Summary
여기에서 우리는 난자의 수용성을 증가시키는 Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 튜브 안내 및 수신을 관찰하기 위한 SIV(semi-in vitro) 방법의 개선을 설명합니다. 고처리량 SIV 겸 중격 방법은 배우자 마커 라인 및 유전적으로 인코딩된 바이오센서와 결합하여 수정의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.
Abstract
꽃 피는 식물에서 암술 내 꽃가루관(수컷 배우체)의 성장과 안내, 암컷 배우체에 의한 꽃가루관의 수용은 이중 수정과 후속 종자 발달에 필수적입니다. 꽃가루 관을 수용하는 동안 수컷과 암컷 배우체 사이의 상호 작용은 꽃가루 관 파열과 두 개의 정자 세포의 방출로 절정에 달하여 이중 수정을 일으킵니다. 꽃가루 관의 성장과 이중 수정은 꽃의 조직 내에 깊숙이 숨겨져 있기 때문에 이 과정은 생체 내에서 관찰하기 어렵습니다.
모델 식물 Arabidopsis thaliana에서 수정의 생세포 이미징을 위한 반시험관(SIV) 방법이 여러 조사에서 개발 및 구현되었습니다. 이러한 연구는 꽃 피는 식물에서 수정 과정이 어떻게 발생하는지, 그리고 수컷과 암컷 배우체의 상호 작용 중에 어떤 세포 및 분자 변화가 발생하는지에 대한 근본적인 특징을 밝히는 데 도움이 되었습니다. 그러나 이러한 생세포 이미징 실험에는 개별 난자의 절제가 포함되기 때문에 이미징 세션당 관찰 횟수가 적기 때문에 이 접근 방식은 지루하고 시간이 많이 걸립니다. 다른 기술적 어려움 중에서도 꽃가루 관이 시험관 내에서 난자를 수정하지 못하는 경우가 종종 보고되어 이러한 분석이 심각하게 혼란스러워집니다.
여기에서는 자동화되고 높은 처리량 방식으로 꽃가루 튜브 수용 및 수정을 이미징하기 위한 자세한 비디오 프로토콜이 제공되어 이미징 세션당 꽃가루 튜브 수신 및 파열을 최대 40개까지 관찰할 수 있습니다. 유전적으로 암호화된 바이오센서 및 마커 라인의 사용과 함께 이 방법을 사용하면 시간 투자를 줄이면서 큰 크기의 샘플을 생성할 수 있습니다. 꽃 스테이징, 해부, 배지 준비 및 이미징을 포함한 기술의 뉘앙스와 중요한 점은 꽃가루 튜브 안내, 수용 및 이중 수정의 역학에 대한 향후 연구를 용이하게 하기 위해 비디오 형식으로 명확하게 자세히 설명되어 있습니다.
Introduction
유성 생식 유기체에서 유전적으로 독특한 자손의 생성은 남성과 여성 배우자의 성공적인 융합에 달려 있습니다. 꽃 피는 식물에서 이중 수정 동안 두 개의 수컷 배우자(정자 세포)와 두 개의 암컷 배우자(난자 세포 및 중앙 세포)의 상호 작용은 꽃가루관(수컷 배우체)에서 정자 방출에 달려 있습니다. 꽃가루 관 수용이라고 하는 이 과정은 배낭(암컷 배우체) 내에 존재하는 시너지 세포에 의해 크게 제어됩니다.1,2. 꽃가루관 수용이 꽃 속 깊숙한 곳에서 일어나기 때문에, 이 과정의 생세포 이미징을 가능하게 하는 방법인 SIV(semi-in vitro (semi-in vitro) 꽃가루관 수용)가 확립되었다3. 이 방법을 사용하면 절제된 애기장대 난자를 반액체 꽃가루 발아 배지에 놓고 스타일 전달관접합부 3,4에서 절단된 암술의 암술머리와 스타일을 통해 자라는 꽃가루 관을 표적으로 합니다. 이 기술의 개발 이후, 상세한 관찰은 꽃가루 튜브 안내, 수용 및 수정을 둘러싼 몇 가지 발견으로 이어졌습니다. 그 중에서도 이러한 발견에는 암술머리3를 통한 성장에 의한 꽃가루관 표적화 능력의 획득, 꽃가루관 도착 시 시너지드에서 세포내 칼슘 진동의시작5,6,7,8,9, 꽃가루관 파열 시 정자 세포 방출 및 수정의 역학 등이 포함된다10 . 그럼에도 불구하고 이 기술은 난자 절제에 의존하기 때문에 수정 관찰 횟수가 제한되고 꽃가루 관 수용이 종종 비정상적이어서 꽃가루 관 파열이 실패합니다(비디오 1 및 보충 파일 1). 따라서 꽃가루 관 수용 및 수정에 대한 고처리량 분석을 가능하게 하는 보다 효율적인 접근 방식이 필요합니다.
이 프로토콜을 개발하면서 가장 "시험관 내"에서 가장 "생체 내" 방법에 이르기까지 꽃가루 관 수용을 분석하기 위한 몇 가지 새로운 접근 방식을 테스트했으며 전체 중격의 절제를 기반으로 하는 효율적인 기술이 정착되어 하루에 최대 40회의 수정 관찰이 가능합니다. 여기에서는 꽃 스테이징, 해부, 중간 준비 및 이미징 설정을 포함하여 기술의 뉘앙스와 중요한 점을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에 따라 꽃가루관 안내, 꽃가루관 수용 및 이중 수정에 중점을 둔 연구가 촉진되어야 합니다. 이 방법이 허용하는 더 높은 샘플 크기는 라이브 이미징 실험에서 도출된 결론의 과학적 건전성을 강화할 것으로 예상됩니다. 이 기술의 잠재적 응용 분야에는 유전적으로 암호화된 바이오센서를 사용하여 배우체 상호작용 동안 세포질 칼슘 농도([Ca 2+]cyt), pH 또는 H2O 2의 분자 및 생리학적 변화를 관찰하는 것이포함되지만 이에 국한되지는 않습니다. 또한, 수용 시너지 효과의 퇴화, 정자 세포 이동 또는 카르요가미와 같은 세포학적 변화는 이 개선된 방법을 사용하여 보다 쉽게 관찰할 수 있습니다. 마지막으로, 광시야 현미경으로 다양한 수정 단계의 시기를 모니터링한 다음 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 또는 이광자 여기 현미경(2PEM)을 사용하여 보다 자세한 분석을 수행하여 고해상도 및 3D 재구성을 수행할 수 있습니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용된 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오.
1. 이미징 실험 설계 시 고려 사항
- 관찰하고자 하는 원하는 현상을 포착하는 데 필요한 이미징 지속 시간과 샘플링 주파수를 미리 결정합니다. 예를 들어, Nyquist의 샘플링 정리에 따르면 샘플링 주파수는 입력 샘플의 가장 높은 주파수의 두 배보다 커야 합니다. 따라서 시너지 [Ca2+]cyt 진동을 정확하게 포착하려면 약 10초마다 이미징을 수행하되 꽃가루 튜브 배출 시 정자 세포의 속도를 측정하려면 1초10 미만의 시간 분해능을 보장해야 합니다.
- 배경 자가형광을 넘어 충분히 밝은 관심 세포에 대한 형광 마커를 선택합니다. 바이오센서를 사용하려면 일반적으로 더 민감하고 노출 시간이 덜 필요하기 때문에 세포 기능을 방해하지 않는 가장 밝은 선을 선택하십시오.
- 원하는 현상을 포착하는 데 어떤 유형의 형광 현미경 및 배율이 가장 적합한지 고려하십시오. 광시야 현미경 및 저배율 대물렌즈를 사용하여 더 넓은 피사계 심도에서 빛을 캡처하고, 시간이 지나도 초점을 유지하고, 전체 난자와 같은 더 큰 물체를 이미지화하거나, 색채 이동 아티팩트에 민감한 비율계량 센서를 사용할 수 있습니다. 세포 및 세포 내 물체의 해상도를 높이기 위해 고배율 대물렌즈와 함께 CLSM 또는 2PEM을 사용하지만 시간이 지남에 따라 초점을 유지하는 데 어려움이 있습니다.
- 실험당 이미지화할 샘플 수를 추정합니다. 예를 들어, 자동 초점 및 다단계 획득 기능에 필요한 시간 때문에 3개의 격막을 이미징하고 실험당 최대 40개의 수정 이벤트를 이미징하는 데 최소 샘플링 시간이 ~30초인 10x 대물렌즈를 사용합니다.
2. 꽃가루 발아 배지 준비
- -20°C에서 저장되는 각 미량 영양소의 1 M 분취액을 사용하여 액체 꽃가루 발아 배지(5mMCaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0.01% [w/v] H3BO3 및 10% [w/v] 수크로오스)를 준비합니다. 0.1M KOH로 pH를 7.5로 조정합니다. 배지를 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
알림: pH는 시간이 지남에 따라 떨어질 수 있습니다. - 10mL 비커에 2.5mL의 액체 배지를 넣고 덩어리를 방지하기 위해 빠르게 회전하는 교반 막대로 32mg의 초저융점 아가로스(~1.3%)를 천천히 추가합니다.
- 65°C의 핫플레이트 상에서 아가로스를 용융시키고, 비커를 너트화하여 측면으로부터 임의의 응결을 수집한다.
- 배지 130 μL를 35 mm 유리 바닥 접시의 14 mm 웰 내로 피펫팅하고, 배지가 웰을 덮을 때까지 접시를 회전시킨다.
- 접시 중앙에서 피펫으로 총 40 μL를 흡입하고 총 부피 90 μL를 남깁니다.
알림: 더 낮은 총 부피를 달성하기 위해 더 많은 매체를 우물에서 흡인할 수 있습니다. 이는 작동 거리가 낮은 고배율 대물렌즈에 필요할 수 있습니다. 그러나 한천 패드가 얇을수록 더 빨리 건조됩니다. - 균일한 냉각을 보장하기 위해 습도 챔버의 알루미늄 블록에서 접시를 식히십시오. 다음날 아침 사용할 수 있도록 플레이트를 4°C에서 밤새 보관하십시오.
3. 중격 기증자, 낙인 기증자 및 꽃가루 기증자의 꽃 스테이징
그림 1: 중격 기증자, 낙인 기증자 및 꽃가루 기증자의 꽃 스테이징. (A) 꽃차례 내 애기장대 꽃(Ler-0)의 단계. 꽃잎이 막 열리기 직전의 꽃잎과 노랗게 변하는 꽃밥이 있는 12B 단계의 새싹은 꽃받침, 꽃잎, 수술을 모두 제거하여 거세해야 합니다. 암술(암컷 배우체 제작자가 있음)은 24시간 후에 중격 기증자로 사용할 수 있습니다. (B) 꽃차례 내 애기장대 꽃(Col-0)의 단계. 꽃잎에서 거의 나오지 않는 노란색 음란한 꽃밥과 암술머리가 있는 12B 단계의 새싹은 꽃받침, 꽃잎, 수술을 모두 제거하여 거세해야 합니다. 그런 다음 암술은 24시간 후에 낙인 기증자로 사용할 수 있으며, 이때 열려 있고 꽃가루를 흘리는 꽃(수컷 배우체 마커가 있음)에 의해 수분되어야 합니다. 수분 된 암술머리는 수분 후 1 시간 이내에 해부해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이미징 전날 아침, 중격 기증자 및 낙인 기증자로 사용할 애기장 대 식물을 선택하십시오. 그들이 건강하고 최근에 규사를 생산하기 시작했는지 확인하십시오.
참고: Landsberg erecta (Ler-0)는 격막이 튼튼하고 난자 사이에 작은 마디가 있기 때문에 중격 기증자로 사용하기에 좋은 접근입니다. 컬럼비아(Col-0)는 꽃가루 튜브 성장에 도움이 되는 것으로 보이기 때문에 낙인 기증자로 사용하기에 좋은 접근입니다. - 수술, 꽃받침 및 꽃잎을 제거하여 최소 3개의 12B 단계 중격 기증자 꽃과 12개의 단계 12B 낙인 기증자 꽃을 거세합니다(그림 1A, B). 같은 꽃차례에서 오래된 꽃도 제거하면 잠재적으로 거세된 꽃에 수분을 공급할 수 있습니다.
- 24시간 후인 아침에 꽃가루를 쉽게 흘리는 꽃가루 기증자 꽃(예: 꽃가루 튜브 또는 정자 세포 마커가 있음)으로 낙인 기증자에게 수분을 공급합니다. 암술머리가 꽃가루로 거의 완전히 덮일 때 수분이 완료됩니다(그림 1B).
4. 중격 해부
그림 2: 중격 및 암술머리 해부에 대한 빠른 가이드. (A) 중격 해부 단계. 인슐린 주사기 바늘로 양면 테이프에 암술을 고정하고 스타일-난소 접합부와 난소-척추경 접합부를 절단한 다음 양쪽 심피의 중격을 따라 얕게 절단합니다(1단계). 심피벽을 테이프에 다시 떼어냅니다(2단계). 상단 중격 아래에서 replum을 자릅니다 (3 단계). 스타일에서 중격을 자르고 작은 꽃자루에서 집게를 사용하여 제거합니다 (4 단계). 중격을 한천 배지에 놓고 집게로 부드럽게 삽입합니다. (B) 낙인 해부 단계. 암술 (수분 <1 시간 전)을 양면 테이프에 고정하고 면도날로 스타일-난소 접합부에서 자릅니다 (6 단계). 중격 옆에 인슐린 바늘이 있는 한천 배지에 암술머리를 놓고 거리를 약 250μm로 조정합니다(7-8단계). 스타일의 마이크로파일과 베이스 주위에 반액체 풀이 형성되는지 확인합니다(9단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 수분 후 30 분 후에 척추 경에서 건강하고 성숙한 중격 기증자 암술을 모아 유리 슬라이드에 장착 된 신선한 양면 접착 테이프에 붙이고 테이프 가장자리 바로 옆에 낙인이 붙어 있습니다.
알림: 암술이 접착 테이프에 붙어 있는 해부 시간을 가능한 한 짧게 제한하십시오. 해부는 높은 습도에서 이루어져야하며, 이는 슬라이드 옆에 가습기를 놓음으로써 달성 할 수 있습니다. - 거세에서 남은 꽃받침, 꽃잎 및 수술 파편을 제거하기 전에 새 인슐린 주사기 바늘의 뒷면을 사용하여 척추경을 부드럽게 누르고 난소를 따라 암술을 테이프에 단단히 고정합니다.
- 입체경 아래에서 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 스타일-난소 접합부와 난소-척추경 접합부에서 심피당 두 번 절단한 다음 각 심피의 중격을 따라 얕게 절단합니다(그림 2, 1단계).
참고: 중격을 따라 너무 깊게 자르면 funiculus에서 난자가 절단됩니다. - 테이프에 난소 벽을 조심스럽게 떼어내고(그림 2, 2단계) 두 격막 사이에 바늘을 부드럽게 밀어 넣어 난자를 방해하지 않고 암술의 전체 길이를 따라 자두를 자릅니다(그림 2, 3단계).
참고: 스타일에서 척추경 방향으로 replum을 잘라서 상단 중격의 난자가 가능한 한 적게 방해받도록 합니다. - 스타일과 척추경과의 접합부 모두에서 상단 중격을 부드럽게 자르고 척추경 쪽에서 집게로 중격을 제거합니다(그림 2, 4단계).
알림: 중격이 평평하게 유지되고 구부러지지 않도록 이 절단을 똑바르고 부드럽게 유지하십시오. - 난자의 미세 파일이 위를 향하고 동일한 초점면에 있도록 중격을 매체에 가능한 한 평평하게 놓습니다. 난자가 배지에 약간 박힐 때까지 중격을 배지에 부드럽게 누릅니다(그림 2, 5단계).
참고: 난자의 미세 파일이 꽃가루 관에 접근할 수 있도록 중격을 배치하는 것이 중요합니다(접근할 수 없는 난자는 바늘로 부드럽게 재배열할 수 있음). 매립 후 중격 주위에 작은 액체 웅덩이가 형성되어야 합니다. - 최대 2개의 암술에 대해 4.1-4.6단계를 반복하여 격막을 끝에서 끝까지 배치합니다.
5. 낙인 해부
- 수분된 암술머리 기증자 암술을 유리 슬라이드에 장착된 신선한 양면 접착 테이프에 올려 난소 스타일 접합부가 테이프 가장자리에서 떨어지도록 합니다(그림 2, 6단계).
- 새 면도날을 사용하여 스타일을 똑바로 자르고 들어 올려 면도날에 오명이 붙지 않도록 합니다(그림 2, 6단계).
알림: 가장 깨끗한 절단을 위해 테이프 가장자리를 자릅니다. - 인슐린 주사기 바늘로 칼날에서 암술머리를 제거하고 난자에서 약 250-300μm 떨어진 곳에 평평하게 놓습니다(그림 2, 7-8단계).
참고: 스타일은 옆으로 수평으로 향해야 합니다. 그렇지 않으면 대부분의 꽃가루 튜브가 중격 아래에서 자랄 것입니다. 스타일 입구에 작은 액체 웅덩이가 1분 동안 매체에 누워 있으면 나타나야 합니다. 꽃가루 튜브가 스타일에서 부드럽게 빠져 나가기 때문에 이것은 좋은 징조입니다. - 최대 12개의 암술머리에 대해 5.1-5.3단계를 반복하여 각 중격의 양쪽에 2개를 배치합니다. 난자의 미세 파일 주위에 형성되는 작은 액체 풀을 찾으십시오. 이것은 배낭에 대한 꽃가루 관의 접근성과 표적화를 돕습니다(그림 2, 9단계).
참고: 배지와 난자가 마르는 것을 방지하기 위해 접시를 여는 시간을 제한하십시오.
6. 이미징
그림 3: SIV 겸 중격 이미징 방식. (A) 입체경을 통해 볼 때 12개의 수분된 암술머리와 3개의 격막이 있는 전체 SIV 겸 중격 설정. (B) 10x 대물렌즈를 사용하여 배양 후 5시간 동안 A에서 볼 수 있는 전체 SIV 겸 중격 설정의 병합된 이미지, 다단계 획득을 위해 표시된 5개의 개요 영역(각각 ~1mm). 녹색 상자는 시너지 효과에서 폭발적인 폭발을 겪는 꽃가루 튜브를 받은 난자를 보여줍니다. (C) 다른 시점에서 개요 영역 2를 자세히 봅니다. 현미경의 습도 챔버에서 배양한 후 약 3시간 후에 꽃가루 튜브가 마이크로파일 근처에 도착해야 하며 6시간 동안 이미징하면 대부분의 난자가 꽃가루 튜브(녹색 사각형)를 제대로 받아야 합니다. 그런 다음 이 난자는 폭발적인 꽃가루 튜브 파열(별표)을 겪습니다. 스케일 바 = (A) 5 mm, (B, C) 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 해부가 완료되고 접시를 이미징할 준비가 되면 92% 상대 습도 및 21°C로 유지되는 현미경의 습도 챔버에서 배양합니다.
알림: 현미경에 사용할 수 있는 습도 챔버가 없는 경우 뚜껑과 접시의 바깥쪽 가장자리를 소량의 물로 감싸면 접시의 높은 습도를 유지하는 데 도움이 됩니다. - 낮은 조도의 명시야에서 샘플에 초점을 맞춘 다음 형광등으로 전환하여 스테이지 오버view에서 이미지화할 샘플의 영역을 표시합니다.
참고: 10x 배율에서 총 3개의 격막에 대해 약 5개의 영역을 표시할 수 있습니다(그림 3). 광독성을 최소화하기 위해 개요 영역을 표시하는 데 사용되는 시간을 제한하십시오.amp형광등에 의한 샘플. - 각 개요 영역의 시작 부분에 자동 초점 기능이 있는 다단계 획득 방식을 사용하여 이미징을 시작합니다. 샘플을 배양한 후 ~1시간 후에 꽃가루 튜브가 스타일에서 나오기 때문에 수집을 2시간 지연시키거나 꽃가루 튜브가 마이크로파일에 도달할 때까지 지연시킵니다. 자동 초점이 100μm 범위(7μm 큰 단계 및 1μm 미세 단계)로 설정되어 있는지 확인하여 시간이 지남에 따라 격막이 약간 움직이고 가라앉을 때 난자에 초점을 유지합니다.
- 샘플 배양을 시작한 후 ~9시간 후에 이미지 획득을 중지하면 이때까지 대부분의 난자가 꽃가루 튜브를 끌어당기고 받았어야 합니다.
참고: 적은 수의 난자가 꽃가루 관을 끌어들이는 경우 입체경으로 접시를 주의 깊게 관찰하면 다음에 난자 또는 스타일 방향을 개선할 수 있는 방법을 결정하는 데 유용합니다.
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Representative Results
애기장대에서 꽃가루관 파열과 관련하여 수용성 시너지드에서 핵 변성의 시기를 평가하고 왼쪽 또는 오른쪽 시너지드가 수용성 시너지드가 될 운명인지 관찰하기 위해, 여기에 설명된 SIV cum septum 방법은 시너지 세포질 마커(pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1)를 중격 기증자로, 수컷 배우체 마커(pLAT52:R-GECO)를 꽃가루 기증자로 사용합니다. 격막과 수분된 암술머리는 프로토콜의 섹션 4-5에 따라 배합 후 24시간 후에 해부하고 전날 준비된 배지로 유리 바닥 접시에 놓았습니다. 각 접시를 현미경의 습도 챔버에 넣고 5개의 개요 영역이 있는 10x 대물 렌즈(개구수 0.4)를 사용하여 다단계 실험을 수행했습니다(그림 3). 각 영역의 이미지는 R-GECO(25ms)의 경우 채널 (1) 560/640, roGFP2-ORP1(60ms)의 경우 채널 (2) 488/520, roGFP2-ORP1(60ms)의 경우 채널 (3) 387/520, 배경 빼기(60ms)의 경우 채널 (4) 387/640(표 1)의 경우 4개의 형광 채널을 사용하여 9시간 동안 60초마다 촬영되었습니다(표 1). 이미지 획득 전 1분마다 7μm 거친 스테핑 및 1μm 미세 스테핑과 함께 100μm 범위를 사용하는 자동 초점 기능이 사용되었습니다. FIJI에서 5개의 이미지 파일을 열고 채널을 분리한 다음 이미지를 수동으로 바둑판식으로 배열했습니다(비디오 2 및 보충 파일 1).
비디오 2(보충 파일 1 참조)에서 시너지 효과의 폭발성 꽃가루관 파열의 41가지 예를 난자 내에서 볼 수 있으며 녹색 사각형은 관심 영역을 표시합니다. 칼슘 바이오센서 라인 pLAT52:RGECO를 꽃가루 기증자로 사용하여 꽃가루 튜브 끝에서 폭발적인 꽃가루 튜브 파열 사례가 관찰되었습니다. 특히, 높은 수준의 칼슘에 갑작스럽게 노출된 결과 바이오센서의 밝기가 급격히 증가했습니다. 폭발성 꽃가루 튜브 파열은 GFP 기반 또는 RFP 기반 정자 세포 또는 세포질 마커로 분석할 수도 있으며, 이는 또한 정자 또는 세포질 함량의 빠른 방출을 보여줍니다. 꽃가루 튜브 파열 시 수용 시너지 효과의 핵이 동시에 분해되는 것이 관찰되었으며(실험에서 1분 시간 분해능 내), 카르요가미의 결과로 꽃가루 튜브 파열 시 마이크로파일로의 난자 세포 핵의 이동도 관찰되었습니다(비디오 3 및 보충 파일 1). 왼쪽과 오른쪽 시너지 모두 수용 시너지 효과를 낼 수 있었고, 첫 번째는 수용 시너지 효과에서, 두 번째는 지속적인 시너지 효과에서 두 개의 꽃가루 튜브 파열 사례가 관찰되었습니다. 비디오 2(보충 파일 1 참조)는 난자에서 볼 수 있는 결함 있는 꽃가루 관 수용의 10가지 예를 보여주며 관심 영역은 빨간색 사각형으로 표시됩니다. 따라서 꽃가루 튜브 수용의 전반적인 효율은 꽃가루 튜브를 끌어들이는 난자에 대해 ~80%였습니다. 이러한 실패한 경우, 꽃가루 튜브는 미세 파일에서 성장을 멈추거나, 시너지 효과로 빠르게 성장한 후 성장을 멈추거나, 성장을 멈추지 못하고 배아 주머니 내에서 계속 성장하고 감겨 있습니다. 표시된 관심 영역이 없는 난자는 꽃가루 관을 끌어들이지 못했거나 접근 가능한 방향이 아니었습니다. 부정적인 결과와 긍정적인 결과의 확대된 예는 비디오 3(보충 파일 1 참조)에서 볼 수 있으며, 결함이 있는 꽃가루 튜브 수용의 두 사례(비디오 3A, C 및 보충 파일 1)와 성공적인 꽃가루 튜브 수용의 두 사례(비디오 3B, D 및 보충 파일 1).
그림 4: SIV 방법 효율성 비교. SIV 절제 난자 방법(총 71개의 난자)의 8가지 기술적 복제는 폭발성 꽃가루 튜브 파열이 있는 ~28%의 난자만 나타내어 ~10%-50% 범위의 효율성을 나타냈습니다. SIV 정액 중격 방법(8개의 격막 및 102개의 난자)의 5가지 기술 복제는 폭발성 꽃가루 튜브 파열과 함께 ~79%의 난자를 보여 ~70%-100% 범위의 효율성을 나타냈습니다. 꽃가루 관을 마이크로파일로 끌어들인 난자와 끌어들인 꽃가루 관을 받기에 충분한 기록된 시간을 가진 난자만 계산되었습니다. "X"는 각각 평균과 중앙선 중앙값(50번째 백분위수)을 나타냅니다. 상위 및 하위 사분위수 외부의 선은 성공적인 꽃가루 튜브 수용의 최소 및 최대 백분율을 보여줍니다. 꽃가루 튜브 파열이 있는 난자의 비율은 짝을 이루지 않은 t-검정을 기반으로 한 두 방법 간에 유의하게 달랐습니다(p < 0.001). 약어: SIV = semi-in vitro. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 장비/설정 | 보충 비디오 2 & 3 |
| 현미경 | 올림푸스 IX-81F-ZDC2 도립 현미경 |
| 온도 제어 | Life Imaging Services GmbH 큐브 & 박스 (22C) |
| 습도 조절 | Life Imaging Services GmbH 벽돌 (92 % 상대 습도) |
| 소프트웨어 | Olympus cellSens Dimension 2.3 |
| 실시간 컨트롤러 | 올림푸스 U-RTC |
| 레이저 | MT20- 150W 크세논 아크 버너 |
| 대물 렌즈 | 10x 공기 침수 U Plan SApo 대물 렌즈(0.4 NA), 작동 거리 3.1 mm |
| 미러 큐브 | GFP/RFP (영어) |
| 필터 휠 | 올림푸스 U-FFWO |
| 채널 1 (25 ms) : 반사 (560/25) 관찰 (624/40) | |
| 채널 2(60ms): 반사(485/20) 관찰(525/30) | |
| 채널 3(60ms): 반사(387/11) 관찰(525/30) | |
| 채널 4(60ms): 반사(387/11) 관찰(624/30) | |
| 발견자 | 하마마츠 ORCA-Fusion 디지털 CMOS 카메라 |
| 자동 초점 | 100 μm 범위, 7 μm 거친 스텝, 1 μm 미세 스텝 |
| 시간 간격 | 1 분 |
표 1: 이 원고에 사용된 현미경 시스템 및 설정.
비디오 1: SIV 절제 난자 방법의 타임랩스. 꽃가루 관( pLAT52:R-GECO를 보유함)의 성장과 난자 내 꽃가루 관 수용을 보여주는 절제된 난자를 사용하여 SIV의 8개 기술 복제에서 병합된 타임랩스. 20 개의 녹색 상자는 시너지 효과에서 폭발성 꽃가루 튜브 파열 사례를 나타내고 51 개의 빨간색 상자는 꽃가루 튜브 파열 실패 및 과증식 사례를 보여줍니다. 시간 경과는 260분에서 400분 사이이며 스케일 바는 100μm입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: SIV 겸 중격 타임랩스. (A) RFP 채널(채널 1)만으로 난자 내 꽃가루 튜브 성장 및 수용의 5개 개요 영역( 그림 3 참조)에서 병합된 타임랩스. 꽃가루에는 pLAT52:R-GECO 와 난자 pFG:roGFP2-ORP1-NLS가 있습니다. pMYB98:roGFP2-ORP1입니다. 41 개의 녹색 상자는 폭발성 꽃가루 튜브 파열 사례를 나타내고 10 개의 빨간색 상자는 꽃가루 튜브 파열 실패 및 꽃가루 튜브 과증식 사례를 나타냅니다. (B) RFP 및 GFP 채널(채널 1 및 채널 2) 모두에서 동일한 타임랩스로, 꽃가루 튜브 수용 동안 배우자 및 시너지 세포의 핵 역학을 보여줍니다. 오른쪽 상단의 숫자는 시간(h:min)을 나타냅니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3: SIV cum septum의 긍정적 및 부정적 결과의 예. (A,C) 실패한 수정의 두 사례를 보여주는 비디오 2에서 가져온 난자의 예. A에서 꽃가루 관은 성장을 멈추지 못하고 배아 주머니에서 계속 감겨 있습니다. C에서는 두 번째 범주의 꽃가루 튜브 과증식이 보이는데, 첫 번째 꽃가루 튜브는 시너지 효과로 성장하면서 빠르게 성장하지만 파열되지 않고 성장을 멈춥니다. (비,디) 성공적인 꽃가루 튜브 수용의 두 가지 사례를 보여주는 비디오 2에서 가져온 난자의 예. 야생형과 같은 꽃가루 튜브 파열은 시너지 효과에서 꽃가루 튜브의 폭발적인 파열을 보여 주며, 난자 세포핵이 마이크로 파일쪽으로 이동하는 것은 karyogamy를 나타냅니다. 오른쪽 상단의 숫자는 시간(h:min)을 나타냅니다. 화살촉은 수용성 시너지 핵(rSN)을 나타내고 화살표는 꽃가루 튜브 파열(용해) 후 난자 세포 핵(EN)의 이동을 나타냅니다. 스케일 바 = 30 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 비디오 1, 비디오 2 및 비디오 3의 정지 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고는 애기장대에서 꽃가루 관 수용 및 이중 수정의 이미징을 위한 효율적인 프로토콜을 소개합니다. 개선된 방법인 SIV cum septum은 이미징 세션당 관찰할 수 있는 성공적인 꽃가루관 수용 이벤트의 백분율과 총 수를 크게 증가시킵니다. 여기에 표시된 대표적인 결과는 41개의 성공적인 꽃가루 튜브 수신 이벤트와 수신 결함(~80% 효율)을 나타내는 10개의 난자가 있는 이미징 세션을 보여줍니다. 이는 원래 SIV 절제 난자 방법을 사용하여 총 8개의 이미징 세션에서 캡처된 성공적인 꽃가루 튜브 수용 이벤트 수의 두 배 이상입니다(비디오 1). 총 8개의 격막에 대해 5개의 기술 복제에서 SIV 겸 중격 방법을 사용하여 8개의 기술 복제가 있는 SIV 절제 중격 방법을 사용한 평균 28%와 비교하여 평균 79%의 꽃가루 튜브 수용 효율을 달성했습니다(그림 4).
꽃가루 튜브 수용의 효율성은 SIV cum septum 방법의 경우 훨씬 더 크지만 꽃가루 튜브 과증식 사례는 여러 요인에 따라 여전히 다양한 속도로 발생합니다. 가장 중요한 것은 시너지 세포가 이미징되는 몇 시간 동안 살아 있고 수용 가능한 상태로 유지되어야 한다는 것입니다. 해부 및 이미징 중에 습한 환경을 유지하고, 갓 만든 배지를 사용하고, 난자와 중격을 반액체 한천에 삽입하고, 이미지 획득 중 과도한 빛 노출로 인해 발생하는 열을 피하는 것은 모두 성공적인 꽃가루 튜브 수용을 보장하는 데 중요한 요소입니다. 난자의 마이크로파일에 대한 꽃가루 튜브의 접근성과 매력은 또한 성공적인 꽃가루 튜브 수용 이벤트의 수를 제한하는 핵심 요소입니다. 해부하는 동안 중격에서 난자의 교란을 최소화하고, 미세 파일이 위쪽을 향하도록 중격을 향하게하고, 난자와 스타일 개구부 사이에 반 액체 풀을 형성하는 것이 꽃가루 튜브 인력의 핵심입니다. 이 풀의 형성은 저 융점 한천의 브랜드에 따라 다를 수 있으므로 1 %에서 1.5 %까지 다양한 비율의 한천으로 실험을 시작하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 해부의 어려움은 약간의 연습이 필요하다는 것을 의미하며, 해부 전에 인내심을 갖고 긴장을 풀고 심호흡을 연습하는 것이 좋으며, 중요한 것은 안정성과 일관성을 향상시키는 기술(예: 손 위치, 슬라이드 방향)을 기록해 두는 것이 좋습니다.
SIV cum septum 방법의 이 상세한 프로토콜은 꽃가루 튜브 수용 및 이중 수정의 라이브 이미징을 목표로 하는 실험의 효율성과 샘플 수를 크게 향상시켜야 합니다. 응용 분야에는 유전적으로 암호화된 바이오센서의 사용, 돌연변이 분석, 이중 수정 전, 도중 및 직후의 세포학적 사건에 대한 설명 관찰이 포함됩니다. 우리는 이 방법이 난소의 태반에 난자를 유지하는 것이 도움이 될 수 있는 다른 꽃 피는 식물 종으로 확장되고 확장될 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.
Acknowledgments
pFG:roGFP2-ORP1-NLS 구조를 기증해 주신 Sara Simonini와 Stefano Bencivenga, 현미경에 대한 조언을 해주신 Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter 및 Celia Baroux에게 감사드립니다. Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima 및 SIV 겸 중격에 대한 프로토콜에 관심을 보인 2022년 성 식물 생식에 관한 국제 회의의 다른 모든 사람들의 조언을 진심으로 감사드립니다. 이 연구는 취리히 대학 (University of Zurich)과 스위스 국립 과학 재단 (Swiss National Science Foundation)의 보조금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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