Summary
Une procédure d’étude de la dynamique du métabolisme de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules à l’aide d’un format de plaque multipuits et d’une imagerie automatisée par immunofluorescence pour détecter et quantifier la synthèse et la distribution de l’ADNmt est décrite. Cela peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs, stress cellulaires et silençage génique sur le métabolisme de l’ADNmt.
Abstract
La grande majorité des processus cellulaires nécessitent un apport continu d’énergie, dont le porteur le plus courant est la molécule d’ATP. Les cellules eucaryotes produisent la majeure partie de leur ATP dans les mitochondries par phosphorylation oxydative. Les mitochondries sont des organites uniques parce qu’elles ont leur propre génome qui est répliqué et transmis à la génération suivante de cellules. Contrairement au génome nucléaire, il existe plusieurs copies du génome mitochondrial dans la cellule. L’étude détaillée des mécanismes responsables de la réplication, de la réparation et du maintien du génome mitochondrial est essentielle pour comprendre le bon fonctionnement des mitochondries et des cellules entières dans des conditions normales et pathologiques. Ici, une méthode qui permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules humaines cultivées in vitro est présentée. Cette approche est basée sur la détection par immunofluorescence de molécules d’ADN synthétisées activement marquées par incorporation de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) et la détection simultanée de toutes les molécules d’ADNmt avec des anticorps anti-ADN. De plus, les mitochondries sont visualisées avec des colorants ou des anticorps spécifiques. La culture de cellules dans un format multipuits et l’utilisation d’un microscope à fluorescence automatisé facilitent l’étude de la dynamique de l’ADNmt et de la morphologie des mitochondries dans diverses conditions expérimentales dans un temps relativement court.
Introduction
Pour la plupart des cellules eucaryotes, les mitochondries sont des organites essentiels, car elles jouent un rôle crucial dans de nombreux processus cellulaires. Tout d’abord, les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’énergie des cellules1. Les mitochondries sont également impliquées dans la régulation de l’homéostasie cellulaire (par exemple, l’oxydoxintracellulaire 2 et l’équilibre calcique3), la signalisation cellulaire4,5, l’apoptose 6, la synthèse de différents composés biochimiques 7,8 et la réponse immunitaire innée9. Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à divers états pathologiques et maladies humaines10.
Le fonctionnement des mitochondries dépend de l’information génétique située dans deux génomes distincts : le génome nucléaire et le génome mitochondrial. Le génome mitochondrial code un petit nombre de gènes par rapport au génome nucléaire, mais tous les gènes codés par l’ADNmt sont essentiels à la vie humaine. La machinerie protéique mitochondriale nécessaire au maintien de l’ADNmt est codée par l’ADNn. Les composants de base du réplisome mitochondrial, ainsi que certains facteurs de biogenèse mitochondriale, ont déjà été identifiés (examinés dans des recherches antérieures11,12). Cependant, les mécanismes de réplication et de maintien de l’ADN mitochondrial sont encore loin d’être compris. Contrairement à l’ADNn, le génome mitochondrial existe en plusieurs copies, ce qui fournit une couche supplémentaire pour réguler l’expression des gènes mitochondriaux. On en sait beaucoup moins actuellement sur la distribution et la ségrégation de l’ADNmt au sein des organites, dans quelle mesure ces processus sont régulés et, le cas échéant, quelles protéines sont impliquées13. Le schéma de ségrégation est crucial lorsque les cellules contiennent une population mixte d’ADNmt de type sauvage et muté. Leur distribution inégale peut conduire à la génération de cellules avec une quantité néfaste d’ADNmt muté.
Jusqu’à présent, les facteurs protéiques nécessaires au maintien de l’ADNmt ont été identifiés principalement par des méthodes biochimiques, des analyses bioinformatiques ou par des études associées à la maladie. Dans ce travail, afin d’assurer une forte chance d’identifier les facteurs qui ont précédemment échappé à l’identification, une stratégie différente est décrite. La méthode est basée sur le marquage de l’ADNmt pendant la réplication ou la réparation avec la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU), un analogue nucléosidique de la thymidine. BrdU est facilement incorporé dans les brins d’ADN naissants lors de la synthèse de l’ADN et, en général, est utilisé pour surveiller la réplication de l’ADN nucléaire14. Cependant, la procédure développée ici a été optimisée pour détecter BrdU incorporé dans l’ADNmt en utilisant l’immunofluorescence des anticorps anti-BrdU.
L’approche permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt dans des cellules humaines cultivées in vitro. Une stratégie à haut débit est nécessaire pour effectuer des essais dans différentes conditions expérimentales dans un temps relativement court; Par conséquent, il est proposé dans le protocole d’utiliser un format multipuits pour la culture cellulaire et la microscopie à fluorescence automatisée pour l’imagerie. Le protocole comprend la transfection de cellules HeLa humaines avec une bibliothèque de siRNA et la surveillance ultérieure de la réplication ou de la réparation de l’ADNmt à l’aide du marquage métabolique de l’ADN nouvellement synthétisé avec BrdU. Cette approche est combinée avec l’immunomarquage de l’ADN à l’aide d’anticorps anti-ADN. Les deux paramètres sont analysés à l’aide de la microscopie quantitative à fluorescence. De plus, les mitochondries sont visualisées avec un colorant spécifique. Pour démontrer la spécificité du protocole, la coloration BrdU a été testée sur des cellules dépourvues d’ADNmt (cellules rho0), sur des cellules HeLa lors du silençage de facteurs de maintenance de l’ADNmt bien connus et sur des cellules HeLa après traitement avec un inhibiteur de la réplication de l’ADNmt. Les niveaux d’ADNmt ont également été mesurés par une méthode indépendante, à savoir la qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation du mélange siRNA
- Un jour avant le début de l’expérience, les cellules de graines (par exemple, HeLa) sur une boîte de 100 mm afin qu’elles atteignent 70% à 90% de confluence le lendemain.
NOTE: Toutes les opérations doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une chambre à flux laminaire. - Préparer la quantité appropriée de siRNA diluée à une concentration de 140 nM dans un milieu Opti-MEM (voir tableau des matériaux). Une plaque de 96 puits peut être utilisée comme réservoir.
- Ajouter 5 μL de la solution siRNA (ou du milieu Opti-MEM pour les échantillons témoins) à chaque puits d’une microplaque de culture cellulaire noire de 384 puits.
REMARQUE: Selon le nombre d’échantillons de siRNA testés, une pipette électronique ou multicanal peut être utilisée. - Préparer la quantité appropriée de solution de réactif de transfection RNAiMAX (voir tableau des matériaux) dans le milieu Opti-MEM. Ajouter 1 μL d’ARNiMAX pour chaque 100 μL de milieu.
- Ajouter 10 μL de la solution de réactif de transfection à chaque puits de la plaque de 384 puits. Le moyen le plus pratique et le plus rapide de le faire est d’utiliser un distributeur de réactifs.
- Incuber le siRNA avec le réactif de transfection pendant 30 min à température ambiante.
2. Préparation des cellules pour la transfection
- Pendant l’incubation (étape 1.6), aspirer le milieu à l’aide d’un dispositif d’aspiration (voir le tableau des matières) et laver les cellules avec 3 mL de PBS.
- Ajouter 1,5 mL de trypsine diluée 1:2 dans du PBS et incuber les cellules à 37 °C pendant 10 min.
- Vérifiez si les cellules se sont détachées; si c’est le cas, ajouter 3 mL de milieu DMEM avec 10% FBS. Suspendez soigneusement les cellules et transférez-les dans un tube de 15 mL. Prélevez au moins 150 μL de la suspension et comptez les cellules dans une chambre de comptage des cellules (voir le tableau des matériaux).
- Préparer une suspension cellulaire à la concentration appropriée (35 000/mL pour la lignée HeLa) dans un milieu DMEM avec 10 % de FBS, de pénicilline et de streptomycine.
3. Transfection cellulaire
- Ajouter 20 μL de la suspension cellulaire à chaque puits de la plaque de 384 puits à l’aide du distributeur de réactif. Cela se traduira par 700 cellules ensemencées par puits.
- Incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante, puis les placer dans l’incubateur pendant 72 h (37 °C et 5% CO2).
4. Constitution BrdU
- Préparer une solution 90 μM de BrdU (voir tableau des matériaux) en milieu DMEM avec 10% de FBS.
- 56 h après la transfection du siRNA (16 h avant la fixation de la cellule), ajouter 10 μL de solution BrdU à 90 μM à chaque puits de la plaque de 384 puits (la concentration finale de BrdU est de 20 μM).
REMARQUE: L’action doit être effectuée aussi rapidement que possible; Par conséquent, il est préférable d’utiliser un distributeur de réactifs, une pipette électronique ou une pipette multi-distributeur. N’oubliez pas de préparer les puits de contrôle sans ajout de BrdU. - Incuber les cellules pendant 16 h (37 °C et 5% de CO2).
5. Étiquetage des mitochondries
- Préparer une solution 20 μM de BrdU dans du DMEM avec 10% de FBS, et y ajouter la solution de colorant de suivi des mitochondries (voir Tableau des matériaux) à une concentration de 1,1 μM.
- 15 h après le début de l’incorporation du BrdU (1 h avant la fixation cellulaire), ajouter 10 μL de la solution de colorant de suivi des mitochondries (voir le tableau des matériaux) à chaque puits de la plaque de 384 puits (la concentration finale du colorant est de 200 nM).
REMARQUE: Utilisez un distributeur de réactif, une pipette électronique ou une pipette multi-distributeur. N’oubliez pas de conserver les puits de contrôle sans l’ajout de BrdU mais avec l’ajout du colorant de suivi des mitochondries. - Incuber les cellules pendant 1 h (37 °C et 5% de CO2).
6. Fixation cellulaire
REMARQUE: Tout le lavage est effectué plus commodément à l’aide d’une laveuse de microplaques, tandis que l’ajout de réactifs est effectué plus rapidement à l’aide d’un distributeur de réactifs.
- À l’aide de la laveuse à microplaques (voir le tableau des matières), rincer chaque puits deux fois avec 100 μL de PBS. Après le deuxième lavage, laissez 25 μL de PBS dans le puits.
REMARQUE: Laisser PBS dans le puits réduit la probabilité de décollement de la cellule lors de l’ajout de liquide à l’étape suivante. Tous les lavages sont terminés avec le PBS laissé dedans; par conséquent, la solution ajoutée à l’étape suivante doit toujours être préparée à une concentration de 2x car elle sera ajoutée dans un volume égal au PBS restant. - Fixer les cellules en ajoutant 25 μL d’une solution de formaldéhyde à 8 % dans du PBS avec 0,4 % de Triton X-100 et de Hoechst 33342 à une concentration de 4 μg/mL (les concentrations finales des réactifs individuels sont de 4 %, 0,2 % et 2 μg/mL, respectivement) (voir le tableau des matériaux).
- Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.
7. Blocage
- Rincer chaque puits quatre fois avec 100 μL de PBS. Après le dernier lavage, laissez 25 μL de PBS dans le puits.
- Ajouter 25 μL de BSA à 6 % dans du PBS (la concentration finale de BSA est de 3 %) à chaque puits.
- Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.
8. Ajout des anticorps primaires
- Aspirer le BSA à l’aide d’une laveuse à microplaques et laisser 10 μL de solution dans le puits.
- Ajouter 10 μL de la solution d’anticorps primaires préparée dans du BSA à 3% dans du PBS. Utiliser de l’anti-BrdU à 0,8 μg/mL et de l’anti-ADN à 0,4 μg/mL (les concentrations finales d’anticorps sont de 0,4 μg/mL et 0,2 μg/mL, respectivement) (voir le tableau des matériaux).
- Incuber la plaque dans l’obscurité à 4 °C pendant la nuit.
9. Ajout des anticorps secondaires
- Rincer chaque puits quatre fois avec 100 μL de PBS. Après le dernier lavage, laissez 10 μL de PBS dans le puits.
- Ajouter 10 μL de la solution d’anticorps secondaires à 4 μg/mL préparée dans du BSA à 6 % dans du PBS (la concentration finale est de 2 μg/mL). Utiliser des anticorps spécifiques aux isotypes (IgG1 anti-souris et IgM anti-souris) conjugués à des fluorochromes tels que Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 555 (voir le tableau des matériaux).
- Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 h.
- Rincer chaque puits quatre fois avec 100 μL de PBS. Après le dernier lavage, laissez 50 μL de PBS dans le puits.
- Scellez la plaque avec un film adhésif (voir Tableau des matériaux) et conservez-la à l’abri de l’obscurité à 4 °C. L’imagerie doit être effectuée dans les 2 semaines.
10. Imagerie
REMARQUE : L’imagerie doit être réalisée à l’aide d’un microscope à grand champ automatisé; Le microscope doit être équipé d’un étage moteur alimenté par des commandes permettant d’imager automatiquement les zones individuelles de la plaque.
- Vérifiez les réglages de l’autofocus dans les coins de la plaque (puits A1, A24, P24, P1) et au centre.
NOTE: Pour l’imagerie, il est recommandé d’utiliser un objectif de courte distance de travail 20x (voir Tableau des matériaux) avec l’ouverture numérique la plus élevée possible. - Sur la base des histogrammes d’intensité générés par le logiciel d’imagerie en mode Live View, sélectionnez un temps d’exposition suffisamment long pour les canaux de fluorescence individuels afin que l’image résultante ne soit pas sursaturée.
- Définissez le nombre approprié de plans pour l’imagerie sur l’axe z.
REMARQUE: Le champ de vision à un grossissement de 20x est suffisamment grand pour que toutes les cellules ne soient pas dans le même plan de focus, de sorte que la section z doit être effectuée pour afficher toutes les cellules dans leur plan de mise au point correct. Habituellement, cinq avions suffisent. En fonction de la disponibilité de l’espace disque, des piles z individuelles ou uniquement des projections d’intensité maximale peuvent être enregistrées. L’analyse d’image présentée dans la section des résultats représentatifs est basée sur des projections d’intensité maximale. - Sélectionnez le nombre approprié de champs de vision à afficher par puits.
REMARQUE: Selon la confluence, environ 60-300 cellules peuvent être imagées dans un champ de vision. Typiquement, pour les cellules HeLa avec une confluence de 60% à 90%, l’imagerie à cinq champs de vision permettra d’analyser de 500 cellules à plus de 1 000 cellules. - Sélectionnez les puits à imager et lancez l’imagerie.
11. Analyse quantitative d’images
REMARQUE: L’analyse quantitative des images acquises peut être effectuée à l’aide d’un logiciel open source tel que Cell Profiler15. Pour la présente étude, l’analyse a été effectuée à l’aide du logiciel ScanR 3.0.0 (voir le tableau des matériaux).
- Démarrez l’analyse en effectuant une correction d’arrière-plan pour toutes les images de tous les canaux de fluorescence. En fonction de la taille des objets analysés, sélectionnez la taille de filtre appropriée : 80 pixels pour les noyaux cellulaires et 4 pixels pour les taches BrdU et ADNmt.
- Commencez à segmenter l’image en créant un masque de l’objet principal basé sur le rapport de l’intensité du signal de fluorescence à l’arrière-plan du canal correspondant aux noyaux cellulaires.
- Créez des masques pour les sous-objets représentant respectivement les taches BrdU et ADNmt, en utilisant les canaux de fluorescence appropriés pour les structures données.
Remarque : Chaque sous-objet est affecté à l’objet principal le plus proche (noyau de cellule). - Définissez les paramètres à mesurer pendant l’analyse et mesurez l’intensité des pixels individuels dans chaque masque pour tous les canaux de fluorescence.
NOTE: Il est également nécessaire de calculer le nombre de sous-objets affectés à un noyau cellulaire donné et l’aire de chaque sous-objet. - Définissez les paramètres dérivés à calculer en fonction des données obtenues. Pour obtenir les intensités de fluorescence totales pour le canal BrdU ou ADNmt, additionnez les intensités de tous les sous-objets assignés à un noyau cellulaire donné. Pour obtenir l’intensité moyenne de fluorescence, divisez l’intensité totale de fluorescence par la somme de l’aire des sous-objets affectés à un noyau cellulaire donné.
REMARQUE: Pour s’assurer que le sous-objet créé (BrdU ou tache d’ADNmt) est réellement situé dans les mitochondries, il est nécessaire de les ouvrir en fonction de l’intensité de fluorescence du colorant de suivi des mitochondries. - Effectuez une analyse plus approfondie des données obtenues avec le logiciel ScanR à l’aide du logiciel statistique R 4.2.216 avec les packages suivants : dplyr 17, data.table 18, ggplot219 et ggpubr20. Cette étape est facultative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un schéma de la procédure pour l’étude à haut débit de la dynamique de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt est présenté à la figure 1. L’utilisation d’un format de plaque multipuits permet l’analyse simultanée de nombreuses conditions expérimentales différentes, telles que le silençage de différents gènes à l’aide d’une bibliothèque de siRNA. Les conditions utilisées pour le marquage des molécules d’ADN nouvellement synthétisées avec BrdU permettent la détection de l’ADN marqué BrdU dans les mitochondries des cellules HeLa (Figure 2A) mais peuvent également être utilisées comme conditions de départ pour la mise en place du test pour d’autres types de cellules. Le temps d’incubation avec BrdU doit être sélectionné pour les lignées cellulaires individuelles sur la base d’une expérience temporelle (figure supplémentaire 1). Dans la présente étude, des cellules HeLa ont été utilisées, car le criblage des siRNA nécessite des cellules qui peuvent être transfectées avec une grande efficacité. Il est important de noter que le signal obtenu avec les anticorps anti-BrdU est spécifique, car il ne peut être observé que dans les cellules traitées avec BrdU (Figure 2). Les spécificités du marquage anti-BrdU et anti-ADN ont été confirmées à l’aide de cellules rho0 dépourvues d’ADN mitochondrial21 (Figure supplémentaire 2). Comme prévu, dans ces cellules, quel que soit le traitement par BrdU, aucun signal n’a été détecté dans les mitochondries pour les anticorps anti-BrdU ou anti-ADN (Figure 2B). La quantification du signal fluorescent des anticorps anti-BrdU a indiqué que les cellules rho0 traitées avec BrdU présentaient le même faible niveau de fluorescence que les cellules BrdU non traitées, tandis que le signal pour les lignées parentales A549 et HeLa était, en moyenne, 50 fois plus élevé (Figure 2C).
Afin de montrer l’utilité de la méthode présentée ici dans l’étude de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial, une expérience a été menée dans laquelle les cellules HeLa ont été traitées avec de la 2′,3′-didésoxycytidine (ddC), un inhibiteur de la synthèse de l’ADNmt22, et l’expression de gènes connus pour être essentiels à la réplication de l’ADNmt a été réduite au silence avec siRNA (Figure 3). Le traitement des cellules avec ddC a conduit à l’inhibition complète de l’incorporation de BrdU, tandis que les siRNA utilisés ont eu des effets variés. La régulation négative de l’hélicase Twinkle (TWNK)23 a conduit à l’inhibition la plus puissante de l’incorporation de BrdU; un effet plus faible a été observé pour la protéine TFAM24, tandis que le silençage de l’ADN polymérase gamma mitochondriale (POLG)25 a entraîné une diminution modérée de l’incorporation de BrdU par rapport aux cellules traitées avec un siRNA témoin négatif (Figure 3A,B). L’utilisation d’anticorps anti-ADN dans la procédure permet de surveiller la distribution de l’ADNmt dans la cellule dans les conditions expérimentales données. La régulation négative de la TFAM a entraîné des changements drastiques dans la distribution de l’ADNmt; moins de taches d’ADNmt ont été détectées par rapport aux cellules témoins, mais celles qui restaient avaient une intensité de fluorescence très élevée (Figure 3A). La quantification du signal de fluorescence moyen de l’anticorps anti-ADN a montré une augmentation de plusieurs fois lors du silençage TFAM par rapport aux autres conditions testées (Figure 3C).
La spécificité des résultats d’imagerie a été vérifiée en mesurant les niveaux d’ADNmt et d’expression génique à l’aide de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) (Figure 4). La méthode a été décrite en détail ailleurs26. Le traitement par ddC a entraîné une très forte diminution des taux d’ADNmt; un effet plus faible a été observé dans le cas du silençage TFAM et TWNK, tandis que la transfection de cellules avec POLG siRNA a eu un effet très modeste sur le nombre de copies d’ADNmt (Figure 4A). La quantification de l’expression TFAM et TWNK a confirmé une réduction efficace de leur expression à ~15%-20% des niveaux de contrôle, contrairement à POLG, dont l’expression au niveau de l’ARNm a été réduite à 30% (Figure 4B).
Figure 1 : Représentation schématique des étapes du protocole. Les barres d’échelle pour les images microscopiques sont de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Détection spécifique de l’incorporation de BrdU dans l’ADNmt par les anticorps anti-BrdU. Images d’échantillons de cellules (A) HeLa et (B) A549 et A549 rho0 soumises à une coloration par immunofluorescence avec des anticorps anti-BrdU (vert) et anti-ADN (rouge). Les cellules ont été traitées ou non avec la solution BrdU. L’ADN nucléaire (bleu) a été marqué avec Hoechst, et les mitochondries (cyan) ont été visualisées avec un colorant de suivi des mitochondries. Une image fusionnée des quatre canaux de fluorescence est montrée. La barre d’échelle représente 10 μm. (C) Le résultat de la quantification du signal des anticorps anti-BrdU. L’analyse a été effectuée pour quatre réplicats biologiques indépendants; chaque fois, 100 cellules choisies au hasard ont été analysées pour chaque condition expérimentale (N = 400 cellules). En moyenne, 18 foyers BrdU ont été détectés par cellule. Les cases représentent les premier et troisième quartiles de l’intervalle interquartile (IQR), la médiane est représentée par une ligne horizontale, les moustaches définissent le minimum et le maximum, et les valeurs aberrantes sont définies comme 1,5 x IQR. Un test statistique de Kruskal-Wallis a été effectué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats de l’inhibition de la synthèse de l’ADNmt, y compris la réduction de l’efficacité de l’incorporation de BrdU et l’affectation de la distribution des nucléoïdes. (A) Images de fluorescence d’échantillons de cellules HeLa traitées pendant 72 h avec du ddC ou du siRNA, qui régulent à la baisse les protéines impliquées dans la réplication de l’ADNmt. Les cellules ont été traitées avec BrdU pendant 16 h avant la fixation. L’ADN nucléaire (bleu) a été coloré avec Hoechst, des anticorps anti-BrdU (vert) et anti-ADN (rouge) ont été utilisés, et les mitochondries ont été marquées avec un colorant de suivi des mitochondries. Une image fusionnée des quatre canaux de fluorescence est montrée. La barre d’échelle représente 10 μm. (B,C) Quantification des signaux de fluorescence des anticorps anti-BrdU et (C) anti-ADN. L’analyse a été effectuée pour quatre réplicats biologiques indépendants; chaque fois, 650 cellules choisies au hasard ont été analysées pour chaque condition expérimentale (N = 2 600 cellules). En moyenne, 18 foyers BrdU et 46 foyers d’ADNmt ont été détectés par cellule. Les cases représentent les premier et troisième quartiles de l’intervalle interquartile (IQR), la médiane est représentée par une ligne horizontale, les moustaches définissent le minimum et le maximum, et les valeurs aberrantes sont définies comme 1,5 x IQR. Un test statistique de Kruskal-Wallis a été effectué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Validation de l’efficacité de l’inhibition de la synthèse de l’ADNmt et de l’efficacité des siRNA testés. Les cellules HeLa ont été traitées pendant 72 heures avec du ddC ou les siRNA indiqués, puis soumises à un isolement d’ADN et d’ARN. (A) Résultats de l’analyse du niveau d’ADNmt par qPCR. (B) analyse qPCR des changements d’expression génique dans les conditions indiquées. Les barres représentent les valeurs moyennes de quatre réplicats biologiques indépendants; les barres d’erreur représentent le MEB ; un test statistique de l’ANOVA a été effectué; un test t a été effectué pour la comparaison par paires avec des échantillons Untr (non traités). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1: Dynamique de l’incorporation de BrdU dans l’ADNmt des cellules HeLa. Les résultats d’une expérience chronologique dans laquelle les cellules ont été incubées avec 20 μM BrdU pendant un temps donné sont présentés. Les moyennes de quatre répétitions indépendantes pour chaque point temporel sont représentées; 900 cellules sélectionnées au hasard ont été analysées dans chaque répétition. Les barres représentent les moyennes de quatre répétitions; un test statistique de l’ANOVA a été effectué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Validation des cellules A549 rho0. (A) Analyse électrophorétique des produits qPCR à partir de fragments d’ADN amplifiants des gènes ND1 codés par ADNmt et B2M codés par l’ADN nucléaire. L’ADN total des cellules A549 ou A549 rho0 a été utilisé comme modèle dans la réaction. (B) Résultats de l’analyse du niveau d’ADNmt par qPCR. Les barres représentent les valeurs moyennes de quatre réplicats biologiques indépendants; les barres d’erreur représentent le MEB ; Un test T a été effectué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historiquement, le marquage de l’ADN par incorporation BrdU et la détection d’anticorps a été utilisé dans la réplication de l’ADN nucléaire et la recherche sur le cycle cellulaire 14,27,28. Jusqu’à présent, tous les protocoles de détection de l’ADN marqué BrdU ont inclus une étape de dénaturation de l’ADN (acide ou thermique) ou de digestion enzymatique (DNase ou protéinase) pour permettre l’exposition des épitopes et faciliter la pénétration des anticorps. Ces protocoles ont été développés pour l’ADN nucléaire serré. Cependant, l’organisation différente de l’ADNmt a permis le développement d’une procédure sans l’étape de dénaturation; Cela a simplifié la procédure et l’a rendue plus adaptée aux applications à haut débit. Cette approche a donné d’excellents résultats car l’omission de l’étape de dénaturation entraîne la détection de l’ADN marqué BrdU uniquement en dehors du noyau (Figure 2 et Figure 3). Par conséquent, le signal fort de l’ADN nucléaire, qui est toujours présent lorsqu’une étape de dénaturation est incluse et qui peut causer un grave problème en masquant le signal del’ADNmt 29 marqué BrdU, peut être évité avec ce protocole. De plus, l’absence de dénaturation sévère assure une meilleure préservation des structures cellulaires et n’affecte pas l’efficacité de la coloration par des colorants fluorescents tels que Hoechst ou un colorant de suivi des mitochondries (Figure 2 et Figure 3).
La dynamique de l’incorporation de BrdU dans l’ADNmt dépend de la lignée cellulaire. Il est recommandé de faire une expérience temporelle sur l’incorporation de BrdU chaque fois que vous utilisez une nouvelle lignée cellulaire. Cette étude a établi 16 h comme temps d’incubation BrdU optimal pour les lignées cellulaires HeLa. Cependant, en raison de la variation biologique des lignées HeLa de différents laboratoires30, il est suggéré d’effectuer une expérience BrdU sur la variante particulière de HeLa avec laquelle on prévoit de travailler.
La combinaison du marquage anti-BrdU et anti-ADN dans ce protocole permet de surveiller la synthèse de l’ADNmt et d’étudier simultanément la distribution de l’ADNmt dans la cellule. Cela peut être très bien vu dans les cellules silencieuses de TFAM (Figure 3). La diminution du niveau de TFAM entraîne une réduction de la synthèse de l’ADNmt (une diminution du signal anti-BrdU total) et le regroupement des nucléoïdes mitochondriaux, qui se manifeste par une augmentation substantielle du signal moyen de fluorescence de l’ADNmt (Figure 3). Il convient de noter que, dans ce cas, l’augmentation de l’intensité moyenne de fluorescence de l’ADNmt est causée par la distribution modifiée des nucléoïdes mitochondriaux et ne reflète pas la régulation positive des niveaux d’ADNmt; en fait, les niveaux d’ADNmt sont réduits, comme le révèle l’analyse quantitative par PCR (Figure 4A). Des résultats surprenants ont été obtenus pour les cellules transfectées avec POLG siRNA (Figure 3). On pourrait s’attendre à ce que la transfection de cellules avec POLG ciblant siRNA, qui est l’ADN polymérase réplicative dans les mitochondries, réduise considérablement l’incorporation de BrdU dans l’ADNmt. Cependant, dans cette étude, l’effet sur l’incorporation de BrdU était négligeable (Figure 3), comme le confirme la mesure des niveaux d’ADNmt à l’aide de la qPCR (Figure 4A). La mauvaise régulation négative de l’expression de POLG peut expliquer ce résultat apparemment contradictoire lors de la transfection de cellules avec le siRNA appliqué (Figure 4B). Cela met en évidence un inconvénient potentiel de l’utilisation de siRNA pour les études fonctionnelles et suggère qu’il est nécessaire de valider le silençage génique.
Dans l’ensemble, un test pour étudier la dynamique du métabolisme de l’ADNmt dans les cellules en culture a été développé qui utilise un format de plaque multipuits et une imagerie par immunofluorescence pour détecter et quantifier la réplication, la réparation et la distribution de l’ADNmt. La méthode permet l’étude simultanée de nombreuses conditions expérimentales différentes. Il peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs, stress cellulaires et silençage génique sur le métabolisme de l’ADNmt. Bien que le test ait un potentiel élevé d’utilisation dans l’étude du métabolisme de l’ADNmt dans divers contextes physiologiques et pathologiques, il convient de noter que le test ne permet pas de distinguer la réplication et la synthèse de l’ADNmt liée à la réparation. Cela devrait être pris en compte lors de l’interprétation des résultats et de la planification des expériences fonctionnelles ultérieures. Notamment, le test a un potentiel de développement supplémentaire. Par exemple, les nucléoïdes mitochondriaux inactifs (ou inactifs en réparation) ne sont pas détectés avec les anticorps anti-BrdU. Par conséquent, l’application d’anticorps anti-ADN permet de quantifier les niveaux d’état de l’ADNmt, le nombre de nucléoïdes silencieux de réplication et la distribution des nucléoïdes dans la cellule.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Centre national des sciences, Pologne (numéro de subvention/bourse: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
