Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Brug af kyllingembryohjernen som model for in vivo- og ex vivo-analyser af humant glioblastomcelleadfærd

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65199
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute, Christiana Care, 3Department of Neurosurgery, Winthrop P. Rockefeller Cancer Institute, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Chick embryoner bruges til at studere humane glioblastom (GBM) hjernetumorer i ovo og i ex vivo hjerneskive co-kulturer. GBM-celleadfærd kan registreres ved time-lapse-mikroskopi i ex vivo-cokulturer, og begge præparater kan analyseres ved det eksperimentelle endepunkt ved detaljeret 3D-konfokal analyse.

Abstract

Kyllingembryoet har været et ideelt modelsystem til undersøgelse af hvirveldyrs udvikling, især til eksperimentelle manipulationer. Anvendelse af kyllingembryoet er blevet udvidet til at studere dannelsen af humane glioblastom (GBM) hjernetumorer in vivo og tumorcellernes invasivitet i omgivende hjernevæv. GBM tumorer kan dannes ved injektion af en suspension af fluorescerende mærkede celler i E5 midbrain (optisk tectum) ventrikel i ovo.

Afhængigt af GBM-cellerne dannes kompakte tumorer tilfældigt i ventriklen og i hjernevæggen, og grupper af celler invaderer hjernevægsvævet. Tykke vævssektioner (350 μm) af fast E15 tecta med tumorer kan immunfarves for at afsløre, at invaderende celler ofte migrerer langs blodkar, når de analyseres ved 3D-rekonstruktion af konfokale z-stack-billeder. Levende E15 midbrain og forhjerne skiver (250-350 μm) kan dyrkes på membranindsatser, hvor fluorescerende mærkede GBM-celler kan indføres i ikke-tilfældige steder for at give ex vivo co-kulturer til at analysere celleinvasion, som også kan forekomme langs blodkar, over en periode på ca. 1 uge. Disse ex vivo co-kulturer kan overvåges ved widefield eller konfokal fluorescens time-lapse mikroskopi for at observere levende celleadfærd.

Co-dyrkede skiver kan derefter fikseres, immunfarves og analyseres ved konfokal mikroskopi for at bestemme, om invasionen forekom langs blodkar eller axoner. Derudover kan co-kultursystemet bruges til at undersøge potentielle celle-celle-interaktioner ved at placere aggregater af forskellige celletyper og farver på forskellige præcise steder og observere cellebevægelser. Lægemiddelbehandlinger kan udføres på ex vivo-kulturer , mens disse behandlinger ikke er kompatible med in ovo-systemet . Disse to komplementære tilgange giver mulighed for detaljerede og præcise analyser af human GBM-celleadfærd og tumordannelse i et meget manipulerbart hvirveldyrhjernemiljø.

Introduction

In vitro-undersøgelser af kræftcelleadfærd bruges ofte til at dissekere potentielle mekanismer, der fungerer under den mere komplekse adfærd, der observeres under tumordannelse og celleinvasion i in vivo-xenograftmodeller. For eksempel med glioblastom (GBM) har in vitro-undersøgelser afdækket mekanismer for, hvordan L1CAM potentielt fungerer under tumordannelse og hjerneinvasion i en ny chick embryo xenograft hjernetumormodel 1,2,3,4,5. Selv om in vitro- og in vivo-forsøg supplerer hinanden på nyttige måder, efterlader de et betydeligt hul i, hvordan resultaterne kan korreleres. For eksempel er mekanistiske analyser af GBM-cellemotilitet på en skål en meget kunstig situation, og in vivo-xenograftmodeller kan kun afsløre statiske tids- eller endepunktsanalyser af tumordannelse og celleadfærd. In vivo-undersøgelser, der bruger enten gnavere eller kyllingembryoner, egner sig ikke let til at overvåge celleadfærd, mens cellerne invaderer hjernevæv i disse xenograftmodeller. Ikke desto mindre har chick embryo xenograft-modellen vist, at adhæsionsproteinet L1CAM spiller en stimulerende rolle i den invasive evne hos humane T98G GBM-celler 2,5.

En passende løsning på dette problem kan opnås ved at bygge bro mellem både in vivo- og in vitro-metoder ved hjælp af en organotypisk hjerneskivekulturmodel, kaldet en ex vivo-model . I denne ex vivo-model kan levende hjernevæv opretholdes i en tykkelse på flere hundrede mikron i op til et par uger, hvilket gør det muligt at implantere kræftceller, observere deres adfærd i faktisk væv over tid og derefter udføre en mere detaljeret markøranalyse ved eksperimentets slutpunkt.

En populær organotypisk skivekulturmetode har været at dyrke en flere hundrede mikron tyk hjerneskive oven på en gennemskinnelig eller gennemsigtig porøs membran, hvilket efterlader vævet udsat for luft, men alligevel tillader næringsmedier at opretholde vævet under membranen (se Stoppini et al.6). Forskellige variationer af denne metode er blevet anvendt til forskellige undersøgelser, herunder anvendelse af forskellige medier eller forskellige membranindsatser. Forskellige membranindsatser inkluderer en 30 mm diameter, porøs (0,4 μm) membranindsats i en 35 mm kulturskål 6 og cellekulturindsatser (0,4 μm) til 6-brøndsplader7. Forskellige medier inkluderer 50% MEM / HEPES + 25% varmeinaktiveret hesteserum + 25% Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS)8, 50% reducerede serummedier + 25% hesteserum + 25% HBSS9 samt andre. Hvis der anvendes en gennemskinnelig eller gennemsigtig membran sammen med fluorescerende mærkede GBM-celler, kan sådanne kulturer afbildes nedenfra ved hjælp af et inverteret vidvinkel- eller konfokalfluorescensmikroskop 10,11,12,13,14,15.

Mens mange in vivo ortotopiske hjernetumor xenograft og ex vivo organotypiske hjerneskivekulturmodeller er blevet etableret ved hjælp af gnavere, som nævnt ovenfor, er kyllingembryoet (Gallus gallus) blevet underudnyttet til disse formål. Imidlertid har kyllingembryoet vist sig at være i stand til at blive brugt som en in vivo ortopisk xenograftmodel til undersøgelse af både human og rottegliom invasion 1,2,5. Xenograferede celler i kyllingembryohjerner har udvist invasionsmønstre svarende til dem, der observeres i gnavermodeller, hvilket yderligere understøtter brugen af kyllingembryoner som en in vivo-model til GBM-tumorcelleanalyse. Kyllingembryoner er også billige, kan lettere vedligeholdes end gnavere (dvs. i deres æggeskaller i en laboratorieinkubator) og er meget lettere at arbejde med, hvilket gør dem til en attraktiv mulighed for kortvarige in vivo GBM-undersøgelser. En nylig artikel har beskrevet brugen af chick embryo hjerneskivekulturer til dannelse og vækst af axoner under normal hjerneudvikling, hvor skiverne var levedygtige i mindst 7 dage16. Imidlertid mangler brugen af sådanne chick embryo brain slice-kulturer til ex vivo-analyse af GBM-celleadfærd i et vævsmiljø. I denne artikel beskrives både transplantation af humane GBM-celler og GBM-stamceller (GSC'er) i den tidlige kyllingeembryohjerne in vivo samt introduktion af GBM-celler på levende chick embryo hjerneskivekulturer ex vivo. Nogle repræsentative eksempler på de resulterende tumorer og celleinvasionsmønstre opnået fra disse præparater er også tilvejebragt.

Protocol

Ingen godkendelse eller godkendelse var nødvendig ved University of Delaware for at udføre dette arbejde.

1. GBM-celleinjektion i chick optisk tectum

  1. Klargøring af GSC'er og GBM-celler til injektion
    1. Kulturelle globale forsyningskæder i GSR's medier (tabel 1). Kultur etablerede GBM-cellelinjer i GBM-medier (tabel 1).
    2. Skyl cellerne på plader med sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) og læg 1 ml trypsinopløsning i en 10 cm skål. Lad det stå i en cellekulturinkubator i 2-3 minutter, indtil cellerne begynder at løsne sig.
    3. Inaktiver trypsinet ved at tilsætte 10 ml passende serumholdigt kulturmedie i 10 cm skålen og løsn cellerne ved pipettering op og ned. Cellesuspensionen anbringes i et 15 ml konisk centrifugeglas.
    4. Pellet cellerne centrifugeres ved 800 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Mediet suges ud af cellepillen ved hjælp af en finglasengangspipette, der er fastgjort til en sidearmskolbe og vakuumpumpe. Resuspender cellerne i passende vækstmedier til en koncentration på 10.000 celler pr. mikroliter og læg dem i et mikrofugerør eller et lille skruerør på is.
    6. Bland cellerne med en lille mængde sterilt 1% Fast Green FCF-farvestof (brug et forhold på 5 μL farvestof / 100 μL cellesuspension).
  2. Injektion af GBM-celler i E5 optisk tectum i ovo. Se supplerende figur 1.
    1. De befrugtede kyllingæg inkuberes i en befugtet æginkubator med den spidse ende nedad ved 37,5 °C ( 1. inkubationsdag er embryonal dag 0 [E0]). På den 6. inkubationsdag (E5) steriliseres æggeskallen ved sprøjtning med 70% ethanol.
    2. Brug en æglyser til at spore langs omkredsen af luftrummet over embryoet med en blyant og dække det skitserede område med gennemsigtigt tape.
    3. Brug buet saks til forsigtigt at skære rundt om det sporede område, pas på ikke at skære ind i embryonale membraner eller blodkar og kassér toppen af æggeskallen.
    4. Placer et par dråber saltvand eller cellekulturmedier på luftrumsmembranen for at våde den, så den let løsner sig. Brug fine tang til forsigtigt at gennembore luftrumsmembranen over toppen af embryoet, fjerne det og lokalisere kyllingembryoets hoved.
    5. Brug fine tang til at gribe fat i den gennemsigtige amnionmembran, der straks omgiver embryoet for at placere hovedet, så det optiske tektum kan injiceres med celler. Brug med den ene hånd de fine pincet til at holde fast i amnion for at holde hovedet på plads under injektionsprocessen. Pas på ikke at beskadige de ekstraembryonale blodkar i chorioallantoic membranen på æggeblommen.
      BEMÆRK: Ovenstående procedure kræver en vis øvelse for effektivt at kunne gribe fat i den klare amnionmembran, der intimt omgiver embryoet, da det er usynligt, indtil det gribes og trækkes. Øv dig i at bruge fine tang til at få fat i den klare amnion, der umiddelbart omgiver embryoet.
    6. Hold hovedet stabilt ved at gribe amnionmembranen med fine pincet. Ved hjælp af en glasmikropipette og en pneumatisk picopumpe injiceres ca. 50.000 celler i 5 μL egnede cellekulturmedier i det optiske tektum (5 μL er ca. 1/2 af en fyldt mikropipette).
      BEMÆRK: Se Cretu et al.1 for et billede af et E5-embryo, der er blevet injiceret med GBM-celler blandet med farvestof.
    7. Placer et par dråber 50 mg / ml ampicillin oven på embryoet.
    8. Dæk hullet i toppen af æggene med klar tape og lad det stå i luftfugter indtil E15 til dissektion.

