Summary
यह न्यूनतम अभिकर्मकों और सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों (एक बुनियादी स्मार्टफोन सहित) का उपयोग करके जौ पत्ती म्यान परख का एक सीधा प्रोटोकॉल है। इसका उद्देश्य उन्नत माइक्रोस्कोपी उपकरणों तक पहुंच के बिना प्रयोगशालाओं में विस्फोट रोग की प्रारंभिक संक्रमण प्रक्रिया की कल्पना करना है।
Abstract
यह समझना कि पौधे और रोगजनक कैसे बातचीत करते हैं, और क्या यह बातचीत रक्षा या बीमारी में समाप्त होती है, पौधे के स्वास्थ्य के लिए मजबूत और अधिक टिकाऊ रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है। संक्रमण और उपनिवेशीकरण के दौरान पौधे-रोगज़नक़ के नमूनों को अधिक प्रभावी ढंग से चित्रित करने वाले तरीकों में प्रगति ने चावल के पत्ती शीथ परख जैसे उपकरण प्राप्त किए हैं, जो चावल और फंगल रोगज़नक़, मैग्नापोर्थे ओरिज़े के बीच संक्रमण और प्रारंभिक उपनिवेशीकरण की घटनाओं की निगरानी में उपयोगी रहा है। यह हेमी-बायोट्रोफिक रोगज़नक़ चावल और संबंधित मोनोकोट में गंभीर रोग हानि का कारण बनता है, जिसमें बाजरा, राई, जौ और हाल ही में, गेहूं शामिल हैं। पत्ती शीथ परख, जब सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो एक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट पौधे अनुभाग उत्पन्न होता है, जो कई परतें मोटी होती हैं, जो शोधकर्ताओं को रोगज़नक़ हमले के दौरान लाइव-सेल इमेजिंग करने या विशिष्ट विशेषताओं के लिए दाग वाले निश्चित नमूने उत्पन्न करने की अनुमति देती है। जौ-एम ओरिज़े इंटरैक्शन में विस्तृत सेलुलर जांच चावल के मेजबान से पीछे रह गई है, जानवरों और मनुष्यों के लिए खाद्य स्रोत के रूप में और किण्वित पेय पदार्थों के रूप में इस अनाज के बढ़ते महत्व के बावजूद। यहां बताया गया है कि टीकाकरण के बाद पहले 48 घंटे के दौरान एम ओरिज़े इंटरैक्शन के जटिल अध्ययन के लिए जौ पत्ती म्यान परख का विकास किया गया है। पत्ती म्यान परख, भले ही किस प्रजाति का अध्ययन किया जा रहा हो, नाजुक है; प्रदान किया गया एक प्रोटोकॉल है जो जौ के विकास की स्थिति और पत्ती म्यान प्राप्त करने से लेकर टीकाकरण, इनक्यूबेशन और पौधे की पत्तियों पर रोगज़नक़ की इमेजिंग तक सब कुछ कवर करता है। इस प्रोटोकॉल को इमेजिंग उद्देश्यों के लिए स्मार्टफोन के रूप में सरल कुछ का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
मैग्नापोर्थे ओरीज़ा, चावल ब्लास्ट कवक, जौ, गेहूं और चावल सहित अनाज की फसलों के वर्गीकरण को संक्रमित करताहै। यह रोगज़नक़ विनाशकारी बीमारियों का कारण बनता है और इन मूल्यवान फसलों के लिए दुनिया भर में खतरा पैदा करता है, जिससे नियंत्रित नहीं होने पर पूर्ण फसल का नुकसान होता है। दुनिया भर की कई प्रयोगशालाएं चावल विस्फोट रोग पर ध्यान केंद्रित करती हैं क्योंकि इसके वैश्विक खतरे और पौधे-फंगल इंटरैक्शन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में इसकी विशेषताएंहैं। इसे पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया है, और इसके संक्रामक चक्र के आनुवंशिकी, विशेष रूप से शुरुआती घटनाओं को 3,4 स्थापित किया गया है। जीवन चक्र एक पत्ती की सतह पर अंकुरित बीजाणु के साथ शुरू होता है, जिससे विशेष प्रवेश संरचना बनती है जिसे एप्रेसोरियम कहा जाता है। एप्रेसोरियम पत्ती के ऊतकों में प्रवेश करता है, और संक्रमण घावों के विकास के साथ जारी रहता है जो स्पोरुलेशन की प्रक्रिया शुरू करते हैं और बीमारी फैलातेहैं। इन शुरुआती घटनाओं में से किसी को भी रोकना इस विनाशकारी बीमारी को काफी हद तक रोक देगा। नतीजतन, विस्फोट रोग पर अधिकांश वर्तमान शोध प्रारंभिक संक्रमण चरणों पर केंद्रित है, अंकुरित कोनिडिया से लेकर आक्रामक हाइप और बायोट्रोफिक इंटरफेशियल कॉम्प्लेक्स (बीआईसी) 5 के विकास तक।
