Summary
Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.
Abstract
De luchtwegepitheelcellaag vormt de eerste barrière tussen longweefsel en de buitenomgeving en wordt daardoor voortdurend blootgesteld aan ingeademde stoffen, waaronder infectieuze agentia en luchtverontreinigende stoffen. De luchtwegepitheellaag speelt een centrale rol bij een grote verscheidenheid aan acute en chronische longziekten en verschillende behandelingen gericht op dit epitheel worden toegediend door inademing. Het begrijpen van de rol van epitheel in pathogenese en hoe het kan worden gericht voor therapie vereist robuuste en representatieve modellen. In vitro epitheliale cultuurmodellen worden steeds vaker gebruikt en bieden het voordeel van het uitvoeren van experimenten in een gecontroleerde omgeving, waarbij de cellen worden blootgesteld aan verschillende soorten stimuli, toxische stoffen of infectieuze agentia. Het gebruik van primaire cellen in plaats van vereeuwigde of tumorcellijnen heeft als voordeel dat deze cellen in cultuur differentiëren tot een pseudogestratificeerde gepolariseerde epitheelcellaag met een betere weergave van het epitheel in vergelijking met cellijnen.
Hier wordt een robuust protocol gepresenteerd, dat de afgelopen decennia is geoptimaliseerd, voor de isolatie en kweek van luchtwegepitheelcellen uit longweefsel. Deze procedure maakt succesvolle isolatie, expansie, cultuur en mucociliaire differentiatie van primaire bronchiale epitheelcellen (PBECs) mogelijk door te kweken op de lucht-vloeistofinterface (ALI) en omvat een protocol voor biobanking. Verder wordt de karakterisering van deze culturen met behulp van celspecifieke markergenen beschreven. Deze ALI-PBEC-culturen kunnen worden gebruikt voor een reeks toepassingen, waaronder blootstelling aan hele sigarettenrook of ontstekingsmediatoren, en co-cultuur / infectie met virussen of bacteriën.
Het protocol in dit manuscript, dat de procedure stapsgewijs illustreert, zal naar verwachting een basis en / of referentie bieden voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het implementeren of aanpassen van dergelijke kweeksystemen in hun laboratorium.
Introduction
De rol van het luchtwegepitheel bij een verscheidenheid aan acute en chronische longziekten is beschreven in verschillende beoordelingen 1,2,3,4,5,6,7. Goed gedifferentieerde culturen van luchtwegepitheelcellen zijn een belangrijk hulpmiddel om de rol van het luchtwegepitheel te ontrafelen. Air-liquid interface (ALI) luchtwegepitheelcelcultuur wordt breed toegepast om de differentiatie van basale epitheelcellen van de luchtwegen te bevorderen en daardoor het luchtwegepitheel betrouwbaar in vitro 8,9 te bestuderen. In de afgelopen jaren is het gebruik van dergelijke modellen nog verder toegenomen als gevolg van nieuwe onderzoeksinitiatieven met betrekking tot de COVID-19-pandemie en een wereldwijde overgang naar proefdiervrij onderzoek. Daarom benadrukt het toegenomen gebruik van deze modelcellijn de noodzaak van het delen van procedures en ervaringen om robuuste resultaten te verkrijgen. Dit zal ook de vergelijking van resultaten tussen onderzoeksgroepen mogelijk maken. De robuustheid van de procedure is het belangrijkste kenmerk en moet daarom worden onderworpen aan kwaliteitscontrole. Verschillende laboratoria hebben geïnvesteerd in het ontwikkelen van protocollen voor het kweken van primaire luchtwegepitheelcellen bij de ALI. De tijd, moeite en het vereiste budget kunnen worden verminderd wanneer deze procedures in detail worden gedeeld. Deze details omvatten bijvoorbeeld de keuze van celkweekplastics en media die door verschillende fabrikanten worden verstrekt, aangezien dit de kenmerken van de verkregen culturen bleek te beïnvloeden10,11,12. Dit benadrukt het belang van het delen van ervaringen en details van cultuurprocedures, omdat bij gebrek aan dergelijke inzichten de resultaten kunnen worden beïnvloed en / of validatie-inspanningen in verschillende laboratoria kunnen worden belemmerd.
Het menselijke longepitheel bestaat uit verschillende celtypen, waaronder belangrijke typen zoals basale cellen, trilhaarcellen, bokaalcellen en clubcellen. Om de epitheelcellaag in de luchtwegen in vitro betrouwbaar na te bootsen, moeten deze celtypen in de kweekmodellen worden weergegeven en hun polarisatie en functie 13,14,15,16 behouden. Het besef dat donorkenmerken (inclusief ziektetoestand) en de anatomische oorsprong van de cellen (d.w.z. nasaal, tracheaal, grote en kleine luchtwegen) de cellulaire samenstelling en functionele reacties van de celcultuur kunnen beïnvloeden, is even belangrijk. Relevante expertise en praktijk zijn een voorwaarde om primaire luchtwegepitheelcellen met succes te kweken en de kwaliteit van de cultuur zowel intuïtief (door visuele inspectie tijdens de kweek) als kwantificeerbaar te beoordelen. Het doel van deze bijdrage is om een kosten- en tijdbesparende methode te bieden voor de isolatie en kweek van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen (PBEC's) die ook kan worden toegepast op de kweek van tracheale en kleine luchtwegepitheelcellen. Naast het beschrijven van een methode voor het isoleren van dergelijke cellen uit gereseceerd longweefsel, wordt een methode voor expansie en biobanking, en ten slotte voor de oprichting en karakterisering van een goed gedifferentieerde ALI-cultuur binnen een redelijke kosten en tijdsperiode gepresenteerd en besproken.
Protocol
Cellen werden geïsoleerd uit macroscopisch normaal longweefsel verkregen van patiënten die een resectieoperatie voor longkanker ondergingen in het Leids Universitair Medisch Centrum, Nederland. Patiënten waarvan dit longweefsel was afgeleid, werden via een geen-bezwaarsysteem in de biobank opgenomen voor gecodeerd anoniem verder gebruik van dergelijk weefsel (www.coreon.org). Sinds 01-09-2022 zijn patiënten echter ingeschreven in de biobank met behulp van actieve geïnformeerde toestemming in overeenstemming met lokale voorschriften van de LUMC-biobank met goedkeuring door de institutioneel medisch-ethische commissie (B20.042/Ab/ab en B20.042/Kb/kb).
OPMERKING: Alle procedures worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast, volgens de lokale biologische veiligheidsregels, en onder steriele werkomstandigheden met chirurgische handschoenen en een laboratoriumjas, tenzij anders vermeld. Voor alle media, reagentia en andere oplossingen die in het protocol worden gebruikt, zie de materiaaltabel en aanvullende tabel 1. Zie figuur 1 voor gedetailleerde protocolstappen
1. Isolatie van bronchiale epitheelcellen uit menselijk longweefsel
OPMERKING: Om een optimaal slagingspercentage voor bronchiale epitheelcelisolatie te verkrijgen, moet de weggesneden bronchiale ring gedurende maximaal 24 uur bij 4 °C worden ondergedompeld in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met primocine toegevoegd.
- Voorbereidingen voor de start van de procedure
- Bereid een coatingoplossing in PBS, zoals beschreven in aanvullende tabel 1, en bedek een passend aantal 6-putplaten met 1,5 ml coatingoplossing per put. Incubeer gedurende 2 uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Het aantal te coaten putten is afhankelijk van de grootte van het weggesneden weefsel. Als ruwe richtlijn worden vier 6-putplaten gecoat wanneer de weggesneden bronchiale ring 10 mm in diameter en 4 mm breed is. - Bereid volledig keratinocytenserumvrij medium (c-KSFM), zoals beschreven in aanvullende tabel 1; gebruik 2 ml van het medium per put van een 6-well plaat.
OPMERKING: Deze c-KSFM kan 7 dagen bij 4 °C worden bewaard. c-KSFM is een calciumarm medium dat wordt gebruikt voor de uitbreiding van luchtwegepitheelcellen en tegelijkertijd de groei van verontreinigende fibroblasten remt.
- Bereid een coatingoplossing in PBS, zoals beschreven in aanvullende tabel 1, en bedek een passend aantal 6-putplaten met 1,5 ml coatingoplossing per put. Incubeer gedurende 2 uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Reinig de bronchiale ring door de ring voorzichtig af te spoelen in 10 ml steriele PBS in een petrischaaltje van 10 cm. Gebruik een pincet om de ring voorzichtig vast te houden (raak alleen de buitenkant aan) en een kleine schaar om overtollig bindweefsel en bloedresten te verwijderen. Voor verdere verwerking snijdt u de ring in tweeën.
OPMERKING: Alle gereedschappen die in het proces worden gebruikt, moeten vóór gebruik worden gesteriliseerd. - Dompel de twee helften van de bronchiale ring onder in 10 ml van een voorverwarmde oplossing van protease XIV (1,8 mg/ml) in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), inclusief Primocine, in een gesloten steriele container, en incubeer gedurende precies 2 uur bij 37 °C in een celkweekincubator.
OPMERKING: HBSS wordt gebruikt als verdunningsmiddel voor protease XIV om de cellen van het weefsel los te maken gedurende een incubatietijd van 2 uur. HBSS is een uitgebalanceerde isotone oplossing die het behoud van de levensvatbaarheid van cellen tijdens kortdurende incubaties mogelijk maakt. - Breng na de incubatie de stukjes weefsel over naar een petrischaal met 10 ml warme PBS en schraap de binnenkant van de ring met een gebogen pincet om een celoplossing te verkrijgen.
OPMERKING: Het weefsel lijkt zachter en enigszins uitgebreid. - Gooi de ring weg, breng de celoplossing over in een buis van 50 ml en voeg warme PBS toe om een eindvolume van 50 ml te verkrijgen. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 230 x g en bij kamertemperatuur (RT).
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 10 ml warme PBS. Vul verder het volume aan tot 50 ml met warme PBS. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 230 x g bij RT.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel in een geschikte hoeveelheid warme c-KSFM die Primocin bevat.
OPMERKING: De Primocin wordt minimaal 7 dagen gebruikt om bacteriën, schimmels of (belangrijk) mycoplasma te elimineren die mogelijk in het weefsel aanwezig zijn geweest; Na 7 dagen is toevoeging van alleen penicilline/streptomycine aan het medium voldoende. - Zuig de coatingoplossing uit de 6-putplaten en voeg 2 ml celsuspensie per put toe.
- Laat de cellen groeien tot 80% tot 90% confluentie is bereikt en verander het medium drie keer per week (bijvoorbeeld elke maandag, woensdag en vrijdag). De gewenste mate van confluentie wordt meestal bereikt tussen 7 en 14 dagen; Als de tijd die nodig is om de gewenste confluentie te bereiken langer is dan 14 dagen, gooi de cellen dan weg.
OPMERKING: In de eerste paar dagen begint slechts een klein aantal cellen zich te vermenigvuldigen; groepen cellen zijn na een paar dagen merkbaar.
2. Cryopreservatie van menselijke primaire bronchiale epitheelcellen (PBEC's)
OPMERKING: Bij het werken met temperaturen van -80 °C en -196 °C worden cryohandschoenen gebruikt voor bescherming en wordt een pincet gebruikt om bevroren injectieflacons over te brengen. Bij het werken met vloeibare stikstof worden cryohandschoenen en een gelaatsscherm gebruikt voor persoonlijke bescherming.
- Zuig het medium aan en was de putjes eenmaal met 2 ml warme PBS per put.
- Trypsinize de cellen door toevoeging van 0,5 ml zachte trypsine per put (zie aanvullende tabel 1 voor de samenstelling van de zachte trypsine-oplossing). Incubeer de cellen gedurende 5 tot maximaal 10 minuten bij 37 °C. Draai de trypsine-oplossing in de plaat en laat de cellen los door zachtjes op de plaat te tikken.
- Breng de losgemaakte cellen over in een centrifugebuis van 50 ml met 1,1 mg/ml soja-trypsineremmer (SBTI; om de trypsine-activiteit te remmen) opgelost in KSFM met penicilline/streptomycine. Het volume SBTI moet het dubbele zijn van het totale volume van zacht trypsine (d.w.z. 1 ml per put).
OPMERKING: Voeg SBTI niet rechtstreeks aan de putten toe, omdat de cellen binnen enkele minuten opnieuw worden bevestigd. - Centrifugeer de buis gedurende 7 minuten bij 230 x g bij RT.
- Gooi het supernatant weg en resuspensie van de gepelletiseerde cellen in 10 ml RT KSFM met penicilline / streptomycine maar geen andere additieven. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Voer een aantal levende/dode cellen uit door trypanblauw toe te voegen in een verhouding van 1:1, of gebruik een alternatieve procedure voor het tellen van levende/dode cellen.
- Cryopreserveer de cellen in een concentratie van 400.000 cellen per ml vriesmedium (zie aanvullende tabel 1 voor samenstelling) en voeg 1 ml van deze suspensie per cryovial toe. Breng de cryovialen over in een coolcell container en plaats deze op -80 °C. Breng de injectieflacons na 24 uur over naar -196 °C vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
OPMERKING: Er zijn twee opties mogelijk voor het overbrengen van de cellen naar vriesmedium, die beide goed werken: 1) Pellet de cellen opnieuw door centrifugeren en resuspenderen in koud vriesmedium bij de vereiste celconcentratie; of 2) voeg koud vriesmedium toe en pas de concentratie van het cryopreservant (dimethylsulfoxide [DMSO]) aan op basis van het volume KSFM waarin de cellen aanwezig zijn.
3. Ontdooien van gecryopreserveerde PBEC's en kweken voor kweek op inserts
- Bestrijk een T75-celkweekkolf 's nachts met 10 ml coatingoplossing in PBS met de deksels goed gesloten. Incubeer de kolf in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Voordat u de gecryopreserveerde PBEC's ontdooit, verwijdert u de coatingoplossing uit de kolf en vult u deze met 10 ml c-KSFM. Laat het opwarmen tot 37 °C in een celkweekincubator, met licht geopende deksels om de incubatorlucht binnen te laten.
- Ontdooi de cellen snel in een water- of kralenbad van 37 °C.
OPMERKING: Een kralenbad heeft de voorkeur boven een waterbad vanwege het lagere risico op besmetting en het lagere energieverbruik. - Voeg de volledige inhoud van de cryovial toe aan de voorverwarmde T75-kolf met medium (stap 3.2) en verdeel de cellen gelijkmatig.
OPMERKING: Centrifugeer de cellen in dit stadium niet, omdat ze de centrifugatiestap niet zullen overleven. - Zorg er na ongeveer 4 uur voor dat de cellen voldoende gehecht zijn. Vervang het medium door 10 ml verse, warme c-KSFM.
OPMERKING: Op deze manier wordt de DMSO uit het vriesmedium verwijderd. Deze stap moet plaatsvinden tussen 4 uur en 24 uur na het zaaien van de cellen in de kolf. - Laat de cellen groeien totdat 80% tot 90% confluentie is bereikt, waarbij het medium elke maandag, woensdag en vrijdag wordt veranderd.
4. Het opzetten van een lucht-vloeistof interfacecultuur met primaire bronchiale epitheelcellen (ALI-PBEC)
OPMERKING: De volgende procedure is voor de kweek van PBEC's op inzetstukken met een binnendiameter van 11,9 mm.
- Bekleed een geschikt aantal celkweekinzetstukken met 0,4 ml coatingoplossing per inzetstuk. Incubeer een nacht bij 37 °C in een celkweekincubator.
- Bereid volledig BD-medium (cBD-medium), zoals beschreven in aanvullende tabel 1.
OPMERKING: cBD-medium is een samengesteld medium (zie aanvullende tabel 1) dat is geformuleerd om de groei van bronchiale epitheelcellen gedurende langere tijd te ondersteunen, terwijl hun differentiatie mogelijk is na een toename van de concentratie en cultuur van retinoïnezuur (RA) (of een analoog van RA zoals gebruikt in dit protocol) bij de ALI, zoals beschreven in stap 4.10. - Trypsineer de PBEC's in de T75-kolf met behulp van 2 ml zachte trypsine per kolf. Incubeer de cellen gedurende 5 tot 10 minuten om de cellen los te laten komen (op basis van visuele inspectie). Na 5 minuten incubatie vergemakkelijkt u het losmaken van de cellen door de trypsine in de kolf te draaien en zachtjes op de kolf te tikken (indien nodig herhalen).
- Voeg 4 ml SBTI toe aan de kolf en breng de celsuspensie direct over in een centrifugebuis van 25 ml.
OPMERKING: De cellen worden binnen enkele minuten opnieuw bevestigd. Daarom moet bij het werken met meer dan één kolf de in stap 4.4 verkregen celsuspensie rechtstreeks in een centrifugebuis worden overgebracht voordat SBTI aan een tweede kolf wordt toegevoegd. In de procedure worden maximaal vijf kolven tegelijkertijd verwerkt. - Centrifugeer de buizen gedurende 7 minuten bij 230 x g bij RT.
- Resuspendeer de cellen in 6 ml cBD-medium en tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Voer een aantal levende/dode cellen uit door bijvoorbeeld trypanblauw toe te voegen in een verhouding van 1:1, of door een andere procedure voor het tellen van levende/dode cellen te gebruiken.
- Verwijder de coatingoplossing uit de celkweekinzetstukken.
- Verdun de celsuspensie, gegenereerd in stap 4.6, met cBD-medium aangevuld met 1 nM EC 23 tot een concentratie van 80.000 cellen per ml en voeg 0,5 ml toe aan de bovenkant van het membraan in de insert. Voeg 1,5 ml cBD-medium aangevuld met 1 nM EC 23 toe aan de put onder de insert.
- Vervang het medium met cBD-medium aangevuld met 1 nM EC 23 driemaal per week totdat de culturen klaar zijn voor blootstelling aan lucht (d.w.z. 2 dagen nadat 100% confluentie is bereikt). Elke keer wordt 0,5 ml van het medium toegevoegd in het inzetstuk (op de cellen) en 1,5 ml wordt toegevoegd aan het onderste compartiment (de put).
OPMERKING: Over het algemeen bereikt de cellaag 100% confluentie ongeveer 5 dagen na het zaaien van de PBECs op de inserts. Op basis van de visuele inspectie van de confluentie van de cellen wordt besloten om de cellen 2 dagen later over te brengen naar het ALI-stadium. - Wanneer de cellen klaar zijn voor overdracht naar de ALI (d.w.z. 2 dagen na het bereiken van 100% confluentie), verwijdert u het medium uit de inserts en de put, voegt u geen nieuw medium toe in de insert en voegt u nieuw medium (1 ml cBD-medium aangevuld met 50 nM EC 23) alleen aan de put toe. Verander het medium in de putten drie keer per week.
- Om overtollig slijm en cellulair afval te verwijderen, voegt u voorzichtig 200 μL warm PBS toe aan de apicale kant van de cellaag in de insert (bij voorkeur via de zijkant van de insert en niet door direct op de cellen te pipetteren) en incubeert u gedurende 10 minuten in een celkweekincubator bij 37 °C. Zuig vervolgens de PBS op om overtollig slijm en cellulair puin te verwijderen.
OPMERKING: Vanaf dit punt (begin van de ALI-cultuur), voordat u het medium van het onderste compartiment verandert, wast u de apicale kant van de cellen elke keer met PBS. - Kweek de cellen minimaal 2 weken in de ALI om ervoor te zorgen dat alle belangrijke celtypen vertegenwoordigd zijn.
5. Het opzetten van een ALI-PBEC-cultuur van een gemengde donorpopulatie
- Gebruik cellen van maximaal vijf individuele donoren om PBEC-culturen uit een gemengde populatie te starten.
- Meng een gelijk aantal cellen per donor met behulp van de cellen gegenereerd in stap 4.7 om een totaal van 150.000 cellen per insert te bereiken (d.w.z. 30.000 cellen per donor bij gebruik van vijf donoren). Dit zorgt ervoor dat de proliferatie in de insert tot een minimum wordt beperkt en dat er gelijke aantallen cellen van de individuele donoren in de kweek aanwezig zijn.
- Ga verder met de ALI-PBEC-cultuur zoals beschreven in stap 4.9-4.12.
6. Kwaliteitscontrole van de ALI-PBEC cultuur
- Monitoring van transepitheelelektrische weerstand (TEER) tijdens celkweek
OPMERKING: De elektrische weerstandsmeting, gebaseerd op het gebruik van een voltohmmeter, kan op elk gewenst moment tijdens de ALI-PBEC-cultuur worden uitgevoerd en wordt elke keer uitgevoerd volgens hetzelfde protocol onder dezelfde omstandigheden, omdat de elektrische weerstandsmeting wordt beïnvloed door verschillende variabelen, waaronder de elektrodepositie, temperatuur, medium en hantering. TEER kan worden berekend met behulp van de gemeten elektrische weerstand door de volgende formule toe te passen op basis van de wet van Ohm:
, waarbij Rm de gemeten elektrische weerstand is, Rb de basislijn elektrische weerstand van een wisselplaat zonder coating en cellen, en SA het oppervlak van het membraan van de insert17.- Voeg voorzichtig 200 μL warme PBS toe aan de apicale kant van de cellaag om het slijm en puin op de cellen te verwijderen. Incubeer de insert gedurende 10 minuten in een celkweekincubator bij 37 °C en verwijder de PBS opnieuw.
- Voeg voorzichtig 700 μL warme PBS toe aan de apicale kant van de cellaag en incuber de insert gedurende 10 minuten bij RT om stabilisatie van de temperatuur voor metingen mogelijk te maken.
- Kalibreer de voltohmmeter met behulp van de testweerstand van 1.000 Ω, stel de voltohmmeter in om Ohm te meten en gebruik een schroevendraaier om de kalibratieschroef "R ADJ" aan te passen totdat deze is ingesteld op 1.000 Ω.
- Spoel de elektrode door deze een paar keer op en neer te bewegen in steriel water (RT) en vervolgens in steriele PBS (RT).
- Meet de elektrische weerstand van de cellaag in de inserts. Plaats hiertoe de elektrode in een verticale positie in de put met de lange arm van de elektrode die de onderkant van de plaat raakt. Op deze manier bevindt de korte arm zich boven de cellaag in het inzetstuk. Lees de waarde die wordt weergegeven op de voltohmmeter.
OPMERKING: De weergegeven waarde zal niet volledig stabiliseren; Lees de waarde op het moment dat de waarde intermitterend is. - Reinig de elektrode tussen de metingen door een paar keer op en neer te bewegen in steriele PBS (RT).
- Reinig de elektrode wanneer de metingen zijn voltooid door deze een paar keer op en neer te bewegen in steriel water (RT), steriele PBS (RT) en 70% ethanol (RT). Bewaar de elektrode droog.
- Voer een nulmeting uit van een wisselplaat (zonder coating) en cellen door 700 μL warme PBS in de insert en 1 ml warme PBS aan de put toe te voegen en de elektrische weerstand naast de andere inserts te meten.
- Evaluatie van de cellulaire samenstelling van de ALI-PBEC-cultuur
- Controleer tijdens de ALI-fase de differentiatie door het kloppen van trilharen visueel te beoordelen. Deze kunnen worden waargenomen via standaard brightfieldmicroscopie al 9 dagen na blootstelling aan lucht aan de apicale kant van de cellen.
OPMERKING: Kloppende trilharen zijn het best zichtbaar direct na het wassen van het apicale oppervlak. Bokaalcellen produceren slijm en daarom is de aanwezigheid van slijm, zoals waargenomen tijdens het wassen van het apicale oppervlak, een teken dat bokaalcellen worden gevormd. Het niveau van bokaalcellen en de hoeveelheid geproduceerd slijm is echter sterk donorafhankelijk. De aanwezigheid van slijm kan worden gezien bij het aanzuigen van de PBS na het wassen van het apicale oppervlak van de cellaag in de insert; in dit geval is de aangezogen PBS stroperiger en kunnen slijmdraden worden waargenomen tijdens het aanzuigen. - Evaluatie van de cellulaire samenstelling met behulp van immunostainings en fluorescerende microscopie of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), of genexpressieanalyse door real-time-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) levert belangrijke informatie op over de differentiatietoestand van de cultuur, maar de beschrijving ervan valt buiten het bestek van deze bijdrage.
- Controleer tijdens de ALI-fase de differentiatie door het kloppen van trilharen visueel te beoordelen. Deze kunnen worden waargenomen via standaard brightfieldmicroscopie al 9 dagen na blootstelling aan lucht aan de apicale kant van de cellen.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de isolatie, expansie en kweekprocedure van primaire bronchiale epitheelcellen . (A) Longweefsel wordt verkregen tijdens kankerresectiechirurgie en de patholoog snijdt bronchiaal ringweefsel weg dat macroscopisch normaal en tumorvrij is. (B) De bronchiale ring wordt gereinigd en blootgesteld aan enzymatische behandeling om de cellaag los te maken en te dissociëren. (C) De opgehaalde celsuspensie wordt gewassen en de cellen worden verdeeld in putten van een 6-putplaat voor expansie. (D) Bij voldoende expansie van de geïsoleerde cellen in c-KSFM met Primocin worden cellagen gedissocieerd door trypsinisatie en cellen geresuspendeerd in vriesmedium voor cryopreservatie. Indien nodig worden gecryopreserveerde cellen ontdooid en opnieuw uitgebreid met behulp van c-KSFM met penicilline / streptomycine in celkweekkolven. Na expansie worden ze gezaaid in cBD-medium op celkweekinzetstukken; e bis) ALI-PBEC-cultuur vindt plaats in twee hoofdfasen: het ondergedompelde stadium in cBD-medium aangevuld met 1 nM EC 23 totdat de cellen volledige samenvloeiing bereiken, gevolgd door verwijdering van apicale medium en cultuur bij de ALI om differentiatie mogelijk te maken; in deze ALI-fase worden de cellen gekweekt in cBD-medium aangevuld met 50 nM EC 23. e ter) Grafische weergave van basale cellen die de insert bedekken tijdens ondergedompelde cultuur. (Eg) Grafische weergave van de gedifferentieerde epitheelcellaag verkregen na kweek in de ALI in aanwezigheid van verhoogde concentraties EC 23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Uitbreiding met behulp van ondergedompelde cultuur
Met behulp van de hier gepresenteerde methode kunnen gemiddeld acht cryovialen met 400.000 cellen/cryovial worden verkregen uit één 6-well plaat voor langdurige opslag in vloeibare stikstof (figuur 2A). Om dit te bereiken, worden geïsoleerde PBEC's gedurende minimaal 7 dagen en maximaal 14 dagen (figuur 2B) gekweekt in 6-putplaten in aanwezigheid van Primocin om microbiële (vooral mycoplasma) besmetting uit te sluiten. Figuur 2A,B geeft inzicht in de verkregen celaantallen en benodigde kweektijd bij verschillende isolaties van verschillende donoren. Voordat de cellen worden geoogst door trypsinisatie voor opslag in vloeibare stikstof, moet de confluentie meer dan 80% zijn. Als dit niet binnen 14 dagen wordt bereikt, mogen de cellen niet worden gecryopreserveerd. Belangrijk is dat bij het oogsten voor opslag en doorgang de samenvloeiing van de cellaag niet groter mag zijn dan ~ 95% (figuur 2C). Na opslag in vloeibare stikstof kunnen de cellen worden ontdooid en gekweekt voor expansie totdat voldoende celaantallen zijn verkregen voor ALI-culturen. Het medium dat wordt gebruikt voor de uitbreiding van de cellen in dit stadium is c-KSFM, vergelijkbaar met tijdens de eerste kweek na de oogst van de bronchiale ring18. Er is echter geen behoefte aan Primocin in dit stadium, omdat het risico op extra microbiële besmetting afkomstig van het longweefsel afwezig is, en daarom kan Primocin worden vervangen door penicilline / streptomycine. Dit medium geeft de voorkeur aan epitheelcellen boven fibroblasten en voorkomt daarom mogelijke overgroei van de cultuur door sneller prolifererende fibroblasten 19,20,21. Met behulp van c-KSFM-medium worden de cellen in de kolf uitgespreid en verbinden ze zich niet met elkaar, wat duidelijk verschilt van de morfologie van gekweekte cellen die in dit stadium zijn ondergedompeld in cBD-medium (figuur 2D, E). Na 5 of 6 dagen kweken van de ontdooide cellen in een T75-kolf, moet de cellaag 80% -95% confluent zijn, wat zich vertaalt in ongeveer 3 x 106 cellen in totaal (figuur 2F). Hieruit kunnen ongeveer 75 inserts (12-well plaatgrootte) worden gegenereerd voor ALI-cultuur.
De in deze bijdrage beschreven methode voor isolatie en kweek kan ook worden aangepast voor gebruik met bronchiale biopsieën of bronchiale borstels als uitgangsmateriaal.
Figuur 2: Basale celexpansie voor en na cryopreservatie. Cellen werden geïsoleerd volgens het beschreven protocol en gekweekt met behulp van c-KSFM. Het aantal cellen gegenereerd per donor werd gemonitord, de levende celtellingen werden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde celteller (A) bij het oogsten van de passage 0 (P0) cellen uit de 6-putplaten (stap 2 van het protocol), n = 123 donoren, de celtelling werd gepresenteerd als het aantal cellen dat per put werd geoogst; Elke stip vertegenwoordigt één donor en de mediaan wordt aangegeven door een horizontale balk. (B) Als onderdeel van de kwaliteitscontrole werd de tijd die de P0-cellen nodig hadden om 80% tot 90% confluentie in de 6-putplaten te bereiken, gecontroleerd en weergegeven als dagen na het starten van de ondergedompelde cultuur in c-KSFM (n = 127 verschillende donoren). Elke individuele donor wordt aangegeven met een stip, alle stippen die bij 1 dag horen, lopen over in een lijn; hoe breder de lijn, hoe meer donoren het vertegenwoordigt; Het mediane aantal dagen dat de cellen in cultuur zijn, wordt aangegeven door een dunnere horizontale balk. (C) Representatief brightfieldbeeld van P0-cellen die ondergedompeld zijn in c-KSFM op het moment dat de cellen werden geoogst voor langdurige cryopreservatie. (D) Representatief brightfieldbeeld van P1-cellen die ondergedompeld zijn in c-KSFM op het moment dat de cellen werden geoogst en overgebracht naar inserts en (E) P1-cellen die werden ondergedompeld in cBD-medium. F) het aantal per donor gegenereerde levende cellen werd gecontroleerd met behulp van een geautomatiseerde celteller bij het oogsten van P1-cellen uit de T75-kolf (punt 4 van het protocol), n = 63 verschillende donoren; het celgetal wordt weergegeven als het aantal cellen per T75-kolf, elke donor wordt aangegeven met een punt en het mediane celgetal wordt aangegeven door een horizontale balk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Air-liquid interface (ALI) cultuur
7 dagen na het starten van de ALI-cultuur wordt de elektrische weerstand van de cellaag gemeten en moet deze meer dan 300 Ω zijn (figuur 3A); Als dit niet wordt bereikt, wordt de cultuur als mislukt beschouwd vanwege een mogelijk gebrek aan tight junction-vorming. Het wordt aanbevolen om de mogelijkheid uit te sluiten om lage TEER-waarden te krijgen die worden veroorzaakt door schade aan de epitheellaag in individuele inserts als gevolg van bijvoorbeeld schade aan de cellaag tijdens het wassen en aspiratie. Dit kan worden gecontroleerd door visuele microscopische inspectie van de kweekinzetstukken. In onze ervaring kan de interdonorvariabiliteit in elektrische weerstand significant zijn (figuur 3B), die ook wordt gerapporteerd in de literatuur14, en zoals waargenomen ook duidelijk wordt beïnvloed door de oorsprong van dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) dat wordt gebruikt (figuur 3C).
Figuur 3: Trans-epitheliale elektrische weerstand als kwaliteitscontrole van ALI-PBEC culturen. PBEC's werden geïsoleerd en uitgebreid, en goed gedifferentieerde ALI-PBEC-culturen werden vastgesteld. Op verschillende tijdstippen tijdens de kweek werd de elektrische weerstand gemeten en vervolgens werd de TEER berekend (Ω·cm2). (A) De elektrische weerstand werd gemeten in de loop van 14 dagen na ALI. n = 4 verschillende donoren. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde waarde ± standaarddeviatie (SD). (B) Als onderdeel van de kwaliteitscontrole van de ALI-PBEC-celcultuur werd de elektrische weerstand gemeten op dag 7 (n = 50) en dag 14 na ALI (n = 25); elke stip vertegenwoordigt één donor en de mediane TEER (Ω·cm2) wordt aangegeven door een horizontale balk. Gegevens werden getest op significantie met behulp van een niet-parametrische Mann-Whitney-test en er werd geen significant verschil gevonden. (C) Media van drie verschillende DMEM-leveranciers werden getest om de invloed op de vorming van TEER te beoordelen. n = 4 verschillende donoren; gemiddelde waarden worden weergegeven ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bij het opzetten van een goed gedifferentieerde ALI-PBEC-cultuur, vanaf het begin van blootstelling aan de lucht, neemt de concentratie van RA toe22. Op deze manier schakelen cellen over van proliferatie naar mucociliaire differentiatie, die al 9 dagen (donorafhankelijk) na blootstelling aan lucht zichtbaar is met behulp van brightfieldmicroscopie. Beweging van de eerste trilharen is zichtbaar op dit punt, en iets eerder wanneer gebaseerd op genexpressie van markers van gedifferentieerde luminale cellen23 (figuur 4).
Zoals beschreven in het protocol, kan de slijmproductie ook worden waargenomen bij het spoelen van het apicale oppervlak tijdens de mediumwissel. RA is zeer gevoelig voor licht, wat leidt tot zeer variabele activiteit bij dezelfde voorraadconcentratie. Om deze reden wordt RA vervangen door het synthetische RA-analoog EC 23 en in dezelfde concentratie gebruikt, met vergelijkbare resultaten als experimenteel bepaald. Om deze reden en om te voorkomen dat de procedure wordt gewijzigd, werd de geselecteerde EC 23-concentratie gelijk gehouden aan de eerder gebruikte RA-concentratie (d.w.z. 50 nM)24,25 (figuur 5). Figuur 5A toont de TEER-waarden die worden bereikt bij gebruik van verschillende concentraties EC 23, met een maximale TEER bij 50 nM binnen dit bereik van geteste concentraties. De resultaten in figuur 5B bevestigen dat de genexpressie van markers voor trilhaar- en bokaalcellen vergelijkbaar is bij gebruik van 50 nM EC 23 of RA. EC 23 is ook vereist tijdens de kweek in het ondergedompelde stadium (hoewel in een veel lagere concentratie), omdat het weglaten in dit ondergedompelde stadium en het alleen toevoegen in het ALI-stadium resulteert in een cultuur die nooit volledige samenvloeiing bereikt. De tijd die nodig is om een goed gedifferentieerde ALI-PBEC-cultuur te genereren met zichtbare ciliaire kloppende activiteit en slijmproductie is ongeveer 14 dagen, en de meeste experimenten worden daarom gestart tussen 14-21 dagen ALI-culturen (figuur 4). Alle belangrijke verschillende celtypen (basale, trilhaar, bokaal- en clubcellen) worden waargenomen na 14 dagen ALI-cultuur, hoewel de expressieniveaus sterk donorafhankelijk zijn. Dit wordt aangetoond door genexpressie van TP63, FOXJ1, MUC5AC en SCGB1A1 door RT-qPCR te beoordelen, of eiwitexpressie met behulp van antilichamen gericht tegen p63, α-tubuline, Muc5AC en CC-16 door immuunfluorescentie (IF) kleuring, om markers te detecteren voor basale, trilhaar, bokaal- en clubcellen, respectievelijk25,26. Hoewel 14-21 dagen voor de meeste experimenten als vuistregel kan worden beschouwd, kan voor geselecteerde experimenten een langere duur van differentiatie worden overwogen, zoals gevonden voor xenobiotisch metabolisme, SARS-CoV-2-infectie en de beoordeling van mucociliaire klaring27,28,29.
Figuur 4: Air-liquid interface (ALI) cultuur. PBEC's werden geïsoleerd en uitgebreid, en goed gedifferentieerde ALI-PBEC-culturen werden vastgesteld. ALI-PBEC-culturen werden in de loop van 14 dagen na ALI gecontroleerd. Celculturen werden gelyseerd voor de isolatie van RNA op dag 0, 7 en 14 post-ALI. Gegevens van twee verschillende donoren worden weergegeven, elke stip vertegenwoordigt één individuele donor die in de loop van de tijd wordt gevolgd en de mediaan wordt aangegeven door een horizontale balk. Genexpressie van basale, trilhaar, bokaal- en clubcelmarkers (respectievelijk TP63, FOXJ1, MUC5B en SCGB1A1) werd gemeten met qPCR en genormaliseerd voor RPL13A- en ATP5B-genexpressie (zie referentie 23 voor details). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van retinoïnezuur (RA) en zijn synthetische analoog EC 23. PBEC's werden geïsoleerd en uitgebreid, en goed gedifferentieerde ALI-PBEC-culturen werden vastgesteld. Bij aanvang van de blootstelling aan de PBEC in de lucht werd RA (50 nM) vervangen door verschillende concentraties EC 23. (A) De elektrische weerstand werd gemeten op dag 14 post-ALI en vervolgens werd de TEER berekend (Ω·cm 2), n =2 donoren, de staven geven de gemiddelde waarde ± SD weer. (B) Op dag 14 post-ALI werden celculturen gelyseerd voor RNA-isolatie en daaropvolgende genexpressieanalyse van celmarkers voor respectievelijk trilhaar- en bokaalcellen (FOXJ1, MUC5AC) met behulp van qPCR, en genormaliseerd voor RPL13A (n = 3 donoren). Een vouwtoename wordt getoond tegen ALI-PBEC gekweekt met 50 nM RA en afgebeeld als de gemiddelde waarde ± SD. (Zie referentie 23 voor details) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In de afgelopen jaren is gekeken naar de prestaties van alternatieve producten in het cultuursysteem, zoals de media en cultuurplastics. Er waren verschillende redenen voor dergelijke evaluaties, waaronder veranderingen in de samenstelling van het medium door de fabrikanten, nieuwe media geïntroduceerd en een tekort aan producten tijdens de COVID-19-pandemie (2020-2022). Er werd opgemerkt dat vergelijkbare producten van verschillende leveranciers resulteren in gedifferentieerde epitheelcelculturen op basis van de beoordeling van markers van epitheelceltypen, hoewel de uiteindelijke cellulaire samenstelling aanzienlijk kan variëren (figuur 6A), terwijl verschillen in TEER minder uitgesproken waren (figuur 6B). Aan de andere kant resulteerde medium van verschillende leveranciers wel in substantiële verschillen in cellulaire samenstelling; bij gebruik van wisselplaten van verschillende merken waren deze verschillen beperkt (figuur 6C). Met name bij het gebruik van het luchtwegepitheelcelkweekmedium PneumaCult van STEMCELL Technologies werd een andere morfologie en snellere vorming van zichtbare ciliaire activiteit waargenomen. Naast deze waarnemingen werd ook een verschil in TEER-waarden en een verschil in cellulaire samenstelling van de ALI-PBEC ten opzichte van cBD-medium opgemerkt (figuur 6D).
Figuur 6: Vergelijking van verschillende leveranciers van epitheelcelmedium en celkweekinzetstukken. PBEC werden geïsoleerd, uitgebreid en goed gedifferentieerde ALI-PBEC culturen werden opgericht. (A) ALI-PBECs werden gedurende 14 dagen gekweekt en vervolgens werden de cellagen gelyseerd voor RNA-isolatie. Genexpressie van basale, trilhaar, bokaal- en clubcelmarkers (respectievelijk TP63, FOXJ1, MUC5AC en SCGB1A1) werd gemeten met qPCR en genormaliseerd voor RPL13A en ATP5B. n = 2 donoren; de staven geven de gemiddelde waarde ± SD weer. (B) In de loop van 9 dagen na ALI werd de elektrische weerstand gemeten en vervolgens werd de TEER berekend (Ω·cm2). n = 3 verschillende donoren; gemiddelde waarden worden weergegeven ± SD. (C) ALI-PBECs werden gedurende 14 dagen gekweekt met behulp van celkweekinzetstukken die bij drie verschillende leveranciers waren gekocht en vervolgens werden de cellagen gelyseerd voor RNA-isolatie. Genexpressie van trilhaar-, bokaal- en clubcelmarkers (respectievelijk FOXJ1, MUC5AC en SCGB1A1) werd gemeten met qPCR en genormaliseerd voor RPL13A. n = 18 verschillende donoren, de staven geven de gemiddelde waarde ± SD weer. Gegevens werden getest op significantie met behulp van een eenrichtings ANOVA niet-parametrische Kruskal-Wallis-test en er werd geen significant verschil gevonden. (D) ALI-PBECs werden gedurende 14 dagen na ALI gekweekt in cBD-medium of PneumaCult-medium (STEMMCELL-technologieën) en vervolgens werden de cellagen gelyseerd voor RNA-isolatie. Genexpressie van basale, trilhaar, bokaal- en clubcelmarkers (respectievelijk TP63, FOXJ1, MUC5B en SCGB1A1) werd gemeten met qPCR en genormaliseerd voor RPL13A (de staven geven de gemiddelde waarde ± SD weer), en de elektrische weerstand werd gemeten op dag 5 en 12 na ALI en gebruikt om de TEER (Ω cm2) te berekenen. n = 2; de gemiddelde waarde wordt weergegeven ± SD (zie referentie 23 voor details). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Samenstelling van de in het protocol gebruikte oplossingen en media. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de isolatie van menselijke bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel, een methode voor de optimale expansie van cellen zonder verlies van differentiatiepotentiaal, een cryopreservatieprocedure en een procedure voor het genereren van goed gedifferentieerde ALI-PBEC-culturen. Verder wordt een beschrijving van de kwaliteitscontrole gegeven, evenals instructies voor monitoring en evaluatie van de gedifferentieerde ALI-PBECs.
Het beschreven protocol begint met een macroscopisch normale, tumorvrije bronchiale ring die wordt gereseceerd uit een longkwab van patiënten die een operatie ondergaan in verband met hun longkankerdiagnose. Daarom moet worden opgemerkt dat deze ringen strikt genomen niet als gezond weefsel kunnen worden beschouwd, wat derhalve de kenmerken van de celkweek kan beïnvloeden. Alternatieve bronnen voor het verkrijgen van bronchiale epitheelcellen zijn het gebruik van bronchiale biopsieën, bronchiale borstels of weefsel van een transplantatiedonor of ontvangende longen. Ongeacht de bron moet bij het gebruik van longweefsel rekening worden gehouden met een risico op microbiële besmetting en daarom worden antibiotica in de verschillende kweekmedia gebruikt om het risico op microbiële besmetting van de celcultuur te verminderen. In het bijzonder is mycoplasma een hoog en veel voorkomend risico in celkweek, vanwege de grote verscheidenheid aan effecten op celkweek, resistentie tegen antibiotica die vaak worden gebruikt in celkweek en het feit dat mycoplasmabesmetting alleen kan worden bevestigd door mycoplasma-detectietests. Daarom wordt in de beginfase van celkweek na de isolatie van cellen uit longweefsel de breedspectrum antimicrobiële formulering Primocin gebruikt en tijdens het kweekproces worden willekeurig geselecteerde monsters getest op de aanwezigheid van mycoplasma.
De isolatieprocedure die begint met een bronchiale ring biedt voldoende uitgangsmateriaal om de mate van expansie van deze primaire cellen mogelijk te maken die nodig is om culturen op de ALI te starten zonder de differentiatiecapaciteit in gevaar te brengen. Het starten van de uitbreiding van de geïsoleerde epitheelcellen met een beperkt aantal cellen kan echter problemen opleveren bij het verkrijgen van een voldoende aantal inserts met voldoende cellen die kunnen worden gezaaid voor ALI-cultuur. Uitgebreide kweek en herhaalde passaging van primaire cellen kunnen resulteren in replicatieve senescentie. Er zijn verschillende oplossingen voorgesteld om deze beperking te overwinnen. Horani et al. toonden aan dat de Rho-kinaseremmer (ROCK) Y-27632 de proliferatie van basale cellen30 verhoogde, Mou et al. gebruikten dubbele Smad-remming om basale stamcellen uit te breiden met behoud van de kenmerken van de gedifferentieerde epitheelcellaag 31, en Sachs et al. hebben een luchtwegorganoïde systeem ontwikkeld dat kan worden gebruikt om luchtwegepitheelcellen uit te breiden en hun differentiatiepotentieel te behouden in de loop van meerdere passages32. De laatste methode werd ook gebruikt om cellen uit te breiden uit bronnen met zeer lage celaantallen, zoals tracheale aspiraten (TA's) van te vroeg geboren baby's (<28 weken zwangerschapsduur) en bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof, voordat ze worden overgebracht naar de ALI-cultuur zoals hierbeschreven 33. Het bleek dat cellen geïsoleerd uit BAL en TA's een differentiatiecapaciteit vertoonden die vergelijkbaar was met cellen gegenereerd uit bronchiaal weefsel, hoewel verschillen werden waargenomen wanneer de differentiatie scheef was in de richting van meer trilhaartjes of meer bokaalcelbevattende culturen met behulp van Notch-signaleringsremming of het Th2-cytokine IL-1333. Het wordt daarom aanbevolen om, als ALI-PBEC's worden gekweekt uit een uitgangsmateriaal met lage epitheelcelaantallen met behulp van vergelijkbare benaderingen, de culturen altijd te controleren op de basiskwaliteitscriteria, zoals besproken in sectie 6 van het protocol. Belangrijk is dat het gebruik van feedercellen ook kan helpen bij het verkrijgen van grotere celaantallen, wat essentieel is in een omgeving voor transplanteerbare steigertechniek waar tijd en celnummer essentieel zijn. Dit wordt geïllustreerd door een studie waarin autologe epitheelcellen werden gekweekt uit biopten afgeleid van een patiënt met tracheale ziekte en cellen snel werden uitgebreid in aanwezigheid van een muriene embryonale feederlaag (mitotisch geïnactiveerde 3T3-J2 fibroblasten) en de bovengenoemde remmer van de Rho / ROCK-route (Y-27632)34. De resulterende celkweek bleek nuttig te zijn voor herbevolking van tracheale steigers, en daarom kon dit worden gezien als een geschikt protocol voor een transplantatiemodel.
Bij het gebruik van het in deze bijdrage beschreven protocol, maar ook bij het gebruik van andere cultuurprotocollen, ontstaat onvermijdelijk een selectiebias. Het is belangrijk om te beseffen dat verschillen in protocoldetails, zoals de oorsprong van cellen die worden gebruikt om culturen te initiëren, mediumsamenstelling en andere protocoldetails, kunnen leiden tot veranderingen in de cellulaire samenstelling van de culturen en daardoor veranderingen in de respons van de ALI-cultuur33,35. Bovendien zijn er ook verschillen in celeigenschappen waargenomen bij het vergelijken van verschillende media voor het differentiëren van de luchtwegcellen10,11. Bij het vergelijken van PneumaCult en cBD-medium werden verschillen waargenomen in bokaalcel- en clubcel-mRNA-markers, TEER-waarden en cellaagdikte. Op basis van deze observaties, ondanks het gebrek aan statistische onderbouwing, vanwege het lage aantal gebruikte donoren, de samenstelling van het medium is onbekend bij klanten en hogere kosten van het PneumaCult-medium, werd in ons laboratorium besloten om cBD-medium te gebruiken.
Zoals besproken, kunnen cellen in eerste instantie worden uitgebreid met behulp van organoïde cultuur en vervolgens worden overgebracht naar het 2D ALI-insertsysteem. Dit is belangrijk, omdat luchtwegepitheelorganoïden niet geschikt zijn voor blootstelling aan stoffen in de lucht, terwijl het gebruik van het ALI 2D-systeem het mogelijk maakt om de impact van stoffen in de lucht zoals sigarettenrook23,36 op gekweekte luchtwegepitheelcellen te evalueren. Een andere benadering voor het vaststellen van ALI-luchtwegepitheelcelculturen is het genereren van luchtwegepitheelcellen door de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hiPSC's)37. In dergelijke protocollen kunnen cellen in de laatste fase van het differentiatieprotocol na differentiatie naar proximale luchtwegvoorlopercellen per kweek worden gedifferentieerd naar de ALI met behulp van procedures die vergelijkbaar zijn met de hier beschreven procedures.
In het huidige protocol wordt cBD-medium gebruikt voor cultuur in het ALI. cBD-medium is een serumvrij medium dat wordt bereid door een mix van verschillende supplementen toe te voegen, geïnspireerd door Fulcher et al.38 en andere studies. De supplementoplossing bevat 52 μg/ml runderhypofyse-extract (BPE), 0,5 μg/ml hydrocortison, 0,5 ng/ml humaan EGF, 0,5 μg/ml epinefrine, 10 μg/ml transferrine, 5 μg/ml insuline, 6,5 ng/ml triiodothyronine en 0,1 ng/ml RA39. Aangezien BPE een weefselextract is en onderhevig is aan batchgewijze variatie, kan het medium niet worden beschouwd als een volledig gedefinieerd medium en is het ook niet diervrij. Celkweekmedium dat volledig is gedefinieerd, heeft de voorkeur om batch-tot-batchverschillen te minimaliseren. Met het oog op de overgang naar proefdiervrij onderzoek is het belangrijk dat er inspanningen worden geleverd voor de productie van gedefinieerde media die geen dierlijke producten bevatten en die betaalbaar zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.
Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen verschillende experimentele opstellingen worden gebruikt op basis van het ALI-model. Om bijvoorbeeld de impact van verbindingen te onderzoeken die het differentiatieproces kunnen beïnvloeden, kan dit worden aangepakt door de verbindingen aan de cultuur toe te voegen tijdens de verschillende stadia van ondergedompelde cultuur, tijdens differentiatie of in het goed gedifferentieerde stadium. De cellulaire samenstelling van de ALI-PBEC-cultuur kan worden beïnvloed door specifieke verbindingen toe te voegen; bijvoorbeeld, het differentiëren van ALI-PBECs in de aanwezigheid van IL-13 genereert een cultuur met meer bokaalcellen en minder trilhaarcellen, terwijl behandeling met de γ-secretaseremmer DAPT (gebruikt om Notch-signalering te blokkeren) tijdens differentiatie resulteert in een cultuur met meer trilhaarcellen ten koste van bokaalcellen 23,40,41,42.
Bovendien kunnen middelen om cellen te stimuleren of bepaalde processen te blokkeren worden toegepast op het basale compartiment of (in een zeer klein volume) op het apicale compartiment van de cultuur. Cellen kunnen ook worden blootgesteld aan stoffen in de lucht vanaf de apicale kant. Dergelijke blootstellingsontwerpen zijn gebruikt om het effect van dieseluitlaatgassen of hele sigarettenrook op PBECs23,43,44 te bestuderen. Het medium kan worden geoogst telkens wanneer het medium wordt veranderd om uitgescheiden eiwitten aan de basale kant te controleren; hetzelfde geldt voor de apicale kant van de cellen die wordt gewassen met PBS terwijl het basale medium wordt ververst. De zogenaamde apicale was wordt geoogst en optioneel dithioerythritol (DTE) wordt toegevoegd om het slijm dat door de bokaalcellen wordt geproduceerd efficiënter te dissociëren. Cellysaten kunnen worden verkregen voor isolatie van totaal eiwit, RNA en chromosomaal en mitochondriaal DNA. De cellen kunnen verder worden bestudeerd met behulp van antilichamen voor specifieke markers, door het polyethyleentereftalaat (PET) -membraan uit de plastic insert te snijden en dit membraan verder in kleinere stukjes te snijden voor meerdere immunofluorescentiekleuringen45. Bovendien kan flowcytometrie of FACS ook worden gebruikt na trypsinisatie van de cellen in de inserts. Tijdens de ALI-fase kan de ontwikkeling van de cellulaire barrière worden gevolgd door de elektrische weerstand te meten en vervolgens de TEER te berekenen, waarbij de elektrische weerstand omgekeerd evenredig is met het oppervlak van de membraaninzet. De berekening is gebaseerd op de wet van Ohm met behulp van de volgende formule: 
, waarbij Rm de gemeten elektrische weerstand is, Rb de basislijn elektrische weerstand van een wisselplaat zonder coating en cellen, en SA het oppervlak van het membraan van de insert is. Het meten van de elektrische weerstand met behulp van EVOM2- en STX/chopstick-elektroden is eenvoudig, maar sterk afhankelijk van de hanteringsprocedures bij het inbrengen in de put. Ook is gesuggereerd dat de vorm van de elektrode van invloed is op de meting van de barrièrefunctie van het relatief grote oppervlak17.
Verdere verbetering van het ALI-celkweeksysteem, gericht op het verhogen van de nauwkeurige weefselrepresentatie, omvat cocultuur van extra celtypen zoals leukocyten, fibroblasten of endotheelcellen46,47,48. Er is waargenomen dat die co-cultuur van ALI-PBEC met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) of M-CSF-gedifferentieerde macrofagen de aangeboren epitheliale responsen en reparatie aanzienlijk beïnvloedt48. Het is belangrijk op te merken dat in dergelijke cocultuurmodellen gemiddelde compatibiliteit een probleem kan zijn. Aangezien het medium dat wordt gebruikt voor de luchtwegepitheelcelcultuur specifiek is ontwikkeld voor PBECs en mogelijk niet optimaal geschikt is voor andere celtypen, is optimalisatie noodzakelijk. Een ander type vooruitgang op het gebied van luchtwegbiologie waarvoor geïsoleerde PBECs kunnen worden gebruikt, is het gebruik van Organs-on-Chips (OoC) -technologie49,50. Met behulp van deze technologie kan de invloed van de mechanische krachten van ademhaling en bloedstroom, zoals stretch, lucht en mediumstroom, worden bestudeerd 29.
Interdonorvariabiliteit kan significant zijn bij het gebruik van PBECs van verschillende donoren, en daarom is het belangrijk om te overwegen cellen van verschillende donoren te gebruiken om rekening te houden met deze variabiliteit in epitheelcelkweekstudies. Aangezien de kweek van ALI-PBEC's tijdrovend is en gepaard gaat met aanzienlijke kosten, wordt de optie onderzocht om ALI-PBEC-culturen te vestigen door cellen van verschillende donoren in één celkweekinzet te mengen. Op deze manier kunnen pilotexperimenten gemakkelijk worden uitgevoerd met behulp van primaire cellen, voordat de reacties van culturen afkomstig van verschillende individuele donoren worden geanalyseerd . Bovendien kunnen donoren met verschillende kenmerken (bijvoorbeeld verschillende leeftijdscategorie of geslacht) worden gegroepeerd voor verkennende studies. Bij het gebruik van donormixen is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er gelijke celaantallen van verschillende donoren aanwezig zijn, om te voorkomen dat één donor de uitkomsten domineert als gevolg van een hogere proliferatiesnelheid. Daarom worden cellen van individuele donoren afzonderlijk geëxpandeerd en met een hogere dichtheid in de insert gezaaid in vergelijking met zaaicellen van een individuele donor, om proliferatie in de insert te minimaliseren vóór de overgang naar de ALI. Responsen van donormixen en overeenkomstige individuele donoren werden vergeleken door de infectiekinetiek van SARS-CoV-2 te bestuderen. Met behulp van RT-qPCR en immunofluorescentiekleuring werd waargenomen dat de donormix een goede weergave gaf van de verschillende individuele donoren, door vergelijkbare aantallen geproduceerde virusdeeltjes en vergelijkbare aantallen geïnfecteerde cellente tonen 28.
Om een aanvaardbaar alternatief voor diermodellen te worden, moet genbewerking van gekweekte bronchiale epitheelcellen haalbaar zijn51. RNA-interferentietechnologie door gebruik te maken van kleine interfererende RNA's (siRNA's) in ALI-PBECs wordt onderzocht, maar aangezien de cellen tijdens de ondergedompelde fase van de cultuur met siRNA moeten worden getransfecteerd, wordt knockdown niet voldoende gehandhaafd tijdens ALI-cultuur vanwege de lange kweekduur, tenzij siRNA-transfectie vaak wordt herhaald tijdens cultuur52. Niettemin kunnen siRNA's met succes worden gebruikt voor het modificeren van genexpressie in ondergedompelde basale cellen. Anderen hebben met succes CRISPR / Cas9-technologie gebruikt om genbewerking te bereiken in primaire ALI-luchtwegepitheelcelculturen met ribonucleoproteïne (RNP) -levering 53. Bij het gebruik van dergelijke technieken is het essentieel dat de cellen hun volledige differentiatiecapaciteit behouden. Omdat primaire luchtwegcelculturen niet onbeperkt kunnen worden doorgelaten, is klonale expansie van de gen-bewerkte cellen niet eenvoudig en is de toevoeging van medium om getransfecteerde cellen te selecteren omslachtig. Daarom is het moeilijk om de gewenste knockdown in alle gekweekte cellen te bereiken. Een alternatief voor het genereren van knock-out klonen is het gebruik van knock-out strategieën in hiPSCs54 en het gebruik van deze cellen om luchtwegepitheelcellen te genereren. Een ander, zij het suboptimaal, alternatief is het opzetten van een vereeuwigde PBEC-lijn om gen-bewerkte cellen klonaal uit te breiden55.
Het hier gepresenteerde protocol is een manier om een goed gedifferentieerde pseudogestratificeerde ALI-PBEC te genereren, maar er zijn ook andere protocollen gevonden om een dergelijke cultuur tot stand te brengen, met kleinere en grotere verschillen in vergelijking met het gepresenteerde protocol. Naar onze mening zijn laboratoriumvalidatie van kweekmethoden en strenge kwaliteitscontrole essentieel voor het ALI-PBEC-systeem en vergelijkbare kweeksystemen van luchtwegepitheelcellen om een geldig alternatief voor dierproeven te worden.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen relevante belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
De studies met behulp van het model dat in deze bijdrage wordt beschreven, zijn ondersteund door verschillende financieringsorganisaties, waaronder het Longfonds, de Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en -ontwikkeling (ZonMw, COVID-19 MKMD-subsidie), de Stichting Proefdiervrij (subsidie #114025007), evenals onderzoekssubsidies van bedrijven als Boehringer Ingelheim en Galapagos. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
| 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
| Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
| Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
| Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
| Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
| Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
| Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
| CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
| Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
| CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
| Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
| Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
| D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
| dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
| EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
| IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
| Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
| M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
| M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
| MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
| Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
| Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
| Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
| Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
| Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
| Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
| Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
| Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
| Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
| Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
| Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
| Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
| Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
| Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
| Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
| Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
| Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
| Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
| RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
| TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
| Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
| Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
| Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
| Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |
References
- Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112 (2022).
- de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
- Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914 (2022).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128 (2021).
- Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
- Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
- Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742 (2019).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
- Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540 (2022).
- Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
- Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
- Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
- Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511 (2022).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
- Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
- Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
- Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
- van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
- Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
- Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
- Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
- Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
- Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
- Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
- Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
- Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071 (2022).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
- Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
- Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
- Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
- Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347 (2017).
- Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
- vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227 (2022).
- Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278 (2020).
- Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013 (2022).
- Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386 (2017).
- van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
- Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
- Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
- Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
- Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
- Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257 (2022).