2. Dissektion af hjerneområder fra E15-embryoner

BEMÆRK: Dissektionen af E15-hjerner her til fiksering svarer til den, der er beskrevet i trin 8.2 for levende hjerneskiver, men dissektionen her behøver ikke udføres under aseptiske forhold.

  1. Skær båndet væk omkring toppen af skallen, så der er adgang til embryoet.
  2. Halshug embryoet ved halsen og læg hovedet i en 10 cm skål med steril calcium- og magnesiumfri tyrodes (CMF Tyrodes) opløsning. Se supplerende figur 2.
  3. Brug fine tang til at fjerne huden, der dækker hjernen for at afsløre den underliggende dura mater. Fjern de dannende kranieknogler på venstre og højre side af hjernen. De dannende kranieknogler dækker endnu ikke størstedelen af hjernen.
  4. Brug forsigtigt fine spidse tang til at rive gennem hjernehinderne, der ligger over midten af hjernen, og skræl den til hver side for at afdække hjernen.
  5. Brug buede tang til at øse hjernen nedenfra og træk den forsigtigt ud af hulrummet.
  6. Disseker hjernen i dens dele: forhjerne, tecta, cerebellum.
  7. Fjern den overliggende pia mater fra tectaen ved hjælp af fine pincet. Bemærk, at pia adskiller sig let fra tectaen, men ikke fra forhjernen eller lillehjernen. Fjern pia fra forhjernen ved at røre ved den eller rulle den på et lille stykke filterpapir.
  8. Placer de dissekerede hjerneområder i en lille skål.
  9. Placer hjerneområderne til fiksering i en 24-brønds pladebrønd og fiksér i 2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M natriumcacodylatbuffer. Lad stå i mindst 24 timer ved 4 °C.
  10. Efter fiksering skylles vævet i 3x PBS over mindst 1 time før indlejring i agar.

3. Indlejring og udskæring af høstede hjerneområder

  1. Forvarm en opløsning af 3,5% agar og 8% saccharose i PBS, indtil den er smeltet, og opbevar den ved smeltetemperatur.
  2. Brug buede tang som en scoop, tag forsigtigt enten det optiske tectum eller forhjerneområdet i kyllingembryohjernen op, og blød lidt på filterpapir for at fjerne ekstra væske for at sikre vedhæftning af agar til den ydre hjerneoverflade.
  3. Brug en steril overførselspipette til at fylde formen med agaropløsning.
    BEMÆRK: En simpel form kan fremstilles ved at danne aluminiumsfolie omkring en genstand af passende størrelse, såsom små rektangulære metalvibrerende vævsskiverblokke.
  4. Placer hjerneområdet i agar, og lad agar helt størkne.
  5. Fjern aluminiumsfolien fra omkring den indlejrede hjerne og trim overskydende agar rundt om siderne ved hjælp af et barberblad eller skalpel.
  6. Læg en dråbe cyanoacrylatlim på skivebakkens firkant i rustfrit stål, læg agaroseblokken med hjernen på limen, og lad limen binde i 1 min. Anbring bakken i den vibrerende vævsskærerpatron, stram og fyld bakken med nok PBS til at dække toppen af agarblokken.
  7. Skær hjerneskiverne på en vibrerende vævsskiver med en tykkelse på 350 μm ved hjælp af et barberblad af stål.
  8. Når hjerneskiver skæres og flyder frit ind i udskæringsbakken, skal du bruge en spatel til at øse op og fjerne skiverne fra bakken. Skub forsigtigt sektionen af spatlen og ind i en mærket 10 cm petriskål med PBS, så sektionerne flyder frit.
    BEMÆRK: Agaren, der omgiver hjerneskiven, kan løsne sig, hvis hjernen ikke er tilstrækkeligt blottet med filterpapir til at fjerne overskydende væske inden indlejring. Hvis dette sker, kan hjernevævet forsigtigt fjernes fra den størknede agar og genindlejres efter korrekt blotting af overskydende væske.

4. Immunfarvning af hjerneskiver med tumorceller

  1. Brug et stereomikroskop udstyret med epifluorescens til at screene individuelle skiver i 10 cm skålen en efter en for tilstedeværelse eller fravær af tumorceller.
  2. Forbered en tilstrækkelig mængde fosfatbufret saltvand med 0,1% Triton X-100 og 5% normalt gedeserum (PBSTG) (se tabel 1) til immunfarvning og skyl skiverne, der skal immunfarves.
  3. Halvfyld brønde i en 24-brønds plade, der vil blive brugt til farvning af hjernesektioner med PBS.
  4. Trim hjørnerne af agar omkring hjerneskiverne med kanten af en spatel eller en skalpel, og læg dem forsigtigt i brøndene, der indeholder PBS.
  5. PBS suges til og erstattes med 350 μL primær antistoffarvningsopløsning i PBSTG (f.eks. 2 μg/ml UJ127 i PBSTG).
  6. Der inkuberes i 24 timer i et koldt rum med let omrøring, så skiven ses at bevæge sig frit i brønden.
  7. Efter 24 timer fjernes den primære antistofopløsning og skylles 3 x 1 time med PBSTG i et koldt rum med omrøring.
  8. Når skylningen er færdig, inkuberes sekundær antistoffarvningsopløsning i PBSTG i 350 μL/hul (f.eks. 1/200 fortynding af biotin-GAM i PBSTG). Inkuber i 20 timer i et koldt rum med omrøring.
    BEMÆRK: Hvis du giver afkald på det tertiære trin og inkuberer med det fluorkromholdige sekundære antistof på dette trin, skal du dække for at beskytte mod lys under inkubation nu og derefter springe til trin 4.11.
  9. Fjern den sekundære antistofopløsning og skyl 3 x 1 time i PBSTG i et koldt rum med omrøring.
  10. PBSTG fjernes og inkuberes i den tertiære opløsning (f.eks. 1:250 fortynding af Alexa Fluor 647 streptavidin i PBSTG). Hvis det ønskes, pletter kernerne på dette trin ved at tilsætte 0,1 μg/ml bisbenzimid til blandingen. Inkuber i 20 timer i et koldt rum med omrøring.
  11. Fjern den tertiære opløsning og skyl 3 x 1 time i PBSTG i et koldt rum med omrøring.
  12. Lad det stå i PBS, indtil det er klar til montering på mikroskopglas.

5. Montering af skiver på mikroskopglas

  1. Forbered så mange mikroskopdias, som der er sektioner, der skal monteres.
  2. For hvert dias placeres en 50 mm lang strimmel på 10 mil (254 μm) tyk vinyl elektrisk tape på et stykke parafilm.
  3. Brug en 1 cm x 1 cm firkantet hulstans til at slå et hul gennem midten af det elektriske bånd og parafilmen.
  4. Træk båndet af parafilmen, og læg det oven på mikroskopdiaset, så der er plads til mærkningstape på diaset.
  5. Brug en mikropipette til at placere en eller to dråber anti-fade monteringsmedier i det firkantede hul i midten af det elektriske bånd.
  6. Brug en buet spatel til at løfte den ønskede vibrerende vævsskærersektion fra PBSTG og transporter fugt grundigt væk med en ren laboratorieserviet eller et stykke filterpapir.
  7. Berør kanten af skiven til dråben af monteringsmidlet, og brug en anden spatel til forsigtigt at skubbe sektionen ind i monteringsmediet.
  8. Dæk sektionen med et par dråber monteringsmiddel mere, og placer forsigtigt en 24 mm x 30 mm (#1,5 tykkelse) dæksel oven på sektionen og monteringsmidlet.
  9. Forsegl kanterne på dækselen med neglelak for at holde den på plads.

6. Konfokal mikroskopi af faste hjerneskiver

  1. Brug widefield fluorescens til at finde fluorescerende tumorer i den monterede hjerneskive ved hjælp af den passende objektivlinse og filtersæt (er).
    BEMÆRK: Nogle tumorer kan være ret store og er let synlige med 4x målet, mens enkeltceller kan kræve 10x målet.
  2. Skift til konfokal mikroskopi ved hjælp af en passende objektivlinse, laser(e), pinhole størrelse og detektorindstillinger. For at følge denne protokol skal du bruge et 20x mål (numerisk blænde [NA] = 0,75) til rutinemæssig billeddannelse og et 60x oliemål (NA = 1,40) til billeddannelse i høj opløsning.
  3. Indstil øvre og nedre grænser for z-aksen og trinstørrelsen (for den specifikke situation i henhold til konfokale mikroskopproducentens instruktioner) til erhvervelse af optiske sektioner. Anskaf en z-stak af optiske sektioner.
  4. Brug den konfokale mikroskopsoftware til at oprette en 3D-volumengengivelse af tumoren i henhold til producentens anvisninger.