चावल में ब्लास्ट रोग पर अनुसंधान की विशाल मात्रा आयोजित की गई है, भले ही एम ओरीज़ा विभिन्न प्रकार की फसलों के लिए एक महत्वपूर्ण रोगज़नक़ है, और नए विकसित उपभेद गेहूं6 के लिए वैश्विक खतरे के रूप में उभर रहे हैं। जबकि चावल गेहूं और मकई के साथ आबादी को खिलाने के लिए उपयोग की जाने वाली शीर्ष तीन मुख्य फसलों में से एक है, जौ पशुधन फ़ीड औरबीयर उत्पादन के मामले में चौथा अनाज अनाज है। जैसे-जैसे शिल्प बीयर उद्योग बढ़ता है, वैसे-वैसे जौ का आर्थिक मूल्य भी बढ़ता है। विस्फोट रोग का अध्ययन करने के लिए एक पैथोसिस्टम के रूप में एम ओरिज़े और जौ का उपयोग करने के अलग-अलग फायदे हैं। ओरिज़े के उपभेद हैं जो केवल जौ को संक्रमित करते हैं, साथ ही उपभेद जो कई घास प्रजातियों को संक्रमित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, 4091-5-8 मुख्य रूप से केवल जौ को संक्रमित करता है, जबकि गाय 11 और 70-15 जौ और चावल 8 दोनों को संक्रमित करसकते हैं। ये उपभेद आनुवंशिक रूप से समान हैं, और संक्रमण प्रक्रिया तुलनीय है। दूसरा, मानक प्रयोगशाला और ग्रीनहाउस स्थितियों के तहत, जौ उगाना आसान है, क्योंकि इसमें चावल की जटिल आवश्यकताएं नहीं हैं (संक्षिप्त तापमान नियंत्रण, उच्च आर्द्रता, विशिष्ट प्रकाश स्पेक्ट्रा)। पत्ती की सतह की हाइड्रोफोबिसिटी के कारण चावल के साथ इमेजिंग चुनौतियां भी हैं, जो जौ10 प्रदर्शित नहीं करता है।
यह प्रोटोकॉल कई संक्रमण चरणों के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए जौ के पत्तों के आवरण को अलग करने और प्रभावी ढंग से उपयोग करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करता है, सामान्य प्रयोगशाला आपूर्ति और डेटा संग्रह के लिए एक स्मार्टफोन का उपयोग करता है। जौ पत्ती म्यान परख के लिए यह विधि दुनिया भर की प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलनीय है क्योंकि इसके लिए न्यूनतम आपूर्ति की आवश्यकता होती है, और फिर भी रोगज़नक़ और पहली कुछ कोशिकाओं के बीच सूक्ष्म बातचीत की स्पष्ट तस्वीर प्रदान करता है। जबकि रोगजनकता परख, जैसे कि स्प्रे या ड्रॉपलेट टीकाकरण, घावों को बनाने के लिए रोगज़नक़ की क्षमता का एक मैक्रो दृश्य प्रदान कर सकता है, यह परख शोधकर्ता को प्रारंभिक संक्रमण के विशिष्ट चरणों की कल्पना करने की अनुमति देती है, पूर्व-प्रवेश घटनाओं से एपिडर्मल कोशिकाओं के उपनिवेशीकरण तक। इसके अलावा, शोधकर्ता आसानी से जंगली प्रकार के कवक के साथ संक्रमण की तुलना एक उत्परिवर्ती के साथ संक्रमण से कर सकते हैं।
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Protocol
1. प्रयोगात्मक सामग्री की तैयारी
- दलिया को पीसकर दलिया एगर (ओएमए) तैयार करें जब तक कि यह एक अच्छा पाउडर न हो जाए। 500 एमएलडीडीएच 2ओ में 25 ग्राम दलिया पाउडर और 15 ग्राम आगर जोड़ें, और मीडिया चक्र पर आटोक्लेव करें (वैकल्पिक रूप से 20 मिनट के लिए उबाल लें)। बाँझ 60 मिमी पेट्री व्यंजनों में मीडिया डालें।
नोट: अन्य मीडिया प्रकार जो स्पोरुलेशन को प्रेरित करते हैं, जैसे कि वी 8 एगर, इस प्रोटोकॉल के लिए स्वीकार्य हैं। - ओरिज़े बाँझ बल का उपयोग करके सीधे ओएमए प्लेटों पर स्टॉक फ़िल्टर करता है, और उन्हें पूरी प्लेट (9-12 दिनों) को कवर करने की अनुमति देता है। प्लेटों को 25 डिग्री सेल्सियस पर 12:12 घंटे के दिन: रात के चक्र के साथ एक विकास इनक्यूबेटर में रखें ताकि स्पोरुलेशन को प्रेरित करने में मदद मिल सके।
नोट: कुछ उत्परिवर्ती अधिक धीरे-धीरे बढ़ते हैं और अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, पहले पूर्ण मीडिया, फिर ओएमए में स्थानांतरण), और पर्याप्त कोनिडिया का उत्पादन करने में एक अतिरिक्त सप्ताह लग सकता है। - जौ (होर्डियम वल्गर लेसी ) के बीजों को नम विकास माध्यम (जैसे, मिट्टी रहित पॉटिंग मीडिया) में प्रति 6 इंच के बर्तन में 10-15 बीज के साथ सीधे लगाएं। बर्तनों को ट्रे में 1-2 इंच पानी के साथ रखें।
- जौ के विकास कक्ष की स्थिति को 12 घंटे (दिन के उजाले) के लिए 22 डिग्री सेल्सियस और 12 घंटे (अंधेरे) के लिए 19 डिग्री सेल्सियस के रूप में 60% सापेक्ष आर्द्रता पर सेट करें। नीचे से पानी देना जारी रखें ताकि बीज परेशान न हों।
- जौ को दूसरे पत्ती चरण तक उगाएं, लगभग 14 दिनों के लिए। बाँझ कैंची का उपयोग करके, मिट्टी की रेखा के ठीक ऊपर जौ के पौधे को काट लें। स्केलपेल का उपयोग करके, पहली पत्ती के पत्ती म्यान को सावधानीपूर्वक काटें जो अनुदैर्ध्य रूप से खुला है, और बल का उपयोग करके, इसे दूसरी पत्ती के आधार से हटा दें।
नोट: 75% -80% इथेनॉल के साथ उपयोग करने से पहले उपकरण (फोर्सप्स, स्केलपेल, आदि) को साफ करें। म्यान पतली एपिडर्मिस परत है जो पहली से दूसरी पत्ती (दूसरी से तीसरी पत्ती, आदि) तक लगाव प्रदान करती है; चित्र 1 देखें)। - पहले पत्ती को बाँझ 60 मिमी पेट्री डिश में रखें, जिसमें प्लेट के अंदर आर्द्रता बनाए रखने के लिए एक गीला पेपर तौलिया होता है। स्केलपेल का उपयोग करके, पहली पत्ती के अधिकांश हिस्से को म्यान से दूर काट दें, जिससे पत्ती के ऊतकों में केवल 0.5 इंच बढ़ने के लिए छोड़ दिया जाए।
- पत्ती के ऊतकों को पेट्री प्लेट के नीचे टेप करें।
नोट: शीथ कर्ल, लेकिन यह स्वीकार्य है क्योंकि एक घुंघराले म्यान कोनिडियल बूंद को अधिक आसानी से पकड़ता है। - 9-12 दिन पुरानी एम ओरीज़ा प्लेटों को इकट्ठा करें, और प्लेटों में 0.5-2 एमएल बाँझ पानी जोड़ें। एक बाँझ टीकाकरण लूप का उपयोग करके, संलग्न कोनिडिया को छोड़ने के लिए धीरे से माइसेलिया को खुरचें। कोनिडियल सस्पेंशन से माइसेलियम के किसी भी बड़े टुकड़े को फ़िल्टर करने के लिए चीज़क्लॉथ का एक छोटा सा टुकड़ा युक्त एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोनिडियल सस्पेंशन को सावधानीपूर्वक पाइप करें।
नोट: बीजाणुओं को 7 दिनों की शुरुआत में एकत्र किया जा सकता है, अगर वांछित बीजाणु एकाग्रता तक पहुंचने के लिए वृद्धि और स्पोरुलेशन पर्याप्त हैं। धीमी गति से बढ़ने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्ती के साथ काम करने पर संग्रह में 14 दिनों से अधिक की देरी नहीं हो सकती है - वांछित बीजाणु एकाग्रता 5 x 104 बीजाणु प्रति एमएल है, लेकिन एक सीमा (1 x 104-1 x 105) स्वीकार्य है। एकाग्रता की बहुत अधिक इमेजिंग व्यक्तिगत संक्रमण साइटों को चुनौतीपूर्ण बनाती है; यदि आवश्यक हो तो बाँझ पानी के साथ बीजाणु एकाग्रता को पतला करें।
- रोल्ड लीफ शीथ के अंदर कोनिडियल सस्पेंशन को ध्यान से पिपेट करें। 25 μL से शुरू करें (म्यान के आकार के आधार पर बूंद का आकार बढ़ाया जा सकता है, 50 μL तक)।
नोट: प्रत्येक उत्परिवर्ती तनाव या जौ रेखा के तीन से पांच प्रतिकृतियां करने की सिफारिश की जाती है। धुंधला होने की प्रक्रिया के दौरान होने वाली क्षति के लिए यह आम है, इसलिए अतिरिक्त म्यान प्रतिकृति की सिफारिश की जाती है। - डीडीएच2ओ के साथ चार या पांच 500 एमएल बीकर भरें, और स्टीमिंग (माइक्रोवेव या हॉटप्लेट का उपयोग करके) तक गर्म करें। गर्म पानी के बीकर को हिलाते समय सावधानी बरतें। प्लेट के अंदर नमी को फंसाने के लिए स्टीमिंग बीकर में से एक पर पेट्री डिश का ढक्कन पकड़ें।
- संक्रमित पत्ती म्यान प्लेटों को ढेर करें और उन्हें शेष गर्म बीकर के साथ घेर लें। यह एक आर्द्र, नम वातावरण बनाता है, जो बीजाणुओं को अंकुरित करने के लिए आवश्यक है।
नोट: ढक्कन को भाप देते समय सावधानी बरतें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई गर्म पानी या भाप म्यान को स्पर्श न करे। - पत्ती के आवरण को प्रकाश से सुरक्षित रखें, ठोस रंग (काले पसंदीदा) रबर या प्लास्टिक बॉक्स के साथ कवर करें, और इमेजिंग के लिए 48 घंटे या वांछित समय-बिंदु तक बैठने दें।
नोट: एक कार्डबोर्ड बॉक्स उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह नमी / आर्द्रता में लॉक नहीं होता है और गर्म पानी के बीकर से भाप को अवशोषित करता है। एक लॉकिंग, प्लास्टिक टब आर्द्रता को रोकने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, और इसे प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए काले कपड़े या एक बड़े अंधेरे कंटेनर के साथ कवर किया जा सकता है।
2. धुंधला होने की प्रक्रिया
- दाग को निम्नानुसार तैयार करें: 45% एसिटिक एसिड का एक ताजा कमजोर पड़ने तैयार करें और 0.1% वी / वी ट्रिपैन ब्लू जोड़ें। डाई समाधान के 1 एमएल को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में मिलाया जाता है। 40 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक या पानी स्नान सेट करें।
- सावधानी से, रेजर या स्केलपेल का उपयोग करके, पत्ती म्यान को टेप से दूर काट लें। फोर्सप्स का उपयोग करके, म्यान को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें और सुनिश्चित करें कि यह डाई समाधान में पूरी तरह से डूबा हुआ है। डाई को पत्ती में प्रवेश करने के लिए 2 घंटे की अनुमति दें। डाई के प्रवेश को बढ़ाने के लिए हीट ब्लॉक या पानी के स्नान में धुंधला प्रक्रिया के समय के दौरान नमूने को 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
नोट: म्यान सूक्ष्म-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तैरने की कोशिश करते हैं; पत्ती के ऊतकों की बिना दाग वाली जेब को रोकने के लिए, ट्यूबों को भरें, म्यान को डुबोएं, और ट्यूब को बंद करें। एक ही माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कई म्यान न डालें। - अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए 60% ग्लिसरॉल में पत्ती म्यान को सावधानी से धोएं। तीन कुल्ला (प्रत्येक ताजा ग्लिसरॉल में) आम तौर पर पर्याप्त होते हैं। म्यान को ग्लिसरॉल में तब तक रखें जब तक कि स्लाइड पर माउंट करने के लिए तैयार न हो जाए।
3. माउंटिंग और इमेजिंग प्रक्रिया
- म्यान को एक साफ ग्लास स्लाइड पर रखें और 60% ग्लिसरॉल की कुछ बूंदें जोड़ें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और बल के दो जोड़े का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक म्यान को खोल दें, जिससे टीका केंद्र ऊपर की ओर निकल जाए। म्यान को बल के साथ खुला रखें, और आवरण को कर्लिंग और संक्रमण स्थल को अवरुद्ध करने से रोकने के लिए कवरस्लिप को शीर्ष पर रखें।
नोट: पत्ती म्यान बहुत नाजुक है, और म्यान को नुकसान को रोकने के लिए इन चरणों को देखभाल के साथ करने की आवश्यकता है। - लंबे समय तक भंडारण के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करके कवरस्लिप को सील करें, या अल्पकालिक भंडारण के लिए टेप। एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइडों का निरीक्षण करें।
- माइक्रोस्कोप और सेल फोन का उपयोग करके बुनियादी छवियां लें। यहां, एक सेल फोन एडाप्टर माउंट और एक स्मार्टफोन के साथ छवियां ली गईं। एंड्रॉइड डिवाइस के लिए, कैमरा एप्लिकेशन को निम्नलिखित सेटिंग्स में समायोजित करें: फ्लैश ऑफ, टॉप शॉट अक्षम करें, चमक और छाया के स्वचालित समायोजन को अक्षम करें, और फोटो रिज़ॉल्यूशन को पूर्ण रूप से सेट करें।
नोट: फोन पर कैमरा एप्लिकेशन का उपयोग करने से बैटरी जीवन सामान्य से अधिक तेजी से कम हो जाता है, इसलिए बाहरी शक्ति होने की सिफारिश की जाती है। - एक बार जब सेल फोन माइक्रोस्कोप पर लगाया जाता है, तो इस उद्देश्य के साथ एक स्केल माइक्रोमीटर की एक छवि लें जिसका उपयोग डेटा प्राप्त करने के लिए किया जाएगा। इस अध्ययन में डेटा को 40x 0.65 NA वायु उद्देश्य पर प्राप्त किया गया था, और फोन एडाप्टर को 10x ओकुलर पर रखा गया था। फोन के ज़ूम को 2.5x पर समायोजित करें, और इसे निरंतर पिक्सेल आकार बनाए रखने के लिए सुसंगत रखें।
- शीथ के केंद्र में बीजाणुओं की सबसे बड़ी एकाग्रता होती है और एप्रेसोरिया को संक्रमित करता है; इसलिए, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए प्रत्येक म्यान की 9-12 छवियों का लक्ष्य रखें। बीजाणुओं और एप्रेसोरिया की संख्या लागू बीजाणुओं की एकाग्रता के आधार पर भिन्न होती है।
4. इमेजजे (फिजी) का उपयोग करके छवि मूल्यांकन और गिनती
- छवियों को ImageJ (FIJI) चलाने वाले कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें। छवियों को खोलने के लिए, फ़ाइलों को ImageJ पट्टी पर खींचें और छोड़ दें।
- स्टेज माइक्रोमीटर छवि लोड करके और पैमाने के लिए दो चिह्नों के बीच एक सीधी रेखा खींचकर छवियों का पैमाना सेट करें। स्केल खोलें, मापी गई रेखा के लिए ज्ञात दूरी टाइप करें, और स्केल के लिए इकाई में टाइप करें। माइक्रोमीटर पर, इस उदाहरण में, सबसे छोटी रेखा 10 μm थी। सेट ग्लोबल बॉक्स की जाँच करें और ओके दबाएं। लोड की गई सभी बाद की छवियों में एक ही पैमाना होगा।
- एप्रेसोरिया, बीजाणुओं, या अन्य वस्तुओं की गणना करने के लिए, पॉइंट टूल का चयन करें। इसके बाद, ROI प्रबंधक खोलें। सूची में अंक जोड़ने के लिए कुंजीपटल पर T कुंजी क्लिक करें. यदि आवश्यक हो तो रुचि के इन क्षेत्रों को सहेजा जा सकता है और उसी छवि पर फिर से लोड किया जा सकता है।
- प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर, अतिरिक्त माप करें, जैसे बीजाणु की लंबाई, एप्रेसोरिया आकार और रोगाणु ट्यूब की लंबाई।
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Representative Results
इस तकनीक के लिए प्रारंभिक वर्कफ़्लो का चित्रण चित्र 1 में प्रदर्शित किया गया है। म्यान को 14 दिन पुराने अतिसंवेदनशील "लेसी" जौ के पौधों (एच वल्गर) से काटा गया था। कोनिडिया को 10 दिन पुराने स्पोरुलेटिंग एम. ओरिजा ओएमए प्लेटों से काटा गया था, जिसमें 5 x 10 4 बीजाणुओं प्रति एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ डीडीएच2ओ का उपयोग करके तैयार कियागया था। इनोकुलम निलंबन को सीधे पत्ती म्यान पर लागू किया गया था, जिसे बाँझ पेट्री प्लेटों के लिए सुरक्षित किया गया था। प्लेटों को प्रकाश के बिना 48 घंटे के लिए एक गर्म, आर्द्र कक्ष में रखा गया था। इनक्यूबेशन अवधि के बाद, पत्ती म्यान को ट्रिपैन नीले रंग से दाग दिया गया और इमेजिंग के लिए तैयार किया गया।
संक्रमण साइटों को स्मार्टफोन और स्मार्टफोन माइक्रोस्कोप एडाप्टर का उपयोग करके चित्रित किया गया था। ओरीज़ा के परीक्षण किए गए उपभेदों में से प्रत्येक के लिए न्यूनतम 10 छवियां दर्ज की गईं। प्रत्येक फंगल स्ट्रेन के लिए न्यूनतम 30 छवियों के लिए प्रयोग को तीन बार दोहराया गया था। चित्रा 2 ए संदर्भ के लिए बिना दाग और अनुचित रूप से रंगे चित्रों के साथ एक सफल शीथ परख के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है।
परिकल्पना के आधार पर, इन छवियों को परिमाणित किया जा सकता है और कई तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है। इस प्रयोग के लिए, टीकाकरण के बाद 48 घंटे में, जीवित बीजाणुओं (अंकुरित बीजाणुओं) की कुल संख्या की गणना की गई, साथ ही एप्रेसोरिया की संख्या और सफलतापूर्वक संक्रमित कोशिकाओं की संख्या भी थी। प्रयोगशाला में जौ-संक्रमित पृष्ठभूमि में 2,000 यादृच्छिक रूप से उत्परिवर्तित एम ओरिज़े उपभेदों का संग्रह उत्पन्न किया गया था। स्प्रे और ड्रॉप टीकाकरण का उपयोग करके रोगजनकता परीक्षणों से जंगली प्रकार ( एम ओरिज़े उत्परिवर्ती के लिए एक सामान्य फेनोटाइप) की तुलना में कम घाव के आकार वाले कई उत्परिवर्ती का पता चला। इन फेनोटाइप्स को अलग करने के लिए, यह अनुमान लगाया गया था कि कम घाव का आकार शुरुआती संक्रमण चरणों (बीजाणु अंकुरण, एप्रेसोरियल गठन, प्रवेश पेग गठन, प्रारंभिक एपिडर्मल सेल औपनिवेशीकरण) में से एक के निषेध के कारण हुआ था, जिसे पत्ती शीथ परख के माध्यम से सबसे आसानी से परीक्षण किया जाता है। म्यूटेनेसिस परियोजना से एक होनहार उम्मीदवार की पहचान जे99 ए 12 नामक एक फॉरवर्ड जेनेटिक का उपयोग करके की गई थी। इस उत्परिवर्ती ने स्क्रीन के दौरान नाइट्रोजन-भूखे या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन की स्थिति के प्रति संवेदनशीलता नहीं दिखाई। अनुवर्ती प्रयोगों के दौरान, जे 9 9 ए ने हाइड्रोफोबिक सतह पर महत्वपूर्ण संख्या में एप्रेसोरिया का उत्पादन किया, लेकिन जीवित जौ पर कम घाव का आकार प्रदर्शित किया। शीथ परख का उपयोग करके परीक्षण किए जाने पर, जे 99 ए ने सफलतापूर्वक एप्रेसोरिया और पेनेट्रेशन पेग विकसित किए, जो पत्ती के आवरण में प्रवेश करते थे, लेकिन अंदर एक बार आक्रामक हाइप का उत्पादन नहीं करते थे, इस प्रकार संक्रमण प्रवेश पेग (चित्रा 2 बी) पर रुक गया था। पत्ती म्यान के ऊतक के अंदर संक्रामक हाइप की उपस्थिति से सफलतापूर्वक संक्रमित कोशिकाओं की पहचान की गई थी। संक्रमित कोशिकाओं की संख्या के लिए एप्रेसोरिया की संख्या की तुलना करने से एप्रेसोरिया को सफलतापूर्वक संक्रमित करने का प्रतिशत प्रदान किया गया। वाइल्ड-टाइप 4091-5-8 के लिए, 87% एप्रेसोरिया ने सफलतापूर्वक सेल पर आक्रमण किया और उपनिवेश किया, जबकि उत्परिवर्ती जे 99 ए में, केवल 36% एप्रेसोरिया में सेल12 के अंदर हाइप था।
चित्र 1: पत्ती म्यान 10 दिन पुराने जौ से काटा गया और इथेनॉल में साफ किए गए उपकरणों के साथ सावधानीपूर्वक हटा दिया गया। कोनिडिया एकत्र किया जाता है, और एकाग्रता को बाँझ पानी के साथ 0.5-1.0 x 105 प्रति मिलीलीटर तक समायोजित किया जाता है। पृथक म्यान को 60 सेमी पेट्री प्लेट के अंदर टैप किया जाता है, और कोनिडियल सस्पेंशन को म्यान में लोड किया जाता है। टीका लगाए गए नमूनों को कमरे के तापमान पर, अंधेरे में, आर्द्रता के लिए गर्म पानी के बीकर के साथ रखा जाता है। नमूने 40 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए 45% एसिटिक एसिड + 0.1% ट्रिपैन ब्लू में दाग दिए जाते हैं, फिर 48 घंटे के बाद 48 घंटे के लिए तीन बार 60% ग्लिसरॉल में धोया जाता है। दाग वाले नमूने लगाए जाते हैं और छवि बनाई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: धुंधला प्रोटोकॉल से प्रतिनिधि परिणाम। (A) धुंधला प्रोटोकॉल से विचलन के परिणामस्वरूप उप-मानक परिणाम हो सकते हैं। गर्मी और एसिटिक एसिड पत्ती के ऊतकों को धीरे से नरम करने का काम करते हैं। 60% ग्लिसरॉल में पोस्ट-स्टेनिंग कुल्ला न केवल अतिरिक्त दाग को हटा देता है, बल्कि पत्ती के कारण प्रकाश प्रकीर्णन को कम करने और छवि की गुणवत्ता में सुधार करने में मदद करता है। स्केल सलाखों = 50 μm. (B) 4091WT के सफल प्रयासों की तुलना में J99A (तीर) के असफल प्रवेश और बाद के संक्रमण के प्रयासों को देखने के लिए इस परख में मजबूती दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां, जिसके परिणामस्वरूप पत्ती ऊतक (तीर) में आक्रामक हाइप का उत्पादन हुआ। स्केल सलाखों = 50 μm. सभी तस्वीरें संक्रमण के 48 घंटे बाद ली गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
ओरिज़े उपभेदों का परीक्षण करने के लिए कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले परख उपलब्ध हैं जो एक संगत या असंगत संक्रमण प्रतिक्रिया का मैक्रोस्कोपिक-स्तरीय दृश्य प्रदान करते हैं, जैसे स्प्रे या ड्रॉपलेट टीकाकरण, और13,14 आकार को मापने के लिए रेटिंग सिस्टम का उपयोग। ओरिज़े के लिए एक और आम परख रोगज़नक़ की क्षमता का परीक्षण करना है ताकि इसकी विशेष प्रवेश संरचना, एपप्रेसोरियम15 बनाई जा सके। यहां वर्णित प्रारंभिक संक्रमण प्रक्रियाओं में परिवर्तन को सेलुलर स्तर पर जल्दी और कुशलता से देखने के लिए एक आसान तरीका है, अधिक सरल जौ के पौधे में। यह विधि अद्वितीय है, जिसमें यह डेटा कैप्चर के लिए सामान्य प्रयोगशाला उपकरण और एक स्मार्टफोन का उपयोग करता है। यह विधि कैमरा-सुसज्जित और कंप्यूटर-नियंत्रित माइक्रोस्कोप की आवश्यकता को नकारती है, जिससे यह प्रोटोकॉल किसी भी प्रयोगशाला के लिए सस्ती हो जाता है। इस विधि का उपयोग करके, हम यह पहचानने में सक्षम थे कि किस चरण में उत्परिवर्ती जे 9 9 ए संक्रमण को रोका गया था, एक सवाल जो पिछले प्रयोग स्पष्ट करने में असमर्थ रहे हैं।
चावल में एम ओरिज़े की संक्रमण प्रक्रिया, विशेष रूप से पहले कुछ एपिडर्मल कोशिकाओं का उपनिवेशीकरण, फ्लोरोसेंट प्रोटीन, मार्कर, रंजक, कॉन्फोकल इमेजिंग और उन्नत माइक्रोस्कोपी16 का उपयोग करके अच्छी तरह से चित्रित किया गया है। इस प्रकार के इमेजिंग प्रयोग महंगे, समय लेने वाले होते हैं, और विशिष्ट विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। कई प्रयोगशालाएं, समरूप पुनर्संयोजन का उपयोग करके, संक्रमण चक्र में व्यक्तिगत जीन की भूमिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एम ओरिज़े के आनुवंशिक उत्परिवर्ती बनाने में सक्षम हैं, लेकिन अंतर्निहित सेल जीव विज्ञान का पता लगाने के लिए आवश्यक उन्नत उपकरणों और विशेषज्ञता तक पहुंच नहीं हो सकती है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य डिजिटल छवियों को कैप्चर करने और निश्चित पत्ती म्यान ऊतकों के जेड-स्टैक-प्रकार के वीडियो उत्पन्न करने के लिए केवल एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप और एक स्मार्टफोन का उपयोग करके इस अंतर को पाटने में मदद करना है। यह विधि ऊतक में कुछ सेल परतों को इमेजिंग करने में सक्षम बनाती है, 48 घंटे तक आक्रामक फंगल हाइप को कैप्चर करती है। चावल और जौ के पत्ती म्यान में समान विशेषताएं हैं; वे केवल कुछ सेल परतें मोटी होती हैं और इनमें कम क्लोरोप्लास्ट होते हैं, जिससे उन्हें छवि बनाना आसान हो जाता है। जैसा कि ऊपर कहा गया है, जौ चावल की तुलना में कम हाइड्रोफोबिक और बढ़ने में आसान है, और एम ओरिज़े के कई उपभेद चावल और जौ पर संक्रमण का कारण बन सकते हैं, जिससे यह प्रयोग अधिक जटिल चावल परख के लिए एक आसान स्वैप बन जाता है।
इस विधि की कुछ सीमाओं में जेड-फील्ड डेटा एकत्र करने के लिए स्मार्टफोन के वीडियो फ़ंक्शन का उपयोग करना शामिल है, क्योंकि फ्रेम दर के लिए जेड-इंक्रीमेंट अज्ञात है। एक और सीमा यह है कि इसके लिए निश्चित ऊतक (जीवित कोशिकाओं नहीं) की आवश्यकता होती है। हालांकि, प्रोटोकॉल की गति और आसानी के कारण, संक्रमण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं की जांच करके इस सीमा को दूर किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक उचित धुंधलापन है। अनुचित कुल्ला स्लाइड तैयारी में अतिरिक्त डाई का कारण बनता है, जिससे डाई संतृप्ति होती है, और रोगज़नक़ ऊतक पत्ती के ऊतकों से अप्रभेद्य हो जाता है। इस बीच, कम धुंधलापन रोगज़नक़ ऊतक को पत्ती के ऊतकों के खिलाफ विपरीत होने से रोकता है।
उपरोक्त विधि कई वैज्ञानिक प्रश्नों के अनुकूल है, और इसका उपयोग फंगल उत्परिवर्ती का आकलन करने, जौ के पौधों में आनुवंशिकी प्रतिरोध की विभिन्न डिग्री का आकलन करने और पहले से लागू फंगल नियंत्रण विधियों की दक्षता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि को अन्य पौधे-रोगज़नक़ इंटरैक्शन, विशेष रूप से अन्य मोनोकोट पत्ती म्यान तक विस्तारित करना भी संभव है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक यूएसडीए-निफा पुरस्कार 2016-67013-24816 से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
