Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Detectie van horizontale genoverdracht gemedieerd door natuurlijke conjugatieve plasmiden in E. coli

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64523
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 2
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Summary

Conjugatie bemiddelt horizontale genoverdracht door plasmide-DNA over twee verschillende cellen te mobiliseren, waardoor de verspreiding van nuttige genen wordt vergemakkelijkt. Dit werk beschrijft een veelgebruikte methode voor de efficiënte detectie van conjugatieve plasmideoverdracht, gebaseerd op het gebruik van differentiële markers in het conjugatieve plasmide, donor en ontvanger om transconjugatie te detecteren.

Abstract

Conjugatie vertegenwoordigt een van de belangrijkste mechanismen die horizontale genoverdracht in Gram-negatieve bacteriën vergemakkelijken. Dit werk beschrijft methoden voor de studie van de mobilisatie van natuurlijk voorkomende conjugatieve plasmiden, met behulp van twee natuurlijk voorkomende plasmiden als voorbeeld. Deze protocollen zijn gebaseerd op de differentiële aanwezigheid van selecteerbare markers in donor-, ontvanger- en conjugatief plasmide. In het bijzonder omvatten de beschreven methoden 1) de identificatie van natuurlijke conjugatieve plasmiden, 2) de kwantificering van conjugatiesnelheden in vaste cultuur en 3) de diagnostische detectie van de antibioticaresistentiegenen en plasmide-replicontypen in transconjugante ontvangers door polymerasekettingreactie (PCR). De hier beschreven protocollen zijn ontwikkeld in het kader van het bestuderen van de evolutionaire ecologie van horizontale genoverdracht, om te screenen op de aanwezigheid van conjugatieve plasmiden met antibioticaresistentiegenen in bacteriën die in het milieu worden aangetroffen. De efficiënte overdracht van conjugatieve plasmiden waargenomen in deze experimenten in cultuur benadrukt de biologische relevantie van conjugatie als een mechanisme dat horizontale genoverdracht in het algemeen en de verspreiding van antibioticaresistentie in het bijzonder bevordert.

Introduction

In 1946 beschreven Lederberg en Tatum1 een seksueel proces in Escherichia coli K-12 dat nu bekend staat als conjugatie. Bacteriële conjugatie is het proces waarbij een bacteriële cel (de donor) unidirectioneel genetisch materiaal overdraagt aan een andere cel (de ontvanger) door direct cel-tot-cel contact. Conjugatie is breed verdeeld in bacteriën2,3, hoewel de fractie van donorcellen die de conjugatiemachinerie tot expressie brengen meestal erg kleinis 4.

Plasmiden zijn autonoom replicerende extrachromosomale DNA-elementen. Naast genen die betrokken zijn bij plasmidereplicatie en -onderhoud, dragen plasmiden vaak een lading genen die betrokken zijn bij aanpassing aan milieu-uitdagingen, zoals zware metalen of blootstelling aan antibiotica5. Conjugatieve plasmiden zijn een klasse van plasmiden met een reeks gespecialiseerde genen die hun overdracht naar ontvangende cellen mogelijk maken en hun persistentie na de overdrachtondersteunen 6. Conjugatieve plasmiden variëren in grootte van 21,8 kb tot 1,35 Mb in bacteriën in het phylum Pseudomonadota (synoniem met Proteobacteria), met de mediaan rond 100 kb 5,7. Ze hebben over het algemeen ook een laag aantal exemplaren, mogelijk om de metabole belasting op de gastheer laagte houden 8,9.

Het typische conjugatieve apparaat bestaat uit vier componenten: een oorsprong van overdracht (oriT), een relaxase, een type IV-koppelingseiwit en een type IV-secretiesysteem (een buisachtige structuur genaamd pilus waarmee donoren contact kunnen opnemen met ontvangers)6. Slechts een zeer klein deel van de cellen met conjugatieve plasmiden drukt de conjugatiemachinerieuit 4, maar als de plasmiden een fitnessvoordeel bieden, kunnen de transconjuganten zich snel uitbreiden in de populatie. Tussen 35% en meer dan 80% van de E. coli-isolaten verzameld uit verschillende habitats hebben conjugatieve plasmiden met genen die resistentie verlenen tegen ten minste één antibioticum10,11; Daarom is horizontale genoverdracht gemedieerd door conjugatieve plasmiden een belangrijk mechanisme dat de wereldwijde verspreiding van antibioticaresistentiegenenstimuleert 12.

Paringsexperimenten uitgevoerd in laboratoriumkweek hebben aangetoond dat de conjugatiefrequentie wordt beïnvloed door meerdere factoren, waaronder de aard van de ontvangende cellen, groeifase, celdichtheid, donor-ontvangerverhouding, of conjugatie wordt uitgevoerd in vloeibare of vaste media, koolstof, zuurstof, galzouten, metaalconcentraties, aanwezigheid van zoogdiercellen, temperatuur, pH en paartijd13,14, 15.

Dit werk beschrijft protocollen om de aanwezigheid van conjugatieve plasmiden in een bepaalde gastheerstam te detecteren, om de conjugatiesnelheden in vaste cultuur te kwantificeren en om hun overdracht naar ontvangende cellen te controleren. Deze protocollen kunnen worden gebruikt als een eerste stap voor de identificatie van natuurlijke conjugatieve plasmiden die geschikt zijn voor onderzoek. Ze gebruiken een minimum aantal vereenvoudigde stappen omdat ze zijn ontworpen om de aanwezigheid van conjugatieve plasmiden in bacteriën verkregen uit meerdere bronnen (omgevings-, commensale en pathogene) op schaal (tientallen tot honderden donoren) te screenen.

Bovendien worden tests getoond om te detecteren of de mobilisatie van een bepaald conjugatief plasmide onafhankelijk is van het antibioticum dat wordt gebruikt voor detectie (d.w.z. de relevantie van het antibioticaresistentiegen onder selectie) en om de conjugatiesnelheden van twee conjugatieve plasmiden in verschillende omgevingsisolaten te vergelijken.

Op basis van de genetische samenstelling van de relevante conjugatieve plasmiden (plasmide replicon en antibioticaresistentie gensamenstelling), kan elke stap van het protocol worden gewijzigd om de impact van een verscheidenheid aan factoren te bestuderen die de conjugatiesnelheid kunnen beïnvloeden.

