Summary
Presentiamo un protocollo che può essere utilizzato per condurre test terapeutici sui farmaci con organoidi di carcinoma ovarico derivati da pazienti.
Abstract
Il carcinoma ovarico è un tumore ginecologico fatale e la quinta causa di morte per cancro tra le donne negli Stati Uniti. Lo sviluppo di nuovi trattamenti farmacologici è fondamentale per far progredire l'assistenza sanitaria e migliorare gli esiti dei pazienti. Gli organoidi sono organi in miniatura multicellulari tridimensionali in vitro. I modelli di organoidi derivati dal paziente (PDO) del carcinoma ovarico possono essere ottimali per lo screening farmacologico perché ricapitolano in modo più accurato i tessuti di interesse rispetto ai modelli di coltura cellulare bidimensionale e sono poco costosi rispetto agli xenotrapianti derivati dal paziente. Inoltre, i PDO per il carcinoma ovarico imitano il microambiente tumorale variabile e il background genetico tipicamente osservati nel carcinoma ovarico. Qui viene descritto un metodo che può essere utilizzato per testare farmaci convenzionali e nuovi su PDO derivati dal tessuto tumorale ovarico e dall'ascite. Un test di adenosina trifosfato (ATP) basato sulla luminescenza viene utilizzato per misurare la vitalità, il tasso di crescita e la sensibilità ai farmaci. Gli screening farmacologici nelle DOP possono essere completati in 7-10 giorni, a seconda del tasso di formazione di organoidi e dei trattamenti farmacologici.
Introduction
Sebbene raro, il carcinoma ovarico è uno dei tumori ginecologici più letali 1,2. Una sfida nello sviluppo di nuovi trattamenti è che il carcinoma ovarico è eterogeneo e il microambiente tumorale differisce notevolmente tra le pazienti. Inoltre, molti tumori ovarici sviluppano resistenza alla chemioterapia a base di platino e agli inibitori della polimerasi (ADP-ribosio), evidenziando la necessità di maggiori opzioni terapeutiche 3,4,5.
Un approccio che può essere utile nell'identificazione di nuove terapie è l'utilizzo di organoidi derivati da pazienti (PDO). Gli organoidi sono ammassi tridimensionali di più tipi cellulari che si auto-organizzano e formano in vitro "mini-organi"6,7,8,9,10. Gli organoidi sono in grado di ricapitolare importanti profili di morfologia tissutale e di espressione genica11,12. Alcuni dei primi organoidi sono stati derivati da cellule tumorali intestinali, gastriche e del colon di topi e esseri umani 8,9,13. Le colture di organoidi di lunga durata sono state stabilite da una vasta gamma di tessuti benigni e maligni, tra cui la vescica, il colon, lo stomaco, il pancreas, il cervello, la retina e il fegato 14,15,16. In precedenza abbiamo dimostrato metodi per stabilire PDO da tumori e asciti del cancro ovaricocampioni 17. I PDO possono essere utilizzati per studiare le caratteristiche molecolari, i meccanismi cellulari e i nuovi trattamenti farmacologici 18,19,20. I PDO presentano diversi vantaggi rispetto alle tradizionali colture cellulari primarie bidimensionali per lo screening farmacologico. Sebbene le colture bidimensionali primarie siano un metodo a basso costo per gli screening farmacologici, le colture cellulari primarie sono tipi a singola cellula e mancano dell'architettura tridimensionale dei tumori 21,22,23. Ciononostante, i PDO sono una risorsa preziosa e sono necessari protocolli efficaci in termini di costi per ottimizzarne l'uso nello screening terapeutico dei farmaci.
Questo articolo descrive un metodo in vitro per utilizzare i PDO del cancro ovarico per testare gli effetti di farmaci noti o candidati. Mentre gli attuali screening farmacologici a medio e alto rendimento che utilizzano PDO richiedono costosi strumenti di dispensazione automatizzati 24,25,26, questo metodo economico utilizza forniture di laboratorio di base prontamente disponibili e un test di vitalità cellulare basato su ATP in un formato standard a 96 pozzetti (Figura 1A). Questo metodo faciliterà i test preliminari di nuovi farmaci per il cancro ovarico prima di passare a schermi più grandi27,28. Sebbene in questo caso vengano utilizzati i PDO per il cancro ovarico, questo metodo può essere applicato ad altri modelli di organoidi tumorali.
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Protocol
La raccolta di campioni umani per questa ricerca è stata approvata dal Washington University School of Medicine Institutional Review Board. Tutte le pazienti eleggibili di età superiore ai 18 anni avevano una diagnosi o una presunta diagnosi di carcinoma ovarico sieroso di alto grado ed erano disposte e in grado di fornire il consenso informato. Il tessuto tumorale da siti primari o metastatici, oltre all'ascite e al liquido pleurico, è stato ottenuto da pazienti consenzienti al momento della cura.
1. Selezione di DOP consolidate per il saggio di vitalità
NOTA: Tipicamente, questi organoidi si trovano all'interno dei primi cinque passaggi. Come descritto in precedenza, i PDO del carcinoma ovarico si formano risospendendo la sospensione di cellule primarie nell'estratto di membrana basale (BME) come Cultrex o Matrigel17 (vedere Tabella dei materiali).
- I PDO dovrebbero avere un tempo di raddoppio percepito di 24-72 ore per la migliore efficienza del saggio. Stimare il tempo di raddoppio percepito determinando visivamente il numero di giorni necessari alla formazione degli organoidi dopo il passaggio/placcatura.
NOTA: In base alla nostra esperienza, gli organoidi che impiegano più di tre giorni per formarsi non possono essere utilizzati per questo test di inibizione della crescita. - Identificare i farmaci e selezionare un intervallo di concentrazioni da testare (ad esempio, carboplatino, 0-50 μM, vedere la tabella dei materiali).
- Determinare l'impostazione della piastra. Questo test sarà eseguito in triplice copia, limitando il numero di farmaci e le concentrazioni che possono essere testate su una piastra.
NOTA: Le linee PDO selezionate devono essere attentamente osservate prima di eseguire il test. I PDO per carcinoma ovarico consolidati formano sfere solide e cave multicellulari con forme di gemmazione simili a quelle di un tumore (Figura 1B). La morfologia della DOP, il profilo genomico, ecc., devono essere confrontati con quelli del campione del paziente (quando possibile) prima di eseguire il test29-33. I PDO del carcinoma ovarico possono essere generati da campioni di tumore primario e metastatico e ascite17.
2. Preparazione dei reagenti per il saggio di vitalità
- Terreni di base: Al DMEM/F12 avanzato, aggiungere l'1% (v/v) di penicillina-streptomicina, 1x glutamax e l'1% (v/v)HEPES17 (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare i terreni organoidi avanzati per gli organoidi del carcinoma ovarico seguendo il rapporto17 pubblicato in precedenza.
3. Placcatura di organoidi (~Giorno -2)
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito 1-3 giorni prima dell'aggiunta dei farmaci. Prima di iniziare, riscaldare tutti i reagenti (terreni di base, terreni organoidi avanzati e reagenti di dissociazione degli organoidi; vedere la tabella dei materiali) a 37 °C a bagnomaria. Scongelare il BME a bagnomaria ghiacciato.
- Utilizzare un microscopio in campo chiaro per verificare se gli organoidi di interesse sono confluenti al 70%-90%.
NOTA: Si consiglia di salvare le immagini degli organoidi per riferimento futuro. - Aggiungere 1-2 mL di terreno di base riscaldato al pozzetto contenente gli organoidi e pipettare su e giù per dissociare meccanicamente gli organoidi contenenti BME. Trasferire l'intera soluzione in una provetta conica da 15 mL17.
NOTA: In genere, 1-2 mL di terreno sono sufficienti per diluire correttamente il BME. Gli organoidi dello stesso paziente e dello stesso passaggio possono essere combinati. - Vorticare per 5-10 s per dissociare ulteriormente le cellule e centrifugare a 1107 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere il surnatante con una pipetta monocanale e gettarlo. Risospendere gli organoidi in un reagente di dissociazione degli organoidi da 1 mL (vedere Tabella dei materiali) e trasferirli in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Incubare per 7 minuti a 37 °C.
- Se il pellet è ancora gelatinoso a causa del BME rimanente, aggiungere un ulteriore 1 mL di terreno di base, vorticare per 5-10 s e ripetere la centrifugazione.
- Centrifugare a 1107 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere ed eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di base.
- Contare il numero di cellule in ciascuna coltura PDO utilizzando un contatore automatico di cellule (vedi Tabella dei materiali) o un emocitometro.
- Risospendere le cellule a 20.000 cellule per 10 μL di terreno di base al 25% e BME al 75%. A tale scopo, risospendere gli organoidi nel terreno e mescolarli con BME.
- Inserire una gocciolina da 3 μL di cellule BME + PDO risospese in un pozzetto di una piastra nera opaca a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali). Posiziona le goccioline al centro di ogni pozzetto. Placcare ogni concentrazione di farmaco in triplice copia.
NOTA: Poiché il test di vitalità cellulare è basato sulla luminescenza, è meglio utilizzare lastre nere opache per evitare lo sfondo. Le piastre trasparenti possono essere utilizzate per visualizzare gli organoidi durante il saggio, ma il fondo delle piastre deve essere coperto con nastro adesivo opaco prima di misurare la luminescenza. - Piastra di incubazione in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per 15 min.
- Aggiungere 100 μL di terreno organoide avanzato a ciascun pozzetto. Piastra di incubazione per 24-72 h (determinare in base al tempo di raddoppio della PDO percepito). Aggiungere 100 μL di terreno Advance Organoid in un pozzetto vuoto da utilizzare come bianco.
NOTA: L'obiettivo è quello di consentire la formazione di organoidi. - Facoltativo: per l'analisi del tasso di crescita, mettere in una piastra separata ulteriori PDO triplicati. Questo verrà utilizzato per contare le cellule a Tempo = 0 e deve essere analizzato il giorno 0 utilizzando il test di vitalità descritto nel Paragrafo 5.
4. Aggiunta di farmaci per il test di vitalità il giorno 0
NOTA: Il giorno 0 si riferisce al giorno in cui i farmaci vengono aggiunti agli organoidi completamente formati.
- Diluire i farmaci selezionati in Advance Organoid Media alle concentrazioni desiderate. Le diluizioni possono essere effettuate in provette da 1,5 mL o in una piastra a 96 pozzetti preimpostata, che consentirebbe l'uso di una pipetta multicanale per l'erogazione del terreno.
NOTA: I farmaci devono essere risospesi nel solvente suggerito dal produttore, come il dimetilsolfossido. Per questo studio, sono state effettuate le seguenti diluizioni di carboplatino in Advance Organoid Media: 1, 5, 10, 25, 50 e 75 μM. - Rimuovere il terreno da ciascun pozzetto con una pipetta monocanale o multicanale, facendo attenzione a non toccare o disturbare la gocciolina PDO/BME.
- Aggiungere 100 μL di Advance Organoid Media e il farmaco o i farmaci desiderati a ciascun pozzetto. Assicurarsi di aggiungere terreno fresco ai tre pozzetti di controllo.
NOTA: Le concentrazioni del farmaco variano e dipendono dalla domanda scientifica e dal meccanismo d'azione del farmaco. Quando decidiamo quali concentrazioni utilizzare, iniziamo con le concentrazioni di farmaco precedentemente stabilite in linee cellulari 2D comparabili (ad esempio, linee cellulari di carcinoma ovarico immortalizzate). Potrebbe essere necessario aumentare le concentrazioni se non vi è alcun effetto osservato sugli organoidi. - Aggiornare i terreni e i farmaci secondo necessità (ripetere i passaggi 4.1-4.3). La necessità di aggiornare il terreno dipende dalla durata del test, dall'attività biologica del farmaco e dall'emivita del farmaco. Per i saggi di una settimana, i terreni dovranno essere aggiornati almeno una volta.
5. Terminare il test di vitalità per la lettura (~Giorno 7)
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito nei giorni 7-10. La durata del test deve essere determinata in base all'emivita e alla farmacodinamica dei farmaci testati.
- Lasciare che i reagenti del saggio di vitalità raggiungano la temperatura ambiente al buio. Conservare i reagenti a 4 °C per una notte (al buio) per ridurre il tempo di scongelamento.
- Rimuovere la piastra del saggio dall'incubatore per colture cellulari e lasciarla acclimatare a temperatura ambiente per 30 minuti. La piastra non deve acclimatarsi al buio.
- Aggiungere 100 μL di reagente per il saggio di vitalità (vedere la tabella dei materiali) in ciascun pozzetto (per un volume totale di 200 μL) e posizionare su uno scuotitore per piastre per 5 minuti (80 giri/min). Rimuovere la piastra dallo shaker e incubare per altri 25 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che la piastra sia sempre protetta dalla luce coprendola con un foglio o una scatola opaca.
- Accendere il lettore di piastre a bioluminescenza e aprire il software i-control (vedere la tabella dei materiali).
- In Connetti a: Nome strumento, seleziona infinite 200Pro.
- Selezionare Luminescenza e Script predefinito.
- Dal menu a discesa, scegliere il tipo di piastra [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
- Determinare quali pozzetti leggere ed evidenziare i pozzetti corrispondenti in Parte di piastra.
- In Misure sul lato sinistro dello schermo, trascina e rilascia Luminescenza sotto la Parte del piatto.
- Selezionare i parametri di luminescenza: Attenuazione: NONE; Tempo di integrazione: 1000 ms; Tempo di assestamento: 0 ms.
- Rimuovere il coperchio dalla piastra e caricarlo nel lettore di piastre. Premere Start per iniziare.
- Al termine, esporta i dati e salva.
6. Analisi dei dati
- Calcolare la percentuale di vitalità cellulare.
- Sottrai il "Bianco" da ogni pozzetto per le letture corrette del bianco. Successivamente, calcola la media di controllo calcolando la media dei tre pozzetti di controllo.
- Utilizzare la seguente equazione per calcolare la percentuale di cellule vitali in ciascun pozzetto: (Pozzetto sperimentale / Media di controllo) x 100
- Rappresentare graficamente i dati risultanti nel software di analisi (vedere la tabella dei materiali).
- Esamina le metriche del tasso di crescita (GR).
- Calcola manualmente le metriche GR in base al report pubblicato34.
- In alternativa, utilizzare il calcolatore GR online (vedere Tabella dei materiali) per generare le metriche35. Utilizzare le misurazioni del giorno 0 come "cell_count_time0", che riflettono il tasso di crescita delle DOP non trattate.
- Esporta dati e grafico.
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Representative Results
Questi risultati illustrano la risposta di due PDO al farmaco chemioterapico carboplatino, che viene utilizzato per trattare il cancro ovarico. Gli organoidi sono stati derivati dalla biopsia tumorale (PDO #1) e dall'ascite (PDO #2). Questi organoidi sono stati selezionati in base al loro tempo di raddoppio percepito (1-2 giorni) e all'aspetto morfologico (formazione di molti organoidi di grandi dimensioni). Sia il PDO #1 che il PDO #2 sono stati placcati il giorno -2, al passaggio due, e il carboplatino è stato aggiunto il giorno 0. Sono state testate le seguenti concentrazioni di carboplatino diluite in Advance Organoid Mezz: 1, 5, 10, 25, 50 e 75 μM. Al termine dell'esperimento, il giorno 7, il reagente del test di vitalità è stato aggiunto alla piastra e i risultati sono stati analizzati. La Figura 2A illustra la percentuale di cellule vive dopo il trattamento con carboplatino.
Successivamente, il GR Calculator online è stato utilizzato per analizzare i dati. In assenza di dati sulla conta cellulare, sono stati utilizzati i valori di luminescenza misurati nel test di vitalità. Dopo aver esportato le metriche GR, sono stati rappresentati graficamente i valori GR, che sono i rapporti tra i tassi di crescita percepiti in condizioni trattate e non trattate normalizzate a una singola divisione cellulare34. Questi valori sono stati poi confrontati con le concentrazioni di carboplatino (Figura 2B). La Tabella 1 riassume le metriche GR, compresi i rispettivi tempi di raddoppio delle cellule di controllo e trattate e l'Area GR Over the Curve (GRAOC), che integra la curva dose-risposta su un intervallo di concentrazioni di carboplatino testate34. La sensibilità a un particolare farmaco può essere determinata interpretando il valore GR50 , corrispondente alla concentrazione alla quale il farmaco ha un effetto semimassimale. Ad esempio, il valore GR50 per PDO #1 è molto più alto di quello per PDO #2 (4,85 μMcontro 0,97 μM), indicando che PDO #1 è più resistente alla chemioterapia a base di platino rispetto a PDO #2.
Figura 1: Organoidi derivati dal paziente prima dello screening farmacologico. (A) Schema sperimentale per lo screening dei farmaci DOP. Dato il tempo di raddoppio della linea PDO e il tempo di esposizione al farmaco, potrebbe essere necessario modificare il piano sperimentale. (B) Immagini rappresentative in campo chiaro (40x) di due linee PDO per carcinoma ovarico (#1 e #2). Barra graduata = 50 μm. Abbreviazioni: PDO = organoidi derivati da pazienti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi del carcinoma ovarico PDO dopo trattamento con carboplatino. (A) Due linee di PDO sono state trattate con concentrazioni crescenti di carboplatino per sette giorni. L'asse X mostra la concentrazione di carboplatino; l'asse Y mostra la % di cellule vive normalizzate per controllare gli organoidi (senza carboplatino). I saggi sono stati completati in triplice copia con due repliche biologiche. Le barre di errore indicano la deviazione standard. (B) Grafico del valore GR che rappresenta la concentrazione logaritmica di carboplatino (asse x) e il valore GR (asse Y). Questi valori sono stati generati nel calcolatore GR online. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Trattamento | Tempo di raddoppio della cella di controllo | Tempo di raddoppio delle cellule trattate | GR50 | GR_AOC | |
| DOP #1 | Carboplatino | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| DOP #2 | Carboplatino | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tabella 1: Tabella che illustra il tempo di raddoppio della cella di controllo, il tempo di raddoppio della cella trattata, GR50 e GR_AOC valori generati nel calcolatore GR. Abbreviazioni: PDO = organoidi derivati dal paziente, GR = tasso di crescita GR_AOC = area del tasso di crescita sulla curva.
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Discussion
Questo articolo descrive un metodo che può essere utilizzato per valutare gli effetti terapeutici di farmaci convenzionali o nuovi sui PDO del carcinoma ovarico. I ricercatori devono considerare diverse questioni prima di condurre il test di vitalità nel modello DOP.
Innanzitutto, quando si seleziona un PDO da utilizzare nel test di vitalità, è necessario determinare il tipo di organoide ideale (tumore vs. ascite) e il numero di passaggio per le proprie esigenze. In base alla nostra esperienza, le DOP derivate dall'ascite crescono più rapidamente e sono più facili da generare rispetto alle DOP derivate dal tumore. Poiché questo test dipende dal tasso di crescita, l'utilizzo di organoidi che impiegano molto tempo per formarsi/crescere può essere difficile. Abbiamo utilizzato con successo solo linee DOP con tempi di raddoppio inferiori a 4 giorni.
In secondo luogo, in questo studio sono state utilizzate piastre nere opache a 96 pozzetti. Poiché il test di vitalità dell'ATP è basato sulla luminescenza, i pozzetti trasparenti ridurranno l'intensità del segnale e genereranno contaminazione del segnale. Le piastre inferiori trasparenti e con pareti opache consentono la visualizzazione degli organoidi durante il saggio e possono aiutare a monitorare i cambiamenti indotti dal trattamento nella morfologia cellulare. Sebbene sia un punto di forza correlato al costo, un limite di questo test è l'utilizzo di una piastra a 96 pozzetti, che limita il numero di campioni e farmaci che possono essere valutati contemporaneamente.
In terzo luogo, il numero di cellule placcate deve essere attentamente considerato e ottimizzato per i saggi di vitalità. Ciò è particolarmente vero a causa del tasso di crescita variabile delle linee DOP; Troppo poche cellule non formeranno organoidi e troppe cellule porteranno a una crescita eccessiva di organoidi. Per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, è stato utilizzato un contatore automatico di cellule che ha mantenuto lo stesso rapporto BME/media (75:25). Questa alta percentuale di BME assicura che le goccioline rimangano solidificate per l'intera durata del saggio. Qui, 3 μL di goccioline di BME sono state posizionate al centro del pozzo. Sebbene la dimensione della gocciolina possa essere aumentata, si consiglia di non rivestire l'intero pozzo. Il rivestimento dell'intero pozzo farà sì che gli organoidi si depositino nei bordi del pozzo, il che impedirà la loro crescita complessiva e influenzerà i risultati del saggio di vitalità. Il posizionamento decentrato della gocciolina va bene purché non tocchi i bordi del pozzetto.
In quarto luogo, l'autopipettaggio introduce l'errore umano, ma questo può essere superato con l'attenzione ai dettagli e l'inclusione di ulteriori pozzetti di controllo.
Infine, la lunghezza del test deve essere accuratamente selezionata. L'esposizione prolungata ai farmaci influenzerà la vitalità dei DOP, indipendentemente dal meccanismo d'azione del farmaco. Per questo motivo, è importante testare una serie di concentrazioni di farmaci per un minimo di cinque giorni. È importante decidere se sarà necessario cambiare il terreno per periodi più lunghi perché livelli ridotti di fattori di crescita ostacoleranno gli effetti dei farmaci36. Per esaminare se il terreno dovrà essere cambiato durante il test, è necessario confrontare i risultati dei controlli del giorno 0 e del giorno 7. I controlli PDO non trattati devono continuare a crescere continuamente durante il test.
Poiché i PDO continuano a progredire in complessità e a ricapitolare meglio i loro tessuti di origine, il loro uso dovrebbe migliorare la scoperta di farmaci. Tuttavia, è probabile che le DOP rimangano una risorsa preziosa e richiedano metodi efficaci in termini di costi per preservarne e ottimizzarne l'uso. A differenza delle tecniche a medio e alto rendimento, questo protocollo può essere utilizzato per testare composti noti e nuovi a costi inferiori con materiali e attrezzature prontamente disponibili. Infine, questo metodo può essere facilmente adattato a diversi modelli di organoidi tumorali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Cancer Institute del National Institutes of Health con il numero di premio R01CA243511. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Gli autori ringraziano Deborah Frank per i suoi commenti editoriali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
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