Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Großtierversuchsmodell zur Beurteilung der Funktionsfähigkeit des kardiovaskulären Systems zur Bewertung der Wirksamkeit neuer Therapien im präklinischen Umfeld. Er ist vergleichbar mit einem klinischen Belastungstest.
Abstract
Trotz des Fortschritts in der Behandlung sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen nach wie vor eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Die gentherapiebasierte therapeutische Angiogenese ist ein vielversprechender Ansatz, um Patienten mit signifikanten Symptomen trotz optimaler pharmakologischer Therapie und invasiver Verfahren zu behandeln. Viele vielversprechende kardiovaskuläre Gentherapietechniken haben jedoch in klinischen Studien die Erwartungen nicht erfüllt. Eine Erklärung ist eine Diskrepanz zwischen präklinischen und klinischen Endpunkten, die zur Messung der Wirksamkeit verwendet werden. In Tiermodellen lag der Schwerpunkt in der Regel auf leicht quantifizierbaren Endpunkten, wie z. B. der Anzahl und Fläche der Kapillargefäße, die aus histologischen Schnitten berechnet wurden. Abgesehen von Mortalität und Morbidität sind Endpunkte in klinischen Studien subjektiv, wie z. B. Belastungstoleranz und Lebensqualität. Die präklinischen und klinischen Endpunkte messen jedoch wahrscheinlich unterschiedliche Aspekte der angewandten Therapie. Dennoch sind beide Arten von Endpunkten erforderlich, um erfolgreiche Therapieansätze zu entwickeln. In Kliniken geht es immer darum, die Symptome der Patienten zu lindern und ihre Prognose und Lebensqualität zu verbessern. Um bessere prädiktive Daten aus präklinischen Studien zu erhalten, müssen die Endpunktmessungen besser mit denen in klinischen Studien abgeglichen werden. Hier stellen wir ein Protokoll für einen klinisch relevanten Laufband-Belastungstest bei Schweinen vor. Diese Studie zielt darauf ab, (1) einen zuverlässigen Belastungstest an Schweinen bereitzustellen, mit dem die Sicherheit und funktionelle Wirksamkeit von Gentherapien und anderen neuartigen Therapien bewertet werden kann, und (2) die Endpunkte zwischen präklinischen und klinischen Studien besser aufeinander abzustimmen.
Introduction
Chronische Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität 1,2. Obwohl die derzeitigen Behandlungen bei der Mehrheit der Patienten wirksam sind, können viele von ihnen immer noch nicht von den aktuellen Therapien profitieren, z. B. aufgrund diffuser chronischer Erkrankungen oder Komorbiditäten. Hinzu kommt, dass bei einigen Patienten die kardialen Symptome durch die verfügbaren Therapien nicht gelindert werden und die Herz-Kreislauf-Erkrankung trotz optimaler medikamentöser Therapie fortschreitet3. Es besteht daher ein klarer Bedarf, neue Behandlungsmöglichkeiten für schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln.
In den letzten Jahren wurden neue molekulare Wege und Wege zur Manipulation dieser Ziele entdeckt, die Gentherapie, Zelltherapie und andere neuartige Therapien zu einer realistischen Option für die Behandlung schwerer Herz-Kreislauf-Erkrankungen machen4. Nach vielversprechenden präklinischen Ergebnissen haben jedoch viele kardiovaskuläre Anwendungen die Erwartungen in klinischen Studien nicht erfüllt. Trotz der geringen Wirksamkeit in klinischen Studien haben mehrere Studien gute Sicherheitsprofile für neuartige Therapien ermittelt 5,6,7,8,9. Um Patienten neue kardiovaskuläre Therapien zur Verfügung zu stellen, sind daher verbesserte Ansätze und bessere präklinische Modelle, Studienumgebungen und Endpunkte in präklinischen Studien erforderlich, die die klinische Wirksamkeit vorhersagen können.
In Tiermodellen lag der Schwerpunkt in der Regel auf leicht quantifizierbaren Endpunkten, wie z. B. der Anzahl und Fläche der Kapillargefäße, die aus histologischen Schnitten berechnet wurden, oder Parametern aus der Bildgebung des linken Ventrikels in Ruhe und unter pharmakologischem Stress. In klinischen Studien waren viele Endpunkte subjektiver, wie z. B. die Belastungstoleranz oder die Linderung der Symptome4. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Endpunkte in präklinischen Studien und klinischen Studien unterschiedliche Aspekte der angewandten Therapie messen. Zum Beispiel korreliert eine Zunahme der Anzahl der Blutgefäße nicht immer mit einer besseren Durchblutung, Herzfunktion oder Belastungstoleranz. Dennoch sind beide Arten von Endpunkten erforderlich, um erfolgreiche Therapieansätze zu entwickeln10. Das Hauptziel ist jedoch immer, die Symptome zu lindern und die Prognose und Lebensqualität des Patienten zu verbessern. Um dies zu erreichen, müssen die Endpunktmessungen zwischen präklinischen und klinischen Studien besser aufeinander abgestimmt sein4.
Die kardiorespiratorische Fitness spiegelt die Fähigkeit des Kreislauf- und Atmungssystems wider, bei anhaltender körperlicher Aktivität Sauerstoff bereitzustellen, und quantifiziert somit die Funktionsfähigkeit eines Individuums. Die funktionelle Leistungsfähigkeit ist ein wichtiger prognostischer Marker, da sie ein starker unabhängiger Prädiktor für das Risiko kardiovaskulärer Mortalität und der Gesamtmortalität ist11. Eine Verbesserung der kardiorespiratorischen Fitness ist mit einem verringerten Mortalitätsrisiko verbunden12. Belastungstests eignen sich zur Bewertung der aeroben Leistung und des Behandlungsansprechens bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Je nach Verfügbarkeit werden die Tests auf einem Fahrradergometer oder einem Laufband durchgeführt. In der Regel wird eine schrittweise Erhöhung der Arbeitsbelastung pro Minute verwendet, und abrupte Anstiege werden vermieden. Dies führt zu einer linearen physiologischen Reaktion. Zu den wichtigsten Variablen in den Belastungstests gehören die Gesamtbelastungszeit, die erreichten metabolischen Äquivalente (METs), die Herzfrequenz und die Veränderungen auf einer Elektrokardiogramm-Linie (EKG) zwischen dem QRS-Komplex (Q-, R- und S-Welle) und der T-Welle (ST-Segment). Klinische Belastungstests sind kostengünstig und leicht zugänglich13. Aus diesen Gründen sind Belastungstests, wie z.B. der 6-Minuten-Gehtest, in Kliniken weit verbreitet und sollten auch bei der präklinischen Bewertung neuer Therapien eingesetzt werden.
Unseres Wissens gibt es keine gut beschriebenen Großtiermodelle, um die funktionelle Wirksamkeit von Gentherapien oder anderen neuartigen Therapien zu bewerten. Daher bietet der klinisch relevante Belastungstest eine hervorragende Perspektive, um die Wirksamkeit dieser neuen Therapien im präklinischen Setting zu bewerten.
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Protocol
Alle Versuche sind vom Tierversuchsausschuss der Universität Ostfinnland genehmigt. Dieses Protokoll beschreibt einen klinisch relevanten Laufband-Belastungstest für Schweine, um die Sicherheit und Wirksamkeit neuartiger Therapien für Herzerkrankungen zu bewerten. Für die vorliegende Studie wurden weibliche Hausschweine mit einem Gewicht von 25-80 kg verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Einrichten der Laufschiene
- Richten Sie die Laufstrecke so ein, dass sich die Tiere nur in eine Richtung bewegen können. Verwenden Sie Tore und Luken, um zu verhindern, dass sich die Tiere zurückbewegen. Der Grundriss der Laufbahn ist in Abbildung 1 dargestellt, und ein Beispiel für eine Laufbahn ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Stellen Sie sicher, dass das Laufband (siehe Materialtabelle) genügend Platz hat, um Steigungsänderungen zu ermöglichen.
- Stellen Sie sicher, dass das Laufband eine einstellbare Breite hat, um zu verhindern, dass sich das Tier während des Laufs dreht.
- Verwenden Sie transparenten Kunststoff, um die Vorderwand des Laufbandes herzustellen. Dadurch wird verhindert, dass das Tier vom Laufband wegläuft, aber es kann immer noch durch die Wand sehen.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Tiere durch die Vorderwand sehen können, da unsere Erfahrung zeigt, dass Schweine motivierter sind zu rennen, wenn sie ihre Artgenossen auf der anderen Seite der Wand sehen. - Platzieren Sie einen EKG-Monitor und einen Defibrillator (siehe Materialtabelle) neben dem Laufband.
HINWEIS: Während des Belastungstests können tödliche Herzrhythmusstörungen auftreten, insbesondere wenn das Schwein eine Myokardischämie hat14,15,16. - Stellen Sie sicher, dass die Laufstrecke eine Wasserstelle enthält, an der die Tiere trinken und sich nach dem Lauf abkühlen können.
2. Eingewöhnungszeit der Schweine vor der Prüfung
- Unterbringe die Tiere 2 Wochen lang, bevor du mit den Experimenten beginnst.
- Stellen Sie in der 1. Eingewöhnungswoche sicher, dass sich die Tiere an ihre Betreuer und die neue Stallumgebung gewöhnen, mit Ausnahme der Laufstrecke.
- Stellen Sie in der 2. Woche der Eingewöhnungsphase sicher, dass sich die Tiere an die Laufstrecke gewöhnen.
- Beginnen Sie mit der Eingewöhnung, damit sich die Tiere an die Laufstrecke gewöhnen. Halten Sie zunächst alle Tore offen, damit sich die Tiere frei auf der Strecke bewegen und die Umgebung erkunden können.
- Wenn die Tiere mit der Strecke vertrauter sind, schalten Sie das Laufband ein und lassen Sie das Tier für kurze Zeiträume am Stück laufen, z. B. 7 Minuten. Die Länge der Laufzeiten muss täglich verlängert werden.
HINWEIS: Denken Sie daran, die Tiere während der Eingewöhnungsphase zu belohnen. So wurden die Schweine in der vorliegenden Studie mit ungesalzenem Popcorn belohnt.
3. Der Belastungstest
HINWEIS: Schweine sollten mindestens 2 Stunden vor dem Belastungstest nüchtern sein oder vor dem Lauf nur eine winzige Portion Futter erhalten.
- Schalten Sie das Laufband ein und stellen Sie die Steigung auf 5%-10% ein.
- Sobald sich das Tier auf dem Laufband befindet, starten Sie das Laufband mit einer Startgeschwindigkeit von 2 km/h.
- Erhöhen Sie die Geschwindigkeit alle 60 s um 0,5 km/h, bis 5 km/h erreicht sind. Die Gesamtlaufzeit beträgt 15 min.
- Falls das Tier nicht die ganze Zeit mit der maximalen Geschwindigkeit laufen kann, führen Sie die folgenden Schritte aus.
- Wenn das Schwein nicht so schnell wie eine gewählte Geschwindigkeit läuft, schieben Sie es vorsichtig von hinten, da dies dem Tier das Gefühl geben kann, dass es schneller laufen muss, ohne langsamer zu werden.
- Versuchen Sie, das Tier maximal dreimal sanft zu drücken. Danach verlangsamen Sie die Geschwindigkeit jeweils um 0,5 km/h, bis das Schwein die Geschwindigkeit bewältigen kann. Verlangsamen Sie nicht unter 2 km/h.
- Wenn das Tier sich weigert, auch bei langsamer Geschwindigkeit zu laufen, schalten Sie das Laufband aus und beenden Sie den Test.
4. EKG-Überwachung während des Belastungstests
- Platzieren Sie EKG-Elektroden (siehe Materialtabelle) an anatomischen Stellen, die während des Laufs nur minimale Bewegungen aufweisen, wie z. B. Skapulen oder Brustkorb.
Anmerkungen: Verwenden Sie EKG-Elektroden, die für Belastungstests entwickelt wurden, um eine bessere Haftung auf der Haut zu erreichen. Denken Sie daran, die Haare aus dem Bereich zu rasieren, in dem die EKG-Elektroden platziert werden. - Zeichne die Veränderungen der Herzfrequenz während des Laufs auf.
HINWEIS: Unsere Erfahrung zeigt, dass ST-Segmentanalysen aufgrund von Bewegungen und anderen Artefakten oft kompliziert sind. Die Rhythmusüberwachung kann auch mit einem implantierbaren Loop-Recorder oder Herzschrittmacher durchgeführt werden.
5. Datenerhebung
- Notieren Sie die Laufstrecke, die Gesamtzeit und die Geschwindigkeit jedes Mal, wenn die Geschwindigkeit geändert wird.
HINWEIS: Moderne Laufbänder können viele andere Daten sammeln, daher ist es wichtig, sich mit dem Laufbandhandbuch vertraut zu machen, um das volle Potenzial des Geräts auszuschöpfen. - Achte auf mögliche Veränderungen im Verhalten der Tiere, wie z. B. Hinken.
Anmerkungen: Wenden Sie sich bei Bedarf an einen Tierarzt und stellen Sie sicher, dass das Tier die erforderliche Analgesie erhält. Entfernen Sie das Tier aus zukünftigen Übungen, bis es sich vollständig erholt hat.
6. Nachsorge nach dem Eingriff
- Stellen Sie sicher, dass das Tier Zugang zur Wasserstelle hat.
- Belohnen Sie das Tier zum Beispiel mit Leckerlis oder Spielzeug.
- Überwachen Sie das Tier nach dem Lauf 30 Minuten lang auf mögliche Nebenwirkungen.
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Representative Results
Man muss Erfahrung in der Arbeit mit großen Tieren haben, um mit diesem Protokoll erfolgreich zu sein. Forscher müssen in der Lage sein, zu beurteilen, ob ein Tier aufgrund von Müdigkeit oder mangelnder Motivation aufhört zu laufen. Die Aufzeichnung der Geschwindigkeit und der Distanz kann helfen, dies zu bewerten, da Tiere ohne Motivation in der Regel vollständig aufhören zu laufen, während müde Tiere nach dem Verlangsamen der Geschwindigkeit weiterlaufen (Abbildung 3). Bei Bedarf kann das Protokoll am nächsten Tag wiederholt werden, wenn die Ergebnisse unzuverlässig erscheinen.
Eine repräsentative Zeitachse für mit Adeno-assoziierten Viren (AAV) behandelte Tiere ist in Abbildung 4 dargestellt. Der Zeitplan kann je nach Studiensetting variieren, insbesondere in Bezug auf den Zeitpunkt der Opferung. Beachten Sie bei der Planung der Experimente die Eingewöhnungszeit.
Die Ergebnisse können mit anderen Organstruktur- und Funktionsmessungen, wie z. B. dem Herzecho, verglichen werden, um zu sehen, wie die Belastungstoleranz mit diesen anderen Messungen zusammenhängt. So korreliert beispielsweise die Änderung der Laufstrecke mit der Änderung der Ejektionsfraktion. Mit einer geringen Auswurffraktion kann ein Tier während des gesamten Belastungstests nicht mit voller Geschwindigkeit laufen (Abbildung 5). Die analysierten Variablen können je nach Studienumgebung unterschiedlich sein. Dieses Protokoll ermöglicht den Vergleich von Gesamtlaufstrecke, Geschwindigkeitsschwankungen, METs, Herzfrequenzschwankungen und Herzrhythmusstörungen.
Das EKG wird während des Belastungstests aufgezeichnet (Abbildung 6). Die Analyse von ST-Segmenten ist aufgrund von Artefakten schwierig. Veränderungen der Herzfrequenzintervalle können während des gesamten Belastungstests anhand des EKGs gemessen werden.
Abbildung 1: Grundriss der Laufbahn. Der Platz für Tiere, die nicht laufen, ist mit (A) gekennzeichnet. Ein Tier nach dem anderen wird durch einen Korridor (B) zum Laufband [Zone (C)] geführt. Das Tor zwischen den Zonen (A) und (B) ist geschlossen, um sicherzustellen, dass immer nur ein Tier auf die Laufbahn geht und die anderen Tiere in Zone (A) bleiben. Es ist wichtig, dass andere Tiere in Zone (A) bleiben, da das Tier auf dem Laufband die anderen Tiere in Zone (A) sehen kann, was es zum Laufen motiviert. Das Tor zwischen dem Laufband und der Zone (B) ist geschlossen, um sicherzustellen, dass das Tier nicht vom Laufband zurückweichen kann. Das Laufband wird von Zone (D) aus bedient, und das Tier wird nach dem Lauf in Zone (A) durch Zone (D) zurückgebracht. Im vorliegenden Fall wird in Zone (A) eine Wasserstelle installiert, an der die Tiere nach dem Auslauf trinken und sich abkühlen können. Symbole: Schwarze Pfeile zeigen die Drehrichtung an, Viertelkreise zeigen Tore an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Laufstrecke . (A) Die Wichtigkeit von nur einer verfügbaren Route für die Tiere. (B) Das Laufband, das eine verstellbare Breite haben sollte, um zu verhindern, dass sich die Tiere während des Laufs drehen. (C) Ein geschlossener Raum, der neben dem laufenden Tier auch für ein anderes Tier bestimmt ist. Tiere sind motivierter zu rennen, wenn sie ein Mitglied ihrer Art sehen. (D) Ein Beispiel für eine Wasserstelle für die Tiere, an der sich die Tiere nach dem Belastungstest abkühlen und trinken können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Laufstrecke und Geschwindigkeit . (A) Repräsentative Daten aus den Gesamtlaufstrecken von vier gesunden Schweinen. Die mittlere Gesamtlaufstrecke der Versuchstiere betrug 970 m, und die Standardabweichung der Gesamtdistanzen betrug 80 m. (B) Daten zur Geschwindigkeitsvariation zwischen Schweinen. Die Geschwindigkeit wird um 0,5 km/h verlangsamt, bis das Schwein die Geschwindigkeit bewältigen kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Zeitleiste. Beachten Sie, dass die Zeitpunkte zwischen den Studien variieren können. Bemerkenswert ist jedoch, dass die Tiere aufgrund der Eingewöhnungszeit 3 Wochen vor Versuchsbeginn im Versuchszentrum eintreffen sollten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Korrelation der Laufstrecke mit der Änderung der Ejektionsfraktion. Korrelation der Änderung der Laufstrecke mit der Änderung der Ejektionsfraktion. Die Ejektionsfraktion im Ruhezustand wurde mit der Biplane Simpon-Methode gemessen. Die Veränderung der Ejektionsfraktion gegenüber dem Ausgangswert korreliert mit der Veränderung der Laufdistanz von Schweinen mit Herzschrittmacher-induzierter Herzinsuffizienz mit r = 0,2831, p = 0,0284 undR2 = 0,0801. Trotz des niedrigen r undR2 wirkt sich die Veränderung des prozentualen Anteils der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF%) tendenziell auf die Laufdistanzen aus. Es ist wichtig zu beachten, dass mehrere Faktoren die Messgrößen beeinflussen und die Ergebnisse beeinflussen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Repräsentative EKG-Bänder eines gesunden Schweins. Das obere EKG-Panel zeigt 3 Minuten nach Beginn des Belastungstests ein EKG. Der untere EKG-Streifen zeigt ein EKG nach 10 min Laufen. Mit dem EKG können die Unterschiede in der Herzfrequenz der Versuchstiere ausgewertet werden. Die Herzfrequenz des oberen EKG-Panels beträgt 176 Schläge pro Minute und auf dem unteren EKG-Streifen 250 Schläge pro Minute. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieser Belastungstest für große Tiere ahmt den in Kliniken verwendeten Test nach und verringert die Lücke zwischen den Endpunkten zwischen den präklinischen Studien und den klinischen Studien. Es kann angewendet werden, um die Wirksamkeit neuer Behandlungen für schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Arteriosklerose obliterans, Herzinsuffizienz und ischämische Herzerkrankungen zu bewerten. Die in diesem Protokoll angewandten Zeitpunkte können je nach getesteter Behandlung variieren. Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage langjähriger Erfahrung in der Arbeit mit Großtieren standardisiert und kann verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit der kardiovaskulären Gentherapie und anderer neuartiger therapeutischer Ansätze zu bewerten.
Das Schweineherz und das Herz-Kreislauf-System ähneln der menschlichen Physiologie, Anatomie und Funktion. Daher wurden Schweine häufig zur Modellierung von Mechanismen und therapeutischen Verfahren von Herz-Kreislauf-Erkrankungen verwendet17. Die Nachbeobachtungszeit in unseren Schweinestudien betrug bis zu 12 Monate18; Der Umgang mit den Tieren wird jedoch immer anspruchsvoller, da sie während der langen Nachbeobachtungszeiten wachsen.
Diese Methode besteht aus verschiedenen kritischen Schritten, die für den Erfolg des Tests unerlässlich sind und im Nachhinein nicht mehr korrigiert werden können. Erstens unterscheiden sich Schweine individuell in ihrer Laufmotivation. Es ist wichtig, die Tiere zum Laufen zu motivieren und während des gesamten Tests eine ausreichende Motivation aufrechtzuerhalten. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Zeitpunkte vergleichbar sind. Um die Laufmotivation von Schweinen aufrecht zu erhalten, bedarf es spezifischer Kenntnisse über ihre individuellen Verhaltensmerkmale. Die Tiere müssen vor dem Belastungstest an das Laufband und die Testumgebung gewöhnt werden. Den Schweinen wird beigebracht, auf dem Laufband zu laufen, und ihre erfolgreichen Leistungen werden belohnt. Eine weitere Möglichkeit, die Laufmotivation zu steigern, besteht darin, andere Versuchstiere im Sichtfeld des Läufers zu halten.
Es ist wichtig, typische anatomische Mängel, wie z. B. verschiedene Beinprobleme, zu vermeiden. Die häufigsten anatomischen Mängel sind Huferkrankungen, angeborene Fehlbildungen der Gliedmaßen und unfallbedingte Probleme wie Platzwunden, Schulterblattverletzungen, Frakturen und Wunden. Diese sind meist auf Lebensräume, Unfälle, erbliche Faktoren und Abweichungen bei der Nahrungsaufnahme zurückzuführen19. Eine Schwäche in den Beinen führt zu unkoordiniertem Gehen, was die Teilnahme an Belastungstests unmöglich macht. Auch wenn während der Studie eine Beinschwäche auftritt, muss das Tier vom Test ausgeschlossen werden. Beinprobleme können vermieden werden, indem Schweine mit intakten Beinstrukturen gewählt werden. Während der Forschung können Beinverletzungen durch gute Bedingungen im Schweinestall verhindert werden. Harte, korrosive Oberflächen müssen vermieden und die allgemeine Hygiene aufrechterhalten werden. Schweine müssen mäßig gefüttert werden, damit sie nicht zu schnell an Gewicht zunehmen, da dies ihre Beine belastet. Darüber hinaus müssen Schweine vorsichtig in ihre Ställe gesetzt werden, um Unfälle zu vermeiden, und sie sollten genügend Reize, wie z. B. Spielzeug, haben, damit ihr Kauen nicht auf andere Schweine gerichtet ist.
Während des Belastungstests wurde das EKG mit einem 3-Kanal-EKG oder einem implantierbaren Loop-Recorder aufgezeichnet. Es ist nicht so genau wie ein 12-Kanal-EKG, kann aber dennoch mehrere Variablen wie Herzrhythmusstörungen und Herzfrequenz bewerten. Verschiedene Arten von Fehlern und Störungen können EKGs verfälschen. So können beispielsweise falsch angeschlossene Elektroden, schlechter Kontakt zwischen Haut und Elektroden sowie Kontraktionen der Skelettmuskulatur zu Fehlern führen. Die Elektroden müssen während der gesamten Prüfung fest an Ort und Stelle bleiben. Dies ist eine Herausforderung, da sich die Haut beim Laufen erwärmt und schwitzt. Der Kontakt zwischen Haut und Elektroden kann durch das Rasieren von Haaren, das Desinfizieren und Entfernen abgestorbener Hautzellen verbessert werden. Außerdem verursacht die Bewegung von Muskeln Artefakte, die das EKG beeinflussen13. Dies kann die Interpretation von ST-Segmenten erschweren. Darüber hinaus können EKG-Ableitungen das Laufen stören. Diese Probleme können jedoch reduziert werden, indem die EKG-Ableitungen fest auf die Haut geklopft werden. EKGs können auch mit einem implantierbaren Loop-Recorder oder Herzschrittmacher registriert werden. Die Verwendung eines implantierbaren Loop-Recorders löst viele Probleme, die bei der Verwendung von 3-Kanal-EKGs auftreten. Die Installation des implantierbaren Loop-Recorders ist jedoch ein invasiver Eingriff mit Risiken, wie z. B. Infektionen.
Die Forscher müssen das Verhalten der Tiere während des gesamten Tests beobachten, um die allgemeine Sicherheit des Verfahrens zu gewährleisten. Zum Beispiel sind Erschöpfung, starke Müdigkeit, Übelkeit, Bewusstlosigkeit, schwere Atemnot oder zyanotische Haut Gründe für den Abbruch des Belastungstests. Außerdem müssen die Forscher Veränderungen im EKG beobachten, wie z. B. Herzrhythmusstörungen. Mit gut ausgebildetem Personal und genügend Erfahrung im Umgang mit Großtieren kann das aktuelle Trainingsprotokoll jedoch routinemäßig in präklinischen Studien eingesetzt werden, um klinisch relevante Daten zu gewinnen, die den klinischen Übergang neuer Therapieansätze im Hinblick auf den klinischen Nutzen für die Patienten erfolgreicher machen sollten.
Poole et al.20 haben Leitlinien für Tierversuche und Trainingsprotokolle für kardiovaskuläre Studien veröffentlicht. Bei diesen Protokollen trainieren Schweine nach dem Aufwärmen etwa 30 Minuten lang auf einem Laufband. Während dieser 30 Minuten liegt die Zielherzfrequenzzone für die Versuchstiere bei 65%-75% der maximalen Herzfrequenz. Die Herzfrequenz wird entweder durch Änderung der Geschwindigkeit oder der Steigung des Laufbandes verändert. Das Protokoll von Poole et al. und der 15-minütige Belastungstest, der in diesem Manuskript vorgestellt wird, weisen mehrere Ähnlichkeiten auf, wie z. B. die Eingewöhnungszeit, die Anforderungen an das Laufband, das Gewicht ausgewählter Versuchstiere und die positive Verstärkung durch Belohnung des Tieres nach der Übung. In beiden Protokollen können die Versuchstiere über die Kapazität des Laufbandes hinauswachsen, was die Nachbeobachtungszeit einschränkt.
Der Hauptunterschied zwischen dem von Poole et al. beschriebenen Protokoll und dem in diesem Manuskript vorgestellten Belastungstest ist der Zweck des Tests. Das von Poole et al. beschriebene Protokoll ist darauf ausgelegt, klassische Trainingsanpassungen hervorzurufen, die beim Menschen beobachtet wurden. Daher konzentriert es sich auf Übungen mit moderater Intensität, während die 15-minütige Belastungstestmethode darauf abzielt, eine nahezu maximale Anstrengung zu unternehmen, um die kardiorespiratorische Fitness besser zu bewerten. Dies ist erreicht, wenn das subjektive Belastungsniveau etwa 90 % der maximalen Herzfrequenz beträgt13. Ein 15-minütiger Belastungstest ahmt den in Kliniken verwendeten Test nach, indem er das Belastungsniveau allmählich erhöht, bis es fast maximal ist. Aufgrund der unterschiedlichen Ziele der Protokolle unterscheidet sich die Bewegungshäufigkeit der Versuchstiere. Poole et al. beschreiben, dass Schweine bis zu viermal pro Woche laufen können, um bessere kardiovaskuläre Anpassungen zu erreichen, die durch Bewegung verursacht werden. Der 15-minütige Belastungstest bewertet die funktionelle Wirksamkeit von Gentherapien und anderen neuartigen Therapien, weshalb die erforderliche Häufigkeit deutlich geringer ist und von den Anforderungen der Behandlung abhängt. Ein Beispiel für diese Anforderungen ist in Abbildung 4 beschrieben.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autorin dankt Minna Törrönen, Riikka Venäläinen, Heikki Karhunen und Inkeri Niemi vom National Laboratory Animal Center für ihre Unterstützung bei der Tierarbeit. Diese Studie wird durch die Finnish Academy, den ERC und den CardioReGenix EU Horizon Grant unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Defibrillator | Zoll M series | TO9K116790 | All portable defribrillators will work |
| Defibrillator pads | Philips | M3713A | All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator |
| ECG electrodes | Several providers | Prefer ECG electrodes designed for exercise tests | |
| Loop recorder | Abbott Oy | DM3500 | Optional for rhythm monitoring |
| Patient monitor | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | All portable ecg monitors will work |
| Pigs | Emolandia Oy | ||
| Treadmill | NordicTrack | All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test. The treadmill should be as long and wide as possible. | |
| Ultrasound system | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| Various building materials | Several providers | For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2 | |
| Various treats for the animals |
References
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