Summary
På grund af sin alsidige anvendelse som modelart inden for forskellige fagområder er der behov for et genetisk transformationsværktøjssæt i smalbladet plantain (Plantago lanceolata). Her præsenteres ved hjælp af Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation en protokol, der resulterer i stabile transgene linjer med en transformationseffektivitet på 20%.
Abstract
Arter i slægten Plantago har flere unikke træk, der har ført til, at de er tilpasset som modelplanter inden for forskellige fagområder. Manglen på et genetisk manipulationssystem forhindrer imidlertid en grundig undersøgelse af genfunktionen, hvilket begrænser alsidigheden af denne slægt som model. Her præsenteres en transformationsprotokol for Plantago lanceolata, den mest almindeligt studerede Plantago-art. Ved anvendelse af Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation blev 3 uger gamle rødder af aseptisk dyrkede P. lanceolata-planter inficeret med bakterier, inkuberet i 2-3 dage og derefter overført til et skudinduktionsmedium med passende antibiotikavalg. Skud opstod typisk fra mediet efter 1 måned, og rødder udviklede sig 1-4 uger efter, at skuddene blev overført til rodinduktionsmediet. Planterne blev derefter akklimatiseret til et jordmiljø og testet for tilstedeværelsen af et transgen ved hjælp af β-glucuronidase (GUS) reporter-assay. Transformationseffektiviteten af den nuværende metode er ~ 20%, med to transgene planter, der dukker op pr. 10 rodvæv transformeret. Etablering af en transformationsprotokol for smalbladet plantain vil lette vedtagelsen af denne plante som en ny modelart i forskellige områder.
Introduction
Konceptet med at bruge modelarter til at undersøge flere aspekter af plantebiologi opstod med den udbredte anvendelse af Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis blev oprindeligt valgt, fordi den deler funktioner med mange andre blomstrende planter og har flere træk, der gør det praktisk at studere i et laboratoriemiljø, såsom at være lille og have en kort generationscyklus. Den store mængde forskningsartikler, der er offentliggjort med det som emne, sammen med dets lille genomstørrelse og lette genetiske transformation2, gør det muligt for det at fortsætte som en udbredt eksperimentel organisme. Arabidopsis kan dog begrænses som model for arter med forskellige egenskaber eller unikke træk3. Dette har ført til udviklingen af nye modelsystemer, såsom majs (Zea mays), en vigtig plante for udviklingsgenetik i monocots4, og tomat (Solanum lycopersicum), som er en vigtig model for evolutionære undersøgelser, frugtudvikling og produktion, og er en god repræsentation for vegetabilske afgrøder5. En metode til genetisk transformation er en forudsætning for, at en planteart kan fungere som modelorganisme2. En Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation er et pålideligt værktøj inden for plantebiologi; det er blevet brugt til at omdanne nogle få modelarter og større afgrøder, herunder tobak (Nicotiana tabacum)6, ris (Oryza sativa)7, bomuld (Gossypium hirsutum)8, sojabønne (Glycine max)9, kartoffel (Solanum tuberosum)10 og raps (Brassica napus)11. Plantearter er meget variable i, hvor godt de reagerer på A. tumefaciens-infektion, og transformationsprotokoller skal ofte skræddersys individuelt til hver art 6,12.
Slægten Plantago omfatter i alt 256 plantearter, bredt fordelt over hele verden13. Arterne i denne slægt har ofte unikke egenskaber, der gør dem ønskelige som modelarter til undersøgelse af genetik, økologi, stressfysiologi, sekundære metabolitter, medicinalkemi, plante-mikrobe-interaktioner, planteudvikling og evolution. Plantago lanceolata , også kaldet smalbladet eller ribwort plantain, har været en populær plante af interesse siden det 19.århundrede , da den først blev brugt til at beskrive fænomenet mandlig sterilitet14. Ligesom andre planter af sin slægt er den blevet brugt i undersøgelser på tværs af forskellige forskningsområder. For nylig er det blevet foreslået som en model for vaskulær biologi, da dets vaskulære væv let kan indsamles15. P. lanceolata er den mest almindeligt undersøgte art i slægten Plantago; en artikel fra 2021 rapporterede, at der var >1,400 publikationer, herunder eller relateret til denne art på det tidspunkt16, og yderligere 102 artikler er blevet offentliggjort siden begyndelsen af 2022, ifølge en PubMed-søgning foretaget den 9.december th 2022. Den næstmest undersøgte plante i slægten, P. major , er kun genstand for 414 artikler, når den søges efter de samme kriterier på samme dato.
På trods af forskningsinteressen i P. lanceolata er undersøgelser, især af karakterisering af genfunktion, ofte begrænset af manglen på et genetisk manipulationsværktøjssæt til arten. Pommerrienig et al. gjorde en indsats for at udvikle en transformationsprotokol for P. major ved hjælp af en blomsterdypteknik17. Denne metode kan imidlertid ikke anvendes på P. lanceolata på grund af den mandlige sterilitet, der er karakteristisk for denne art18,19. Så vidt vi ved, er der ingen eksisterende protokol til transformation af P. lanceolata.
Denne undersøgelse præsenterer en simpel protokol for A. tumefaciens-medieret transformation af P. lanceolata. Ved at målrette rodvæv kan fuldt voksne transgene planter genereres inden for 3 måneder efter transformation.
Protocol
BEMÆRK: Trin 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 og 6.1-6.3 skal udføres under aseptiske forhold ved hjælp af en ren hætte for at forhindre kontaminering.
1. Formering af plantemateriale med henblik på omdannelse
- Placer kommercielt tilgængelige vildtype (WT) Plantago lanceolata frø (se materialetabel) i et 50 ml centrifugerør op til 5 ml linjen, afhængigt af antallet af ønskede planter.
BEMÆRK: Alternativt kan et 2 ml mikrocentrifugerør bruges, når der er behov for et lille antal frø, men det skal fyldes til et volumen, der ikke er større end 0,1 ml, da for mange frø kan reducere effektiviteten af sterilisering. - Dyp frøene i 75% ethanol i 60 s.
- Kassér ethanolen, nedsænk derefter frøene i 20% natriumhypochlorit (20% NaClO, 80% sterilt vand) i 40 min, vend forsigtigt røret, så alle frøene kommer i kontakt med opløsningen.
BEMÆRK: Natriumhypochloritopløsningen skal være frisklavet for optimale resultater. - Kassér natriumhypochloritopløsningen under en laminær strømningshætte, vask derefter frøene med destilleret vand (fem gange). Tilsæt en lille mængde vand til frøene efter den sidste skylning, da dette kan hjælpe med at hjælpe planternes bevægelse på plader.
- Brug steriliserede tang til at overføre frøene til forberedte 95 mm x 100 mm petriskåle med fast MS-medium (tabel 1). Frøene spredes jævnt over pladens overflade med ca. 1 cm mellem hvert frø for at forhindre overfyldning af de spirede frøplanter (figur 1A) .
- Pladerne forsegles med to lag paraffinfilm for at forhindre kontaminering, og inkuberes derefter under et køligt hvidt vækstlys (se materialetabellen) ved stuetemperatur (22 °C med 50 μmol m-2 s-1, 12 timer dage). Frøene spirer typisk inden for 5-6 dage.
- Når frøplanterne er spiret og er store nok til at overføre (figur 1B), typisk 2 eller 3 dage efter spiring, skal du bruge steriliseret tang til at overføre frøplanterne til sterile kasser med 50-100 ml MS-medium (tabel 1). Ideelt set plant kun fem frøplanter pr. Kasse for at opnå rødder af bedste kvalitet.
- Forsegl kasserne med kirurgisk tape, og lad derefter planterne vokse under et køligt hvidt vækstlys (se materialetabellen) under de samme forhold, der er nævnt i trin 1.6. Planterne skal være klar til transformation om cirka 3-4 uger, eller når hovedrødderne er vokset ca. 2 cm i længden, og siderødderne ser hvide ud.
BEMÆRK: Opskrifter på mellemtilberedning og vitaminlagre er inkluderet i tabel 1 og tabel 2.
2. Plasmidkonstruktion og E. Coli-transformation
BEMÆRK: Den nøjagtige plasmidkonstruktionsprocedure varierer afhængigt af genet af interesse. I denne procedure blev restriktionsenzymerne HindIII og SalII anvendt til at indsætte 1,5 kb AtPP2-promotoren i det binære plasmid pBI101 (se materialetabel) med GUS ved anvendelse af standardkloningsproceduren20. AtPP2 (floemprotein 2) er et gen, der specifikt udtrykkes i floem21.
- Klon promotoren ved hjælp af primerpar 5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3' (Forward) og 5'-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGATATTTATTTTTTTG-3' (Reverse) fra Arabidopsis. Figur 2 viser et diagram over den binære plasmidvektor med AtPP2:GUS-indsatsen .
- Efter plasmidkonstruktion omdannes plasmiderne til DH5a E. coli (se materialetabellen) kompetente celler ved hjælp af varmechokmetode22 og inkuberes derefter i 1,5 time ved 37 °C under omrystning (150 omdr./min.).
- Der udtages 150 μL af hver transformationskultur, pladen på LB-agarmedieplader (tabel 1) med passende valg (50 mg/l kanamycin for den stamme, der anvendes i denne protokol; se materialetabellen), og pladerne inkuberes derefter i 16-24 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Den bakteriestamme, der anvendes i denne undersøgelse, er A. tumefaciens GV3101. - Brug derefter koloni PCR til at screene kolonierne for positive rekombinanter23.
BEMÆRK: I denne protokol blev følgende primere brugt til at forstærke det målrettede gen; 5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3'(fremad) og 5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3' (baglæns).- Reaktionen køres i en termocyklisk maskine (se materialetabellen) med cykelbetingelser på 3 minutter ved 95 °C, efterfulgt af 35 cyklusser med: 30 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C, 2 minutter ved 72 °C og et sidste 10 minutters forlængelsestrin ved 72 °C.
- Pod de positive kolonier i 6 ml LB bouillon (tabel 1) med det relevante antibiotikum (50 mg / L kanamycin) og voks ved 37 ° C natten over ved 200-250 o / min.
- Efter vækst natten over ekstraheres plasmiderne fra bakterierne ved hjælp af standardprocedurer24.
3. A. tumefaciens transformation med plasmid
- Efter plasmidekstraktion skal du bruge elektroporation til at omdanne det modificerede plasmid til den ønskede stamme af kompetente celler. I denne procedure blev A. tumefaciens stamme GV3101 anvendt. Følg standardiserede metoder til elektroporationsteknikker25.
- Efter elektroporation resuspenderes de kompetente celler i 1 ml LB bouillon og inkuberes derefter i 2-4 timer ved 28 °C ved 100 omdr./min.
- Cellerne opsamles ved centrifugering ved 6.800 x g i 3 minutter i en bordmikrocentrifuge (se materialetabellen) ved stuetemperatur (22 °C), og spred derefter 50-100 μL på en LB-agarplade med et passende selektionsmiddel (50 mg/l kanamycin for plasmidet anvendt i denne protokol).
- Når cellerne har inkuberet i 2 dage ved 28 °C, identificeres positive kolonier, der indeholder det relevante gen ved anvendelse af koloni-PCR. I denne protokol skal du bruge de primere og betingelser, der er nævnt i trin 2.4.
- Brug derefter de positive kolonier til at stribe en lagerplade med LB agar media + valg. Pladen kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- Alternativt, til langtidsopbevaring, podes en positiv koloni med et lille volumen LB med passende udvælgelse. Den podede kultur rystes natten over ved 28 °C ved 200 omdr./min., og derefter tilberedes en glycerolstamme (50 % w/v glycerol i en 50:50 blanding af bakterier og glycerol), som kan opbevares ved -80 °C i op til 10 år.
4. A. tumefaciens forberedelse
- Stribe A. tumefaciens indeholdende det ønskede plasmid på forberedte 95 mm x 100 mm faste LB-plader med det passende selektionsmiddel. I denne protokol blev bakteriestammen GV3101 med plasmidindsatsen AtPP2:GUS anvendt, med 50 mg/L kanamycin tilsat til udvælgelsen.
- Pladerne forsegles med paraffinfilm, og de inkuberes derefter ved 28 °C i op til 48 timer, eller indtil bakterierne vokser sig store nok til at plukke.
- Brug en pipettespids til at vælge en bakteriekoloni 2 dage før transformation, og pod den i et 15 ml rundbundet rør indeholdende 6 ml flydende LB med passende valg. Ryst ved 200 o/min i en 28 °C bordryster natten over, indtil OD600 når 0,6-0,7.
BEMÆRK: Plader og 6 ml bakteriepodning kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned. - Når bakterierne når den korrekte OD 600, anvendes en pipette til at overføre A. tumefaciens til en steril kolbe indeholdende100 ml flydende LB med et selektionsmiddel. Typisk er 200 μL bakterier pr. 100 ml LB egnet til formering. Omrystes ved 200 o/min ved 28 °C natten over, indtil OD600 når 0,6-0,7.
- Overfør bakterierne til 50 ml sterile centrifugeglas, og centrifuger ved 2.200 xg i 10 minutter ved stuetemperatur (22 °C) i en bordcentrifuge for at opsamle bakterierne.
- Supernatanten kasseres med en pipette. Bakteriepelletsen resuspenderes i 5 ml flydende suspensionsopløsning (SS) ved stuetemperatur (22 °C) (tabel 1) ved pipettering, tilsæt derefter op til 50 ml SS og inverter flere gange for at blande. Bakterierne er nu klar til transformation.
BEMÆRK: Den flydende SS skal tilberedes frisk inden for 1 uge efter transformation.
FORSIGTIG: Alt materiale, der kommer i kontakt med A. tumefaciens , skal kasseres i en biohazard affaldsspand. Resterende væsker fra bakteriekulturer kan steriliseres med natriumhypochlorit (blegemiddel) i en koncentration på 20% eller højere.
5. Transformation af Plantago rødder
- Når planterne når det ideelle stadium til transformation (frøplanter er 3 uger gamle) (figur 1C), skal du bruge sterile tang og saks til at adskille rødderne fra resten af planten (figur 3A). Kassér blad- og stammematerialet.
- Umiddelbart efter skæring overføres rodstykkerne til sterile kasser indeholdende sterilt vand ved hjælp af sterile tang. Dette trin gør det muligt for rødderne at forblive hydreret, mens alt væv opsamles.
- Når alle rødderne er skåret, hældes A. tumefaciens/SS suspensionen i sterile 150 mm x 15 mm engangs petriskåle. Overfør rødderne til A. tumefaciens-kulturen og pod i mindst 20 minutter (figur 3B).
- Under inkubation skal du bruge en steril skalpel med et skarpt blad til at skære rødderne i 1 cm fragmenter, der adskiller de primære rødder fra laterale rødder. Lav tynde, overfladiske snit på overfladen af rødderne for at give bakterierne mulighed for at inficere planten.
BEMÆRK: Hvis du beskæftiger dig med et stort antal planter, skal du overføre rodstykkerne til bakteriekulturen i partier for at sikre, at alle rødderne nedsænkes under podning. - Efter inkubation skal du bruge de sterile tang til at overføre rodstykkerne til sterile papirhåndklæder for at fjerne overskydende bakterier. Undgå at tørre rødderne i mere end 60 s, da dette kan forårsage dehydrering og beskadige rodvævet. Ideelt set kan 10-15 rødder tørres samtidigt (figur 3C).
- Overfør de tørrede rødder til tilberedte 95 mm x 15 mm petriskåle med faste samkulturmedier (tabel 1), ca. 10-20 rødder pr. tallerken, afhængigt af røddernes størrelse (figur 3D).
- Forsegl pladerne med to lag gennemsigtig plastfilm, og dæk derefter med aluminiumsfolie. Der inkuberes ved stuetemperatur (22 °C) i 3 dage. Dette trin giver bakterierne tid til at inficere rødderne uden tilstedeværelse af et antibiotikumvalg (figur 3E).
6. Udvælgelse og regenerering af hele anlægget
- Efter inkubation i samkulturmedier overføres rodstykkerne til tilberedte 95 mm x 15 mm petriskåle med faste induktionsmedier (SIM) (tabel 1) med Timentin (500 mg/l; se materialetabel) og passende antibiotikavalg. I denne protokol brugte vi kanamycin (100 mg / L).
BEMÆRK: Bunden af rødderne skal komme i fuldstændig kontakt med mediet. Rødder, der ikke berører mediets overflade, er for lange og skal skæres for at forhindre vævet i at undslippe selektion. - Forsegl pladerne med to lag gennemsigtig plastfilm, og voks derefter under et vækstlys i 1 måned (se trin 1.6 for passende forhold), eller indtil skuddene begynder at dukke op.
OBS: Typisk kan skudinitialer observeres efter 2 ugers vækst, og skuddene er typisk synlige efter 1 måned. - Når planterne er 1,5-2,0 cm lange (figur 1D), overføres de til forberedte sterile kasser med faste rodinduktionsmedier (tabel 1).
- Dyrk planterne under et vækstlys (se trin 1.6 for betingelser) i flere uger, indtil rødderne dannes. Rødder kan typisk først ses efter 1 uge.
BEMÆRK: Det anbefales at lade rødderne vokse i flere uger, før de flyttes til jorden, da planter med større rodsystemer har tendens til at have en højere overlevelsesrate i jorden.
7. Overførsel af jord
- Når rodsystemerne er blevet store nok til at overføre (figur 1E), typisk efter 1 måneds vækst, overføres planterne til 3,5 i firkantede potter, der indeholder forvædet jord til alle formål (BM7). I denne protokol blev BM7 barkblanding anvendt (se materialetabel).
- Fjern ethvert medium, der klæber til rødderne ved at vaske dem forsigtigt i vand.
BEMÆRK: Planterne kan dyrkes til modenhed i et drivhus ved 800 til 1400 μmol fotoner m-2 s-2 ved hjælp af 600 W højnatriumtrykslys (se materialetabel) eller i et vækstkammer ved stuetemperatur (22 ° C) med kølige hvide lys ved 50 μmol m-2 s-1, 12 timer dage.
- Fjern ethvert medium, der klæber til rødderne ved at vaske dem forsigtigt i vand.
- Dæk planterne med et plastikpottedæksel, og dæk dem derefter med en klar plastpose. Dette trin gør det muligt for planterne at forblive i et fugtigt miljø, når de tilpasser sig jorden.
- Efter ca. 3-5 dage skal du fjerne plastikposen og derefter langsomt fjerne låget for at tillade akklimatisering til det ydre miljø.
BEMÆRK: Afhængigt af årstiden og det miljø, som planterne overføres til, kan den tid, planterne skal tilpasse sig, variere. Det anbefales at kontrollere planterne dagligt og tilføje vand til potterne efter behov. - Vand planterne regelmæssigt og tilsæt gødning efter behov. Planter kan også overføres til større potter for yderligere vækst (figur 1F).
8. β-glucuronidase (GUS) histokemisk farvning
- Forbered β-glucuronidase (GUS) farvningsopløsning i henhold til offentliggjorte protokoller15.
- Når skudinitialerne er ca. 0,5-1 cm lange, skal du fjerne en lille spids af et ungt, fuldt udvidet blad (<5 mm i længden er normalt tilstrækkeligt) og straks overføre til 0,5-1 ml GUS-farvningsopløsning i et 1,5 eller 2 ml mikrocentrifugerør. Opløsningen skal fuldt ud dække plantevævet.
- Anbring de åbnede rør i en vakuumekssikkator og vakuum ved 20-25 kPa i 5-10 min. Små bobler skal være synlige i opløsningen under vakuumproceduren. Dette gør det muligt for opløsningen at komme ind i plantens celler.
- Lad luften filtrere tilbage i vakuumekssikkatoren. Glassene lukkes og inkuberes ved 37 °C natten over (12 timer), eller indtil den blå farve er synlig.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev GUS-aktivitet lokaliseret til floem, hvilket betyder, at i positivt transformerede planter bør blå farvning kun være synlig i floemvævet. Planter uden transgenet oplever ikke farvning (figur 4). - For bedre at visualisere pletten skal du overføre planterne til 100% ethanol for at fjerne klorofyl. For at øge effektiviteten af klorofylfjernelsesprocessen inkuberes rørene ved 60 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Ethanolen skal muligvis ændres flere gange, før al klorofyl fjernes, afhængigt af størrelsen på bladet, der farves.
Representative Results
En simpel protokol rapporteres her til opnåelse af transgene P. lanceolata-planter ved anvendelse af A. tumefaciens-medieret transformation. Reportergenet GUS (kodende β-glucuronidase) transformeres, drevet af den floem-udtrykte promotor af AtPP2, til 3 uger gamle P. lanceolata-rødder gennem A. tumefaciens-stammen GV3101 (figur 2). En floem-specifik promotor blev valgt, fordi vores hovedinteresse var at etablere et system til funktionel genomik af plantevaskulært væv, især floem. Metoden blev testet på rod-, blad- og petiolevæv i det indledende forsøg. Selvom callus kunne induceres i alle vævstyper, var det kun rodvævet, der producerede skudinitialer (figur 5A) efter 1 måned i SIM; bladet og petiole blev brune og døde (figur 5B). Dette førte til den konklusion, at rodvæv var den optimale vævstype til brug i transformationsmetoden. Rødderne blev inkuberet i de tilberedte bakterier resuspenderet i suspensionsopløsning (SS) (tabel 1) i mindst 20 minutter og derefter inkuberet ved stuetemperatur på faste SS-plader i op til 3 dage i mørke (figur 3E). Rødderne blev derefter overført til skudinduktionsmediet (SIM) og holdt under et vækstlys under de betingelser, der er angivet i protokollen (trin 1.6). Figur 1 og figur 3 viser repræsentative billeder af hvert trin i protokollen som reference.
Figur 6 viser progressionen af skudinitialer, der kommer ud af transformeret væv, fra den første dag, rødderne blev placeret på SIM-kortet (figur 6A), til da skuddene var klar til at blive rodfæstet (figur 6D). Efter 1 uge dannede rodvævet callus (figur 6B), og begyndelsen af skudinitialer kunne observeres (figur 6B1). Skud fortsatte med at dukke op i uge 2 og 3 (figur 6C), og efter 4 uger var skuddene klar til at blive overført til rodinduktionsmediet (figur 6D).
Identifikation af de formodede transgene planter blev udført ved hjælp af β-glucuronidase (GUS) histokemisk assay ved hjælp af bladsegmenter taget, når skuddene var omkring 0,5 cm lange. Positive transgene planter viste det forventede farvningsmønster i floemlokaliseret væv, vist i figur 4. Positive GUS-farvede skud blev overført til rodinduktionsmediet, hvor de udviklede robuste rodsystemer efter 4 uger (figur 1E). Rotede planter blev derefter overført til jorden. Figur 4 viser resultatet af farvning i en smalbladet plantain transformeret med AtPP2-promotoren og β-glucuronidase (GUS) genet sammen med en vildtype og en smalbladet plantain transformeret med AtPP2-promotoren til sammenligning. Alle skud, der opstod, blev bekræftet som transgene. Transformationseffektiviteten blev bestemt til at være et gennemsnit på 20%, med ca. to skud, der opstod for hver 10 rødder, der blev transformeret. Bekræftede transgene planter blev overført til større potter og dyrket i 4-8 uger, indtil de nåede voksenstadiet (figur 1F).
Figur 1: Tidslinje for Plantago lanceolata transformation. Repræsentative billeder af hvert trin i protokollen. A) Ikke-erminerede frø belagt på en MS-plade. (B) Frø spiret efter 1 uge, klar til at blive overført til magenta kasser. C) Planter i MS-kasser efter 3 ugers vækst. Rødder er grønne og sunde, på det ideelle stadium for transformation. (D) Skud i skudinduktionsmedier efter 4 uger er klar til at blive overført til rodmediet. På dette stadium kan β-glucuronidase (GUS) histokemisk farvning udføres, hvis det er relevant. (E) Planter i kasser med rodinduktionsmedier, hvor rødder er dannet efter 4 ugers vækst. (F) Transgene planter dyrkes til fuld længde efter 4 ugers vækst i jorden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Diagram over det binære vektorplasmid pBI101 + β-glucuronidase (GUS) med den indsatte floemspecifikke promotor AtPP2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Trin af transformation. Repræsentative billeder af hvert trin i transformationen. (A) Adskillelse af rødder fra skud under transformation. (B) Iblødsætning af rødder i bakterier/SS-suspension. (C) Tørring af rødder på køkkenrulle for at fjerne overskydende bakterier. (D) Rødder belagt på co-kultur medium. E) SS-plader indpakket i aluminiumsfolie. Planter blev inkuberet i 2-3 dage, før de blev overført til skydemediet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: GUS-farvning. β-glucuronidase (GUS) farvningsresultater af smalbladede plantain bladsegmenter. (A) Vildtype. (B) Smalbladet plantain transformeret med plasmidet, der huser AtPP2-promotoren (tom vektor). (C) Smalbladet plantain transformeret med plasmidet, der huser AtPP2-promotoren og β-glucuronidase (GUS) genet. Hvert blad blev farvet ved hjælp af GUS histokemiske farvningsprotokol og derefter afbildet med et mikroskopisk kamera. Billeder (B) og (C) viser intet farvningsmønster på grund af fraværet af GUS-genet. Det højre billede viser et klart blåt farvningsmønster i venerne, hvilket bekræfter, at planterne er transgene. Stangen repræsenterer 1 mm, hvor hvert bladsegment måler ca. 1 cm i længden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af transformationseffektiviteten af forskellige vævstyper efter >1 måneds inkubation på skydemedier . (A) Rodvæv efter mere end 1 måneds vækst. Rødder har oplevet udvidet callus, og skudinitialer er dukket op. Ikke-transformeret callus er begyndt at dø som reaktion på antibiotikavalg. (B) Blad- og petiolevæv efter mere end 1 måneds vækst. Væv oplevede en vis callus ekspansion, men døde snart som reaktion på antibiotika. Ingen skud opstod fra begge væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Fremkomst af callus og skud på transformeret væv. Repræsentative billeder af væv placeret på skudmedium efter forskellige inkubationslængder. (A) Rodvæv lige efter at være blevet belagt på skydemediet. (B) Rodvæv efter 1 uge på skydemedium. Callus ekspansion kan observeres, og (B1) de første skudinitialer er begyndt at dukke op. (C) Rodvæv efter 3 uger på skudmedium. Flere skudinitialer er dukket op. (C1) Skuddet, der opstod fra B1-skydeinitialen. (D) Rodvæv efter 4 ugers inkubation. Ikke-transformeret væv er begyndt at blive sort / brunt og dø, og nye skud fortsætter med at vokse. På dette stadium er skud klar til at blive flyttet til rodmediet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Opskrifter til medieforberedelse. En beskrivelse af, hvordan man forbereder medier til transformation. Mængden af tilsatte vitaminer beregnes ud fra den angivne stamopløsningskoncentration. Se tabel 2 vedrørende tilberedning af stamopløsning. For alle medier tilsættes reagenser til 900 ml dobbeltdestilleret H2O, pH til det angivne niveau, og tilsæt derefter vand til et slutvolumen på 1.000 ml. * = tilsættes efter sterilisering. ** = pH med 1 M KOH. = pH med 1 M NaOH. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Vitaminlagre for Plantago-medier . Alle vitaminer skal filtreres, steriliseres og mærkes nøjagtigt inden opbevaring. Hvor det er angivet, opløses pulverne først i 1 N NaOH og fyldes derefter op til det ønskede rumfang med dobbeltdestilleret H2O. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Manglen på en transformationsprotokol for planter i slægten Plantago begrænser brugen af disse planter som modeller, især når forskere er interesserede i at udforske genfunktioner. P. lanceolata blev valgt til at udvikle en genetisk transformationsprotokol, fordi det er den mest almindeligt undersøgte plante i sin slægt16. Den protokol, der er udviklet, vil sandsynligvis blive brugt som et værktøj til yderligere at fremme undersøgelser relateret til vaskulær biologi, økologi, plante-insektinteraktioner og abiotisk stressfysiologi.
Den præsenterede protokol skitserer klart trin, der giver en bruger mulighed for at opnå transgene planter. Ud over P. lanceolatas evne til at trives i et vævskulturmiljø bidrog flere faktorer til succesen med vores transformationsmetode. For det første blev vigtigheden af at anvende sterilt planterodvæv af høj kvalitet til transformation observeret. Rødder havde de højeste transformationshastigheder, når de blev taget fra 3-4 uger gamle planter og fremstod grønne eller lysehvide. Rødder taget fra kasser med en hvilken som helst mængde bakteriel eller svampeforurening resulterede ofte i forurenede skydekulturer, og ældre rødder, der syntes brune, resulterede ikke i vellykket transformation. Rodvæv var den mest effektive vævstype til transformation ved hjælp af den nuværende metode, da blad- og petiolevæv ikke havde succes med at udvikle skud.
En anden vigtig observation var, at den optimale metode til indsamling af rodvæv til transformation var at placere friskskåret rodmateriale i sterilt vand. Dette trin tillod effektivt rodmateriale at forblive hydreret, mens resten af vævet blev opsamlet, da rødder har tendens til at tørre hurtigt ud, når de fjernes fra deres vækstbeholdere. Dette trin bidrog også til at øge succesraten for transformationen, fordi det tillod flere rødder at blive inkuberet i bakterierne ad gangen.
Denne protokol kan ændres ved at reducere den tid, hvor rodvævet inkuberer i cokulturmediet til 2 dage. Det blev observeret, at en 2 eller 3 dages inkubationstid er tilstrækkelig til at tillade infektion, der resulterer i skudinitialer. Imidlertid anbefales længere inkubationstider ikke, da det blev observeret, at fraværet af en antibiotikahæmmer i medierne ofte resulterer i A. tumefaciens overvækst, som kan dræbe det nye væv.
En begrænsning ved denne undersøgelse er manglen på tilgængelige data om ydeevnen af andre metoder eller arter af A. tumefaciens i P. lanceolata transformation til sammenligning. Så vidt vi ved, er denne protokol ny. Under de indledende forsøg blev der konstateret en høj transformationseffektivitet med A. tumefaciens GV3101, og vi fokuserede på at forfine teknikken ved hjælp af denne stamme i stedet for at eksperimentere med andre stammer. Vores transformationseffektivitet på 20% er relativt høj for plantetransformation - mange konventionelle metoder anser alt >1% for at være vellykket26,27,28. Brug af en anden stamme af A. tumefaciens, såsom A. rhizogenes, kendt for dets anvendelse i rodtransformation i flere arter 29,30,31, kan imidlertid resultere i en endnu højere succesrate. Yderligere eksperimenter ville være nødvendige for at vurdere virkningen af at bruge andre stammer til at fremme øget transformationseffektivitet i P. lanceolata.
Den vellykkede transformation af P. lanceolata vil sandsynligvis gavne mange fagområder. Den høje transformationseffektivitet og den hurtige vækst af planten i vævskulturmedier gør P. lanceolata til en mulig kandidat til genfunktionsundersøgelser15.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 til C.Z. og Y.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
| 1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
| 3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
| 600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
| Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
| Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
| Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
| Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
| D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
| ddH2O | |||
| DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
| Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
| Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
| Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
| Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
| Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
| Glycine | Sigma | 241261 | |
| Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
| Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
| Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
| Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
| Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
| Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
| Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
| Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
| Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
| Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
| Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
| Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
| Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
| Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
| Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
| myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
| Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
| Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
| Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
| Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
| Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
| Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
| Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
| Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
| Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
| Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
| Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
| trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
| Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
| Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
| Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |
References
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. Brachypodium distachyon. Agrobacterium Protocols. , Springer. New York, NY. 17-33 (2015).
- Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Field guide to plant model systems. Cell. 167 (2), 325-339 (2016).
- Müller, B., Grossniklaus, U.
- Ding, X., et al. Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato. Molecules. 27 (1), 317 (2022).
- Niedbała, G., Niazian, M., Sabbatini, P. Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies. Frontiers in Plant Science. 12, 695110 (2021).
- Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting. , (2022).
- Zhang, B. Agrobacterium-mediated transformation of cotton. Transgenic Cotton. , Humana Press. Totowa, NJ. 31-45 (2013).
- Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L). Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).
- Bakhsh, A. Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars. Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).
- Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus). Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).
- Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L.
- Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia. Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).
- Coleman, N.
- Huang, J., et al. Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses. Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).
- Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients. The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).
- Pommerrenig, B., et al. Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method. Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).
- Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata. Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).
- Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata. G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).
- Bloch, K. D., Grossmann, B. Digestion of DNA with restriction endonucleases. Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).
- Du, C., et al. Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber. International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).
- Deshmukh, S. 22, Kulkarni, R., Bose, K. Transformation and protein expression. Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins. , Springer. Singapore. 83-114 (2022).
- Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, Academic Press. 299-309 (2013).
- Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum. BMC Genomics. 14, 6 (2013).
- Dong, Z., et al. Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation. Parasites & Vectors. 15 (1), 141 (2022).
- Li, S., et al.
- Manimaran, P., et al. Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency. Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).
- Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Geng, S., et al. An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops. Horticulture Research. 9, (2022).
- Xiao, Y., et al. Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge). Scientia Horticulturae. 296, 110906 (2022).