Algemeen experimenteel ontwerp:
De essentiële componenten die nodig zijn om een paringsexperiment op te zetten, zijn donorcellen, een ontvangende stam en vaste media om donoren (antibioticum A), ontvangers (antibioticum B) en transconjuganten (antibioticum A en B) te selecteren. Transconjuganten zijn ontvangende cellen die stabiel het conjugatieve plasmide van de donor in stand houden.

Donorcellen zijn resistent tegen een antibioticum (antibioticum A) en zijn gevoelig voor de marker of markers die worden gebruikt om ontvangende cellen te selecteren (antibioticum B). De genomische locatie van het antibioticaresistentiegen (d.w.z. of het zich in het chromosoom of een plasmide van de donorcel bevindt) hoeft niet a priori bekend te zijn, omdat mobilisatie van antibioticaresistentiemarkers naar de ontvanger (na een direct donor-ontvangercontact) impliceert dat de door de donor verstrekte markers zich in een plasmide bevonden.

Een ontvangende stam (waarvan bekend is dat hij conjugatieve plasmiden neemt) moet een stabiele selecteerbare marker hebben die niet in de donor aanwezig is; Deze selecteerbare marker is over het algemeen resistent tegen een antibioticum of biocide dat zich in het chromosoom bevindt. De selectie van de ontvanger die moet worden gebruikt in paringsexperimenten is van cruciaal belang, omdat sommige E. coli-stammen variëren in hun vermogen om conjugatieve plasmiden te nemen16.

Zodra deze componenten zijn vastgesteld, is elke kolonie die groeit op media met zowel antibiotica (A als B) na contact tussen donor en ontvanger een vermeende transconjugant (figuur 1). Dit gaat ervan uit dat donoren in media kunnen groeien met antibioticum A, maar niet kunnen groeien in media met antibioticum B, en dat ontvangers in staat zijn om te groeien in media met antibioticum B, maar niet in staat zijn om te groeien met antibioticum A. Transconjugatie kan worden bevestigd met behulp van twee diagnostische tests. De eerste test bestaat uit de detectie (door polymerasekettingreactie [PCR] amplificatie van genen, of andere methoden) van genen gevonden in het conjugatieve plasmide in transconjugante kolonies. De tweede test omvat het gebruik van differentiële koloniekleurmarkers op basis van lactosemetabolisme. De differentiële koloniekleur wordt onthuld door het gebruik van MacConkey-agar; De lactose in de agar kan worden gebruikt als fermentatiebron door lactose-fermenterende (LAC+) micro-organismen. Deze micro-organismen produceren organische zuren, met name melkzuur, die de pH verlagen. Neutraal rood is een pH-indicator in de media die verandert van gebroken wit naar fel rood / roze als de pH onder 6,817 daalt. E . coli lactosepositieve stammen produceren dus grotere roze kolonies op MacConkey-agar, terwijl lactose-negatieve stammen lichtgele en kleinere kolonies produceren op MacConkey-agar.

Figure 1
Figuur 1: Experimenteel ontwerp gebruikt om de aanwezigheid van conjugatieve plasmiden in donorstammen te detecteren. In dit voorbeeld draagt de donor een conjugatief plasmide met een antibioticaresistentiegen dat resistentie verleent tegen antibioticum A, maar ze zijn vatbaar voor antibioticum B. Omgekeerd heeft de ontvanger een chromosomale resistentiedeterminant die bescherming biedt tegen antibioticum B, maar het is gevoelig voor antibioticum A. Transconjuganten zijn resistent tegen zowel antibiotica (A als B), omdat ze het conjugatieve plasmide van de donor hebben dat resistentie verleent tegen antibioticum A en het chromosoom van de ontvanger dat bescherming biedt tegen antibioticum B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het conjugatiepercentage voor een donor-ontvangerpaar (onder bepaalde experimentele omstandigheden) kan worden berekend door het aantal transconjuganten te delen door het aantal donoren of door het aantal ontvangers; De eerste snelheid geeft de fractie van donorcellen aan die functionele expressie van de conjugatiemachinerie door de donor vertoont16,18, terwijl de tweede snelheid het vermogen van de ontvanger aangeeft om conjugatieve plasmiden te nemen 19,20. In deze studie, tenzij anders vermeld, vertegenwoordigt de conjugatiesnelheid de fractie van ontvangende cellen die transconjugant worden (d.w.z. snelheid per ontvanger).

Hier worden twee onafhankelijke paringsexperimenten gerapporteerd, waarbij één E. coli-ontvanger en twee E. coli-donoren betrokken waren. Bovendien werden verschillende antibiotica gebruikt om transconjuganten voor een van de donoren te selecteren om te bevestigen dat een enkel multiresistent plasmide kan worden geselecteerd met een van de antibioticaresistentiegenen die in het conjugatieve plasmide worden aangetroffen.

De donor- en ontvangerstammen die in dit werk worden gebruikt, zijn volledig gesequenced om alle componenten van dit experimentele systeem te begrijpen; Deze protocollen zijn echter ontworpen om te screenen op de aanwezigheid van conjugatieve plasmiden in gastheren van onbekende sequentie, en kunnen ook in deze experimentele context worden gebruikt; In dit geval worden echter eerst de relevante genen gesequenced.

De donor- en ontvangerstammen die in het protocol worden gebruikt, zijn de volgende:

Donor 1. E. coli SW4955 werd verzameld in een meer in Baton Rouge (LA, USA). Het heeft een 134.797 bp conjugatief plasmide (p134797) met IncFIC (FII) en IncFIB (AP001918) replicons. Dit conjugatieve plasmide heeft genen die resistentie verlenen tegen cefalosporines van de derde generatie (blaCTX-M-55), aminoglycosiden (aac(3)-IIa en aadA1), fenicolen (catA2), tetracyclines (tet(A)), trimethoprim (dfrA14) en sulfonamiden (sul3). Voor een volledige kaart van p134797, zie figuur 2A. E. coli SW4955 is lactosepositief en produceert roze kolonies op MacConkey-agar.

Donor 2. E. coli SW7037 werd verzameld in Lake Erie (Ottawa County, OH, USA). Het draagt een 101.718 bp conjugatief plasmide (p101718) met een IncI1-I (Alpha) replicon. Dit conjugatieve plasmide heeft een gen dat resistentie verleent tegen bèta-lactams (blaCMY-2). Voor een volledige kaart van p101718, zie figuur 2B. E. coli SW7037 is ook lactosepositief en produceert roze kolonies op MacConkey-agar.