7. Sfærisk forberedelse

  1. Oprettelse af poly (2-hydroxyethylmethacrylat) (poly-HEMA) plader
    1. Der fremstilles en opløsning af 10 μg/ml poly-HEMA i 95% ethanol, og 35 mm petriskåle (eller cellekulturskåle) belægges med 1 ml af denne opløsning.
    2. Lad opvasken sidde på en vippe, der afdækkes natten over ved stuetemperatur for at udvikle en belægning af skålens overflade.
      BEMÆRK: Opløsningsmidlet vil fordampe og efterlade en gennemskinnelig belægning på skålen, som kan forekomme ujævn, men dette påvirker ikke evnen til at fremstille cellesfæroider.
    3. Efter tørring steriliseres de åbne retter under UV-lys i et biosikkerhedsskab i 1 time. Udskift lågene efter sterilisering. De overtrukne fade er nu klar til brug.
  2. Fluorescerende DiD-farvning til time-lapse-mikroskopi
    BEMÆRK: Dette afsnit er til farvning af enkeltceller med DiD-fluorescerende farvestof, der skal bruges til fremstilling af sfæroider, hvilket optimerer visualisering af cellemotilitet til live time-lapse-billeddannelse.
    1. Suspender cellerne i et serumfrit dyrkningsmedium.
    2. Der tilsættes 5 μL DiD-stamme/ml cellesuspension, og blandingen blandes forsigtigt ved pipettering. Der inkuberes i 20 minutter ved 37 °C.
    3. Den mærkede cellesuspension centrifugeres ved 800 × g ved 5 °C i 5 minutter.
    4. Opsug supernatanten og genopslæm cellerne i varme medier for at skylle.
    5. Gentag denne centrifugering og skyl trin to gange mere.
      BEMÆRK: Hvis det ønskes, skal du springe til trin 7.3.6 for at fremstille sfæroider umiddelbart efter denne proces.
  3. Gør celle sfæroider
    1. 0,25% trypsin/ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opvarmes til 37 °C.
    2. Dyrkning af globale forsyningskæder i GSR-medier17 (tabel 1) og U-118 maligne gloimaceller (MG) i U-118-dyrkningsmedium (se tabel 1). Brug en sammenflydende 10 cm skål til fremstilling af en 35 mm plade sfæroider. Tilføj bFGF (10 ng/ml endelig koncentration) og TGF-α (20 ng/ml endelig koncentration) vækstfaktorer til GSC'er først og derefter hver 3. dag.
      BEMÆRK: De celler, der blev brugt i den aktuelle undersøgelse, var grøn GSC15-2/K72, grøn GSC16-4/K72, rød U-118/L1LE/mCherry2x og rød U-118/1879/mCherry2x. En plade af sfæroider skal være tilstrækkelig til to 6-brønds plader af hjerneskiver på membranindsatser.
    3. Skyl cellerne på pladerne med steril PBS og læg 1 ml trypsinopløsning på en 10 cm skål. Anbring i cellekulturinkubatoren i 2-3 minutter, indtil cellerne begynder at løsne sig.
    4. Inaktiver trypsinet ved at tilsætte 10 ml passende serumholdigt kulturmedie i 10 cm skålen og løsn cellerne ved pipettering op og ned. Cellesuspensionen anbringes i et 15 ml konisk centrifugeglas.
    5. Pellets cellerne ved centrifugering ved 800 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    6. Opsug mediet fra cellepillen og resuspender cellerne i 10 ml medier.
    7. Der anbringes 2 ml cellesuspension på hver 35 mm poly-HEMA-belagt skål, og der tilsættes yderligere 2 ml passende medier for at opnå 4 ml medier i alt pr. skål. Hvis du bruger globale forsyningskæder, skal du tilføje vækstfaktorer.
    8. Inkuber cellerne i en celleinkubator, indtil aggregaterne når en størrelse på 100-200 μm, hvilket kan være 1-2 dage afhængigt af densiteten af de celler, der blev belagt.

8. Levende chick embryo hjernedissektion og vibrerende vævsskiver

  1. Forberedelse til dissektion
    1. Forbered en 6-brønds polyestermembranindsatsplade med 1 ml hjerneskivekulturmedie (se tabel 1) under membranindsatsen.
    2. Steriliser arbejdsområdet og værktøjerne med 70% ethanol.
    3. Placer den 6-brønds indsatsplade på is, mens dissektionen finder sted.
    4. Forbered 100 ml vibrerende vævsskiver (tabel 1) og læg det på is.
    5. Anbring et hætteglas med 4% lavsmelteagarose i PBS i et vandbad, indtil det smelter til en væske (ca. 50 °C).
    6. Fyld det vibrerende vævsskiverkar med is.
  2. Aseptisk E14/15 hjernedissektion for kyllingembryoner
    1. Brug en æglyser til at spore langs omkredsen af luftlommen over E14- eller E15-embryoet med en blyant og dække det skitserede område med gennemsigtigt tape.
    2. Brug buet eller fin saks til forsigtigt at skære rundt om det sporede område, pas på ikke at skære ind i embryomembranen eller blodkarrene, og kassér det øverste stykke skal.
    3. Brug buede tang til at fjerne luftrumsmembranen over toppen af embryoet og lokalisere kyllingembryoets hoved.
    4. Halshug embryoet og læg hovedet i en 10 cm skål med kold steril CMF-opløsning. Se supplerende figur 2.
    5. Brug sterile fine tang til at fjerne huden, der dækker hjernen, for at afsløre den underliggende dura mater. Fjern de dannende kranieknogler på venstre og højre side af hjernen. De dannende kranieknogler dækker endnu ikke størstedelen af hjernen.
    6. Brug forsigtigt fine spidse tang (# 5 eller # 55) til at rive gennem meninges, der ligger over midten af hjernen, og skræl den til hver side for at afdække hjernen.
    7. Brug fint buede tang til at øse hjernen op fra bunden foran og træk den forsigtigt ud af hulrummet.
    8. Disseker hjernen i dens tre hoveddele: forhjerne, midterhjerne (optisk tecta), cerebellum. Se et atlas over kyllingudvikling, hvis det er nødvendigt.
    9. Fjern den overliggende pia mater fra tectaen ved hjælp af fine pincet.
      BEMÆRK: Pia adskiller sig let fra tectaen, men ikke fra forhjernen eller lillehjernen. Pia kan fjernes fra forhjernen ved at røre ved den eller rulle den på sterilt gaze.
    10. Placer de dissekerede hjerneområder i en lille steril skål på is.
  3. Indlejring og skæring af hjernen
    1. Brug buede tang som en scoop, tag forsigtigt enten det optiske tectum eller forhjerneområdet op og blød lidt på sterilt gaze for at fjerne ekstra væske for at sikre vedhæftning af agarose til den ydre hjerneoverflade.
    2. Brug en steril overførselspipette til at fylde formen med lavsmeltet agarose. Forbered en simpel form ved at danne aluminiumsfolie omkring en genstand af passende størrelse. Den lille rektangulære metalvibrerende vævsskærerblok bruges rutinemæssigt som objekt. Se supplerende figur 3.
    3. Placer hurtigt hjerneområdet i agarose og lad det størkne (ca. 4-5 min) på is.
      BEMÆRK: Hjernen kan synke til bunden af formen, før agarose hærder. Hvis dette sker, skal du vente 1 minut for at lade agaren begynde at sætte sig, og placer derefter hjerneområdet i agarose. Prøv at suspendere hjerneområdet direkte midt i agarose.
    4. Fjern aluminiumsfolien fra omkring den indlejrede hjerne i den størknede agarose, og trim overskydende agarose rundt om siderne ved hjælp af et sterilt barberblad eller skalpel.
    5. Læg en dråbe cyanoacrylatlim på skiveskålens/bakkens firkant i rustfrit stål, placer agaroseblokken med hjernen, og lad limen binde i 1 min. Anbring fadet / bakken i den vibrerende vævsskiver, stram og fyld bakken med skæremedier for at dække toppen af agaroseblokken.
    6. Skær sektionerne på en vibrerende vævsskærer ved 250-350 μm ved hjælp af en safirkniv, som er rapporteret at resultere i mindre levende vævsskade end et barberblad af stål.
    7. Når hjerneskiver skæres og flyder frit i udskæringsbakken, skal du bruge en steril spatel til at øse op og fjerne skiven fra bakken. Skub forsigtigt sektionen ud af spatlen og på en membranindsats ved hjælp af en anden steril spatel.
      BEMÆRK: Normalt kan to eller tre hjerneskiver placeres på hver membranindsats, hvis det ønskes. Agarose, der omgiver hjerneskiven, kan løsne sig, hvis hjernen ikke er tilstrækkeligt blottet med sterilt gaze til at fjerne overskydende væske. Hvis dette stadig sker efter tilstrækkelig blotting før indlejring, skal du forsigtigt tage skiven uden den omgivende agarose op og skubbe den på membranindsatsen.
    8. Hjerneskiverne med 6 huller anbringes på membranindsatser i cellekulturkuvøsen ved 37 °C og 5 % CO2.
    9. Dagen efter plettering skal du bruge en steril Pasteur-pipette til at aspirere mediet under skæret (der er huller i siderne af indsatserne, så en pipette kan få adgang til mediet nedenfor). Tilsæt 1 ml frisk skivemedie til hvert hul under membranindsatsen. Fortsæt med at skifte medie hver anden dag derefter.
    10. Vent et par dage på, at hjerneskiverne fastgøres fast til membranindsatserne og ser ud til at flade noget ud. Dette er et tegn på, at skiverne er levedygtige og klar til introduktion af GBM-celler.

9. GBM-celleintroduktion på hjerneskiver

  1. Spheroid metode
    1. Når cellesfæroiderne har nået 150-200 μm i størrelse, skal du bruge en 20 μL mikropipette indstillet til 5 μL for at fjerne en til flere sfæroider fra deres kulturskål. Se supplerende figur 3.
    2. Udvis forsigtigt mediet med sfæroider på den ønskede hjerneskive.
      BEMÆRK: Cellesfæroiderne skal være synlige i pipettespidsen. Brug af en klar pipettespids gør dem lettere at se i spidsen. Hvis sfæroiden falder af hjerneskiven, når væsken frigives, skal en ethanolsteriliseret øjenvipper limet på en tynd træapplikatorpind bruges til forsigtigt at skubbe sfæroiden tilbage på hjerneskiven.
    3. Lad sfæroiderne dyrke på hjerneskiverne i 2-5 dage.
      BEMÆRK: Begrænsningen her synes at være den eventuelle nedbrydning af blodkar og hjerneceller i skiven. Nedbrudte blodkar vises som diskontinuerlige kugler i skiven, når de farves for laminin.
  2. Biopsi punch metode
    1. Lad hjerneskiverne sætte sig fast ved at se ud til at flade ud på membranindsatsen (kan tage 2-5 dage i kultur).
    2. Optø cellematrixen på is.
    3. I cellekulturens biosikkerhedsskab skal du tilslutte en steril biopsitang med en diameter på 1 mm til et vakuumaspiratorrør.
    4. Rør forsigtigt ved hjerneskiven med biopsistansen for at skabe et hul på 1 mm i midten af hjerneskiven.
      BEMÆRK: Vævet i biopsistansen vil blive opsuget ind i stansen af vakuumet.
    5. Forbered en cellematrixsuspension ved at trypsinisere en 60% -70% sammenflydende 10 cm skål med celler og resuspendere i 10 ml medier; Derefter blandes 1 ml af suspensionen med 100 μL matrix.
    6. Brug en 20 μL mikropipette til at placere 1 μL af cellematrixblandingen i hvert hul i hjerneskiverne.
    7. Når celleblandingsplaceringen er færdig, skal du placere skålen med hjerneskiver med indlejrede celler tilbage i inkubatoren og lade matrixen størkne og cellerne potentielt invadere den omgivende hjerneskive.

10. Widefield fluorescens time-lapse mikroskopi

  1. Placer aftageligt tape rundt om kanten af 6-brøndpladen for at forhindre fordampning af mediet, hvilket efterlader et lille hul på den ene side til gasudveksling.
  2. Placer pladerne i et tilpasset kulturkammer på et justerbart automatiseret trin på et omvendt epifluorescensmikroskop.
    BEMÆRK: Kammeret blev holdt ved atmosfæriske forhold på 5% CO2 og 95% luft ved hjælp af en gasindsprøjtningsregulator, og temperaturen blev holdt på 37 ° C med en varmlufttemperaturregulator og en temperaturstyret trinindsats. Se Fotos et al.18 for detaljer om det anvendte system her.
  3. Brug passende mikroskopstyringssoftware til at oprette en tidsplan for erhvervelse af timelapse, der indsamler fluorescerende billeder af interesseområderne en gang hvert 10. minut i 20 timer.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes en grøn fluorescerende etiket i celler (f.eks. Grønt fluorescerende protein [GFP]), skal du bruge den mindste mængde blåt excitationslys, der kræves for at visualisere cellerne for at forhindre fototoksicitet. Røde (f.eks. mCherry) og langt røde (f.eks. DiD) etiketter synes ikke at have dette potentielle problem på grund af længere bølgelængde excitation.

11. Immunfarvning af hjerneskiver efter time-lapse-mikroskopi

BEMÆRK: Denne immunfarvningsprotokol er optimeret til farvning af blodkar med laminin og kerner med bisbenzimid. Brug passende antistoffer til det eller de ønskede molekyler af interesse.

  1. Opsug mediet nedefra membranindsatsen ved hjælp af en Pasteur-pipette, og anbring 1 ml 2 % PFA i 0,1 M natriumcacodylatbuffer under skæret og 1 ml oven på indsatsen for at dække hjerneskiven. Lad skiverne fiksere natten over ved 4 °C.
  2. Fjern fikseringsmidlet nedefra membranindsatsen og eventuelt fikseringsmiddel, der er tilbage på hjerneskiven (fikseringsmiddel har tendens til at lække gennem membranindsatsen i brønden nedenfor).
  3. Fjern indsatsen med skiver fra 35 mm brønden og læg dem i en større plastskål.
  4. Forbered en plade med 24 brønde ved at tilsætte 350 μL PBS i så mange huller, som der er hjerneskiver (en skive / brønd ved immunfarvning).
    1. Brug en tynd spatel til forsigtigt at fjerne agarosen fra omkring hjerneskiven uden at løsne hjerneskiven fra membranindsatsen. Sørg for, at agarose let løsner sig fra yderkanten af hjerneskiven. Hvis ikke, lad agarose være fastgjort til hjerneskiven.
    2. Brug en skarp skalpel til at skære gennem membranen omkring hjerneskiven, indtil skiven med den underliggende membran er fri for resten af indsatsen. Tag membranen op med den vedhæftede hjerneskive ved hjælp af fine tang til at gribe membranen, og læg den i en brønd på 24-brøndpladen i PBS.
  5. Skyl skiverne 3x med PBS over 1 time i kølerummet med konstant blid omrøring eller rokke, så skiven bevæger sig i brønden.
  6. Under skylning skal du forberede den primære antistofopløsning.
    1. Antilaminin fortyndes til 2 μg/ml i PBSTG (se tabel 1).
  7. PBS fjernes fra hullerne og inkuberes natten over i primær antistofopløsning i et koldt rum med let omrøring.
  8. Efter mindst 20 timers inkubation aspireres den primære antistofopløsning og skylles sektionerne 3x i 1 time i PBSTG.
  9. Under skylning skal du forberede den sekundære antistofopløsning.
    1. Fortynd fluorescerende GAM med den specifikke fluorochrom, der er nødvendig til en 1:200 fortynding i PBSTG sammen med en 0,1 μg/ml koncentration af bisbenzimid.
    2. PBSTG fjernes og inkuberes natten over i et kølerum med omrøring i den fluorescerende sekundære antistofopløsning.
    3. Fjern det sekundære antistof og skyl 2x over 1 time i PBSTG og 1x over 1 time i PBS.
    4. Lad det stå i PBS, indtil det er klar til montering på mikroskopglas (afsnit 5) og visning.

Representative Results

Her præsenteres flere figurer for at vise nogle repræsentative resultater, der blev opnået ved at udføre in vivo-injektioner i det optiske tektum (figur 1 og figur 2), dyrke levende hjerneskiver og vurdere deres levedygtighed (figur 3), skabe ex vivo hjerneskivekulturer og implantere fluorescerende mærkede celler ved hjælp af biopsistansemetoden (figur 4), generere cellesfæroider ved at dyrke celler på poly-HEMA (figur 5), skabe ex vivo hjerneskive-cokulturer med cellesfæroider og registrere den invasive celleadfærd ved hjælp af 4D-konfokal time-lapse-mikroskopi (figur 6) og analysere invasiv celleadfærd fra sfæroider i forhold til blodkar i faste hjerneskivepræparater (figur 7 og figur 8). Disse resultater er på ingen måde udtømmende, men giver snarere gode eksempler på, hvad der kan opnås ved hjælp af kyllingembryohjernen som en xenograftmodel til human GBM-forskning.

Figur 1 viser nogle repræsentative resultater af tumorer, der dannes i det optiske tectum in vivo efter injektion af GSC'er, der udtrykker GFP. GSC'er fastgøres til ventrikulær overflade og danner invasive tumorer i hjernevæggen. GSC'er bor tydeligvis i nærheden af blodkar og ser ud til at migrere langs dem. Film med roterende 3D-volumengengivelser af faste og immunfarvede skiver af in vivo GSC-tumorer er angivet i supplerende video S1, supplerende video S2, supplerende video S3 og supplerende video S4. I dette eksperiment blev fire farver brugt til at identificere fem funktioner (grønne GSC'er, hvide kerner, hvide blodkar, blå integrin alfa-6 og enten rød Sox2 eller rød nestin).

Figur 2 viser nogle repræsentative resultater af tumorer, der dannes i det optiske tectum in vivo efter injektion af GSC'er, der udtrykker GFP blandet med U-118/L1LE-celler2 , der udtrykker mCherry på grund af retroviral vektortransduktion. Disse eksperimenter afslørede, at da disse tumorer blev dannet af en blandet cellesuspension, skete sortering således, at GSC'er boede enten i periferien eller midten, mens U-118-celler omfattede enten en indre kerne eller en ydre cortex, afhængigt af den specifikke GSC-linje.

Figur 3 viser levedygtighedsresultater af ex vivo hjerneskivekulturer. Efter 1 uge i kultur afslørede fiksering og immunfarvning for laminin mange intakte blodkar og ekspression af Sox2, som begge blev brugt her til at demonstrere levedygtigheden af hjerneskiven. Dette viste, at hjerneskiver fra kyllingembryoner kunne dyrkes på membranindsatser i ca. 2 uger og forblive levedygtige med normalt udseende blodkar og transkriptionsfaktorekspression.

Figur 4 viser resultaterne af at indføre "propper" af røde U-118 / L1LE / mCherry-celler (blandet med matrix) i ex vivo-hjerneskiver efter dannelse af hulrum i skiverne ved hjælp af biopsistansemetoden. U-118-celler invaderede tydeligt hjernevævet, nogle gange i vid udstrækning og ofte langs blodkarrene. Imidlertid var celleinvasionen ikke ensartet omkring omkredsen af de indførte celler. Blodkar syntes undertiden også beskadiget eller fraværende i visse skiver, formodentlig på grund af det ekstra traume af stansemetoden eller længden af tid i kultur. Dette viste, at biopsistans/cellestikmetoden kunne bruges til at introducere GBM-celler på bestemte steder i en dyrket ex vivo hjerneskive, hvorefter cellerne invaderer hjerneskiven.

Figur 5 viser levende sfæroider i kultur og flere eksempler på widefield fluorescens af levende GBM-cellesfæroider, der indføres på ex vivo hjerneskiver til time-lapse-eksperimenter. Film af celleinvasion fra sfæroider ind i hjerneskiven findes i supplerende video S5 og supplerende video S6 . Dette viste, at cellesfæroider er en anden vellykket metode til at introducere GBM-celler eller GSC'er på bestemte steder i en ex vivo hjerneskive, og invasiv celleadfærd kan overvåges ved widefield fluorescensmikroskopi, selvom opløsningen af individuelle celler kan være dårlig.

Figur 6 viser statiske billeder af konfokale time-lapse eksperimenter af levende GSC16-4 / GFP og U-118 / L1LE / mCherry celle invasion i hjerneskiver. Konfokale z-stack-billeder blev taget hvert 10. minut over en periode på 20 timer i et multipunkts timelapse-eksperiment. Film af celleinvasion fra sfæroider til hjerneskiver taget som konfokale z-stakke over tid præsenteres i supplerende video S7, supplerende video S8, supplerende video S9, supplerende video S10 og supplerende video S11. Dette eksperiment afslørede, at konfokal time-lapse-billeddannelse var bedre end widefield-fluorescens til sporing af individuel celleinvasiv adfærd. U-118/L1LE-cellerne var mærkbart mere invasive end GSC'erne under disse forhold. Dette er endda tydeligt på de statiske billeder, hvor GSC'erne er placeret mere centralt, og U-118-cellerne er mere spredt.

Figur 7 viser flere eksempler på ex vivo hjerneskive / sfæroidpræparater, hvor to forskellige separat mærkede sfæroider (U-118 / L1LE / mCherry sfæroider og GSC16-4 / GFP sfæroider) blev anbragt på hjerneskiver, dyrket i flere dage og derefter fikseret, immunfarvet for laminin og afbildet ved optisk sektionering på et konfokalmikroskop. Dette afslørede, at begge celletyper invaderede hjerneskiven og rejste langs blodkarrene. Når de forskellige typer sfæroider var tæt nok til at kontakte hinanden, syntes der at være lidt, hvis nogen, invasion af en celletype i sfæroiden af den anden celletype, og sfæroiderne forblev adskilt.

Figur 8 viser flere eksempler på ex vivo hjerneskive / sfæroidpræparater, hvor "blandede celletype" sfæroider genereret i kultur ved hjælp af to forskelligt mærkede celletyper (U-118 / L1LE / mCherry blandet med GSC16-4 / GFP) blev anbragt på hjerneskiver, dyrket i flere dage og derefter fikseret, immunfarvet til laminin og afbildet ved optisk sektionering på et konfokalmikroskop. Dette afslørede, at de røde U-118 / L1LE / mCherry-celler migrerede ud af sfæroiderne og spredte sig meget tydeligere end de grønne GSC16-4 / GFP-celler, som havde tendens til at forblive i klumper nær midten af sfæroiderne. Derudover blev U-118 / L1LE / mCherry-celler også farvet med DiD, så de to separate etiketter (mCherry og DiD) kunne sammenlignes direkte i de faste ex vivo-præparater . DiD-mærket kunne stadig detekteres, selv i enkeltceller, der havde invaderet hjerneskiven; Dette var dog som intracellulær PUNCTA.

Figure 1
Figur 1: Tumorer ved E15 som følge af injektion af GSC'er i E5 optisk tectum in vivo. GSC'er er grønne på grund af GFP-udtryk. GSC15-2-celler vises i panel A, C og E, og GSC16-4-celler vises i panel B, D og F. (A) Lav forstørrelse visning af optisk tectum med en tumor nær ventriklen (V). Sox2-farvning er vist i rødt, hvilket pletter de fleste kerner i OT-celler. (B) Lignende billede som A, men med GSC16-4-celler, der også er farvet til nestin i rødt, som kan vises gult eller hvidt på billedet på grund af farveblanding og billedeksponering. OT-kerner ser hvide ud på grund af modfarvning med bisbenzimid. (C-F) Forskellige perspektiver på volumengengivelser genereret fra z-stakke ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål. Cellekerner ser hvide ud på grund af bisbenzimidfarvning, og nogle vises røde i panelerne C og E på grund af immunfarvning for Sox2. Rød farvning i panelerne D og F er fra farvning til nestin. Bemærk, at på grund af "Alpha Blending" for volumengengivelser i konfokalmikroskopsoftwaren blandes farver ikke som de ville ved hjælp af en maksimal intensitetsprojektion, og den mest udbredte farve dominerer og skjuler den mindre intense farve. Blodkarrene er farvede hvide på grund af immunfarvning for laminin. GSC-markør integrin alfa-6-farvning vises med blåt og vises punkteret på GSR-overflader. Micron skalaer vises langs kanterne af volumengengivelserne. Videoer af rotationer af volumengengivelser i panelerne C-F præsenteres i Supplerende video S1, Supplerende video S2, Supplerende video S3 og Supplerende video S4. Skalastænger = 500 μm (A,B). Forkortelser: GSC'er = stamceller fra glioblastom; OT = optisk tektum; GFP = grønt fluorescerende protein; BV = blodkar. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Tumorer ved E15 som følge af en blanding af GSC'er og U-118 GBM-celler injiceret i E5 optisk tektum. GSC'er er grønne på grund af GFP-ekspression, og U-118/L1LE-celler er røde på grund af mCherry-udtryk. GSC15-2 vises i panelerne A-D, og GSC16-4 vises i panelerne E og F. (A) Lav forstørrelse konfokal enkelt z-plan af en blandet celletumor (pil) nær ventriklen. Kerner er modfarvet hvide med bisbenzimid. (B) Højere forstørrelse (10x objektiv) af tumor vist i A med invasion af røde U-118-celler i OT nær ventrikeloverfladen. (C) Et lidt andet plan af optisk sektion end det i A, der viser tumoren (pilen) indlejret dybere ind i OT-væggen. (D) Maksimal projektion (20x mål) af flere z-planer af tumoren i C, der viser detaljer om de sorterede celler i tumoren. (E) Enkelt z-plan billede (20x mål) af en blandet tumor med GSC16-4-celler, der viser, at sortering inden for tumoren forekom i et modsat mønster fra GSC15-2-celler, hvor de grønne GSC'er skabte en tynd og jævn cortex omkring de røde U-118-celler. Fastgørelsesområdet for tumoren til OT-væggen er ikke vist i dette z-plan. Bemærk det område af tumoren, hvor der er en diskontinuitet af GSC cortex med U-118 / L1LE celler, der buler igennem (pil). Immunfarvning for L1CAM er vist i blåt. (F) Samme billede som i E, men viser kun de grønne GSC'er og blå L1CAM-farvning. Skalastænger = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Forkortelser: GSC'er = stamceller fra glioblastom; OT = optisk tektum; GFP = grønt fluorescerende protein; V = ventrikel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Levedygtighed af ex vivo optiske tectum skiver efter 1 uge i kultur. E14 optiske tectumskiver blev dyrket på membranindsatser i 1 uge og derefter fikseret og immunfarvet. Vist i A og B er konfokale billeder (10x objektiv) af en hjerneskive farvet for kerner med bisbenzimid (A) og immunfarvet for laminin (B), som tydeligt viser normale, intakte blodkar optisk sektioneret i forskellige konfigurationer i kraft af lamininfarvningen. C) Et konfokalbillede svarende til det, der er vist i panelerne A og B, hvor både kerner og lamininfarvning er synlige. (D) Et konfokalbillede med højere forstørrelse (60x oliemål), der viser detaljer om nuklear og lamininfarvning. (E) Maksimalt projektionsbillede af konfokal z-stak (20x mål) af hjerneskive farvet for Sox2-transkriptionsfaktor i rød og samlede kerner med bisbenzimid i hvidt. Bemærk, at størstedelen af kernerne udviser Sox2-farvning, som vist in vivo (se figur 1). Skalastænger = 100 μm (A, B, C, E), 25 μm (D). Forkortelse: P = pial overflade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: U-118/mCherry-celler placeret i en ex vivo hjerneskive via biopsistansemetoden. Hulrum blev skabt i hjerneskiver ved hjælp af en 1 mm biopsistans, og derefter blev røde U-118 / L1LE / mCherry-celler blandet med matrix implanteret som en "prop". Efter flere dage blev hjerneskiverne fikseret, immunfarvet til laminin og monteret på dias til konfokal mikroskopanalyse. Panelerne A og C viser nærbilleder med lav forstørrelse, enkelt z-plan (4x objektiv) af den resulterende "tumor" og omgivende celler, der invaderede hjerneskiven. (B) En volumengengivelse af en z-stak fra præparatet i panel A ved en højere forstørrelse (20x mål), der viser omfattende invasion af U-118-celler (pil). (D) Billedet viser en lignende volumengengivelse af den nederste del af de omfattende invaderende celler, der er vist i panel C. Lamininfarvning er vist i grønt, men ingen klare blodkar er tydelige. (E) Billedet viser en del af en celleprop og gruppe af celler, der har invaderet hjerneskiven, sammen med lamininfarvning til blodkar i blåt. (F) En højere forstørrelse af de invaderende celler vist i panel E, og celler kan tydeligt ses justeret langs blodkar (pile). Alle paneler viser hvid nuklear modfarvning med bisbenzimid. Skalastænger = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). Skala for panel B og D er langs volumengengivelsesakserne. Forkortelse: OT = optisk tectum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Levende cellesfæroider i kultur og widefield fluorescensbilleder af levende GBM-celler i ex vivo hjerneskiver. Vist i panel A og B er fasekontrastbilleder (ved hjælp af et 10x mål på et omvendt mikroskop) af U-118/L1LE GBM-celler (A) og GSC'er (B), der vokser som sfæroider (pile). I baggrunden af panel A vises de usynlige ujævnheder i poly-HEMA-belægningen, der kan forekomme på cellekulturskålen. Vist i paneler C-F er widefield fluorescensbilleder af U-118 / L1LE cellesfæroider og invaderende celler (pile) under et time-lapse eksperiment for at overvåge den levende opførsel af invasion i ex vivo skiverne (ved hjælp af et 20x mål på et brugerdefineret time-lapse mikroskopsystem18). I panelerne C og E farves cellerne med det langt røde fluorescerende membranfarvestof DiD, og i panelerne D og F afbildes cellerne via deres røde mCherry-udtryk. Skalastænger = 100 μm. Videoer af widefield fluorescens time-lapse eksperimenter vist i panel C og D findes i henholdsvis Supplementary Video S5 og Supplementary Video S6. Forkortelser: GBM = glioblastom; GSC'er = GBM stamceller; S = sfærisk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Volumengengivelse af billeder af konfokal 4D-time-lapse af levende GSC'er og GBM-celler. Vist i alle paneler er slutpunktsbillederne af fem forskellige blandede celle sfæroidindkapslinger på separate hjerneskiver. For panelerne A-E blev konfokale z-stack-billeder taget med 10 μm trin hvert 10. minut over en periode på 20 timer. Forberedelserne omfattede hjerneskiver med implanterede blandede cellesfæroider af røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale billeder blev taget, mens hjerneskiver blev dyrket på membranindsatser i en 6-brønds plastcellekulturskål ved hjælp af en ekstra lang arbejdsafstand (ELWD) 20x objektivlinse (0,45 NA), som gav den nødvendige ekstra arbejdsafstand. Volumengengivelser blev genereret ved hjælp af konfokalmikroskopsoftware "Alpha Blending", hvilket giver en tilsyneladende 3D-effekt. Time-lapse-videoer af disse konfokale volumengengivelser over tid præsenteres i Supplementary Video S7, Supplementary Video S8, Supplementary Video S9, Supplementary Video S10 og Supplementary Video S11. Forkortelser: GBM = glioblastom; GSC'er = GBM stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein; NA = numerisk blænde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Konfokale billeder af faste hjerneskiver med invasive GBM-celler fra sfæroider af forskellige celletyper. Grønne sfæroider var sammensat af GSC16-4 / GFP-celler og røde sfæroider var sammensat af U-118 / L1LE / mCherry-celler. Vist i paneler A-F er forskellige syn på hjerneskiver, hvor flere røde og grønne sfæroider blev dyrket i flere dage før fiksering og immunfarvning for laminin (blå). Panelerne A-C er af samme OT-skive, hvor A blev taget med et 4x mål, og panelerne B og C er gengivelser med højere forstørrelsesvolumen (20x objektiv) af celler, der invaderede hjerneskiven fra to af de sfæroider, der er vist i panel A. Begge celletyper invaderede klart væv langs blodkarrene. Panel D viser en volumengengivelse (20x mål) af en anden hjerneskive, hvor to forskellige sfæroider var placeret tæt på hinanden, og celler fra begge ses migrere langs det samme blodkar, der er placeret mellem dem (pil). Panel E er en højforstørrelse (60x olie objektiv) volumen render afslører, at de grønne celler migrerer langs ydersiden af blodkarret, mens de røde blodlegemer migrerer inde i blodkarret (pil). Indsatsen viser en enkelt z-plan optisk sektion, hvor den røde celle er tydeligt omgivet af blå farvning af blodkarret (pil), og den grønne celle er tydeligt uden for blodkarret. Skalabjælke i indsats = 50 μm. Panel F viser en volumengengivelse (10x objektiv) af en forhjerneskive med to tæt apponerede forskelligt farvede sfæroider. Meget lidt, hvis nogen, celleinvasion forekom fra den ene sfæroid til den anden, og der eksisterede en skarp grænse mellem dem. Panelerne A, B, C og E viser også hvid nuklear modfarvning med bisbenzimid. Skalabjælke = 500 μm (A). Skalaer til paneler B-F er langs volumengengivelsesakserne. Forkortelser: GBM = glioblastom; GSC'er = GBM stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein; OT = optisk tektum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Konfokale billeder af faste hjerneskiver med invasive GBM-celler fra blandede cellesfæroider og sfæroider mærket med DiD. Paneler A-D viser volumengengivelser af hjerneskiver, der indeholdt blandede cellesfæroider sammensat af grønne GSC16-4 / GFP-celler og røde U-118 / L1LE / mCherry-celler. Talrige røde U-118-celler spredte sig fra sfæroiderne og invaderede hjerneskiven i alle retninger, mens de grønne GSC'er ikke spredte sig og forblev på de centrale steder af sfæroiderne. Panelerne E og F viser et ex vivo-skivepræparat med røde U-118/L1LE/mCherry-sfæroider, også mærket med langt rødt membranfarvestof DiD (vist som blåt). Efter fiksering blev skiven immunfarvet for laminin i grønt. DiD-etiketten var synlig i røde blodlegemer som punktfarvning (pile) og var synlig selv i celler, der havde spredt sig fra sfæroider langs blodkar. Nuklear modfarvning med bisbenzimid er ikke vist i denne figur, så den anden farvning er tydeligere synlig. Skalastænger = 100 μm (E,F). Forkortelser: GBM = glioblastom; GSC'er = GBM stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Medium/opløsning Sammensætning
GSR's medier 1:1 blanding af DMEM/F12, 1% føtalt bovint serum (FBS), 15 mM HEPES buffer, 2 mM L-glutamin, 100 μg/ml penicillin-streptomycin (pen/strep), 2% B27 supplement uden vitamin A, og 2,5 μg/ml heparin.
GBM-medier DMEM (høj glukose), 10% FBS, pen / strep og 2 mM L-glutamin.
Fikseringsbuffer 2% PFA i 0,1 M natriumcacodylatbuffer
Indlejring af medium 3,5% agar og 8% saccharose i PBS
PBSTG 0,1% Triton X-100 + 5% normalt gedeserum (NGS) i PBS
U-118 MG cellekulturmedium DMEM + 10% FBS + pen / strep + L-glutamin
hjerneskive kultur medier 50% MEM + 25% HBSS + 25% Hesteserum + B27 + pen/strep + L-glut + 15 mM HEPES buffer
vibrerende vævsudskæringsmedier Medium 199 + pen/strep + 15 mM HEPES buffer

Tabel 1: Sammensætning af medier og buffere, der anvendes i denne protokol.

Supplerende figur 1: Injektion i E5 optisk tectum. (A) Efter at der er skåret et hul i æggeskallen over luftrummet, og luftrumsmembranen er fugtet med saltvand eller medier, fjernes membranen med fine pincet. (B) For at injicere celler i det optiske tektum klemmes amnion og holdes med fine tang for at placere hovedet, så det optiske tektum er tilgængeligt.  Derefter indsættes mikropipetten i det optiske tektum, og celler injiceres tryk i det. (C) Efter injektion af celler tilsættes nogle få dråber ampicillinopløsning oven på embryoet ved hjælp af en sprøjte og en fin nål. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Dissektion af E15 hjerneområder. (A) Efter halshugning anbringes E15-embryohovedet i en skål med steril CMF-opløsning. (B) Huden, der ligger over hjernen, fjernes derefter ved hjælp af fine pincet. (C) De to kranieknogler fjernes derefter fra de to forhjernehalvdele (FB). (D) Bindevævsdura fjernes derefter forsigtigt fra omgivelsen af forhjernen (FB), optisk tektum og lillehjernen. (E) Hele hjernen fjernes derefter fra hovedet ved forsigtigt at øse det ud af hjernehulen nedenunder ved hjælp af buede tang. (F ) Vist er dorsal visning af hele den fjernede hjerne med forhjerne (FB), optisk tectum (OT) og cerebellum (CB). (G ) Den isolerede hjerne dissekeres derefter i forhjernen (FB), optisk tectum (OT) halvkugler og cerebellum (CB) ved hjælp af en fin saks. (H ) Den sarte bindevævspia fjernes derefter let fra de optiske tectum (OT) halvkugler ved hjælp af fine tang. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Indlejring og udskæring af E15 optisk tektum og placering af cellesfæroider. (A) En optisk tectum halvkugle er nedsænket i lavsmelte agarose ved hjælp af buede tang. (B) Når agarosen hærder på is, trimmes blokken med det optiske tektum og limes på soklen af rustfrit stål i skæreskålen/bakken. (C) Når limen tørrer, placeres skæreskålen/bakken i borepatronen på den vibrerende vævsskiver og fyldes med kolde skæremedier.  Skiver skæres derefter med safirkniven fra den nedsænkede vævsblok.  Afskårne skiver flyder ned i fadet/bakken og kan fjernes ved hjælp af en spatel.  (D) Udskårne skiver fjernes fra skålen/bakken og anbringes direkte på membranindsatser med underliggende skivekulturmedier i en plade med flere brønde. (E) Efter at cellesfæroider er dyrket på poly-HEMA-belagte retter, fjernes en sfæroid fra skålen i en minimal mængde medier ved hjælp af en 20 μL mikropipettor. (F) Den isolerede sfæroid placeres derefter direkte på hjerneskiven i det minimale medie. (G) Hvis kuglen falder af hjerneskiven på grund af mediets strømning, kan den skubbes tilbage på hjerneskiven ved hjælp af en øjenvipper limet på en træapplikatorpind. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video S1: Video af høj forstørrelsesvolumen gengivelse af en lille GSC15-2 tumor ved E15. GSC'er er grønne på grund af GFP-udtryk. Video svarer til figur 1C og viser GSC15-2-celler. Videoen viser rotation af en volumengengivelse genereret fra en z-stak ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål. Cellekerner ser hvide ud på grund af bisbenzimidfarvning, og nogle ser røde ud på grund af immunfarvning for Sox2. Bemærk, at på grund af "Alpha Blending" for volumengengivelser i konfokalmikroskopsoftwaren blandes farver ikke som de ville ved hjælp af en maksimal intensitetsprojektion, og den mest intense farve dominerer og skjuler den mindre intense farve. Blodkarrene er farvede hvide på grund af immunfarvning for laminin. GSC-markør integrin alpha-6-farvning vises med blåt og vises punkteret på grønne GSC-overflader. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S2: Video af høj forstørrelsesvolumen gengivelse af lille GSC16-4 tumor ved E15. GSC'er er grønne på grund af GFP-udtryk. Video svarer til figur 1D og viser GSC16-4-celler. Videoen viser rotation af en volumengengivelse genereret fra en z-stak ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål. Cellekerner ser hvide ud på grund af bisbenzimidfarvning, og nogle GSC'er ser røde ud på grund af immunfarvning for nestin. Bemærk, at på grund af "Alpha Blending" for volumengengivelser i konfokalmikroskopsoftwaren blandes farver ikke som de ville ved hjælp af en maksimal intensitetsprojektion, og den mest intense farve dominerer og skjuler den mindre intense farve. Blodkarrene er farvede hvide på grund af immunfarvning for laminin. GSC-markør integrin alpha-6-farvning vises med blåt og vises punkteret på grønne GSC-overflader. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S3: Video med høj forstørrelsesvolumen gengiver af lille GSC15-2 tumor ved E15. GSC'er er grønne på grund af GFP-udtryk. Video svarer til figur 1E og viser GSC15-2-celler. Videoen viser rotation af en volumengengivelse genereret fra en z-stak ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål. Cellekerner ser hvide ud på grund af bisbenzimidfarvning, og nogle ser røde ud på grund af immunfarvning for Sox2. Bemærk, at på grund af "Alpha Blending" for volumengengivelser i konfokalmikroskopsoftwaren blandes farver ikke som de ville ved hjælp af en maksimal intensitetsprojektion, og den mest intense farve dominerer og skjuler den mindre intense farve. Blodkarrene er farvede hvide på grund af immunfarvning for laminin. GSC-markør integrin alpha-6-farvning vises med blåt og vises punkteret på grønne GSC-overflader. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S4: Video af høj forstørrelsesvolumen gengivelser af små GSC16-4 tumorer ved E15. GSC'er er grønne på grund af GFP-udtryk. Video svarer til figur 1F og viser GSC16-4-celler. Videoen viser rotation af en volumengengivelse genereret fra en z-stak ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål. Cellekerner ser hvide ud på grund af bisbenzimidfarvning, og nogle ser røde ud på grund af immunfarvning til nestin. Bemærk, at på grund af "Alpha Blending" for volumengengivelser i konfokalmikroskopsoftwaren blandes farver ikke som de ville ved hjælp af en maksimal intensitetsprojektion, og den mest intense farve dominerer og skjuler den mindre intense farve. Blodkarrene er farvede hvide på grund af immunfarvning for laminin. GSC-markør integrin alpha-6-farvning vises med blåt og vises punkteret på grønne GSC-overflader. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S5: Video af levende GBM-celler i ex vivo hjerneskive. Video svarer til figur 5C og viser widefield fluorescensbilleder af U-118 / L1LE cellesfæroider og invaderende celler under et time-lapse eksperiment for at overvåge den levende opførsel af invasion i ex vivo skiven (ved hjælp af et 20x mål på et brugerdefineret time-lapse mikroskopsystem). U-118/L1LE-cellerne blev farvet med det langt røde fluorescerende membranfarvestof DiD. Billeder blev erhvervet med et monokromt kamera. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S6: Video af levende GBM-celler i ex vivo hjerneskive. Video svarer til figur 5D og viser widefield fluorescensbilleder af U-118 / L1LE cellesfæroider og invaderende celler under et time-lapse eksperiment for at overvåge den levende opførsel af invasion i ex vivo skiven (ved hjælp af et 20x mål på et brugerdefineret time-lapse mikroskopsystem). Cellerne blev afbildet via deres røde mCherry-udtryk. Billeder blev erhvervet med et monokromt kamera. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S7: Video af volumen gengiver billeder af konfokal 4D-time-lapse af live GSC'er og GBM-celler. Video svarer til figur 6A. Konfokale z-stack-billeder blev taget med 10 μm trin hvert 10. minut over en periode på 20 timer. Præparatet var af en hjerneskive med implanterede blandede cellesfæroider af røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale billeder blev taget, mens hjerneskiven blev dyrket på en membranindsats i en 6-brønds plastcellekulturskål ved hjælp af en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som gav den nødvendige ekstra arbejdsafstand. Volumengengivelsen blev genereret ved hjælp af den konfokale mikroskopsoftware "Alpha Blending", som giver en tilsyneladende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Videoen observeres bedst ved manuelt at trække skyderen for videofremskridt i videoafspilleren frem og tilbage for at observere cellebevægelse i stedet for at lade videoafspilleren fortsætte med sin normale langsomme hastighed. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S8: Video af volumen gengiver billeder af konfokal 4D-time-lapse af live GSC'er og GBM-celler. Video svarer til figur 6B. Konfokale z-stack-billeder blev taget med 10 μm trin hvert 10. minut over en periode på 20 timer. Præparatet var af en hjerneskive med implanterede blandede cellesfæroider af røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale billeder blev taget, mens hjerneskiven blev dyrket på en membranindsats i en 6-brønds plastcellekulturskål ved hjælp af en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som gav den nødvendige ekstra arbejdsafstand. Volumengengivelsen blev genereret ved hjælp af den konfokale mikroskopsoftware "Alpha Blending", som giver en tilsyneladende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Videoen observeres bedst ved manuelt at trække skyderen for videofremskridt i videoafspilleren frem og tilbage for at observere cellebevægelse i stedet for at lade videoafspilleren fortsætte med sin normale langsomme hastighed. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S9: Video af volumen gengiver billeder af konfokal 4D-time-lapse af live GSC'er og GBM-celler. Video svarer til figur 6C. Konfokale z-stack-billeder blev taget med 10 μm trin hvert 10. minut over en periode på 20 timer. Præparatet var af en hjerneskive med implanterede blandede cellesfæroider af røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale billeder blev taget, mens hjerneskiven blev dyrket på en membranindsats i en 6-brønds plastcellekulturskål ved hjælp af en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som gav den nødvendige ekstra arbejdsafstand. Volumengengivelsen blev genereret ved hjælp af den konfokale mikroskopsoftware "Alpha Blending", som giver en tilsyneladende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Videoen observeres bedst ved manuelt at trække skyderen for videofremskridt i videoafspilleren frem og tilbage for at observere cellebevægelse i stedet for at lade videoafspilleren fortsætte med sin normale langsomme hastighed. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S10: Video af volumen gengiver billeder af konfokal 4D-time-lapse af live GSC'er og GBM-celler. Video svarer til figur 6D. Konfokale z-stack-billeder blev taget med 10 μm trin hvert 10. minut over en periode på 20 timer. Præparatet var af en hjerneskive med implanterede blandede cellesfæroider af røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale billeder blev taget, mens hjerneskiven blev dyrket på en membranindsats i en 6-brønds plastcellekulturskål ved hjælp af en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som gav den nødvendige ekstra arbejdsafstand. Volumengengivelsen blev genereret ved hjælp af den konfokale mikroskopsoftware "Alpha Blending", som giver en tilsyneladende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Videoen observeres bedst ved manuelt at trække skyderen for videofremskridt i videoafspilleren frem og tilbage for at observere cellebevægelse i stedet for at lade videoafspilleren fortsætte med sin normale langsomme hastighed. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S11: Video af volumen gengiver billeder af konfokal 4D-time-lapse af live GSC'er og GBM-celler. Video svarer til figur 6E. Konfokale z-stack-billeder blev taget med 10 μm trin hvert 10. minut over en periode på 20 timer. præparatet omfattede en hjerneskive med implanterede blandede cellesfæroider af røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale billeder blev taget, mens hjerneskiven blev dyrket på en membranindsats i en 6-brønds plastcellekulturskål ved hjælp af en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som gav den nødvendige ekstra arbejdsafstand. Volumengengivelsen blev genereret ved hjælp af den konfokale mikroskopsoftware "Alpha Blending", som giver en tilsyneladende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kanterne af volumengengivelsen. Videoen observeres bedst ved manuelt at trække skyderen for videofremskridt i videoafspilleren frem og tilbage for at observere cellebevægelse i stedet for at lade videoafspilleren fortsætte med sin normale langsomme hastighed. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Kritiske trin i protokollen for injektion af celler i midterhjernen (optisk tectum) ventrikel omfatter ikke at beskadige blodkarrene i chorioallantoic membranen i ægget eller omkring embryoet før og under injektionen, selvom amnionmembranen umiddelbart omkring embryoet forsigtigt kan trækkes og holdes for at placere hovedet, når cellerne injiceres i midthjernen. Amnion er relativt hård og kan trækkes med fine tang for at placere hovedet og holde det stabilt med den ene hånd, til injektion af celler med den anden hånd ind i optisk tectum, som er den store, runde struktur midt i hjernen. Generelt varierer levedygtigheden af injicerede embryoner fra 25% til 75% afhængigt af ukendte faktorer, og praktisk talt hvert embryo, der overlever, indeholder mindst en lille tumor i det optiske tektum. Kritiske trin i generering af levedygtige hjerneskiver omfatter blotting af vævet af overskydende væske, så agarose klæber til hjernen under udskæring og for at holde væv og skiver kolde, indtil de placeres på membranindsatsen. Da forskellige celletyper danner sfæroider forskelligt (i hastighed og størrelse), bør den belagte celletæthed på poly-HEMA-plader og længden af tiden før høstning af sfæroider optimeres for hver celletype.

Arbejdet her har ikke været genstand for en formel longitudinel undersøgelse af hjerneskivens levedygtighed. Yang et al. brugte chick embryo hjerneskivekulturer svarende til dem, der blev brugt her og viste god levedygtighed af skiverne i mindst 7 dage16. Tidligere arbejde viste, at når OT-væv blev holdt i suboptimale medier, optrådte mange pyknotiske kerner i vævet, hvilket ikke forekom i skiverne i arbejdet her. Derudover, når skiver degenererer under suboptimale forhold, fragmenterer blodkarrene og fremstår som rækker af laminin-positive kugler (ikke vist). Selvom levedygtigheden her ikke er blevet kontrolleret ved metoder som elektrofysiologi eller aktiv caspase-3-ekspression, optrådte ingen af indikatorerne for celledød, der blev set under suboptimale dyrkningsbetingelser, her.

OT har været fokuseret på in vivo hjernetumor eksperimenter, fordi det er den lettest injicerede region med den største ventrikel. Ved E5, som er den seneste dag, hvor embryoet er lille nok til at forblive tilgængeligt oven på æggeblommen, skal injektioner foretages i en ventrikel, da alle hjerneområder ikke er andet end en tynd ventrikulær zone. Ikke desto mindre resulterer disse injektioner med succes i indlejrede tumorer med celler, der invaderer hjernens parenchyma. Nogle gange findes resulterende tumorer i forhjernen eller lillehjernen, men det er ikke almindeligt. Ex vivo skiver af E15 optisk tectum er primært blevet anvendt til forsøg her, således at ex vivo co-kulturresultaterne kan korreleres med in vivo injektionsforsøgene. Imidlertid er forhjerneskiver også velegnede og har et større overfladeareal og en meget tynd ventrikel sammenlignet med det optiske tectum, hvilket kan gøre forhjernen mere egnet til ex vivo-cokulturer, der ikke korreleres med in vivo-injektioner .

Det er blevet påvist her, at in vivo-injektioner efterfulgt af vævsfiksering, vibrerende vævssnit og immunfarvning for laminin og andre markører resulterede i billeder i høj opløsning af GBM-celler og GSC'er i hjernevæv tæt på blodkar. Evnen til at bestemme sammenhængen mellem tumorceller og blodkar blev i høj grad lettet ved at skabe 3D-volumengengivelser fra z-stakke af konfokale optiske sektioner ved hjælp af den konfokale software og producentens instruktioner. Time-lapse-billeddannelse ved hjælp af widefield fluorescensmikroskopi af GFP-, mCherry- og DiD-mærkede celler var mulig; Imidlertid blev migrerende celler, der var tæt på de stærkt fluorescerende sfæroider, undertiden skjult af "gløden" fra sfæroiden. Denne uønskede effekt kan minimeres noget ved omhyggeligt at justere eksponeringstiderne for indsamling af widefield-billeder. Time-lapse-billeddannelse ved hjælp af konfokale z-stakke over tid (4D) eliminerede den ufokuserede glød fra sfæroiderne og resulterede i skarpt definerede migrerende celler med en mørk baggrund. Dette blev ikke beskrevet i protokollen, men blev udført på samme måde som widefield time-lapse billeddannelse, som blev udført, mens hjerneskiver var på de gennemsigtige membranindsatser i en 6-brønds plastplade. Selvom konfokal time-lapse-billeddannelse resulterer i markant klarere billeder af individuelle celler og deres adfærd, er et multipunkts time-lapse-eksperiment, der indsamler z-stakke af 10 z-planer / punkt med 10 minutters intervaller over en 20 timers periode, en omfattende brug af scanningshovedgalvanometre. Da dette kan reducere galvanometrenes levetid betydeligt, anvendes denne metode med omtanke.

Selvom kyllingembryosystemet er meget velegnet til både in vivo-injektion og ex vivo-samkultureksperimenter, der undersøger GBM-celleadfærd, er der flere begrænsninger for dette modelsystem. Som med ethvert xenograftsystem er miljøet, hvor humane celler implanteres, ikke den menneskelige hjerne, men GBM-celleadfærd ser ud til at efterligne det i gnavermodeller og hos menneskelige patienter. Efter at have udført in vivo injektionsforsøg på E5 får tumorer normalt lov til at dannes i 10 dage, indtil E15. Dette er tydeligvis ikke nok tid til at studere alle aspekter af tumorigenese og celleinvasion. Det er imidlertid blevet påvist her, at faste tumorer dannes i hjernens parenchyma, celler interagerer og omarrangerer sig i tumoren, og signifikant hjerneinvasion forekommer både langs blodkar og diffust inden for denne relativt korte periode. En anden begrænsning for in vivo kyllingembryosystemet er, at det ikke er egnet til lægemidler eller andre behandlinger på grund af det store æggeblomme og ekstraembryonale kredsløbssystem, der fungerer under kyllingembryoudvikling. Topiske flydende lægemiddelbehandlinger ville resultere i en meget variabel og ukendt koncentration i hjernen på grund af diffusion væk fra embryoet til den meget større æggeblommemasse. På samme måde vil intravenøs injektion af lægemidler i det meget sarte ekstraembryonale kredsløbssystem lække eller diffundere ud af blodkarrene og også resultere i ukendte koncentrationer i hjernen. Dette er en af hovedårsagerne til, at ex vivo-skivekulturmetoden blev vedtaget - så ikke kun celleadfærd kunne observeres og spores via time-lapse-mikroskopi, men også så behandlinger, der har haft succes med at ændre GBM-celleadfærd i en skål4 , kunne testes i et mere relevant hjernevævsmiljø.

Udviklingen af chick embryo ortopisk hjernetumor modelsystem ses som en væsentlig tilføjelse til de systemer og værktøjer, der er tilgængelige til undersøgelse af GBM tumordannelse og invasiv celleadfærd. Befrugtede kyllingæg vil sandsynligvis være let tilgængelige i de fleste områder, de er billige sammenlignet med gnavere, der er ingen omkostninger til dyrepleje, embryonerne er meget modstandsdygtige og resistente over for infektion (dvs. det meste arbejde udføres på en bænk), embryonerne er meget manipulerbare og kan dyrkes i skalløs kultur19, og kyllingembryoner betragtes ikke som hvirveldyr og kræver derfor ikke IACUC-godkendelse af NIH-retningslinjer (institutionelle krav kan variere). Disse mange fordele gør således kyllingembryosystemet meget attraktivt, hvis man begrænser deres spørgsmål og eksperimenter til dem, der falder inden for dets begrænsninger. Flere GBM-celleundersøgelser er blevet udført af andre ved hjælp af kyllingembryoet, men disse har næsten udelukkende udnyttet den chorioallantoiske membran (CAM) i embryoet 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 og lemknop 30, og ikke hjernen. Der har også været en rapport, der implanterer medulloblastom i kyllingens hjerne på E231. Uden tvivl bør brugen af kyllingembryoet som et ortopisk xenograftmodelsystem, som beskrevet her, give resultater, der er meget mere meningsfulde for human GBM-tumorbiologi end undersøgelser, der bruger CAM.

Selvom disse undersøgelser kun er begyndt at udnytte chick embryo hjernetumor modelsystemet fuldt ud til undersøgelser af human GBM-celle og GSC-adfærd, er det håbet, at andre vil udvide anvendelserne og finde yderligere potentielle anvendelser. Man kunne forestille sig, at dette system ikke kun vil afdække mekanismer, der regulerer GBM tumordannelse og celleadfærd, men også vil tillade præklinisk test af specifikke lægemidler og stoffer på specifikke patienters celler. For eksempel, hvis hjerneskivekulturer blev oprettet på forhånd, kunne tumorceller, stykker fra kirurgiske tumorresektioner eller patientafledte GBM-organoider32 placeres direkte i ex vivo-cokultur , og forskellige behandlinger kunne vurderes i løbet af få dage. På samme måde kunne dissocierede patientceller injiceres direkte i E5-mellemhjerner i ovo for at vurdere deres evne til at danne tumorer og invadere hjernens parenkym. Det er således håbet, at beskrivelserne af metoderne og repræsentative resultater her vil lette og tilskynde til øget brug af dette stærkt underudnyttede system til hjernekræftforskning.

Disclosures

Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist finansieret af et tilskud til D.S.G. fra National Cancer Institute (R03CA227312) og af et generøst tilskud fra Lisa Dean Moseley Foundation. Levende GBM-prøver blev opnået med patientens samtykke gennem Tissue Procurement Center of Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Finansiering til A.R. blev leveret af National Center for Research Resources og National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Sommer bachelor forskningsstipendier til N.P., A.L., Z.W. og KS blev leveret af University of Delaware Undergraduate Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch Birabira N/A
1 mm biopsy punch pen Robbins Instruments 20335
6 well insert plate (Corning Transwell) Millipore Sigma CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
24 well plate Corning Costar 3526
50 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-9
Agar Fisher BioReagents BP1423-500 for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-545-146
Aluminum foil ReynoldsWrap N/A
Ampicillin Sigma Aldrich A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 Santa Cruz Biotechnology sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 Santa Cruz Biotechnology sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 Santa Cruz Biotechnology sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 Santa Cruz Biotechnology sc-365823
B27 supplement without vitamin A GIBCO 17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258) Sigma-Aldrich B2883 nuclear stain
Cell culture incubator Forma standard humidified CO2 incubator
Centrifuge Beckman Coulter
Confocal microscope Nikon Instruments C2si+ With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses Nikon Instruments Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software Nikon Instruments NIS Elements Version 5.2
Curved foreceps World Precision Intruments 504478
Curved scissors Fine Science Tools
Curved spatula Fisher Scientific 14-375-20
Cyanoacrylate glue Krazy Glue KG-585 12R
D-Glucose Millipore Sigma G8270
DiD far red fluorescent dye Invitrogen V22887 Vybrant DiD
DMEM Sigma Aldrich D5671
DMEM/F12 Sigma Aldrich D8437
DMSO Sigma Aldrich D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5493-1L
egg incubator Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm) Scotch N/A
Ethanol 200 proof Decon Laboratories 2701
Fast green FCF dye Avocado Research Chemicals 16520
FBS Gemini Bio-products 900-108
filter paper Fisher Scientific
Gauze Dynarex 3353
Glass Capillaries for microinjection World Precision Instruments TW100-4
Glycerol Fisher BioReagents BP228-1 for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells) Not applicable Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Hausser scientific
Heparin Fisher Scientific BP2524-100
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887
Horse Serum (HI) Gibco 26050-088
Human FGF-2 BioVision 4037-1000
Human TGF-α BioVision 4339-1000
Inverted phase contrast microscope Nikon Instruments TMS for routine viewing of cultured cells
KCl Fisher Scientific BP366
KH2PO4 Fisher Scientific P284
Laboratory film Parafilm
Labquake Shaker LabIndustries T400-110
L-Glut:Pen:Strep Gemini Bio-products 400-110
Low-melt agarose Fisher Scientific BP1360 for embedding live brains
Matrix Corning Matrigel 354234
Medium 199 GIBCO 11150-059
MEM Corning 10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) Fisherbrand 12544A
NaCl Fisher Scientific S271
NaH2PO4 + H2O Fisher Scientific S369
NaHCO3 Fisher Scientific BP328
Normal goat serum Millipore Sigma 526-M
N-propyl gallate Sigma Aldrich P3130 for mounting media
Parafilm Parafilm
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS Sigma Aldrich P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides Fisherbrand 12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish Becton Dickinson 351008
pneumatic picopump World Precision Intruments PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA) Sigma Aldrich P-3932
razor blade- double edge PACE for cutting fixed brain slices
sapphire knife Delaware Diamond Knives for cutting live brain slices
Scalpel TruMed 1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 11652
Specimen chamber for vibratome custom-made
Stereo Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ1500 Equipped with epifluorescence
straight foreceps World Precision Intruments 500233
straight scissors Fine Science Tools
Sucrose Mallinckrodt 7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) Nikon Instruments TE2000-E With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm Thermo Fisher Scientific 130182 for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm Becton Dickinson 353004 for cell culturing
Transfer pipette American Central Scientific Co. FFP011
Transparent tape Scotch
Triton X-100 Sigma Aldrich T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line ATCC HTB-15 Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump Cole-Parmer EW-07532-40 "Air Cadet"
Vibrating tissue slicer Vibratome 3000 for cutting live and fixed brain slices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (3), 225-236 (2005).
  2. Yang, M., et al. L1 stimulation of human glioma cell motility correlates with FAK activation. Journal of Neuro-Oncology. 105 (1), 27-44 (2011).
  3. Mohanan, V., Temburni, M. K., Kappes, J. C., Galileo, D. S. L1CAM stimulates glioma cell motility and proliferation through the fibroblast growth factor receptor. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (4), 507-520 (2013).
  4. Anderson, H. J., Galileo, D. S. Small-molecule inhibitors of FGFR, integrins and FAK selectively decrease L1CAM-stimulated glioblastoma cell motility and proliferation. Cellular Oncology. 39 (3), 229-242 (2016).
  5. Pace, K. R., Dutt, R., Galileo, D. S. Exosomal L1CAM stimulates glioblastoma cell motility, proliferation, and invasiveness. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3982 (2019).
  6. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  7. Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
  8. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  9. Aaberg-Jessen, C., et al. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (4), 546-560 (2013).
  10. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochemical and Biophysical Research Communications. 269 (2), 513-520 (2000).
  11. Ren, B., et al. Invasion and anti-invasion research of glioma cells in an improved model of organotypic brain slice culture. Tumori. 101 (4), 390-397 (2015).
  12. Fayzullin, A., et al. Time-lapse phenotyping of invasive glioma cells ex vivo reveals subtype-specific movement patterns guided by tumor core signaling. Experimental Cell Research. 349 (2), 199-213 (2016).
  13. Jensen, S. S., et al. Establishment and characterization of a tumor stem cell-based glioblastoma invasion model. PloS One. 11 (7), e0158746 (2016).
  14. Marques-Torrejon, M. A., Gangoso, E., Pollard, S. M. Modelling glioblastoma tumour-host cell interactions using adult brain organotypic slice co-culture. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031435 (2018).
  15. Tamura, R., et al. Visualization of spatiotemporal dynamics of human glioma stem cell invasion. Molecular Brain. 12 (1), 45 (2019).
  16. Yang, C., et al. Organotypic slice culture based on in ovo electroporation for chicken embryonic central nervous system. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 1813-1826 (2019).
  17. Murrell, W., et al. Expansion of multipotent stem cells from the adult human brain. PloS One. 8 (8), e71334 (2013).
  18. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  19. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  20. Shoin, K., et al. Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
  21. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  22. Balciūniene, N., et al. Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane. Medicina. 45 (2), 123-131 (2009).
  23. De Magalhães, N., et al. Applications of a new In vivo tumor spheroid based shell-less chorioallantoic membrane 3-D model in bioengineering research. Journal of Biomedical Science and Engineering. 3 (1), 20-26 (2010).
  24. Szmidt, M., et al. Morphology of human glioblastoma model cultured in ovo. Journal of Veterinary Research. 56 (2), 261-266 (2012).
  25. Jaworski, S., et al. Comparison of tumor morphology and structure from U87 and U118 glioma cells cultured on chicken embryo chorioallantoic membrane. Journal of Veterinary Research. 57 (4), 593-598 (2013).
  26. Yuan, Y. J., Xu, K., Wu, W., Luo, Q., Yu, J. L. Application of the chick embryo chorioallantoic membrane in neurosurgery disease. International Journal of Medical Sciences. 11 (12), 1275-1281 (2014).
  27. Urbańska, K., et al. The effect of silver nanoparticles (AgNPs) on proliferation and apoptosis of in ovo cultured glioblastoma multiforme (GBM) cells. Nanoscale Research Letters. 10, 98 (2015).
  28. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  29. Han, J. M., Jung, H. J. Synergistic anticancer effect of a combination of berbamine and arcyriaflavin A against glioblastoma stem-like cells. Molecules. 27 (22), 7968 (2022).
  30. Ruiz-Ontañon, P., et al. Cellular plasticity confers migratory and invasive advantages to a population of glioblastoma-initiating cells that infiltrate peritumoral tissue. Stem Cells. 31 (6), 1075-1085 (2013).
  31. Cage, T. A., et al. Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (4), 371-380 (2012).
  32. Darrigues, E., et al. Biobanked glioblastoma patient-derived organoids as a precision medicine model to study inhibition of invasion. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10720 (2021).

Tags

Neurovidenskab nummer 195
Brug af kyllingembryohjernen som model for <em>in</em> vivo- og <em>ex vivo-analyser</em> af humant glioblastomcelleadfærd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin,… More

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin, A., Doerr, J., Waterman, Z., Sershen, K., Ray, P., Rodriguez, A., Galileo, D. S. Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior. J. Vis. Exp. (195), e65199, doi:10.3791/65199 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter