Summary
3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.
Abstract
Bağırsak epiteli, insan sağlığında önemli bir rol oynar ve konakçı ile dış ortam arasında bir bariyer sağlar. Bu son derece dinamik hücre tabakası, mikrobiyal ve immün popülasyonlar arasındaki ilk savunma hattını sağlar ve bağırsak immün tepkisini modüle etmeye yardımcı olur. Epitel bariyerinin bozulması, inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ayırt edici özelliğidir ve terapötik hedefleme için ilgi çekicidir. 3 boyutlu kolonoid kültür sistemi, IBD patogenezinde bağırsak kök hücre dinamiği ve epitel hücre fizyolojisini incelemek için son derece yararlı bir in vitro modeldir. İdeal olarak, hayvanların iltihaplı epitel dokusundan kolonoidlerin oluşturulması, hastalık üzerindeki genetik ve moleküler etkilerin değerlendirilmesinde en faydalı olacaktır. Bununla birlikte, akut inflamasyonu olan farelerden oluşturulan kolonoidlerde in vivo epitelyal değişikliklerin mutlaka tutulmadığını gösterdik. Bu sınırlamayı ele almak için, kolonoidleri tipik olarak IBD sırasında yükselen bir inflamatuar mediatör kokteyli ile tedavi etmek için bir protokol geliştirdik. Bu sistem çeşitli kültür koşullarına her yerde uygulanabilirken, bu protokol hem farklılaşmış kolonoidler hem de yerleşik kolonoidlerden türetilen 2 boyutlu tek tabakalar üzerinde tedaviyi vurgular. Geleneksel bir kültür ortamında, kolonoidler bağırsak kök hücreleri ile zenginleştirilir ve kök hücre nişini incelemek için ideal bir ortam sağlar. Bununla birlikte, bu sistem, bariyer fonksiyonu gibi bağırsak fizyolojisinin özelliklerinin analizine izin vermez. Ayrıca, geleneksel kolonoidler, terminal olarak farklılaşmış epitel hücrelerinin proinflamatuar uyaranlara hücresel yanıtını inceleme fırsatı sunmaz. Burada sunulan yöntemler, bu sınırlamaları ele almak için alternatif bir deneysel çerçeve sağlar. 2 boyutlu tek katmanlı kültür sistemi, ex vivo terapötik ilaç taraması için de bir fırsat sunar. Bu polarize hücre tabakası, hücrenin bazal tarafında enflamatuar mediatörlerle ve IBD tedavisinde yararlılıklarını belirlemek için apikal olarak varsayılan terapötiklerle birlikte tedavi edilebilir.
Introduction
İnflamatuar barsak hastalığı (IBD), inflamasyon ve klinik sessizlik atakları ile karakterize kronik, remisyonlu ve tekrarlayan bir hastalıktır. İBH'nin etiyolojisi multifaktöriyeldir, ancak hastalığın temel karakteristik özellikleri arasında epitel bölmesinde aktive olan proinflamatuar sinyal kaskadlarına ek olarak kusurlu bariyer fonksiyonu ve bağırsak epitelinin artmış geçirgenliği yer alır 1,2. IBD sırasında epitel yanıtını özetlemek için hücre kültürü ve inflamasyonun murin modelleri de dahil olmak üzere çeşitli in vitro ve in vivo modeller kullanılmıştır3. Bununla birlikte, tüm bu sistemlerin, İBH4 sırasındaki epitelyal değişiklikleri özetleme yeteneklerini sınırlayan önemli eksiklikleri vardır. IBD'yi incelemek için kullanılan hücre dizilerinin çoğu dönüştürülür, tek tabaka oluşturma yeteneğine sahiptir ve3'ü ayırt edebilir, ancak konakçıdaki dönüştürülmemiş bağırsak epitel hücrelerinden farklı şekilde özünde yayılır. IBD'yi incelemek için birkaç farklı fare inflamasyon modeli kullanılır, bunlardan bazıları nakavt modelleri, enfeksiyöz modeller, kimyasal enflamatuar modeller ve T hücresi transfer modelleri5,6,7,8'i içerir. Her biri IBD'nin genetik yatkınlıklar, bariyer disfonksiyonu, immün deregülasyon ve mikrobiyom gibi belirli etiyolojik yönlerini inceleyebilse de, hastalığın multifaktöriyel doğasını inceleme yetenekleri sınırlıdır.
Enteroidler ve kolonoidler de dahil olmak üzere bağırsak organoidleri, son on yılda, sadece bağırsak kök hücrelerinin dinamiklerini değil, aynı zamanda bağırsak epitelinin bariyer bütünlüğünü ve işlevini bağırsak homeostazı ve hastalığında oynadıkları rolü incelemek için yararlı bir in vitro model olarak kurulmuştur. Bu antiteler, İBH9'un patogenezini anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunmuş ve kişiselleştirilmiş tıp için yeni fırsatlar açmıştır. Kolonoidler veya kolondan kök hücre türevi, kendi kendini organize eden doku kültürleri, bağırsak kriptlerinde bulunan kök hücrelerin süresiz olarak yayılmasına ve muhafaza edilmesine izin veren bir süreçte hem murin hem de insan dokusundan geliştirilmiştir10. Kök hücre nişi in vivo büyümesini desteklemek için hücre dışı faktörlere, özellikle kanonik Wnt sinyaline ve kemik-morfojenik protein sinyal yollarınadayanır 11. Bu faktörlerin eklenmesi, kolonoidlerin sağlığını ve uzun ömürlülüğünü destekler, ancak aynı zamanda kültürü, hem kendi kendini yenileyen hem de terminal olarak farklılaşmış hücrelerden oluşan in vivo epitelyal hücresel mimariyi yansıtmayan kök hücre benzeri bir duruma doğru yönlendirir12,13. Bağırsak epitelinin işlevselliği, kök hücre bölmesi ile farklılaşmış hücreler arasındaki sürekli karışmaya bağlı olsa da, bir kolonoid kültür sisteminde her ikisine de sahip olma yeteneği oldukça sınırlıdır. Bu sınırlamalara rağmen, organoid kültür sistemi, epitelin içsel özelliklerini ex vivo olarak incelemek için altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, eldeki bilimsel soruyu cevaplamak için alternatif kültür stratejilerinin düşünülmesi gerekebilir.
Sürekli 7 günlük bir dekstran sodyum sülfat (DSS) rejimindeki farelerin hem epitel iltihabı hem de bariyer disfonksiyonu geliştirdiğigösterilmiştir 14. Ayrıca, insan IBD'sinde belirgin olduğu gösterilen mitokondriyal biyogenez yetmezliği ve bağırsak epitelinde metabolik yeniden programlama da bu DSS kolit15 modelinde yakalanmıştır. Bununla birlikte, ön verilerimiz, mitokondriyal biyogenez başarısızlığının özelliklerinin, DSS ile tedavi edilen hayvanların kriptlerinden türetilen kolonoidlerde korunmadığını göstermektedir (Ek Şekil 1). Bu nedenle, inflamasyonun murin bağırsak iltihabı sırasında epitel değişikliklerini nasıl yönlendirdiğini incelerken alternatif kültür yöntemleri kullanılmalıdır. Burada, 1) murin kolonoidlerinin kurulması için tüm kolon dokusundan kriptlerin nasıl izole edileceğini, 2) hücre popülasyonunu in vivo olarak yansıtmak için bu hücre popülasyonunun terminal olarak nasıl ayırt edileceğini ve 3) bu in vitro modelde inflamasyonun nasıl indükleneceğini açıklayan bir protokolü özetliyoruz. İltihaplı epitel içindeki ilaç etkileşimlerini incelemek için, temel olarak inflamatuar mediatörlerle tedavi edilebilen ve ilaç tedavileri ile apikal olarak tedavi edilebilen murin kolonoidlerinden 2-dimensonal (2D) tek tabakalar oluşturmak için bir protokol geliştirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan fare dokuları kullanılarak yapılan tüm deneyler, Pittsburgh Üniversitesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı ve Pittsburgh Üniversitesi'ndeki Hayvan Araştırma ve Bakım Komitesi ve UPMC tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak yürütüldü.
1. Kültür için hazırlık
NOT: Tüm reaktifler Malzeme Tablosu bölümünde listelenmiştir ve tüm çözelti bileşimleri çözelti bileşimi tablosunda bulunabilir (Tablo 1).
- Fare yıkama ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. 4°C'de 2 aya kadar saklayın.
- Tablo 1'de açıklandığı gibi crypt izolasyon arabelleği 1'i (CIB1) hazırlayın. 4°C'de 2 aya kadar saklayın.
DİKKAT: Ditiyotreitol (DTT), yutulduğunda potansiyel akut toksisite ve bu alanlara maruz kalırsa cilt ve göz hasarı nedeniyle OSHA Tehlike İletişim Standardı tarafından tehlikeli olarak kabul edilir. Bu kimyasalla çalışırken koruyucu eldiven, göz koruması ve yüz koruması kullanılmalıdır. - Tablo 1'de açıklandığı gibi crypt izolasyon arabelleği 2'yi (CIB2) hazırlayın. 4°C'de 2 aya kadar saklayın.
- L-WRN koşullu ortamı daha önce yayınlanmış bir protokolegöre hazırlayın 16.
- Tablo 1'de tarif edildiği gibi tam kolonoid ortamı hazırlayın. Tam kolonoid büyüme ortamı, aktivite kaybı olmadan 4 ° C'de 5 güne kadar saklanabilir.
- Farklılaşma ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Bu protokol daha önce yayınlanmış bir makaledendeğiştirilmiştir 17. Farklılaşma ortamı, aktivite kaybı olmadan 4°C'de 5 güne kadar saklanabilir.
- Enflamasyon aracı ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Bu protokol daha önce yayınlanmış bir makaledendeğiştirilmiştir 18. Enflamasyon aracı ortamı, aktivite kaybı olmadan 4 ° C'de 5 güne kadar saklanabilir.
- Murin tek katmanlı ortamı hazırlayın. Tek katmanlara enflamatuar faktörler ve/veya ilaç(lar) ile meydan okurken Y-27632'yi atlayın. Murin tek katmanlı besiyeri, aktivite kaybı olmadan 4°C'de 5 güne kadar saklanabilir.
- Enflamasyon aracı tek tabakalı ortamı hazırlayın. Enflamasyon aracısı tek tabakalı ortam, aktivite kaybı olmadan 4 ° C'de 5 güne kadar saklanabilir.
2. Murin kolon dokusundan kript izolasyonu
NOT: Dokuyu buz üzerine aktarın. Uygun miktarda bazal membran matrisini −20°C'lik depodan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün. Her 24 oyuk, 15 μL bazal membran matrisi ile kaplanmıştır. Bölüm 1'de açıklandığı gibi CIB1, CIB2 ve tam kolonoid büyüme ortamını hazırlayın.
- Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokole göre bir C57BL / 6J fareyi (6-8 haftalık) ötenazi yapın ve temiz cımbız ve makas kullanarak kolonun distal ucunu (yaklaşık 5-7 cm) çıkarın.
NOT: Bu çalışmada, deneklere 2-3 dakika karbondioksit odası inkübasyonu ve ardından servikal çıkık kullanılarak ötenazi uygulandı.- Bunun için fareyi sırt üstü yatırın, göğüs kafesinin hemen altına yatay bir kesi yapın ve ardından karın boşluğunu ortaya çıkarmak için yatay kesiğin ortasından kuyruğun tabanına doğru dikey bir kesi yapın.
- Cımbızla ince bağırsağı alandan çıkarın, kolonu tanımlayın ve kuyruğun tabanına kadar takip edin. Gerekirse distal kolonu tamamen ortaya çıkarmak için pelvisi makasla kırın. Kolonun en distal 5-7 cm'sini kesmek için makası kullanın.
- Kolon dokusunu temiz bir yüzeye yerleştirin. Kolonu çevreleyen fazla serozal yağı çıkarın. 18 G 1 1/2 iğneye bağlı bir şırınga kullanarak kolonun lümen içeriğini Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayarak dışkı maddesini çıkarın. Ardından, kolonu 10 mL buz gibi soğuk DPBS içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Kolonu birden fazla hayvandan izole ediyorsanız, bir sonraki hayvana devam etmeden önce dokuyu buzun üzerine yerleştirin. - Kolon dokusunu 10 mL buz gibi soğuk DPBS içeren bir Petri kabına aktarın ve bir P1.000 pipet kullanarak lümeni DPBS ile iki kez sulayın.
- Kolonu makas kullanarak uzunlamasına açın ve kalan dışkı içeriğini çıkarmak için DPBS'de ~30 saniye boyunca cımbız kullanarak hafifçe sallayın.
- Dokuyu 10 mL buz gibi soğuk DPBS içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve kolonu makas kullanarak 2 cm'lik parçalara ayırmadan ve 7 mL buz gibi soğuk CIB1 ile 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirmeden önce cımbız kullanarak tekrar hafifçe çalkalayın. CIB1'deki dokuyu 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.
NOT: Kalan adımlar biyolojik bir güvenlik kabini içinde gerçekleştirilir. - Dokuyu cımbız kullanarak 7 mL CIB2 içeren önceden ısıtılmış 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin.
- Dokunun konik tüpün dibine yerleşmesine izin vererek ve ardından CIB2'yi pipetleyerek CIB2'yi 50 mL'lik konik tüpten çıkarın. Ardından, aynı konik tüpe 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamı ekleyin.
- Yeni bir 50 mL konik tüp alın ve açık tüpün üzerine 70 μm'lik bir filtre yerleştirin.
- Tüpü kolon içeriği ile tutarken, elinizi yaklaşık 45° döndürün. Kriptoları serbest bırakmak için tüpü 45 saniye boyunca sallanan ve kuvvetli bir şekilde sallayın. Ardından, kript süspansiyonunu 70 μm hücre süzgecinden 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dökün.
- Cımbız kullanarak, kolon dokusunu boş 50 mL konik tüpe geri yerleştirin ve 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamı ekleyin. Yeni bir 70 μm hücre süzgeci edinin ve önceki filtrelenmiş çözeltiyi içeren 50 mL'lik konik tüpün üzerine yerleştirin.
- Yine, kript parçalarını içeren 50 mL'lik tüpü alın ve adım 2.9'daki gibi sallayın. Ortamı 70 μm hücre süzgecinden geçirerek 50 mL'lik konik tüpe süzün ve daha önce filtrelenmiş kriptlerle birleştirin.
NOT: Kript verimi düşükse, dokuyu 10 mL fare yıkama ortamı ile boş bir 50 mL konik tüpe yerleştirerek kolon dokusunu bir süre daha sallayın. Kriptoları serbest bırakmak için dokuyu 45-50 saniye sallayın. Ayrıca, kript verimi düşükse, sallamanın gücünü arttırın. Son olarak, genel kript verimi düşükse, dokunun plastiğe yapışmasını önlemek için hem pipetler hem de tüpler fetal sığır serumu (FBS) ile kaplanabilir. - Filtrelenmiş kriptleri içeren 50 mL'lik konik tüpü 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
NOT: 50 mL konik tüpün dibinde bir pelet gözlenmelidir. - Pipetleme yoluyla ortamı boşaltın, 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptleri yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Daha temiz bir preparat elde etmek için, kriptleri ek 10 mL fare yıkama ortamıyla yıkayın. Önceki ortamı boşaltın ve 10 mL fare yıkama ortamında yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptleri yeniden süspanse edin. 15 mL'lik bir konik tüp kullanarak 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
NOT: Ortamı pipetlerken dikkatli olunmalıdır çünkü bazen pelet sıkıca santrifüjlenmez. Pelet sıkı değilse, 500 μL ila 1 mL bırakarak ortamın çoğunu pipetleyin. Ardından, 10 mL fare yıkama ortamında pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin ve solüsyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Daha küçük bir konik tüpte santrifüjleme, peletin sıkılığını artırabilir. - Ortamı boşaltın ve 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptoları yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alındıktan sonra, ortamın 10 μL'sini hemen bir cam slayt üzerine pipetleyerek kriptleri parlak alan mikroskobu altında sayın.
- Slaytın ayrı uçlarına iki adet 10 μL'lik damla yerleştirin ve her damlacıktaki kript sayısını sayın. 10 μL başına kript sayısını belirlemek için iki damla arasındaki sayıların ortalamasını alın. 100 mL'deki kript sayısını elde etmek için bu sayıyı 1 ile çarpın.
NOT: Doğru sayım için, yeniden süspansiyondan hemen sonra 10 μL kript süspansiyonu çıkarılmalıdır. Aksi takdirde, kriptler tüpün dibine düşecek ve bu da yanlış bir sayıma neden olacaktır.
- Slaytın ayrı uçlarına iki adet 10 μL'lik damla yerleştirin ve her damlacıktaki kript sayısını sayın. 10 μL başına kript sayısını belirlemek için iki damla arasındaki sayıların ortalamasını alın. 100 mL'deki kript sayısını elde etmek için bu sayıyı 1 ile çarpın.
- Kuyucuk başına 300-500 kript kaplama hedefiyle, fare yıkama ortamında yeniden süspanse edilen uygun hacimdeki kriptleri yeni bir 15 mL'lik konik tüpe aktarın ve buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla 10 mL'ye getirin. Tüpü 300 x g'da 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Tüpün dibinde küçük bir pelet görünmelidir.
- Süpernatanı bir elektrikli pipetle çıkarın. Kalan ortamı dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın ve geriye yalnızca pelet bırakın.
- Pelet, uygun miktarda buz gibi bazal membran matrisinde yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Kript peletini yeniden askıya alırken kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Plaka 300-500 kript / 15 μL bazal membran matrisi bir plakanın her kuyucuğunda. Kaplamadan sonra, doku kültürü plakasını ters çevirin ve 10-20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre koyun.
- Plakayı geri çevirin ve her bir oyuğa 500 μL tam fare kolonoid ortamı ekleyin. Ortamı geçmeye hazır olana kadar her gün değiştirin. Kolonları her 3-5 günde bir geçirin.
3. Kolonların geçirilmesi
NOT: Her kuyu genellikle orijinal kuyunun yoğunluğuna göre 1:4 ila 1:6 arasında geçilebilir. Uygun miktarda bazal membran matrisini −20°C'den çıkarın ve çözülmesi için buzun üzerine koyun. Kolonoidler iki geçişten sonra deneyler için kullanılabilir. Kolonoidleri geçirirken, kontaminasyonu önlemek için adımlar biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.
- Ortamı geçilecek kuyulardan çıkarın.
- Bazal membran matrisi içinde, ilk izolasyon sırasında meydana gelebilecek kalıntılar varsa, kalıntıları temizlemek için aşağıdaki protokol kullanılabilir:
- Her bir oyuğa Ca2+ veya Mg2+ olmadan DPBS'de 1 mL buz gibi% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Biyolojik güvenlik kabininde 5 dakika bekletin.
- Bazal membran matrisini bozmak için bir P1000 pipet kullanarak üç ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve kuyucukların içeriğini 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Kolonoidleri Ca 2 + veya Mg2 + olmadan DPBS'de toplam 5-10 mL% 0.1 BSA'da santrifüjleyin. % 0.1 BSA ile uygun hacme kadar yapın.
- Kolonoidleri peletlemek için 150 x g'da 4 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin, ancak döküntüleri değil.
- DPBS'yi pipetleyerek boşaltın ve peleti bırakın. 1 mL oda sıcaklığında (RT) enzimatik ayrışma reaktifi ekleyin ve üç ila beş kez pipetleyin.
- 15 mL'lik konik tüpü enzimatik ayrışma reaktifi ve bozulmuş kolonoidlerle birlikte 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-4 dakika yerleştirin.
- Tüpü su banyosundan çıkarın, 3-5 kez pipetleyin ve ardından fare yıkama ortamıyla 10 mL'ye getirin. Adım 3.6'ya geçin.
- Bazal membran matrisi içinde, ilk izolasyon sırasında meydana gelebilecek kalıntılar varsa, kalıntıları temizlemek için aşağıdaki protokol kullanılabilir:
- Her oyuğa 500 μL RT enzimatik ayrışma reaktifi yerleştirin ve bazal membran matrisini bozmak için üç ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetlemeden önce yaklaşık 1 dakika bekletin.
- Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatöre 3-4 dakika yerleştirin.
- Plakayı inkübatörden çıkarın ve kolonoidleri ayırmak için bir P1000 pipeti kullanarak üç ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- İçeriği 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla 10 mL'ye kadar hazırlayın.
- Numuneyi 300 x g'da 5°C'de 4 dakika santrifüjleyin.
- Konik tüpte yalnızca bir pelet kalacak şekilde gerektiğinde bir elektrikli pipet ve bir P200 pipeti kullanarak ortamı çıkarın.
- Uygun miktarda buz gibi soğuk bazal membran matrisinde, kaç kuyu kaplanacağına göre hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Pipetleme sırasında kabarcık oluşturmayın. Kolonoid fragmanlarını oyuk başına 15 μL bazal membran matris damlasına yerleştirin.
- Kriptleri kaplayın, doku kültürü plakasını ters çevirin ve ardından plakayı 10-20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Son olarak, plakayı ters çevirin ve her bir oyuğa 500 μL tam fare kolonoid ortamı ekleyin. Ortamı, yaklaşık 3-5 gün içinde tekrar geçilebilecek kadar büyüyene kadar her gün değiştirin.
4. Kolonoid hücrelerin terminal olarak farklılaşması
- Kolonoidleri yukarıdaki gibi geçirin ve her bir oyuğa 500 μL tam fare kolonoid ortamı ekleyin.
- Geçişten en az 48 saat sonra, fare kolonoid ortamının tamamını çıkarın ve her bir oyuğa 500 μL farklılaştırıcı ortam ekleyin (bkz. bölüm 1).
- Kolonları farklılaşma ortamı ile 48 saat inkübe edin, daha sonra RNA ve protein toplanması da dahil olmak üzere deneylerde kullanılabilirler.
NOT: Kolonoidler, RNA toplanarak ve kantitatif ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yoluyla sırasıyla bir kök hücre belirteci ve hücre proliferasyon belirteci olan Lgr5 ve Ki67'nin ekspresyonunu değerlendirerek farklılaşma açısından değerlendirilebilir. Terminal olarak farklılaşmış hücreler, hücrelerin daha kök benzeri olduğu geleneksel kolonoid ortamda yetiştirilen kolonoidlere kıyasla nispeten düşük bir Lgr5 ve Ki67 ekspresyonuna sahip olmalıdır. Kolonoidlerin farklılaşma ortamında inkübe edilmesi gereken sürenin her bir laboratuvar için optimize edilmesi gerekebilir. Primerlerin listesi için Ek Tablo 1'e bakın.
5. İnflamatuar mediatörlerle farklılaşmış kolonoidlerde inflamasyonun indüklenmesi
- Kolonoidler farklılaşma ortamı ile 2-3 gün inkübe edildikten sonra, mevcut ortamı çıkarın ve her bir oyuğa 500 μL inflamasyon aracı ortamı ekleyin.
- RNA ve proteini toplamadan (veya diğer aşağı akış parametrelerini değerlendirmeden) önce kuyucukların 24-72 saat inkübe etmesine izin verin. Ortamı her gün değiştirin.
6. Yerleşik murin kolonoidlerinden türetilen bağırsak epitelyal tek tabakaları
NOT: Murin bağırsak epitelyal tek katmanları, en az iki kez geçen murin kolonoidlerinden türetilir. 3-5 gün içinde başarılı bir tek tabaka oluşumuna izin vermek için, kolonoidleri tek hücrelere ayırmamak zorunludur. Enzimatik olarak hücresel kümelere ayrışmış parçalanmış organoidler büyüme için idealdir.
- Deneye başlamadan önce tüm reaktifleri hazırlayın. Bazal membran matrisini buz üzerinde çözün. Murin tek katmanlı ortamını bölüm 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Çözülmüş bazal membranı 1:20 oranında soğuk murin tek katmanlı ortam ile seyreltin. Buzda kal.
- 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının tek bir oyuğuna 0,4 μm şeffaf hücre kültürü eki yerleştirmek için steril forseps kullanın (Malzeme Tablosu). Ek parçanın bir köşe ucunu tutun ve kuyuya aktarın. Kültür için uygun sayıda hücre kültürü eki mevcut olana kadar tekrarlayın.
NOT: Ek bir kontrol kuyusunu yalnızca bazal membran matrisi ile kapladığınızdan emin olun. Bu hücre kültürü eki, sonraki adımda (adım 6.3) açıklandığı gibi, hücreler olmadan hücre kültürü ekinin arka plan direncini ölçmek için kullanılacaktır. - Bir P200 pipeti kullanarak, her bir hücre kültürü ekinin apikal (üst) yüzeyini 150 μL seyreltilmiş bazal membran matrisi ile kaplayın. Pipet ucunu, uçun membranına dokunmadan ekin ortasına yerleştirin ve çözeltiyi nazikçe dışarı atın. Plakayı en az 1 saat boyunca% 5 CO2 içeren steril bir 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
- Kullanmadan önce bazal membran matrisini nazikçe çıkarın ve hücre kültürü eklerinin en az 10 dakika biyolojik güvenlik kabininde kurumasını bekleyin.
- Bazal membran matrisini çıkarmak için 24 oyuklu plakayı 45° açıyla döndürün. Ucu sabitlemek için tek parmağınızı çatalın köşesine yerleştirin ve bir P200 pipet kullanarak pipet ucunu ucun alt tarafına yavaşça yerleştirin ve matrisi çıkarın.
- Her bir hücre kültürü ekini Ca2+ veya Mg2+ içermeyen 150 μL steril DPBS ile yıkayarak fazla kalıntıları giderin.
- 10 dakika kuruduktan sonra, hücre kültürü ekinin altına 400 μL murin tek tabakalı ortam ve üstüne 75 μL ekleyin. Tüm hücre kültürü ekleri daldırılana kadar tekrarlayın. Plakayı biyolojik güvenlik kabininde bırakın veya ihtiyaç duyulana kadar inkübatöre geri koyun.
- 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörden 24 oyuklu olgun (büyümenin 5-5. gününde organoidler) bağırsak kolonoidleri plakasını çıkarın ve biyolojik güvenlik kabininin altına yerleştirin. Steril uçlar kullanarak ortamı çıkarın ve her birini 1 mL RT steril DPBS (Ca 2 + veya Mg2 + olmadan) ile iyice yıkayın.
NOT: 75-125 olgun kolonoidden oluşan tek bir kuyu 1:4 oranında bölünür. - Steril uçlar kullanarakCa2 + veya Mg2+ içermeyen DPBS'yi çıkarın ve geçilecek her oyuğa 500 μL RT enzimatik ayrışma reaktifi yerleştirerek bazal membran matrisinin her bir tapasını sindirin.
- Fişi kırmak için her birini yaklaşık 6-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Fişi çıkarmak için plakanın altını çizmeyin. Bunun yerine, 24 oyuklu plakayı 45°'lik bir açıyla döndürün, pipetin ucunu tapanın kenarına yerleştirin ve yavaşça yerinden çıkarın.
- 24 oyuklu plakayı 3-4 dakika boyunca steril bir 37 ° C,% 5CO2 inkübatöre geri yerleştirin.
- Plakayı çıkarın ve enzimatik ayrışma reaktifini biyolojik bir güvenlik kabini altındaki her kuyucuk için beş ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin. İlişkisiz kolonoidleri her bir kuyucuktan steril, 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Buz gibi soğuk fare yıkama ortamı ile 10 mL'lik bir hacme kadar getirin.
- Kısmen sindirilmiş kolonoidleri 300 x g'de 4°C'de 5 dakika boyunca sallanan bir kova santrifüjünde santrifüjleyin.
- Biyolojik güvenlik kabininin altında, 10 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı peletten çıkarın. Kalan ortamı bir P200 pipeti kullanarak çıkarın. Kolonoid peletini murin tek tabakalı ortamda yeniden süspanse edin. Kaplanacak parçalanmış kolonoidlerin her hücre kültürü eki başına 75 μL ortam ekleyin.
- Her hücre kültürü ekinin merkezine 75 μL kolonoid süspansiyon ekleyin. Her bir oyuğa kolonoid süspansiyonu eklemeden önce, 75 μL'yi çıkarmadan önce bir veya iki kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin, bu da daha homojen bir kaplama sağlar.
- Hücre kültürü eki boyunca homojen dağılıma izin vermek için hücre kültürü eklerine sahip 24 oyuklu plakayı 10 dakika boyunca dönen bir platforma yerleştirin.
- Plakayı steril 37°C, %5CO2 inkübatöre yerleştirin.
- Ertesi gün (Gün 1), ortamı bir P200 pipeti ile üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek bağlanmamış kolonoid parçalarını yerinden çıkarın. Bağlı bağırsak hücrelerini bozmamak için ucu yavaşça hücre kültürü ekinin iç kısmına yerleştirin. Ortama kabarcıklar sokmayın, çünkü bu, bağlanmamış tüm parçaların çıkarılmasını önler.
- Ortam ve kolonoid karışımını hemen çıkarın. Tüm hücre kültürü ekleri temizlenene kadar tekrarlayın.
- Her bir hücre kültürü ekinin apikal tarafına yavaşça 150 μL önceden ısıtılmış murin tek tabakalı ortam ekleyin. Yeni bir 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 400 μL ısıtılmış murin tek tabakalı ortam ekleyin. Steril forseps kullanarak çatalını tutarak hücre kültürü ekini yeni plakaya aktarın. Ortamı izdiham oluşana kadar her gün değiştirin.
NOT: Kolonoid fragmanları, kaplamadan 3-5 gün sonra birleşik bir tek tabaka oluşturmalıdır.
7. Tek tabakalı kültürün 3 - 5. günlerinde bir voltohmmetre kullanarak epitelyal tek tabakaların net direncinin ölçülmesi
NOT: Çubuk elektrotları forsepslere benzer ve asimetrik uzunluktadır. Probun uzun kolu bazolateral elektrottur ve daha kısa kolu apikal elektrottur. Probun, hücre kültürü ekinin içi ve dışı arasına yerleştirilmesi zor olabilir. Probun yerleştirildikten sonra hafif bir açıyla yerleştirilmesi ve ardından probun dikey olarak doğrultulması, probun sıkışmasını önleyecektir. Değerleri etkileyebileceğinden, her bir hücre kültürü ekinin net direncini benzer bir açıyla okuduğunuzdan emin olun.
- Voltohmmetreyi ve tüm reaktifleri biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin.
- Voltohmmetreyi en yakın AC prizine takın ve elektrot probunun plastik modüler konektörünü ön ekrandaki GİRİŞ jakına takın.
- Voltohmmetreyi 45° açıyla yerleştirmek için, ekipmanın arka tarafındaki metal kolu yerine kilitlenene kadar dışarı doğru çevirin.
- Şimdi, ön ekrandaki güç anahtarını YUKARI çevirerek voltohmmetreyi açın. Son olarak, bu metrikteki okumayı görüntülemek için anahtarı OHMS'ye doğru çevirin.
- 24 oyuklu plakayı 37°C, %5CO2 inkübatörden çıkarın ve plakayı biyolojik güvenlik kabinine düz bir şekilde yerleştirin. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) sıcaklığa duyarlıdır. Plakayı yalnızca TEER okunmadan hemen önce çıkarın.
- Elektrot probunu önceden ısıtılmış %70 etanol içinde 30 s ila 1 dakika arasında sterilize edin. Probu çıkarın, ters çevirin ve fazla etanolü çıkarmak için bir ila iki kez hafifçe vurun. Probun yaklaşık 30 saniye kurumasını bekleyin.
- Prob üzerinde kalan etanolü önceden ısıtılmış fare yıkama ortamıyla yıkayın.
DİKKAT: Prob üzerinde daha yüksekte kalan etanol damlacıklarının hücre kültürü ekine düşmesine izin vermeyin. Etanolü ortamla yıkarken, ortamın steril etanol alanının üzerine çıkmasına izin vermeyin. Bu, kontamine ortamın hücre kültürü ekine girmesine neden olabilir. - Probu hücre kültürü ekine dik tutun. Bazolateral elektrodu (probun daha uzun ucu) 24 oyuklu plakanın tabanına değene kadar hücre kültürü ekinin dışına yerleştirin. Apikal elektrodu (probun kısa ucu) hücre kültürü ekine kaydırın. İki elektrotun mesafesini kuyudan kuyuya değiştirmeyin. Bu, TEER ölçümünü etkileyecektir.
- TEER'i okumadan önce apikal elektrotun hücre kültürü ekinin tabanına temas etmediğini doğrulayın. Arka plan denetimi hücre kültürü ekiyle başlayın ve değeri kaydedin. Değer, voltohmmetrenin ön tarafında otomatik olarak dijital olarak görüntülenecektir.
- Her hücre kültürü eki için 7.5-7.6 arasındaki adımları yineleyin.
NOT: Hücre kültürü ekleri arasında farklı deney koşulları varsa, probu her yeni koşul arasında sterilize edin. Adım 7.1'den başlayın ve adımlarda sayısal olarak ilerleyin. - Tüm TEER ölçümleri kaydedildikten sonra 24 oyuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
- 350 Ω veya daha yüksek net değerler, tek tabaka oluşumunun göstergesidir. Tek tabaka oluşumu sağlanana kadar sonraki günlerde tekrarlayın.
NOT: Genel olarak, 3. günde 1.000 Ω veya daha büyük değerler yakalanabilir, ancak zamanla hepsi 350 Ω civarında daha düşük bir sayıya yakınsayacaktır.
8. Voltohmmetreden net direnç ölçümlerini kullanarak TEER'in hesaplanması
NOT: Kolonoidlerin başarılı tek tabaka oluşumu, 115 Ω ·cm2'den büyük TEER ölçümleri verecektir.
- Bireysel net direnç değerlerini alın ve net direnci arka plandan çıkarın. Bazal matris membranı ile kaplanmış hücre kültürü ekleri, yaklaşık 100 Ω'lik bir net okuma verecektir.
- Arka plandan çıkarılan net direnç ölçümlerini alın ve bunları hücre kültürü ekinin yüzey alanıyla çarpın. 24 oyuklu bir hücre kültürü eki, 0.33cm2'lik bir yüzey alanına sahiptir.
- Değerler 115 Ω ·cm2 veya daha büyükse, aşağı akış deneysel tahlillerine geçin.
9. Enflamatuar mediatörler ile epitelyal tek tabakalarda inflamasyonun indüklenmesi
- Başarılı tek tabakalar oluştuktan sonra, kültürün bazal tarafındaki kültüre inflamatuar mediatörler ekleyin. Adım 1.9'da açıklandığı gibi inflamasyon aracısı tek tabakalı ortamı hazırlayın ve yeni bir 24 oyuklu plakada her bir oyuğa 400 μL ekleyin.
- Ortamı hücre kültürü ekinin apikal tarafından çıkarın ve Y-27632 olmadan 150 μL murin tek katmanlı ortam ekleyin. Bu tarafı enflamatuar mediatörlerle takviye etmeyin. Bununla birlikte, hücre ölümü aşırı görünüyorsa, Y-27632'yi medyada bırakın. Bu, son kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
- Hücre kültürü eklerini yeni bir 24 oyuklu plakaya aktarın ve bunları inflamasyon aracısı tek tabakalı ortam ile desteklenmiş kuyucuklara yerleştirin.
- Deneye bağlı olarak, tek katmanları 24-72 saat boyunca enflamatuar mediatörlerle uyarın.
- Bu enflamatuar modeli kullanarak ilaç yanıtlarını test etmek için, hücre kültürü ekinin apikal tarafındaki tek katmanlı ortamı tercih edilen ilaçla destekleyin. İlaç, ilacın etki mekanizmasına ve değerlendirilecek aşağı akış parametrelerine bağlı olarak deneyin herhangi bir noktasında eklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D bağırsak kolonoid kültür sistemi, epitelin bağırsak mukozal homeostazına içsel katkısını incelemek için paha biçilmez bir araçtır. Açıklanan protokol, 8 haftalıkken C57BL/6J (WT) farelerinden kriptlerin nasıl izole edileceğine ve birden fazla aşağı akış uygulaması için manipüle edilebilen uzun vadeli bir kolonoid kültür sisteminin nasıl kurulacağına dair ayrıntılı talimatlar sağlar. Bazal membran matrisindeki kriptlerin izolasyonu ve kaplanması üzerine, kriptler parlak alan mikroskobu ile görselleştirildiğinde yapı olarak yoğun ve çok hücreli görünür. Normalde in vivo bağırsak mimarisinde gözlemlenen tek, kript benzeri yapıya benzeyen küresel veya uzun ve silindirik olabilirler (Şekil 1A). 1. Günde, kriptlerin çoğunluğu kompakt, küresel bir yapı oluşturur ve birkaç kolonoid epitel hücrelerinden yoksun bir iç lümen (boş alan) geliştirmeye başlar (Şekil 1B). Önümüzdeki birkaç gün içinde büyümeye devam ettikçe, kolonoidlerin çapları artmaya devam eder ve kolonoidlerin lümenleri daha belirgin hale gelir (Şekil 1C). 5. Günde, her kolonoid yaklaşık 100-250 μm çapındadır ve ince bir epitelyal kök hücre tabakası ile çevrili büyük, belirgin bir lümen oluşturur (Şekil 1D). Bu noktada, kolonoidler pasaj için hem enzimatik hem de mekanik olarak bozulur. İki geçişten sonra, aşağı akış deneyleri için kullanılabilirler.
DSS ile tedavi edilen farelerin kolonik kazıntılarında gözlenen metabolik değişikliklerin, aynı DSS rejimindeki farelerden türetilen kolonoidlerde tutulup tutulmadığını değerlendirmek için, 8 haftalık WT fareleri, içme suyunda% 2 DSS ile tedavi edildi. Yaş ve cinsiyet uyumlu WT kontrol hayvanlarına DSS olmadan içme suyu ad libitum verildi. 7 gün sonra, fareler sakrifiye edildi ve kolonoidler oluşturmak için hem kontrol (n = 3, erkek) hem de DSS ile tedavi edilen hayvanların (n = 3, erkek) kolonlarından kriptler izole edildi. İki pasajdan sonra, her bir kolonoid setinden protein izole edildi ve mitokondriyal biyogenezin ana düzenleyici proteini olan peroksizom proliferatör-aktivatör reseptörü-gama koaktivatörü-1α (PGC1α) ekspresyonu, western blot analizi ile değerlendirildi (Ek Şekil 1). DSS ile tedavi edilen farelerden oluşturulan kolonoidler ile kontrol farelerinden oluşturulan kolonoidler karşılaştırıldığında PGC1α ekspresyonunda anlamlı bir fark yoktu, bu da bu kolonoid kültür metodolojisinin farelerde gözlenen in vivo metabolik değişiklikleri uygun şekilde yansıtmadığını düşündürmektedir15.
PGC1α'nın bir bağırsak enflamatuar hakareti sırasında mitokondriyal biyogenezi başlatmadaki başarısızlığı öncelikle farklılaşmış kolon epitelinelokalizedir 15,19. İn vivo olarak gözlemlenen değişiklikleri yansıtmak için, kolonoidleri daha farklılaşmış bir duruma yönlendirmeye karar verdik. Bu değişimi indüklemek için, kolonoidler başlangıçta geleneksel kolonoid ortamı ile inkübe edildi. 24 saat ila 48 saat sonra, kolonoidler 48 saat daha farklılaşma ortamına geçirildi. Farklılaşma sırasında, kolonoidlerin küçük bir yüzdesi küresel bir mimariden goblet hücreleri ve kolonositler17 ile zenginleştirilmiş tomurcuklanmış yapılara geçiş yaptı (Şekil 2A,B). WRN takviyeli ortamda büyütülen kolonoidler, hızla bölünen Lgr5+ kök hücrelerle zenginleştirildi. Hem Lgr5+ kök hücrelerinin hem de diğer çoğalan hücrelerin farklılaşma sırasında hücre döngüsünden çıktığını doğrulamak için mRNA seviyeleri qPCR ile analiz edildi. Farklılaşmış kolonoidlerde (n=6) geleneksel kültür ortamında yetiştirilen kolonoidlere kıyasla (n=6; Ek Şekil 2A,B). Ayrıca, farklılaşmış kolonoidlerin esas olarak mukus salgılayan goblet hücrelerinden oluşması beklenir. Ek olarak, aslında, MUC2, geleneksel olarak yetiştirilen muadillerine kıyasla farklılaşmış kolonoidlerde yaklaşık iki kat yukarı regüle edildi (n = 3, p = 0.0433, Ek Şekil 3). Birlikte ele alındığında, bu veriler kolonoidlerin başarılı bir şekilde farklılaştığını ve aşağı akış deneyleri için hazır olduklarını göstermektedir. Daha sonra, protokolün 5. bölümünde açıklandığı gibi farklılaşma ortamına enflamatuar mediatörler eklendi. Protein ve RNA, analiz için inflamatuar mediatörlerin kullanılmasından 72 saat sonrasına kadar toplandı. Bununla birlikte, 72 saatte, zaman zaman hücre ölümünde artış gözlenmiştir.
Enflamatuar mediatörlerin farklılaşmış kolonoidlere eklenmesinin hem insan IBD'sinde hem de akut bir murin kolit modelinde gözlenen mitokondriyal biyogenez başarısızlığını taklit edip edemeyeceğini değerlendirmek için, PGC1α ve transkripsiyon faktörü A'nın protein ekspresyonu, mitokondri (TFAM), 72 saat boyunca inflamatuar mediatörlerle tedavi edilen farklılaşmış kolonoidlerde (n = 5) western blot analizi ile değerlendirildi. PGC1α ekspresyonunun kolitin murin modellerinde azaldığı gösterilmiştir, insan IBD15'te olduğu gibi. Mitokondriyal genomun hem transkripsiyonunu hem de replikasyonunu yönlendiren bir protein olan TFAM'ın da kolitin murin modellerinde azaldığı ve gen ekspresyonunun insan IBD'sinde azaldığı gösterilmiştir15,20. Bu inflamatuar mediatörlere 72 saat maruz kaldıktan sonra farklılaşmış kolonoidlerde hem PGC1α (%50.4, p = 0.0442 ) hem de TFAM (%88.9, p = 0.004) ekspresyonunda benzer bir aşağı regülasyon gözlemledik (Şekil 3). Toplu olarak, bu, farklılaşmış kolonoidlerin sitokinlerle tedavisinin, in vitro mitokondriyal dinamikleri incelemek için ideal bir model olduğunu göstermektedir.
3D kolonoid kültür ortamlarında çeşitli hücresel ve moleküler fonksiyonlar incelenebilirken, bariyer fonksiyonunu, konakçı-patojen etkileşimlerini ve oral yoldan emilen terapötiklerin inflamasyon üzerindeki etkisini değerlendirirken 2D tek katmanlı kültür sistemleri üstündür21,22. Sağlam bir bariyere sahip sürekli bir birleşik hücre tabakasının oluşturulması, farklı biyolojik veya kimyasal ajanların hücrelerin apikal ve/veya bazal tarafına kolaylıkla yerleştirilmesine izin verir. Bu protokol, iki kez pasajı yapılmış önceden var olan WT kolonoidlerinden 2D tek katmanlı kültürlerin oluşturulmasına izin verir. Enzimatik ve mekanik olarak bozulan kolonoidler, bazal membran matrisi ile kaplanmış hücre kültürü ekleri üzerine kaplanır. İlk kaplamada, parçalanmış kolonoidler 15 ila 150 hücre arasında değişen hücresel kümelerde görülür (Şekil 4A). 3. Günde, hücreler düzleşmeye ve hücre kültürü ekini yavaşça örtmeye başlamış ve genellikle birleşmeye ulaşmıştır (Şekil 4B). Önümüzdeki birkaç gün boyunca, tek katmanlar büyümeye devam eder ve TEER ile nicel olarak ölçülebilen sürekli bir bariyer oluşturur (Şekil 4C, D). İlginç bir şekilde, TEER ölçümleri 3. günden 5. güne kadar dalgalanır. Tek katmanlar daha önce geniş bir aralıkta (200-800 Ω · cm 2) daha yüksek değerlere sahiptir, ancak bu değerler 5. günde yavaş yavaş daha düşük bir sayıya yaklaşır (115-150 Ω · cm2, Şekil 5A). Tek katmanlar kararlı bir duruma ulaştığında, aşağı akış deneyleri için kullanılabilirler.
Kolonoid kaynaklı tek tabakaların inflamasyona epitelyal tepkisini karakterize etmek için, enflamatuar mediatörler 48 saat boyunca hücrelerin bazal tarafına (ekin dışına) yerleştirildi. RNA ekstrakte edildi ve çeşitli kök ve hücre farklılaşma belirteçlerinin yanı sıra bağlantı proteinlerinin mRNA seviyeleri qPCR ile analiz edildi. Her iki durumda da Lgr5 tespit edilmedi, ancak başka bir kök hücre belirteci olan mTERT, tedavi edilmemiş kontrole kıyasla iltihaplı tek tabakalarda yaklaşık% 60 oranında azaldı (Ek Şekil 4A). Daha sonra, farklılaşmış hücre tiplerinin iki belirtecinin, Muc2 ve Alkalin fosfatazın (Alpi) ekspresyonunu analiz ettik. Her iki mRNA transkripti, iltihaplı tek tabakalarda kontrol hücrelerine kıyasla daha düşüktü (Ek Şekil 4A). Hem kök hem de post-mitotik hücreler kolon inflamasyonu sırasında yaygın olarak azalır23,24,25 ve bu çalışmada elde edilen tek katmanlı modelde de benzer bir yanıt gözlenmiştir.
Tek katmanlı sistemin bir avantajı, bariyer tepkisini değerlendirme yeteneğidir. Bağışıklıkla uyarılan durumda bariyerin tehlikeye girip girmediğini belirlemek için, 48 saat sonra TEER değerlerini ölçtük. Kontrol tek katmanları (n = 2) için TEER değerleri ortalama 129.16 Ω · cm2 idi, ancak iltihaplı tek katmanlarda önemli ölçüde (p = 0.0087) ortalama 98.54 Ω ·cm2'ye düştü (Şekil 5B). Enflamatuar durumda bariyerin tehlikeye girdiğini daha fazla doğrulamak için, üç farklı sıkı bağlantı belirteci, Zo-1, Occludin ve Claudin için mRNA seviyelerini değerlendirdik. Her üç belirteç de iltihaplı durumdaki inflamasyonsuz muadillerine kıyasla daha düşük seviyelere sahipti (Ek Şekil 4B). Toplu olarak, bu veriler bariyer disfonksiyonunun iltihaplı tek tabakalarda mevcut olduğunu ve IBD patogenezi sırasında gözlenen bariyer disfonksiyonunu taklit ettiğini göstermektedir.
Şekil 1: Uzun süreli kolonoid kültürün kurulması için murin kriptlerinin ilk izolasyonu. (A) 0. günde, bazal membran matrisinde 300-500 kript kaplandı (resim kaplamadan 5 saat sonra elde edildi) ve kolonoidlerin büyümesi (B) Gün 1, (C) Gün 3 ve (D) Gün 5'te yakalandı. 5. Günde, kolonoidler geçişe hazırdı. Büyütme = 10x; ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Geleneksel kolonoid kültüründen terminal olarak farklılaşmış kolonoidlerin oluşumu. Farklılaşma besiyeri, murin kolonoidlerini geçtikten 48 saat sonra kolonoidlere yerleştirildi. (A) 24 saat ve (B) 48 saat sonra, kolonoidler terminal olarak farklılaşmış hücrelerle zenginleşir. Büyütme = 10x; ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnflamatuar mediatörlerle tedavi edilen murin farklılaşmış kolonoidlerde PGC1α ve TFAM protein ekspresyonu. Diferansiye kolonoidlere inflamatuar mediatörlerle takviye edilmiş ortam yerleştirildi ve maruziyetten 0 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra protein toplandı. (A) PGC1α'nın protein ekspresyonu 72 saat boyunca genel olarak anlamlı bir azalma gösterdi (p = 0.0442) TFAM, 72 saatte inflamatuar mediatörlere maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde aşağı regüle edildi (p = 0.004) ve (B) ANOVA ile analiz edildiğinde 24 saat, 48 saat ve 72 saatte protein ekspresyonunda düşüş eğilimi vardı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. *p < 0.05, **p < 0.005. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Önceden var olan kolonoidlerden tek tabakaların kurulması ve büyümesi. Enzimatik ve mekanik olarak bozulmuş kolonoidler, bir bazal membran matrisi ile kaplanmış hücre kültürü ekleri üzerine kaplandı. İlk kaplamadan sonra, parçalanmış kolonoidler (A) hücresel kümeler halinde ortaya çıktı ve (B) 3. Günde, düzleşmeye ve hücre kültürü ekini yavaşça örtmeye başladılar. (C) 5. ve (D) 7. günlerde, tek katmanlar TEER tarafından nicel olarak ölçülebilen sürekli bir bariyer oluşturmak için büyümeye devam etti. Büyütme = 10x; ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kolonoid kaynaklı tek tabakalar ve iltihaplı tek tabakalar oluşturmak için TEER değerleri. (A) TEER değerleri, 3. günden 5. güne kadar bir voltohmmetre kullanılarak ölçülmüştür. Tek katmanlar daha önce geniş bir aralıkta daha yüksek değerlere sahipti, ancak 5. günde yavaş yavaş daha düşük bir sayıya yaklaştı. Tek katmanlar kararlı bir duruma ulaştığında, aşağı akış deneyleri için kullanılabilirler. (B) TEER değerleri, iltihaplı tek tabakalarda (n = 2) iltihapsız kontrollere (n = 2) göre daha düşüktü. Kontrol tek katmanlarının ortalama TEER'si 129.16 ohm · cm2 idi ve iltihaplı tek katmanların TEER'si önemli ölçüde daha düşüktü (p = 0.0087), ortalama 98.54 Ωcm2, bir t-testi kullanılarak analiz edildiğinde. **p < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Çözelti kompozisyon tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: WT kontrollerinden ve% 2 DSS ile tedavi edilen farelerden izole edilen geleneksel kolonoid ortamında yetiştirilen murin kolonoidlerinde PGC1α protein ekspresyonu. Kolonoidler, 7 gün sonra hem 8 haftalık WT kontrol farelerinden hem de %2 DSS ile tedavi edilen farelerden elde edildi. Protein, kolonoidlerden iki kez ve kaplamadan sonraki 4. günde izole edildi. Eşlenmemiş bir t-testi ile analiz edildiğinde, 7 gün boyunca% 2 DSS'ye maruz kalan farelere kıyasla, kontrol farelerinden türetilen kolonoidlerde PGC1α protein ekspresyonunda (p = 0.9996) fark yoktu. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Farklılaşmış kolonoidlerde azaltılmış Lgr5 ve Ki67 mRNA ekspresyonu. 48 saat önce geçen murin kolonoidleri, RNA ve cDNA sentezini izole etmeden önce 48 saat boyunca farklılaşma ortamına maruz bırakıldı. mRNA düzeyleri qPCR ile belirlendi ve karşılaştırmalı BT yöntemi ile analiz edildi. (A) Lgr5 ve (B) Ki67, t-testi kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildiğinde diferansiye kolonoidlerde anlamlı olarak azaldı (p = 0.0023, p = 0.0007). Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur.**p < 0,005. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Farklılaşmış murin kolonoidlerinde artan müsin salgılayan kadeh hücreleri. 48 saat önce geçen murin kolonoidleri, 48 saat boyunca farklılaşma ortamına maruz bırakıldı. Hücreler RIPA tamponunda parçalandı ve protein western blot analizi ile görüntülendi. (A) MUC2 ekspresyonu, farklılaşmamış kolonoidlere kıyasla her bir farklılaşmış kolonoid setinde artmıştır. (B) Farklılaşma koşullarında MUC2 proteininde yaklaşık iki kat değişiklik gözlendi, bu da bir t-testi kullanılarak analiz edildiğinde anlamlıydı (p = 0.0433). Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. *p < 0,05. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: İnflamatuar mediatörlerle tedavi edilen tek tabakalarda gövde ve farklılaşma belirteçlerinin yanı sıra sıkı bağlantı belirteçlerinin ekspresyonunun azalması. Murin kolonoid kaynaklı tek tabakalar (Gün 5) 48 saat boyunca inflamatuar mediatörlere maruz bırakıldı, daha sonra RNA toplandı ve cDNA sentezlendi (n = 2). Kök, diferansiyasyon ve kavşak belirteçlerinin mRNA seviyeleri qPCR ile belirlendi ve karşılaştırmalı BT yöntemi ile analiz edildi. (A) Kök hücre belirteci Lgr5 her iki durumda da tespit edilmedi, ancak enflamatuar koşullarda mTERT önemli ölçüde azaldı. Goblet hücre markörü Muc2 ve kolonosit markörü Alpi, tedavi edilmemiş tek tabakalara kıyasla iltihaplı tek tabakalarda azalmıştır. (B) Sıkı bağlantı belirteçleri, Zo-1, Occludin ve Claudin, kontrole kıyasla enflamatuar ile muamele edilmiş tek katmanlarda daha düşüktü. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Primerlerin listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organoid gelişimi, bilimsel topluluğun organ sistemlerini in vitro olarak inceleme biçiminde devrim yarattı ve hücresel yapıyı ve işlevi bir tabaktaki bir hayvandan veya insandan kısmen özetleme yeteneği ile değiştirdi. Ayrıca, hastalıkları olan insanlardan elde edilen organoid sistemler, terapötik karar verme sürecine rehberlik edebilecek kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir araç sunmaktadır. Burada, iyi çalışan bir kript izolasyon protokolünü açıklıyoruz ve kaplamadan önce izolasyondaki fazla kalıntıların temizlenmesine izin veren temel adımları tanıtıyoruz. Ek olarak, süreçte genellikle gözden kaçan önemli bir ayrıntıyı açıklıyoruz: kaplama için kriptoları doğru bir şekilde sayma yeteneği. Kolonoidler kurulduktan sonra, IBD sırasında bağırsak epitelindeki değişiklikleri inceleme yeteneğini artırabilecek hücresel farklılaşmalarına veya tek tabaka oluşumuna izin veren anahtar manipülasyonları özetliyoruz.
Memelilerde kolon epitelinde yer alan kript-villus ekseni, farklı işlevlere sahip farklı hücre tiplerinden oluşan kompleks bir yapıdır. Bu eksenin bakımı, birlikte epitelyal homeostazın korunmasına yardımcı olan hem içsel hem de dışsal hücresel faktörlere bağlıdır18. Geleneksel ortamda yetiştirilen murin kolonoidlerinin, hem kök hücrelerin hem de in vivo olarak görülen terminal olarak farklılaşmış hücrelerin kümelenmesinin aksine, öncelikle kök hücreleri yansıttığını belirtmiştik. Ayrıca, bu şekilde yetiştirilen ve bakımı yapılan murin kolonoidleri, düz tek tabakaların aksine dairesel yapılardır. Bu farklılıkların bağırsak hastalığını in vitro olarak inceleme girişimlerimiz için potansiyel etkileri vardır. Spesifik olarak, bariyer fonksiyonundaki değişiklikleri ve ayrıca inflamasyonun terminal olarak farklılaşmış bağırsak epitel hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için organoidleri kullanma yeteneğimiz sınırlıdır.
Burada, kolonoidleri büyütmek için sadece murin kriptlerinin izolasyonu için değil, aynı zamanda bağırsak epitel fizyolojisini ve inflamasyona epitel tepkisini incelemek için bu kolonoidlerin manipülasyonu için protokolleri açıklıyoruz. Pluripotent kök hücrelerin ve terminal olarak farklılaşmış hücrelerin gradyanını destekleyen birkaç dışsal faktör arasında, kriptler açısından zengin olan ve kök hücre sağlığını destekleyen Wnt kanonik yolu bulunur. Wnt sinyali, kript ekseninin ucunda azalır ve kök hücrelerin terminal olarak farklılaşmış hücrelere evrimi ile çakışır26. Kolonoid hücrelerin terminal farklılaşmasına izin veren bir protokol tanımladık. Diğerleri gibi, Wnt'yi büyüme ortamından çıkararak farklılaşırız, ancak daha düşük bir R-spondin konsantrasyonu kullanırız (500 ng / mL'ye karşı 1 μg / mL R-spondin)17. Şaşırtıcı bir şekilde, R-spondin'de% 50'lik bir azalma, organoidlerin başarılı bir şekilde farklılaşmasını etkilemez. Daha düşük bir konsantrasyonla farklılaşma yeteneği, in vivo fizyolojik ortama daha yakından benzeyebilecek daha az yapay bir sistem oluşturmaya yardımcı olur. Bu protokol sonlu terminal farklılaşmasına (Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3) ve hücresel ölümsüzlüğün sürdürülememesine neden olsa da, yine de kolonositler, enteroendokrin hücreler ve goblet hücreleri dahil olmak üzere terminal olarak farklılaşmış epitelin IBD ve diğer hastalık durumlarına fizyolojik katkısını daha iyi anlamak için yararlı bir yöntemdir. Ayrıca, IBD'li hastalarda geleneksel olarak yükselen spesifik sitokinlerin bu ortama eklenmesinin, farklılaşmış organoid sistemi inflamatuar bir duruma yönlendirdiğini gösteriyoruz. 72 saat boyunca, inflamatuar sitokinlerle tedavi edilen farklılaşmış kolonoidler, diğer yerleşik kolit ve insan IBD modellerinde gösterilen bazı metabolik bulguları daha yakından yansıtır (Şekil 3). Ayrıca, bu şekilde tedavi edilen farklılaşmış kolonoidler, inflamasyonun farklılaşmış epitel üzerindeki hücresel homeostaz üzerindeki etkilerini muhtemelen daha fazla yansıtmaktadır. Ayrıca, epitelin hem apikal hem de bazal tarafının oluşumunu sağlayan ve in vivo bariyer fonksiyonunun analizine izin veren tek tabakalar geliştirmek için bir protokol belirledik. Bu sistem, farklılaşmaya gerek kalmadan bariyer disfonksiyon mekanizmalarının incelenmesinde ve tedavi için yeni terapötik hedeflerin geliştirilmesinde yararlıdır.
Yukarıda açıklanan protokollerle ilgili çeşitli sınırlamalar ve olası tuzaklar not edilmelidir. Kriptlerin başarılı bir şekilde izole edilmesi ve kolonoidlerin gelişimi, her bir hayvandan elde edilen kript verimi, kriptleri saymanın doğruluğu ve preparatın temizliği ile sınırlandırılabilir. Resüspansiyondan sonra izole edilen kriptleri sayma hızı, kriptlerin altta yatan muskularisten mekanik ayrışmasındaki varyasyonlar ve yıkama ve santrifüj dönüşlerinin sayısı başarılı kolonoid kültüre katkıda bulunur. Ayrıca, 2D tek katmanlı kültür için pasaj veya kaplama sırasında organoidlerin tek hücrelere tam olarak ayrılmaması çok önemlidir. 30 ila 50 hücreden oluşan kümeler, kültürün uzun süreli kültür için yayılmasına izin vermek için idealdir. Yukarıdaki protokoller, olası tuzak alanlarını ve bu sorunları gidermek için isteğe bağlı ek adımları not eder. Sonuç olarak, protokol, beceri seti ve manevralardaki (yani sallama) doğal değişkenliğin yanı sıra her bir hayvandaki varyasyon nedeniyle izolasyonu gerçekleştiren birey tarafından optimizasyon gerektirebilir. IBD'de bulunan genetik ve moleküler çeşitliliği yakalamak için son kullanıcı tarafından ek optimizasyon gerekebilir.
Sonuç olarak, kolonoid sistem, insan fizyolojisinin ve hastalığının temel yönlerini in vivo olarak özetlemek için oldukça yararlı bir araç olsa da, bu sistem nihayetinde insan hastalığının tüm yönlerini inceleme yeteneğiyle sınırlıdır. Kolon gelişimi için geleneksel yöntemler, kök hücre dinamiğinin temel yönlerini aydınlatmıştır; Bununla birlikte, bu bulgular genellikle konak epiteli içindeki terminal farklılaşmış hücrelerdeki bulguları yeterince yansıtmaz. Bu çalışmada özetlenen stratejiler, araştırmacılara, uygun şekilde kullanıldığında, inflamasyon sırasında bağırsak epitel yapısının ve fonksiyonunun temel yönlerine ışık tutabilecek organoid manipülasyon için nispeten hızlı ve ucuz bir model sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Katkıda bulunan yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe R01DK120986 (KPM'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
References
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
- Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
- Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
- Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
- Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
- Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
- Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
- Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
- Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
- Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
- Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
- Komiya, Y., Habas, R.