Figure 2
Figuur 2: Genetische kaart van de conjugatieve plasmiden die in dit onderzoek zijn gebruikt . (A) Plasmide p134797, het conjugatieve plasmide dat voorkomt in E. coli stam SW4955. (B) Plasmide p101718, het conjugatieve plasmide dat voorkomt in E. coli stam SW7037. Antibioticaresistentiegenen worden blauw gemarkeerd en genen die tot het conjugatieve apparaat behoren, worden rood gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ontvanger. E. coli LMB100 wordt gebruikt als ontvanger. Dit is een plasmideloze stam die resistent is tegen rifampicine (100 mg/L) en streptomycine (100 mg/L). Het hebben van resistentie tegen twee antibiotica vermindert de kans op resistentiemutaties bij de donor die de interpretatie van de resultaten zouden verstoren. Bovendien is E. coli LMB100 lactose-negatief en kan het worden onderscheiden van de twee donorstammen omdat het lichtgele en kleine kolonies produceert (in tegenstelling tot grotere, roze kolonies) op MacConkey-agar.

Wanneer de donor lactose-negatief is, raden we aan om een lactose-positieve ontvanger te gebruiken (bijv. E. coli J53). De LMB100- en J53-stammen zijn beschikbaar voor andere laboratoria voor gebruik. Stuur een verzoek naar Dr. Gerardo Cortés-Cortés met een adres en FedEx-nummer.

Het vaste medium dat nodig is om donoren, ontvangers en transconjuganten te selecteren en te tellen, is MacConkey-agar in petrischalen met een diameter van 100 mm. De toevoeging van de volgende antibiotica is nodig: (i) Media A: carbenicilline (100 mg/L) om donoren te tellen en ervoor te zorgen dat ontvangers niet met dit antibioticum kunnen groeien. ii) Media B: rifampicine (100 mg/l) + streptomycine (100 mg/l) om de ontvangers te tellen en ervoor te zorgen dat donoren niet in deze twee antibiotica kunnen groeien. iii) Media AB: carbenicilline (100 mg/l) + rifampicine (100 mg/l) + streptomycine (100 mg/l) om transconjugelingen te verkrijgen en te tellen. iv) Media C: geen antibiotica om alle onderzochte isolaten te strelen.

De conjugatiesnelheden van conjugatieve plasmiden van E. coli SW4955 en E. coli SW7037 tot E. coli LMB100 worden vergeleken. Bovendien wordt in het geval van het p134797-conjugatieve plasmide (SW4955-stam) het antibioticum carbenicilline (100 mg / L) vervangen door gentamicine (2 mg / L), chlooramfenicol (25 mg / L), tetracycline (10 mg / L), trimethoprim (20 mg / L) of sulfamethoxazol (100 mg / L) in latere experimenten om vast te stellen of de antibioticumresistentiemarker die voor selectie wordt gebruikt, enige invloed heeft op de resultaten.

Protocol

1. Methode 1: Vervoeging

  1. Dag 1: Streep de donoren en ontvanger. Streep apart van glycerolvoorraden op media C (MacConkey-agar zonder antibiotica) en incubeer 's nachts bij 37 °C.
    OPMERKING: Deze stap is nodig om ervoor te zorgen dat het experiment wordt uitgevoerd met zuivere isolaten en om het lactosefenotype te bevestigen aan de hand van de kleur van kolonies.
  2. Dag 2: Label een kweekbuis van 14,0 ml voor elke donor en ontvanger. Selecteer een enkele kolonie van elke donor en ontvanger en laat ze 's nachts (18 uur) groeien in afzonderlijke kweekbuizen van 14,0 ml met 2 ml Mueller Hinton-bouillon bij 37 ° C en schudden bij 200 tpm.
    OPMERKING: Bij de gebruikte stammen wordt de stationaire fase bereikt na een nachtelijke kweek van 18 uur.
  3. Dag 3: Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van de nachtcultuur van elke donor en ontvanger (geen vortexing) met behulp van een 1:10 verdunning van 900 μL zoutoplossing en 100 μL van de nachtcultuur.
  4. Pas de optische dichtheid van elke donor en ontvanger aan op 2,0 (OD600 = 2,0) met gesteriliseerde zoutoplossing (0,85% NaCl in water).
    OPMERKING: Een nachtkweek van E. coli met een OD600 = 2,0 heeft 1,6 x 109 KVE / ml.
  5. Label een 1,5 ml microcentrifugebuis "paringsbuis", met vermelding van de donor- en ontvangerstammen. Breng 500 μL van de aangepaste (OD600 = 2,0) suspensie van elke donor en ontvanger over en plaats ze in de paringsbuis (deze paringsbuis zou 0,8 x 109 CFU / ml van elke donor en ontvanger hebben). Meng de paringsbuis voorzichtig door inversie.
  6. Centrifugeer de paringsbuis gedurende 10 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur.
  7. Zonder de pellet te verstoren, pipetteer 800 μL uit de conjugatiebuis. Er moet nog 200 μL in de conjugatiebuis zitten.
    OPMERKING: Gooi het supernatant weg in een 10% bleekcontainer om bacteriën in de suspensie te inactiveren.
  8. Incubeer de paringsbuis gedurende 18 uur ('s nachts) bij 37 °C in een incubator. Paring vindt plaats tijdens de incubatietijd.
    OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd zonder te schudden om de vervoegingspili niet te breken.
  9. Als negatieve controle, streep de nachtcultuur van donoren op media B en ontvangers op media A. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C
  10. Dag 4: Voeg 800 μL zoutoplossing toe aan de paringsbuis en vortex om te resuspenderen (dit reconstitueert het paringsmengsel tot 1 ml).
    OPMERKING: Vortexing breekt de paringsbacteriën uit elkaar en homogeniseert de cultuur om de KVE / ml te kwantificeren.
  11. Bereid 1:10 verdunningen (van 1 x 100 tot 1 x 10-7) van de paringsmix. Plaat 100 μL verdunningen 10-5 tot 10-7 op media A en media B, en alle verdunningen op media AB.
    OPMERKING: Dlution 100 verwijst naar de nette buis.
  12. Laat de platen drogen voordat je ze ondersteboven in de couveuse legt. Incubeer de platen gedurende 18 uur ('s nachts) bij 37 °C.
  13. Dag 5: Inspecteer de negatieve controles om ervoor te zorgen dat de strepen van pure nachtculturen van donoren niet groeiden op media B, en de pure nachtcultuur van ontvangers niet groeide op media A.
  14. Noteer het aantal kolonies en verdunningen dat kan worden geteld:
    1. Tel de kolonies in media A; Dat zijn de donoren. De kolonies moeten roze zijn (figuur 3A,B).
    2. Tel de kolonies in media B; Dit zijn de ontvangers en transconjuganten. De kolonies moeten lichtgeel zijn (figuur 3C).
    3. Tel de kolonies in media AB; Dit zijn de transconjuganten. De kolonies moeten lichtgeel zijn.
      OPMERKING: Selecteer een telbare plaat. Een aftelbare plaat heeft tussen de 30 en 300 kolonies (meer dan 300 kolonies zouden moeilijk te tellen zijn, en minder dan 30 kolonies worden beschouwd als een te kleine steekproefgrootte om een nauwkeurige weergave van het oorspronkelijke monster te presenteren).
  15. Bereken de frequentie van vervoeging per donor of per ontvanger
    Frequentie van conjugatie per donor = (CFU/ml van de transconjugant [media AB])/ (CFU/ml donoren [media A]) x 100
    Frequentie van conjugatie per ontvanger = (CFU/ml van de transconjugant [media AB])/ (CFU/ml van ontvangers en transconjuganten [media B]) x 100
    OPMERKING: De vervoegingsfrequentie voor dit protocol werd berekend als transconjuganten gedeeld door het aantal van de ontvanger, vermenigvuldigd met 100. Volgens de literatuur kan de resulterende hoeveelheid conjugatie worden genoemd als exconjugantfrequentie, genoverdrachtsfrequentie, conjugatiefrequentie, recombinante opbrengst, plasmideoverdrachtsefficiëntie, conjugatiefrequentie op basis van het totale aantal bacteriën, aandeel transconjuganten, fractie van transconjuganten in de ontvangende populatie, transconjugantenfrequentie, conjugatiefrequentie, logaritme van conjugatiesnelheid, overdrachtssnelheidsconstante, conjugatiesnelheid per paringspaar, conjugatiecoëfficiënt of conjugatie-efficiëntie20. Dit protocol verwijst naar de term conjugatie-efficiëntie.
  16. Bewaar de transconjuganten in glycerolvoorraden bij -80 °C. Volg de substappen voor het bereiden van glycerolvoorraden.
    1. Selecteer een enkele kolonie transconjuganten en laat ze 's nachts (18 uur) groeien in kweekbuizen van 5,0 ml met 2 ml Mueller Hinton-bouillon aangevuld met carbenicilline (100 mg / L), bij 37 ° C en schudden bij 200 tpm.
    2. Label cryogene injectieflacons, met vermelding van de naam van transconjugant, als volgt: Tc + naam van donor + antibioticum van selectie in media A (omdat het transconjuganten zijn, is bekend dat hun achtergrond de ontvangende stam is, die al resistent is tegen streptomycine en rifampicine, maar bovendien het plasmide herbergt dat een bèta-lactamresistentiegen draagt); bijvoorbeeld TcU1Carb. Voeg continue getallen toe voor het geval er meer dan één transconjugant van dezelfde donor moet worden opgeslagen (bijv. TcU1Carb1, TcU1Carb2, enz.).
    3. Breng 1 ml van de nachtcultuur over op 1 ml 50% glycerol (v / v; de uiteindelijke glycerolconcentratie moet 25%) zijn en meng voorzichtig door inversie. Leg de cryogene injectieflacons gedurende 15 minuten op droogijs en bewaar de cryovialen bij -80 °C voor toekomstige experimenten.
  17. Voor DNA-extractie, streep de trasnconjuganten uit glycerolvoorraden op Mueller Hinton-agar aangevuld met carbenicilline (100 mg / L) en incubeer 's nachts bij 37 ° C; Volg vervolgens de aanbevelingen uit stap 2.1.

2. Methode 2: Polymerasekettingreactie (PCR) ter versterking van antibioticaresistentiegenen en plasmide-repliconen in E. coli-transconjuganten

OPMERKING: Polymerase kettingreactie (PCR) werd ontwikkeld door Dr. Kary Mullis in 1983. De PCR is afhankelijk van specifieke primers (een kort stukje DNA complementair aan een bepaalde DNA-sequentie dat fungeert als een punt waarop replicatie kan plaatsvinden, over het algemeen 20-40 nucleotiden in lengte en idealiter met een guanine-cytosinegehalte van 40% -60%), die worden uitgegloeid tot tegenovergestelde strengen van een gedenatureerd, dubbelstrengs DNA-sjabloon en uitgebreid door een thermostabiel DNA-polymerase, zo wordt een extra sjabloon gegenereerd voor de volgende cyclus van reacties, wat leidt tot de exponentiële versterking van de oorspronkelijke sjabloon21. In dit protocol werden de replicons en resistentiegenen in de conjugatieve plasmiden versterkt om de overdracht in transconjugante ontvangende cellen te bevestigen.

