Summary
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Genom-Editierung in aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Makrophagen unter Verwendung von Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in vitro zusammengesetzt und durch Elektroporation verabreicht werden.
Abstract
Aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMDMs) von Mäusen sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der komplexen Biologie von Gewebemakrophagen. Als Primärzellen modellieren sie die Physiologie von Makrophagen in vivo genauer als immortalisierte Makrophagen-Zelllinien und können von Mäusen abgeleitet werden, die bereits definierte genetische Veränderungen tragen. Die Störung der Genfunktion in BMDMs ist jedoch nach wie vor eine technische Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll für die effiziente CRISPR/Cas9-Genom-Editierung in BMDMs zur Verfügung, das die Einführung kleiner Insertionen und Deletionen (Indels) ermöglicht, die zu Frameshift-Mutationen führen, die die Genfunktion stören. Das Protokoll beschreibt, wie Single-Guide-RNAs (sgRNA-Cas9) synthetisiert und gereinigte sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe (RNPs) gebildet werden, die durch Elektroporation verabreicht werden können. Es bietet auch eine effiziente Methode zur Überwachung der Bearbeitungseffizienz mithilfe der routinemäßigen Sanger-Sequenzierung und eines frei verfügbaren Online-Analyseprogramms. Das Protokoll kann innerhalb von 1 Woche durchgeführt werden und erfordert keine Plasmidkonstruktion; Dies führt in der Regel zu einer Bearbeitungseffizienz von 85 % bis 95 %.
Introduction
Makrophagen sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die eine entscheidende Rolle bei der Gewebereparatur und Immunität spielen 1,2. Immortalisierte Makrophagen-Zelllinien, wie z. B. RAW 264.7-Zellen der Maus oder menschliche THP-1-Zellen, haben mehrere vorteilhafte Eigenschaften, darunter robustes Wachstum und einfache Genstörung durch die Bereitstellung von Vektoren für RNA-Interferenz oder CRISPR/Cas9 3,4. Die onkogene Transformation verändert jedoch dramatisch ihre Physiologie, was zu einer abnormen Aktivierung einiger Signalwege und zu gedämpften Reaktionen anderer führt 5,6. Primäre aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) rekapitulieren die Physiologie der Makrophagen in vivo genauer, sind aber aufgrund der geringen Effizienz sowohl der Plasmidtransfektion als auch der viralen Transduktion in diesen primären Immunzellen nach wie vor schwierig genetisch zu manipulieren 7,8. Daher werden effizientere Methoden zur Störung der Genfunktion benötigt.
Die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genetischen Manipulation in einer Reihe biologischer Systeme, einschließlich Säugetierzellen 9,10,11,12. Das Cas9-Protein von Streptococcus pyogenes spaltet effizient und spezifisch doppelsträngige DNA, wenn es mit einer sequenzspezifischen Leit-RNA komplexiert wird. Die DNA-Reparatur durch die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) der gespaltenen DNA führt zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels), die Frameshift-Mutationen erzeugen. In frühen Studien wurden Cas9 und sgRNAs über Plasmid- oder lentivirale Vektoren verabreicht, die für viele Zelllinien effektive Verabreichungsmethoden darstellen 9,10. Primärzellen und insbesondere primäre Immunzellen sind jedoch aufgrund der geringen Effizienz der Vektorverabreichung durch Transfektion oder Transduktion oft refraktär gegenüber diesen Methoden. In der Folge wurden Methoden entwickelt, um sgRNA-Cas9-Komplexe in vitro zu erzeugen und über Elektroporation zu verabreichen, und diese Methoden haben in einer Vielzahl von Zelltypen eine hohe Effizienz erreicht13,14. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Ansatz für die Genom-Editierung in primären Makrophagen verwendet werden kann.
Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexen (RNPs) zur Durchführung von Genom-Editierung in primären BMDMs zur Verfügung. Es enthält Schritte, um die Aktivierung der in primären Immunzellen vorhandenen Immunsensoren zu mildern, und führt zu einer bis zu 95%igen Editierung an Zielorten mit minimaler Toxizität. Dieses Protokoll umfasst auch Arbeitsabläufe zur Bewertung der Bearbeitungseffizienz mithilfe der routinemäßigen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der Sanger-Sequenzierung, gefolgt von der In-silico-Analyse durch Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, ein gut validiertes Online-Software-Tool.
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Protocol
1. sgRNA-Design
HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Auswahl der Zielsequenzen und das Design der sgRNAs. Es ist hilfreich, Leitfäden zu entwerfen, die sich im ersten großen kodierenden Exon befinden, so dass jedes translatierte Protein früh im offenen Leserahmen gestört wird. Es ist auch hilfreich, Zielsequenzen auszuwählen, die innerhalb desselben Exons liegen, da dies die Analyse der Bearbeitungseffizienz rationalisiert (Schritt 6). Die Beispiele für Genom-Editierung, die mit diesem Protokoll zur Verfügung gestellt wurden, verwendeten sgRNAs, die auf das erste Exon des Src-Gens und des Cblb-Gens sowie auf den nicht-kodierenden Rosa26-Locus des Mausgenoms abzielen.
- Identifizieren Sie 20 Nukleotid-Genomsequenzen, die Sie mit einem von mehreren kostenlosen Online-Design-Tools anvisieren möchten (Tabelle 1). Wählen Sie vier bis fünf Guides aus, die sich innerhalb jedes Gens nicht überlappen, da die Cas9-Aktivität je nach gewähltem Guide variiert und eine A-priori-Vorhersage eines hochaktiven Guides nicht möglich ist.
HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Ausrichtung der Führung in Bezug auf die Sequenz des Zielortes sicherzustellen. Design-Tools liefern die Leitsequenz in der Regel in einer Ausrichtung von 5' bis 3', unabhängig davon, welcher Chromosomenstrang anvisiert wird. Um die Strangorientierung zu überprüfen, überprüfen Sie, ob eine Protospacer-Adjacent Motif (PAM)-Sequenz für S. pyogenes Cas9 (nGG) unmittelbar 3' der anvisierten genomischen Sequenz vorhanden ist. Die sgRNA-Sequenz enthält das PAM nicht.
2. sgRNA-Synthese
HINWEIS: In diesem Schritt wird beschrieben, wie sgRNAs mithilfe von PCR synthetisiert werden, um eine Vorlage für die In-vitro-Transkription (IVT) zu generieren, und wie die sgRNA dann mithilfe von Spinsäulen gereinigt wird (Abbildung 1A). Benutzerdefinierte synthetische sgRNAs sind als Alternative zu PCR/IVT über verschiedene Anbieter im Handel erhältlich.
- Führen Sie eine PCR durch, um die IVT-Vorlage für die T7-RNA-Polymerase zu generieren. Für die PCR-Reaktion werden universelle Primer verwendet, die einen T7-RNA-Polymerase-Promotor und eine transaktivierende CRISPR-RNA (tracrRNA)-Sequenz enthalten (Tabelle 2), zusätzlich zu kurzen Einzelprimern mit der genspezifischen Leitsequenz.
- Dies ist der nicht verstärkende Überlappungserweiterungsschritt. Verdünnen Sie den PCR-Puffer auf 1x und fügen Sie zusätzlich 1 mM MgCl2 hinzu. Dann werden 0,25 μl High-Fidelity-DNA-Polymerase, 0,5 mM Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP), 0,02 mM guide-spezifischer Primer und 0,02 mM T7 Reverse Long Universal Primer (Tabelle 2) zu einem Gesamtvolumen von 46 μl zugegeben. Legen Sie dann das Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie zwei Zyklen durch: 95 °C für 15 s, 37 °C für 15 s und 72 °C für 15 s. Kühlen Sie die Reaktionen auf Eis.
- Dies ist der PCR-Amplifikationsschritt. Zu jeder Reaktion werden 2 μl 25 mM Vorwärtsamplifikationsprimer und 2 μl 25 mM Rückwärtsamplifikationsprimer zugegeben. Das endgültige Reaktionsvolumen beträgt 50 μl. Denaturierung für 30 s bei 95 °C. Führen Sie dann 35 Zyklen durch: 95 °C für 15 s, 65 °C für 20 s und 72 °C für 15 s. Eine zusätzliche Verlängerung bei 72 °C für 2 Minuten durchführen.
- Überprüfen Sie das PCR-Reaktionsprodukt auf einem 2%igen Agarose-Gel. Die Überlappungs-Extensions-PCR führt zu einem 127 bp dsDNA-Molekül mit dem T7-Promotor stromaufwärts des genspezifischen 20-Nukleotid-Leitfadens und der tracrRNA unmittelbar stromabwärts (Abbildung 1B).
- IVT-Template-Reinigung: Es gibt zahlreiche Protokolle und Kits, die dafür gut funktionieren. Bei diesem Protokoll werden SPRI-Kügelchen (Solid Phase Reversible Immobilization) verwendet. Mischen Sie 50 μl des PCR-Produkts mit 90 μl Kügelchen und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Die DNA wird durch Zugabe von 40 μl Puffer (5 mM Tris, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) eluiert und 5 Minuten lang bei 65 °C erhitzt.
- Messen Sie die DNA-Konzentration des IVT-Templates unter Verwendung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm. Für die IVT ist eine DNA-Konzentration von mindestens 50 ng/μl erforderlich. Die IVT-Schablone kann bei -20 °C gelagert werden.
- IVT-Reaktion
- Verwenden Sie ein handelsübliches Kit, das für die Herstellung hoher IVT-Ausbeuten entwickelt wurde (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers, um die IVT-Reaktion durchzuführen. Unter Verwendung von 250 ng IVT-Template in einer 20-μl-Reaktion bei 37 °C für 4-16 h inkubieren.
- Überprüfen Sie das IVT-sgRNA-Produkt, indem Sie 1 μl der Reaktion auf ein 2%iges Agarose-Gel auftragen. Es sollte eine helle RNA-Bande beobachtet werden, die ähnlich wie 70 bp dsDNA verläuft (Abbildung 1C). Um scharfe und besser aufgelöste Banden zu erhalten, verwenden Sie einen RNA-Probenpuffer mit Harnstoff und denaturieren Sie die Probe bei 65 °C für 5 Minuten vor dem Laden, um scharfe und besser aufgelöste Banden zu erhalten.
ANMERKUNG: Schwache Banden mit höherem Molekulargewicht und leichte Migrationsunterschiede können bei einigen Leit-RNAs aufgrund von Unterschieden in der RNA-Sekundärstruktur beobachtet werden.
- Dephosphorylieren Sie das sgRNA-IVT-Produkt, um die Aktivierung von RIG-I (einem fremden RNA-Sensor) und den anschließenden Zelltod nach der Elektroporation zu minimieren. Für jede 20-μl-IVT-Reaktion werden 69 μl Wasser in molekularer Qualität und 15 U Kälbertarmphosphatase (CIP) in 1x CIP-Puffer zugegeben. 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Degradieren Sie die IVT-Vorlage, um die Aktivierung zellulärer DNA-Sensoren zu minimieren, die den Zelltod nach der Elektroporation auslösen. Zu jeder IVT-Reaktion werden 2 E RNase-freie DNase hinzugefügt. 15 min bei 37 °C inkubieren. Das IVT-Produkt kann bei -20 °C für 1 Tag oder -80 °C für mehrere Monate gelagert werden.
- Reinigen Sie das IVT-Produkt mit Hilfe von Schleudersäulen. Für diesen Schritt sind SPRI-Bead-Reinigungskits minderwertig.
- Binden Sie die RNA an die Säule, indem Sie 220 μl Bindungspuffer zum IVT-Produkt hinzufügen, gefolgt von 1 ml 100 % molekularbiologischem Ethanol. Gut mischen und die Säule beladen. Befolgen Sie danach die Anweisungen des Herstellers. Führen Sie die letzte Wäsche in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank durch, um eine Kontamination der sgRNA zu vermeiden.
- Führen Sie die Elution in der Laminar-Flow-Haube durch, um eine Kontamination zu vermeiden. Die RNA wird mit 30 μl sterilem 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0) eluiert.
- Messen Sie die Konzentration von sgRNA, indem Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm messen.
HINWEIS: Typische sgRNA-Ausbeuten liegen bei mindestens 100 μg. - Lagern Sie die sgRNA bei -80 °C. Stellen Sie Aliquots her, um mehr als drei Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden.
3. Vorbereitung für die Elektroporation
HINWEIS: Alle Schritte sollten in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Dieses Protokoll verwendet ein kommerziell erhältliches Elektroporationssystem (siehe Materialtabelle) mit 10-μl-Spitzen.
- Tauen Sie die BMDMs 48-72 h vor Gebrauch auf und expandieren Sie sie auf mit Nicht-Gewebekulturen (TC) behandelten Platten.
HINWEIS: Pro Reaktion werden 4 x 105 Zellen benötigt. - Sterilisieren Sie PCR-Röhrchen für die Reaktionsmontage. