플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

Madeline M. Mumbleau; Madeline R. Meyer; Ming C. Hammond

doi:10.3791/64367

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방법 논문

플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

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DOI:

10.3791/64367

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2022년 8월 9일

Madeline M. Mumbleau^*¹ , Madeline R. Meyer^*¹ , Ming C. Hammond¹

¹Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 플루오로 생성 RNA 압타머 시금치2 및 브로콜리의 동역학을 결정하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 플레이트 리더로 시험관 내에서 형광 발생 압타머 역학을 측정하는 방법을 설명하는 반면, 두 번째 방법은 유세포 분석에 의한 세포의 형광 발생 압타머 역학 측정을 자세히 설명합니다.

초록

플루오로제닉 RNA 앱타머는 살아있는 세포에 적용되어 RNA에 태그 및 시각화하고, 유전자 발현에 대해 보고하고, 대사 산물 및 신호 분자의 수준을 감지하는 형광 바이오센서를 활성화합니다. 이들 시스템 각각에서의 동적 변화를 연구하기 위해서는, 실시간 측정을 얻는 것이 바람직하지만, 측정의 정확도는 샘플링 주파수보다 빠른 형광 생성 반응의 동역학에 의존한다. 여기에서는 각각 샘플 주입기와 유세포분석기가 장착된 플레이트 리더를 사용하여 플루오로제닉 RNA 앱타머에 대한 시험관내 및 세포 턴온 동역학을 결정하는 방법을 설명합니다. 우리는 시금치2 및 브로콜리 압타머의 형광 활성화에 대한 시험관 내 동역학이 2상 연관 반응으로 모델링될 수 있고 각각 0.56 s-1 및 0.35 ^s-1의 다른 빠른 위상 속도 상수를 갖는다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 그람 음성 박테리아로의 염료 확산에 의해 더욱 제한되는 대장균에서 시금치2의 형광 활성화를 위한 세포 역학이 분 시간 척도에서 정확한 샘플링 빈도를 가능하게 할 만큼 충분히 빠르다는 것을 보여줍니다. 형광 활성화 동역학을 분석하기 위한 이러한 방법은 개발된 다른 형광 RNA 앱타머에 적용할 수 있습니다.

서론

형광 생성 반응은 형광 신호를 생성하는 화학 반응입니다. 플루오로제닉 RNA 앱타머는 일반적으로 형광 양자 수율을 향상시키기 위해 소분자 염료를 결합하여 이 기능을 수행합니다(그림 1A)¹. 상이한 플루오로겐 RNA 앱타머 시스템이 개발되었고, 특정 RNA 앱타머 서열 및 상응하는 염료 리간드¹로 구성된다. 플루오로 제닉 RNA 앱타머는 mRNA 및 비 코딩 RNA ^2,3,4의 라이브 셀 이미징을 가능하게하는 형광 태그로 RNA 전사체에 추가되었습니다. 그들은 또한 보고 기능이 RNA 수준 ^5,6이라는 점을 제외하고는 녹색 형광 단백질(GFP)을 리포터로 사용하는 것과 유사하게 유전자 발현의 형광 리포터로서 프로모터 서열 뒤에 배치되었습니다. 마지막으로, 플루오로 생성 RNA 압타머는 특정 소분자에 반응하여 형광 생성 반응을 유발하도록 설계된 RNA 기반 형광 바이오 센서에 통합되었습니....