  1. DNA-extractie
    1. Om de overdracht van resistentiegenen gedragen door conjugatieve plasmiden te detecteren, gebruikt u transconjugant DNA als sjabloon. Gebruik eenvoudige kookvoorbereidingsextractie om de bacteriële celwanden te lyseren.
      OPMERKING: Eenvoudige kookvoorbereidingsextractie is een eenvoudige aanpak om de bacteriële celwanden te lyseren. Deze extractie bevat plasmide-DNA gemengd met genomisch DNA, maar omdat primers zijn ontworpen op basis van specifieke DNA-sequenties van belang, is deze sjabloon ook nuttig voor PCR. Plasmiden kunnen ook specifiek worden gezuiverd, hoewel de opbrengsten de neiging hebben om te dalen met toenemende plasmidegrootte22. Dit is een handige stopplaats. DNA kan enkele maanden bewaard worden bij -20 °C.
  2. Pcr
    1. Aangezien het experiment een negatieve en een positieve controle heeft, is het gunstig om een pool op te zetten voor alle reacties in een buis van 1,5 ml. Label een buis van 1,5 ml als "pool" en de vereiste PCR-buizen met de naam van het gen en monster (bijv. OXA-U1).
    2. Pipetteer de PCR-reagentia in de volgende volgorde in een buis van 1,5 ml: steriel water, 2x Master Mix, primers en polymerase (behalve het sjabloon-DNA) (zie tabel 1). Meng voorzichtig door minstens 10 keer op en neer te pipetteren. Blijf de hele tijd op ijs.
      OPMERKING: Draag handschoenen om besmetting van het reactiemengsel of de reagentia te voorkomen. Probeer te voorkomen dat reagentia worden geopend en gemengd en monsters in hetzelfde gebied worden behandeld om reagensbesmetting te voorkomen. Plaats de reagentia in de ijsemmer om nucleaseactiviteit en niet-specifieke priming te onderdrukken. Laat ze volledig ontdooien voordat je een reactie opzet. Houd de reagentia gedurende het hele experiment op ijs. Taq Polymerase wordt aan het einde toegevoegd omdat het gevoelig is voor pH-veranderingen; Het moet worden gebufferd om degradatie of verkeerd vouwen te voorkomen. De volgorde van de primers is vermeld in tabel 2-antibioticaresistentiegenen-en tabel 3-replicons 23,24,25,26,27,28.
    3. Voeg het sjabloon-DNA toe aan de bijbehorende buis. Vermijd het introduceren van bubbels en veilige doppen op de PCR-buizen.
    4. Plaats de PCR-buizen in de thermische cycler.
    5. Start het programma. Raadpleeg de programma-instellingen voor elk gen in tabel 2 (resistentiegenen) en tabel 3 (replicons).
      OPMERKING: Stel PCR-programma's in om de monsters na het uitvoeren op 4 °C te houden.
      1. PCR-omstandigheden voor replicons: één denaturatiecyclus bij 94 °C gedurende 5 min, gevolgd door 30 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 1 minuut, gloeien bij 60 °C gedurende 30 s, rek bij 72 °C gedurende 1 minuut en een laatste verlenging van één cyclus bij 72 °C gedurende 5 minuten.
        OPMERKING: Dit zijn de voorwaarden gestandaardiseerd door Carattoli et al.29.
    6. Wanneer het programma is voltooid, bewaart u de PCR-buizen bij 4 °C.
      OPMERKING: Dit is een handige stopplaats. PCR-producten kunnen enkele maanden worden bewaard bij -20 °C
    7. Bereid een 1% agarose-gel door 0,6 g agarose in een kolf van 250 ml te wegen en 60 ml 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer toe te voegen (pas reagentia aan als een andere gelgrootte nodig is). Smelt de agarose voorzichtig en langzaam in een magnetron om te voorkomen dat agarose over de kolf morst en laat het afkoelen tot ongeveer 55 °C (10-15 min).
      1. Bereid alle reagentia met ultrapuur gedeïoniseerd water en reagentia van analytische kwaliteit:
      2. TAE 50x Buffer (Tris-base, azijnzuur en EDTA) (1 L): Meng 121,1 g Tris-base + 372,24 g EDTA en voeg 500 ml gedestilleerd water toe. Los op met een magneetroerder. Voeg 57,1 ml azijnzuur toe en voeg gedestilleerd water toe tot een totaal volume van 1.000 ml.
      3. Autoclaaf bij 15 psi, 121 °C gedurende 15 minuten, en op kamertemperatuur bewaren tot het klaar is voor maximaal 6 maanden.
      4. TAE 1x Buffer (1 L): Combineer 20 ml TAE 50x buffer met 980 ml gedestilleerd water en meng.
    8. Voeg onder een zuurkast 6 μL SYBR Green toe aan de gesmolten agarose, meng en giet uit in de lade (en kam), vooraf afgesloten met plakband om morsen te voorkomen. Laat de gel 15-25 minuten inwerken totdat troebelheid verschijnt.
      OPMERKING: Andere alternatieve kleurstoffen zijn ook beschikbaar30,31,32,33.
    9. Verwijder het plakband en plaats de gel in de elektroforesekamer, voeg voldoende 1x TAE-buffer toe om de gel te bedekken.
    10. Meng 5 μL 6x DNA gel loading kleurstof met 25 μL van elke reactie. Meng voorzichtig door minstens 10 keer op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Niet al het PCR-product hoeft in de gel te worden geladen om het verwachte product te visualiseren (pas de hoeveelheid kleurstof aan zoals overeenkomt). Het resterende PCR-monster kon worden bewaard en gedurende enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
    11. Laad het mengsel in putjes (vermijd het introduceren van bubbels) en leg het deksel van de kamer naar beneden.
      OPMERKING: Laad het eerste monster in het tweede putje (reserveer het eerste naar de ladder), te beginnen met de negatieve controle.
    12. Laad 4 μL van 1 kb DNA-ladder in de eerste put.
    13. Voer de elektroforese uit op 120 V, 400 mA en 60 min.
    14. Visualiseer de gel onder UV-licht (met een UV-verlichting) en neem het beeld op.
      OPMERKING: Als er een PCR-product aanwezig is, kunnen gekleurde DNA-banden worden gedetecteerd met behulp van een standaard UV-transilluminator, een transilluminator voor zichtbaar licht of een laserscanner.
Reagens Voorraad oplossing Volume toegevoegd aan 50 μL reactie (1x) Finaal Voorbeeld: volume Voorbeeld: volume Voorbeeld: volume toegevoegd aan elke buis Final Vol. 50 μL Volume toegevoegd aan positieve controle Volume toegevoegd aan negatieve regeling
Concentratie toegevoegd aan 1x toegevoegd aan 3x (pool)
Steriel water - 21,5 μL (q.s. tot 50 μL) - 21,5 μL 64,5 μL 49 μL/buis 49 μL/buis 49 μL/buis
Master Mix 2x 25 μL 1x 25 μL 75 μL
Voorwaartse primer 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Omgekeerde primer 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Sjabloon DNA Variabel (100-200 ng/μL) Variabele (1 μL) Veranderlijk 0,5 μL 1,5 μL
Polymerase 5 eenheden/μL 0,5 μL 2,5 eenheden - - 1 μL (transconjugant) 1 μL (donor) 1 μL (ontvanger)
OPMERKING: q.s. is een Latijnse afkorting voor quantum satis wat de hoeveelheid betekent die nodig is.

Tabel 1: PCR-reagentia en pool voor drie reacties (een voorbeeld). 

Primers (volgorde vermeld in de 5' - 3' oriëntatie) PCR-programma Verwachte grootte
(bp) Ref.
blaCTX-M groep 1 94 oC 7 min (864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 s (35 cycli)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC 50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
BlaCMY-2 95 oC 3 min (1855) 24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 oC 30 s (30 cycli)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
AAC(3')-II 94 oC 5 min (237) 25
aac(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 s (32 cycli)
aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 oC 45 s
72 oC 2 min
72 oC 8 min
aada 94 oC 5 min (283) 26
AADA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 oC 1 min (35 cycli)
AADA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 8 min
sul-3 94 oC 5 min (799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 oC 1 min (30 cycli)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A) 95 oC 5 min (957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 s (23 cycli)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 min
DFR Een 95 oC 5 min (302) Dit werk
DFRA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 min (30 cycli)
55 oC 1 min
DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 min
72 oC 7 min
CatA2 95 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTCTACTGTCTTTC 95 oC 1 min (25 cycli) (225) Dit werk
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 7 min

Tabel 2: Primers en PCR-programma's die worden gebruikt om diagnostische resistentiegenen te versterken. 

Replicon Primer (volgorde vermeld in de 5' - 3' oriëntatie) Doel PCR-programma Verwachte grootte (bp)
IncFIB F: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC RepA 94 oC 5 min 683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 oC 1 min (30 cycli)
60 oC 30 s
IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG repA2 72 oC 1 min 262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 oC 5 min
IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA RNAI 139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabel 3: Primers en PCR-programma gebruikt om plasmiden p134797 en p101718 te classificeren door PCR-gebaseerde replicontypering29. 

Representative Results

Aangezien donoren SW4955 en SW7037 zijn gesequenced, wordt van deze twee donorstammen verwacht dat ze de resistentiefenotypen hebben die overeenkomen met het resistentiegenprofiel dat in hun genomische sequentie is geïdentificeerd. Plasmide p134797 (van SW4955) heeft genen die resistentie verlenen tegen cefalosporines van de derde generatie (blaCTX-M-55) en resistentie tegen aminoglycosiden (aac(3)-IIa en aadA1), fenicolen (catA2), tetracyclines (tet(A)), trimethoprim (dfrA14) en sulfonamiden (sul3); er werden geen antibioticaresistentiegenen gevonden in het SW4955-chromosoom. Plasmide p101718 (van SW7037) draagt slechts één antibioticaresistentiegen (bla CMY-2), waarvan wordt verwacht dat het resistentie verleent tegen cefalosporines van de derde generatie (blaCTX-M-55). Opnieuw werden geen antibioticaresistentiegenen gevonden in het SW7037-chromosoom.

Na de paring werd detectie verwacht van de overdracht van de twee conjugatieve plasmiden met alle bovengenoemde resistentiegenen. Positieve conjugatiedetectie houdt in dat de ontvangers die als transconjuganten zijn geïdentificeerd, de conjugatieve plasmiden moeten hebben verworven. De aanwezigheid van de diagnostische resistentiegenen voor de conjugatieve plasmiden in de transconjuganten (zoals gedetecteerd door PCR) werd ook verwacht.

Om de hier beschreven methoden te illustreren, werd het vermogen van twee E. coli-omgevingsisolaten om plasmide-DNA over te dragen door conjugatie getest . Een schematische weergave van de experimentele setting is weergegeven in figuur 1. Twee donoren (E. coli SW4955 en SW7037) en één ontvanger (E. coli LMB100) werden onafhankelijk van elkaar gedekt. De genkaart van conjugatieve plasmiden gevonden in E. coli SW4955 (p134797) en SW7037 (p101718) is weergegeven in figuur 2.

Conjugatieve plasmiden werden geselecteerd met carbenicilline en tegengeselecteerd met behulp van rifampicine en streptomycine, waarvan de resistentiedeterminanten zich in het chromosoom van de ontvanger bevinden. MacConkey-agar werd gebruikt om de lactosepositieve donoren (die grote, roze kolonies produceren) te onderscheiden van de ontvanger en transconjuganten (die lactosenegatief zijn en kleinere, lichtgele kolonies produceren) (figuur 3).

Figure 3
Figuur 3: Illustratie van de differentiële kleurmarkeringen voor donor- en ontvangerkolonies op MacConkey-agar. De kolonies die overeenkomen met donoren zijn roze op MacConkey-agar omdat ze lactosepositief zijn. Dit onderscheidt donor- van ontvangende kolonies, die lichtgeel en kleiner (lactosenegatief) zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De mobilisatie van het conjugatieve plasmide p134797 werd gedetecteerd, waarbij elk van de vijf antibiotica overeenkwam met de vijf verschillende klassen van resistentiegenen die in het plasmide werden aangetroffen.

Een voorbeeld van het berekenen van de conjugatie-efficiëntie (CE) voor stam SW4955 wordt gepresenteerd. Uit de test met stam SW4955 werd 172 kve transconjuganten geteld in de plaat vanaf verdunning 10-2; het aantal van de ontvanger uit de overeenkomstige verdunning (10-2) was 10.300.000 KVE/ml (tabel 4).

De CE wordt als volgt berekend:

CE = (174 CFU/ml)/(10.300.000 kve/ml)

CE= 1,67 x 10-5 transconjuganten/ontvanger

LMB100 Transconjuganten van stam SW4955 geselecteerd met Carbelicilline Efficiëntie van conjugatie
Verdunning KVE (aftelbare plaat) Ca. CFU / ml KVE (aftelbare plaat)
100 samenvloeiing 1,03E+09
10-1 samenvloeiing 1,03E+08
10-2 samenvloeiing 10300000 172 1,67 x 10-5 transconjuganten/ontvanger
10-3 samenvloeiing 1030000
10-4 samenvloeiing 103000
10-5 samenvloeiing 10300
10-6 samenvloeiing 1030
10-7 103 103
De waarden die worden gebruikt om de CE te berekenen, zijn vetgedrukt.

Tabel 4: Een voorbeeld van het berekenen van de conjugatie-efficiëntie (CE) voor stam SW4955.

De resultaten zijn weergegeven in tabel 5, uitgedrukt als conjugatie-efficiëntie per ontvanger. De vijf conjugatie-efficiënties verkregen met stam SW4955 als donor lagen allemaal binnen dezelfde orde van grootte. Deze resultaten geven aan dat de mobilisatie van het conjugatieve plasmide kan worden gedetecteerd, ongeacht de selectie die wordt gebruikt voor transconjugante identificatie.

Met behulp van de stam SW7037 als donor was de verkregen conjugatie-efficiëntie drie ordes van grootte lager; Deze resultaten maken het mogelijk om de conjugatie-efficiëntie van verschillende donoren en plasmidetypen met dezelfde ontvangers te vergelijken.

Efficiëntie van conjugatie
Zeven Carbenicilline (100 mg/L) Gentamicine (2 mg/l) Chlooramfenicol (25 mg/L) Tetracycline (10 mg/l) Trimethoprim (20 mg/l)
sw4955 1,67 x 10-5 5,67 x 10-5 2,17 x 10-5 7,62 x 10-5 1,36 x 10-5
sw7037 2,14 x 10-6

Tabel 5: Conjugatie-efficiëntie van E. coli-donorstammen SW4955 en SW7037, afhankelijk van het antibioticum dat voor selectie wordt gebruikt.

Bij transconjuganten werd de aanwezigheid van repliconen en alle resistentiegenen gecodeerd in twee geteste conjugatieve plasmiden, en hun overeenkomstige replicons, gecontroleerd door PCR. De voorwaarden die voor deze diagnostische PCR-reacties worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 3.

De diagnostische gels zijn weergegeven in figuur 4. Deze gels bevestigen de aanwezigheid van de verwachte repliconen in transconjuganten (IncFIC en IncFIB in p1347975 en IncI1 in p101718). Ze bevestigen ook de aanwezigheid van de verwachte antibioticaresistentiegenen, namelijk de bla CTX-M-55-groep (bèta-lactam), aac(3)-II en aadA (aminoglycoside), catA2 (fenicol), tet(A) (tetracycline), dfrA14 (trimethoprim) en sul3 (sulfonamide) voor p1347975 en blaCMY-2 voor p101718 (figuur 4).

Figure 4
Figuur 4: Diagnostische elektroforesegels. Gel-elektroforese van PCR-producten van antibioticaresistentiegenen en plasmide-repliconen gevonden in conjugatieve plasmiden p134797 en p101718 in de donorcellen (stammen SW4955 en SW7037, respectievelijk) en in de overeenkomstige LMB100-transconjuganten. Carbenicilline werd gebruikt voor plasmideselectie. Afkortingen. -: negatieve controle (DNA van stam LMB100 werd gebruikt als negatieve controle); D: donor; T: transconjugant. Verwachte amplicon maten: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; catA2 : 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; sul3: 799 bp; IncFIC (FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; blaCMY-2: 1.855 bp; IncI1-I: 139 bp. De gel heeft 1% agarose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Conjugatieve plasmiden bieden toegang tot een gemeenschappelijke pool van genen binnen een bepaalde omgevingsomgeving door recombinatie en horizontale genoverdracht34. Conjugatieve plasmiden zijn dus evolutionaire entiteiten die in staat zijn om functies te verwerven en te verlenen die bacteriën in staat stellen zich aan te passen aan meerdere omstandigheden (waaronder resistentie tegen antibiotica, resistentie tegen metalen, verwerving van metalen, biofilmvorming en pathogene genen, onder andere) binnen een temporele schaal van uren.

Dit werk presenteert een protocol voor de identificatie van conjugatieve plasmiden in bacteriën. Om het protocol te laten werken, moeten de gebruikte markers donor- en ontvangerstammen onderscheiden, zoals blijkt uit de besturingselementen in media A en B. Ze moeten ook effectief cellen selecteren die het plasmide dragen. De paringsreactie is van cruciaal belang. In deze reactie moeten donoren en ontvangers langdurig contact maken (via pili) om conjugatie te laten plaatsvinden. Alles wat het cel-tot-celcontact kan verstoren, zoals een onvoldoende incubatietijd of het schudden of roeren van de cultuur, vermindert dus de efficiëntie van conjugatie. De keuze van de ontvanger is ook van cruciaal belang, omdat sommige ontvangende stammen ongevoelig zijn voor conjugatie35,36. LMB100 wordt voorgesteld als de ontvanger van keuze, omdat het plasmiden van meerdere incompatibiliteitstypen kan nemen.

De conjugatiesnelheid is specifiek voor elk plasmide-donorchromosoompaar, ontvanger en omgevingsconditie. De conjugatie van specifieke plasmiden is gevoelig gebleken voor een groot aantal variabelen, waaronder groeifase, celdichtheid, donor-ontvangerverhouding, of conjugatie wordt uitgevoerd in vloeibare of vaste media, koolstof, zuurstof, galzouten, metaalconcentraties, aanwezigheid van zoogdiercellen, temperatuur, pH en paartijd13,14,15 . De studie van deze interacties hangt af van de initiële detectie van een conjugatief plasmide dat diepgaand moet worden bestudeerd. Het hier beschreven protocol kan dus ook worden aangepast om de impact van verschillende experimentele variabelen te onderzoeken, hoewel dit ten koste gaat van het beperken van het aantal gescreende donoren. Het kan ook mobiliseerbare plasmiden identificeren in gastheren met helperplasmiden (d.w.z. plasmiden die conjugatie mogelijk maken door functies te bieden die ontbreken in de mobiliseerbare plasmiden in trans6).

Het kennen van de volgorde van het conjugatieve plasmide wordt aanbevolen (maar niet nodig om conjugatie te detecteren, zoals hierboven besproken). Wanneer de donoren lactose-negatief zijn (het produceren van gele kolonies op MacConkey-agar), kan een lactose-positieve ontvanger (die roze kolonies produceert op MacConkey-agar) worden gebruikt om echte transconjuganten te onderscheiden van donorcellen die op de media kunnen groeien om transconjuganten te selecteren. Het hier beschreven protocol is ontworpen om conjugatieve plasmiden te detecteren van omgevings-, commensale en pathogene leden van de familie Enterobacteriaceae; Het kan echter worden gebruikt met elke bacteriesoort met een geschikte donor, ontvanger, antibioticum (en) en kleurmarkers. De identificatie van deze kritieke componenten in andere bacteriën vereist systematische studies met behulp van meerdere donoren, ontvangers en markers (antibiotica en kleuren). Dit protocol is niet getest op Gram-positieve bacteriën.

Verschillende varianten van de hier gepresenteerde methode zijn gemeld in de literatuur, onlangs besproken20. De kwalitatieve uitkomst kan ook op verschillende manieren worden genoemd (bijv. exconjugante frequentie en genoverdrachtsfrequentie), en dimensieloze eenheden kunnen worden gebruikt om conjugatie-efficiëntie te rapporteren (ml / CFU x h)20.

Het hier beschreven protocol lost verschillende beperkingen op die voorheen niet werden aangepakt door bestaande methoden16,18,19,20. Eerst is een geschikte ontvanger geïdentificeerd. Ten tweede minimaliseert het gebruik van twee antibiotica (rifampicine en streptomycine) om echte transconjuganten te selecteren de mogelijkheid dat donoren resistentie ontwikkelen tegen een van de antibiotica die worden gebruikt om transconjuganten te selecteren door spontane mutagenese. Valse transconjuganten kunnen ook het gevolg zijn van omstandersbescherming door hydrolyse van het antibioticum dat wordt gebruikt om transconjuganten te selecteren door enzymen (bijv. Bèta-lactamasen) die in grote hoeveelheden door de donor worden geproduceerd. Ten derde zijn verschillende experimentele controles opgenomen om ervoor te zorgen dat het product van de paring een echte transconjugant is (d.w.z. een ontvangende cel die stabiel het conjugatieve plasmide van de donor heeft opgenomen). Hier presenteerden we twee onafhankelijke methoden om de authenticiteit van de transconjuganten te testen, namelijk een colorimetrische marker in MacConkey-agar en PCR-detectie van de replicons en antibioticaresistentiegenen van het conjugatieve plasmide in de ontvanger. Ook is het hier beschreven protocol ontworpen om conjugatieve plasmiden te isoleren en te karakteriseren van omgevings-, commensale en pathogene leden van de familie Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella en andere soorten).

Om de mechanica van conjugatie te begrijpen, zijn experimentele waarnemingen gemodelleerd met behulp van computersimulaties. Deze voorspellende modellen schatten de frequentie van plasmideoverdracht voor bepaalde groeidichtheden van donoren, ontvangers en transconjuganten. Een model dat bekend staat als het eindpuntmodel vond drempels waarboven de snelheid van plasmideoverdracht in vloeibare cultuur en concludeerde dat de overdrachtssnelheid niet wordt beïnvloed door celdichtheid, donor-ontvangerverhouding en paartijd19. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is gebruikt als een alternatieve methode voor transconjugant plasmide detectie. FISH maakt plasmidevisualisatie mogelijk met behulp van fluorescentiemicroscopie door de hybridisatie van een DNA-sonde en een doel-DNA. Fish maakt dus de visuele detectie van plasmidestromen over verschillende celpopulatiesmogelijk 37, hoewel het niet hetzelfde niveau van gevoeligheid heeft als de hier gepresenteerde methode als transconjuganten worden gedetecteerd door visuele screening in plaats van selectie.

Er is een enorme behoefte om de biologie te begrijpen van conjugatieve plasmiden die antibioticaresistentiegenen verspreiden door verschillende componenten van het ecosysteem (kliniek, landbouw, riolering, dieren in het wild, huisdieren, bodems, rivieren en meren). Kortom, de vereenvoudigde experimentele omstandigheden die in de hier beschreven protocollen worden gepresenteerd, vergemakkelijken de screening van donoren op schaal en vormen dus een belangrijk hulpmiddel voor de studie van horizontale genoverdracht afkomstig van conjugatieve plasmiden uit verschillende bronnen. Ze kunnen worden gebruikt om de prevalentie van antibioticaresistentiegenen of andere klinisch relevante genen in conjugatieve plasmiden uit meerdere bronnen en bacteriën te onderzoeken. Ze kunnen ook worden aangepast voor de studie van conjugatie in vivo (bijvoorbeeld in de darm van gewervelde dieren) en om de omstandigheden te bestuderen die de efficiëntie van conjugatie moduleren. Al deze studies zullen sterk bijdragen aan het begrijpen hoe de mobilisatie van multiresistente conjugatieve plasmiden bijdraagt aan de verspreiding van multidrugresistentie.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

LM-B, IMG, AT en IS werden ondersteund door NIH-subsidie GM055246 toegekend aan LM-B. GC-C ontving de UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship voor twee opeenvolgende jaren: AY 2017-18 en 2018-19. We bedanken studenten Sage Chavez en Pepper St. Clair van het door de Genentech-Foundation gesponsorde mentorprogramma van het Academic Inspiration Network (GAIN) enorm voor hun technische ondersteuning bij experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 22-313630 It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials Corning 430659 It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes FALCON 149597 It can be replaced for another brand
14 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 8850 It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder New England Biolabs N0552G 
250 mL sterile flasks  PYREX 5320 It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid Fisher Scientific A38SI-212 It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) Fisher Scientific BP160-500 It can be replaced for another brand
Carbenicillin GOLD BIOTECHNOLOGY C-103-50 It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL Fisherbrand 22-363-595 It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x  New England Biolabs B7024S It can be replaced for another brand
EDTA Fisher Scientific BP119-500 It can be replaced for another brand
Electronic digital scale Denver Instrument APX-2001 It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL Eppendorf 14-282-302 It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis Fisher Scientific FP300 It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers Sharpie 37001; 37002; 37003 It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo) Analytakjena SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 It can be replaced for another brand
Gloves X-GEN 44-100M Any nitrile gloves brand works
Ice bucket Thermo Fisher Scientific 432128 It can be replaced for another brand
MacConkey agar  BD DIFCO 212123
Master Mix  BioLabs M0496S  It can be replaced for another brand
Methanol Fisher Scientific A452-4 It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL Fisherbrand 05-408-138 It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar BD DIFCO DF0479-17-3
Mueller Hinton broth BD DIFCO 275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL 740588. 250
PCR tube racks AXYGEN   R96PCRFSP It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL) AXYGEN  PCR-02-C It can be replaced for another brand
Rifampicin Fisher Scientific 50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) RAININ 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride Fisher Scientific S671-3 It can be replaced for another brand
Spectrophotometer Thermo Scientific 335905P It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL  Eclipse 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 It can be replaced for another brand
Streptomycin Fisher Scientific BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain  Thermo Fisher Scientific S33102
Taq DNA Polymerase BioLabs M0273S
Thermal cycler C1000 Touch  Bio-Rad 1851196 It can be replaced for another brand
Tris  Fisher Scientific BP153-500 It can be replaced for another brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
  2. de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
  3. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
  4. Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
  5. Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
  6. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  7. Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
  8. San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
  9. Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
  10. Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
  11. Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
  12. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  13. Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
  14. Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
  15. Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
  16. Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
  17. Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
  18. Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
  19. Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
  20. Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
  21. Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).
  22. NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022).
  23. Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
  24. Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
  25. Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
  26. Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
  27. Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
  28. Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
  29. Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
  31. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
  32. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
  33. Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
  34. Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
  35. Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
  36. Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
  37. Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).

Tags

Genetica Experimentele evolutie horizontale genoverdracht conjugatieve plasmiden antibioticaresistentie Escherichia coli
Detectie van horizontale genoverdracht gemedieerd door natuurlijke conjugatieve plasmiden in <em>E. coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mota-Bravo, L., Camps, M.,… More

Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter