дно планшетов или чашек для культур, чтобы крышки не сбились. - Распределите эмбрионы в планшете лунки, если радиационные экраны могут покрыть и защитить дополнительные лунки от радиации, в то время как другие лунки подвергаются воздействию определенной дозы облучения; В противном случае используйте отдельные планшеты или диски для посева эмбрионов в соответствии с дозой облучения.
- Включите рентгеновский облучатель (см. Таблицу материалов) и начните инициализацию и прогрев аппарата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение расстояния от источника до объекта (SSD) должно составлять 50 см; Опять же, можно использовать разные SSD, что требует стандартизации. - Поместите экспериментальную пластину под облучатель внутри аппарата в центре, убедившись, что планшет находится непосредственно под источником рентгеновского излучения, а затем установите дозу (например, 5 ГР) и запустите рентген.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запечатайте планшеты парафиновой пленкой, чтобы избежать нежелательного пролития или загрязнения во время транспортировки планшетов из инкубатора в облучатель и обратно. - После завершения облучения выньте пластины, выключите программу аппарата, выключите аппарат и проверьте пластины под микроскопом сразу после облучения. Удалите мертвые эмбрионы и верните планшеты в инкубатор при температуре 28,5 °C. Запишите количество погибших эмбрионов после их оценки под препарирующим микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Облучайте различные группы эмбрионов определенными дозами облучения без особых задержек между отдельными группами, так как на эффект облучения может значительно повлиять разница в стадии развития.
ВНИМАНИЕ: При работе с рентгеновским аппаратом примите надлежащие меры защиты.
5. Сбор, визуализация и анализ данных
- Собирайте данные через заранее определенные промежутки времени, например, каждые 24 часа после облучения. Запишите все возможные наблюдения, такие как выживаемость, эффективность вылупления, стадия развития, количество сердцебиений, искривление тела и хвоста, отек перикарда, удлинение желточного мешка, микроцефалия, развитие плавательного пузыря, общая моторика или активность и т. д.62,63,64.
- Чтобы получить изображения, выберите репрезентативные эмбрионы на чистом предметном стекле, проверьте эмбрионы под микроскопом, сориентируйте их в определенном направлении и нажмите на изображения. Переименуйте файлы изображений в соответствии с группой и временем.
ПРИМЕЧАНИЕ: При съемке снимков через разные промежутки времени необходимо использовать одно и то же увеличение и освещение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая компоновка протокола показана на рисунке 2. Влияние радиации и характеристика в зависимости от дозы оценивались с помощью следующих анализов.
Оценка токсичности, вызванной рентгеновским излучением
С помощью стереомикроскопа были оценены и охарактеризованы следующие аномалии после медикаментозного лечения и/или облучения. В соответствии с руководящими принципами ОЭСР61, для оценки токсичности у рыб для анализа общейтоксичности были включены четыре основные апикальные конечные точки, включая коагуляцию эмбрионов, деформации в образовании сомитов, неотделение хвоста от желточного мешка и снижение или отсутствие сердцебиения. Острая токсичность определялась на основании положительного исхода при любой из вышеперечисленных аномалий. В дополнение к этим четырем основным конечным точкам также проводилось морфологическое наблюдение за искривлением позвоночника или хвоста, пороками развития головы и микроцефалией, дефектами развития, отеком перикарда, деформациями желточного мешка, деформациями плавательного пузыря и изменениями в структуре глаза (рис. 3С и рис. 4). Оценка радиотоксичности может быть основана на проценте выживаемости и/или оценке различных морфологических аномалий.
Процент выживаемости и кривая выживаемости
Процент выживаемости рассчитывали путем деления общего количества живых эмбрионов на общее количество эмбрионов, первоначально взятых в группе, и умножения результата на 100 38,50,65. Затем были построены графики значений, соответствующих разным временным точкам и разным экспериментальным группам, чтобы получить кривую выживаемости. В этом исследовании представлена кривая выживаемости эмбрионов, облученных при 6 hpf (рис. 3A).
Основные аномалии, связанные с радиационно-индуцированной токсичностью (рис. 3 и рис. 4)
Искривление кузова и изгиб хвоста
Это один из наиболее распространенных параметров для оценки любых токсических уродств у эмбрионов рыбок данио-рерио 50,65,66. Деформации искривления тела могут наблюдаться в различных формах, от низких до умеренных и тяжелых, с изгибом в области запеченного хвоста или в основной оси тела или даже с полностью полукруглым позвоночником или более чем одним изгибом в оси тела и в хвосте. При более низких дозах облучения искривление может появиться не у всех эмбрионов, но может развиться у большинства эмбрионов. С увеличением дозы тяжесть искривления также возрастает и затрагивает всех людей. В этом исследовании эти деформации наблюдались у эмбрионов, обработанных дозой радиации 10 ГР.
Отек перикарда и сердца
У эмбрионов, подвергшихся токсическому воздействию, такому как радиация и лекарственные препараты, выходящие за пределы допустимых диапазонов или в токсических дозах, также развивается отек перикарда. У эмбрионов, подвергшихся рентгеновскому облучению, наблюдается перикардальный и сердечный отек, при котором жидкость скапливается в полости перикарда и сердце, что приводит к отеку перикарда и сердца.
Отек желточного мешка, утолщение желточного мешка и сужение желточного мешка
После рентгеновского воздействия желточный мешок у некоторых рыб утолщается или задерживается, что указывает на токсичность рентгеновского излучения. В некоторых случаях также может наблюдаться общее сужение желточного мешка, при котором расширение желтка короткое, или развитие отека в области желтка.
Уменьшение размера головы (микроцефалия)
Одним из ожидаемых результатов тяжелой радиации является уменьшение размера головы, или микроцефалия, которая может быть выявлена при сравнении обработанных эмбрионов с эмбрионами в контрольной группе.
Деформации плавательного пузыря
После облучения у нескольких эмбрионов наблюдается уменьшение или нарушение состояния плавательного пузыря, а у эмбрионов, подвергшихся воздействию более высоких доз облучения, деформация плавательного пузыря усиливается, что может способствовать снижению подвижности или способности к плаванию у эмбрионов, подвергшихся воздействию высоких доз рентгеновского излучения.
Изменение строения глаз
Радиация может вызвать огромные повреждения ДНК и изменения белка, которые в конечном итоге вызывают гибель клеток и уменьшение их количества или гибельопределенных типов клеток. Глаз может подвергаться воздействию интенсивных доз облучения, и наблюдался небольшой размер глаза и уменьшение его клеточныхслоев 55.
Количество ударов пульса в минуту (уд/мин)
Количество сердечных сокращений в минуту подсчитывалось путем наблюдения за эмбрионами под стереомикроскопом. При увеличении дозы облучения уд/мин имеет тенденцию к уменьшению (рис. 3B). Пять личинок рассматривались для вычисления bpm в каждый момент времени в каждой группе. Уменьшение количества сердечных сокращений может указывать на сердечную дисфункцию66.
Используя этот протокол, доза рентгеновского излучения в 10 ГР была заметно токсичной для эмбрионов рыбок данио, облученных при 6 hpf. В контрольной группе и эмбрионах, подвергшихся воздействию 2 ГР и 5 ГР, значимой гибели эмбрионов не было (рис. 3А). Точно так же количество ударов сердца в минуту показало, что частота сердечных сокращений значительно снижается при увеличении доз рентгеновского излучения. В контрольной группе с интервалом каждые 24 часа наблюдалось увеличение частоты сердечных сокращений (рис. 3B). Однако в каждый момент времени частота сердечных сокращений снижалась при увеличении дозы облучения. Тем не менее, эмбрионы, подвергшиеся воздействию 5 ГР и 10 ГР, не показали существенных различий до 5-го дня после оплодотворения. У эмбрионов, подвергшихся воздействию радиации 15 ГР и 20 ГР, подозревается тяжелая сердечно-сосудистая деформация, поскольку сердцебиение значительно снизилось (рис. 3B). Как уже говорилось ранее, для эмбрионов, подвергшихся воздействию различных доз радиации в разные моменты времени, выявляются и оцениваются различные фенотипические дефекты и дефекты развития (рис. 3C и рис. 4).
Рисунок 1: Стадии развития эмбриона рыбки данио. Репрезентативные изображения различных стадий раннего развития рыбок данио. Покрываются стадии до 75% эпиболии (8 hpf). Эмбрионы на стадии щита; 6 HPF (зеленый цвет) используется для нормирования излучения. Масштабная линейка = 276,4 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обобщенный план протокола. (А) Разведение, сбор эмбрионов и стадирование. (Б) Экспериментальная установка: посев эмбрионов в лунки и медикаментозная обработка. (C) Эмбрионы требуемых стадий, подвергшиеся воздействию радиации и фенотипических изменений, наблюдаемых после облучения. (D) Схема рентгеновского аппарата и его установки. (E) Наблюдения, сбор данных и визуализация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние различных доз рентгеновского облучения на 6 эмбрионов рыбок данио. (A) Кривая выживаемости, показывающая общую долю выживших эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию индивидуальных доз радиации в диапазоне от 2 до 20 ГР. (B) Количество сердцебиений в минуту эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию различных доз рентгеновского излучения со скоростью 6 hpf в последующие дни после оплодотворения. (C) Репрезентативные изображения эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию различных доз радиации (от 2 до 20 ГР), облученных при 6 hpf. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Представление различных морфологических аномалий, обусловленных радиационно-индуцированной токсичностью. (А) контрольные эмбрионы данио-рерио при 72 hpf и (B) облученные эмбрионы при 72 hpf; Верхний эмбрион демонстрирует умеренные деформации, в то время как нижний эмбрион имеет серьезные деформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рыбки данио-рерио используются в качестве ценных моделей во многих исследованиях, в том числе в нескольких видах исследований рака. Эта модель предоставляет полезную платформу для широкомасштабного скрининга на наркотики67,68. Как и любой другой метод оценки токсичности, количественная оценка основных биологических изменений при облучении и/или медикаментозном лечении является наиболее важной частью этого протокола. В такого рода исследованиях выживаемость не должна быть единственным критерием для наблюдения за токсичностью; Она должна подкрепляться оценкой физических дефектов или дефектов развития с помощью надлежащих систем подсчета баллов. В этом случае также до 72 ГР выживаемость эмбрионов мало чем отличается между группами, в которых эмбрионы подвергаются воздействию рентгеновского излучения дозами 5 ГР, 10 ГР и 20 ГР; однако, когда общая морфология и фенотипы эмбрионов проверяются в этих конкретных дозах, становится ясно, что рентгеновская токсичность более серьезна, чем это кажется на графике выживаемости. Выраженность морфологической деформации у эмбрионов в этих дозах очень высока, отражая изменения их общих размеров тела, дефекты развития, пороки развития жизненно важных органов, изменения их общей активности. Даже в группе 15 ГР и 20 ГР эмбрионы не могут даже вылупиться из хориона и демонстрируют значительные деформации в зависимости от дозы. Таким образом, для оценки действия токсических веществ, в том числе смертельно опасного рентгеновского излучения, необходимо всеми возможными способами учитывать оценку морфологических, дефектов развития и физиологических дефектов, которые должны использоваться для оценки общей реакции эмбрионов рыбок данио или различных лекарственных препаратов, вводимых в ходе эксперимента.
Несмотря на то, что не существует окончательных систем оценки для оценки радиотоксичности конкретно в модели эмбриона рыбки данио, общая выживаемость и/или морфологические изменения, такие как искривление тела, отек перикарда, изменения в желточном мешке, микроцефалия, изменения в плавательном пузыре и глазу, изменения сердцебиения и дефекты локомоции, были приняты во внимание в различных исследованиях62. С. 63,64. Выживаемость эмбрионов может быть оценена на основе сердцебиения или оценки апикальных конечных точек, как описано в рекомендациях ОЭСР. В то же время морфологические аномалии, наблюдаемые в таких экспериментах, могут быть оценены индивидуально; Например, оценка изгиба хвоста была принята многими исследователями61.
При работе с рыбками данио-рерио и проведении этого протокола необходимо учитывать некоторые моменты. К ним относится племенная группа, которая всегда должна принадлежать к одному и тому же сорту рыб. Во всех экспериментах должен участвовать один заранее определенный штамм эмбриона рыбки данио. Еще одним важным фактором является стадия эмбриона; Нужно быть скрупулезным к стадии развития, на которой облучаются эмбрионы, потому что небольшое изменение в сроках или стадии приведет к другим результатам. Некоторые препараты могут влиять на развитие или вызывать серьезные повреждения эмбрионов при введении на ранней стадии развития, например, 2 hpf. В этом случае необходимо определить надлежащую сублетальную дозу препарата, после чего можно провести скрининг.
Параметры рентгеновского облучения должны быть одинаковыми для всех проводимых экспериментов. Тремя важными аспектами стандартного рентгеновского облучателя являются тип фильтра, доза излучения и характер облучения, а также расстояние между источником рентгеновского излучения и объектом. Существует два основных типа фильтров, используемых для генерации рентгеновских лучей: алюминиевые фильтры и медные фильтры; однако фильтры с различными комбинациями меди и алюминия или других металлов также используются для генерации рентгеновского излучения в других случаях69. Для эмбрионов рыбок данио-рерио здесь используется капперный фильтр для получения рентгеновских лучей. Расстояние от источника рентгеновского излучения до испытуемого называется расстоянием от источника до субъекта (SSD). В этом исследовании SSD был установлен равным 50 см. Рентгеновское излучение подавалось с помощью фильтра 0,3 мм Cu. Однократное облучение желаемой дозы проводилось с мощностью дозы 140,32 сГр/мин в диапазоне длин волн 0,01-10 нм. Перед проведением любого радиологического эксперимента доза облучения, подходящая для эксперимента и объектива, должна быть стандартизирована. Цель исследования, время облучения и доза облучения являются тремя основными критериями стандартизации дозы облучения. Сроки облучения будут включать в себя как то, на какой стадии развития эмбриона следует проводить облучение, так и период времени, в течение которого эмбрион будет подвергаться облучению в установленной дозе. Хорошо известно, что на ранних стадиях развития действие радиации максимально. В этом протоколе эмбрионы облучались на стадии развития 6 hpf различными дозами облучения (2 ГРц, 5 ГРц, 10 ГР, 15 ГР и 20 ГР) и наблюдались в течение 5 дней после оплодотворения. Любое отклонение от обычного протокола должно быть четко определено и стандартизировано.
Эта модель имеет ряд преимуществ для изучения эффекта радиосенсибилизаторов или протекторов в почти лонгитюдном исследовании, таких как возможность получения нескольких эмбрионов от индивидуального разведения, возможность размножаться каждую неделю из одного родительского аквариума, помещать значительное количество эмбрионов в экспериментальные группы, наблюдать фенотипические эффекты через несколько дней после лечения, и увидеть спектр фенотипических переменных после лечения. Эта модель может отражать воздействие радиации практически на все системы эмбриона, и одновременно можно тестировать несколько препаратов в форматах планшетов. Однако такой подход также сталкивается с определенными ограничениями. Например, эта модель не может повторить все деформации, демонстрируемые радиацией у высших животных и людей. Кроме того, многие исследования на основе белков или механистические исследования на этих рыбах ограничены из-за проблем с доступностью реагентов, например, с антителами. Однако, несмотря на эти ограничения, рыбка данио-рерио оказывается отличной моделью для радиологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Лаборатория SS и лаборатория RKS финансируются за счет грантов DBT и SERB, Индия. APM является стипендиатом ICMR правительства Индии. DP является стипендиатом CSIR правительства Индии. ООН является стипендиатом DST-Inspire правительства Индии. Рисунок 2 был сгенерирован с помощью Biorender (https://biorender.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
References
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2373-2380 (2020).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Zhang, C., Willett, C., Fremgen, T. Zebrafish: An animal model for toxicological studies. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 1, Unit 1.7 (2003).
- Dai, Y. J., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 11-17 (2014).
- Gamse, J. T., Gorelick, D. A. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish. Zebrafish. 13 (5), 377-378 (2016).
- Yesudhason, B. V., et al. Developmental stages of zebrafish (Danio rerio) embryos and toxicological studies using foldscope microscope. Cell Biology International. 44 (10), 1968-1980 (2020).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- McGrath, P., Li, C. Q. Zebrafish: A predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discovery Today. 13 (9-10), 394-401 (2008).
- Haque, E., Ward, A. C. Zebrafish as a model to evaluate nanoparticle toxicity. Nanomaterials. 8 (7), 561 (2018).
- Xia, Q., et al. Psoralen induces developmental toxicity in zebrafish embryos/larvae through oxidative stress, apoptosis, and energy metabolism disorder. Frontiers in Pharmacology. 9, 1457 (2018).
- Al-Samadi, A., et al. PCR-based zebrafish model for personalised medicine in head and neck cancer. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 235 (2019).
- Van Sebille, Y. Z., Gibson, R. J., Wardill, H. R., Carney, T. J., Bowen, J. M. Use of zebrafish to model chemotherapy and targeted therapy gastrointestinal toxicity. Experimental Biology and Medicine. 244 (14), 1178-1185 (2019).
- Heideman, W., Antkiewicz, D. S., Carney, S. A., Peterson, R. E.
- Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. 151-152, 152-168 (2019).
- Farrelly, J., McEntee, M. C. Principles and applications of radiation therapy. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 18 (2), 82-87 (2003).
- Seegenschmiedt, M., Micke, O., Muecke, R. German Cooperative Group on Radiotherapy for Non-malignant Diseases (GCG-BD). Radiotherapy for non-malignant disorders: State of the art and update of the evidence-based practice guidelines. The British Journal of Radiology. 88 (1051), (2015).
- Mohan, G., et al. Recent advances in radiotherapy and its associated side effects in cancer-A review. The Journal of Basic and Applied Zoology. 80 (1), 14 (2019).
- Jarosz-Biej, M., Smolarczyk, R., Cichoń, T., Kułach, N. Tumor microenvironment as a "game changer" in cancer radiotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3212 (2019).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Garibaldi, C., et al.
- Koka, K., Verma, A., Dwarakanath, B. S., Papineni, R. V. L. Technological advancements in external beam radiation therapy (EBRT): An indispensable tool for cancer treatment. Cancer Management and Research. 14, 1421-1429 (2022).
- Citrin, D. E.
- Ghani, S., et al. Recent developments in antibody derivatives against colorectal cancer; A review. Life Sciences. 265, 118791 (2021).
- Lu, L., Shan, F., Li, W., Lu, H. Short-term side effects after radioiodine treatment in patients with differentiated thyroid cancer. BioMed Research International. 2016, 4376720 (2016).
- Szejk, M., Kołodziejczyk-Czepas, J., Żbikowska, H. M. Radioprotectors in radiotherapy - Advances in the potential application of phytochemicals. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 70 (0), 722-734 (2016).
- Citrin, D., et al. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury. The Oncologist. 15 (4), 360-371 (2010).
- Jairam, V., et al. Treatment-related complications of systemic therapy and radiotherapy. JAMA Oncology. 5 (7), 1028-1035 (2019).
- Gong, L., Zhang, Y., Liu, C., Zhang, M., Han, S.
- Wardman, P. Chemical radiosensitizers for use in radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 397-417 (2007).
- Citrin, D. E.
- Citrin, D. E., Mitchell, J. B. Altering the response to radiation: sensitizers and protectors. Seminars in Oncology. 41 (6), 848-859 (2014).
- Caragher, S., Chalmers, A. J., Gomez-Roman, N. Glioblastoma's next top model: Novel culture systems for brain cancer radiotherapy research. Cancers. 11 (1), 44 (2019).
- Wang, J. S., Wang, H. J., Qian, H. L. Biological effects of radiation on cancer cells. Military Medical Research. 5 (1), 20 (2018).
- Serrano Martinez, P., et al. Mouse parotid salivary gland organoids for the in vitro study of stem cell radiation response. Oral Diseases. 27 (1), 52-63 (2021).
- Martin, M. L., et al. Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity. Cancer Research. 80 (5), 1219-1227 (2020).
- Szabó, E. R., et al. Radiobiological effects and proton RBE determined by wildtype zebrafish embryos. PLoS One. 13 (11), 0206879 (2018).
- Hurem, S., et al. Dose-dependent effects of gamma radiation on the early zebrafish development and gene expression. PLoS One. 12 (6), 0179259 (2017).
- Lu, B., Hwang, M., Yong, C., Moretti, L. Zebrafish as a model system to screen radiation modifiers. Current Genomics. 8 (6), 360-369 (2007).
- Curran, W. Seminars in radiation oncology. 12 (1), 2-4 (2002).
- McAleer, M. F., et al. Novel use of zebrafish as a vertebrate model to screen radiation protectors and sensitizers. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 61 (1), 10-13 (2005).
- Bladen, C. L., Lam, W. K., Dynan, W. S., Kozlowski, D. J. DNA damage response and Ku80 function in the vertebrate embryo. Nucleic Acids Research. 33 (9), 3002-3010 (2005).
- Geiger, G. A., et al. Zebrafish as a "biosensor"? Effects of ionizing radiation and amifostine on embryonic viability and development. Cancer Research. 66 (16), 8172-8181 (2006).
- Kelland, L. R. Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the clinic: Current status. Expert Opinion on Investigational Drugs. 9 (12), 2903-2911 (2000).
- Prasanna, P. G., et al. Radioprotectors and radiomitigators for improving radiation therapy: The Small Business Innovation Research (SBIR) gateway for accelerating clinical translation. Radiation Research. 184 (3), 235-248 (2015).
- Daroczi, B., et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF-1as assessed in a zebrafish model. Clinical Cancer Research. 12 (23), 7086-7091 (2006).
- Adenan, M. N. H., et al. Radioprotective effects of Kelulut honey in zebrafish model. Molecules. 26 (6), 1557 (2021).
- Liu, G., et al. High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch's reaction for in vivo X-ray damage determination. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
- Mohapatra, D., et al. Fluvastatin sensitizes pancreatic cancer cells toward radiation therapy and suppresses radiation- and/or TGF-β-induced tumor-associated fibrosis. Laboratory Investigation. 102 (3), 298-311 (2022).
- Chen, Y., Yang, J., Fu, S., Wu, J. Gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 15, 9407-9430 (2020).
- Ma, N., et al. Enhanced radiosensitization of gold nanospikes via hyperthermia in combined cancer radiation and photothermal therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (42), 28480-28494 (2016).
- Hosen, M. J., et al. Zebrafish models for ectopic mineralization disorders: Practical issues from morpholino design to post-injection observations. Frontiers in Genetics. 4, 74 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Zhou, R., et al. The effects of x-ray radiation on the eye development of zebrafish. Human & Experimental Toxicology. 33 (10), 1040-1050 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species -- An update. ALTEX. 22 (2), 87-102 (2005).
- Nagel, R. DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio--A general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX. 19, Suppl 1 38-48 (2002).
- Aspatwar, A., Hammaren, M. M., Parikka, M., Parkkila, S. Rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (150), e59315 (2019).
- Gence, L., et al. Hypericum lanceolatum Lam. Medicinal plant: Potential toxicity and therapeutic effects based on a zebrafish model. Frontiers in Pharmacology. 13, 832928 (2022).
- OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals., Section 2. , OECD Publishing. Paris, France. (2019).
- Li, X., et al. Toxic effects and foundation of proton radiation on the early-life stage of zebrafish development. Chemosphere. 200, 302-312 (2018).
- Si, J., et al. Effects of ionizing radiation and HLY78 on the zebrafish embryonic developmental toxicity. Toxicology. 411, 143-153 (2019).
- Si, J., et al. Toxic effects of (56)Fe ion radiation on the zebrafish (Danio rerio) embryonic development. Aquatic Toxicology. 186, 87-95 (2017).
- Pucci, G., Forte, G. I., Cavalieri, V. Evaluation of epigenetic and radiomodifying effects during radiotherapy treatments in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9053 (2021).
- Song, Z., et al. Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway. Chemosphere. 246, 125727 (2020).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (8), 611-628 (2021).
- Rosa, J. G. S., Lima, C., Lopes-Ferreira, M. Zebrafish larvae behavior models as a tool for drug screenings and pre-clinical trials: A review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6647 (2022).
- Kong, E. Y., Cheng, S. H., Yu, K. N. Biphasic and triphasic dose responses in zebrafish embryos to low-dose 150 kV X-rays with different levels of hardness. Journal of Radiation Research. 57 (4), 363-369 (2016).
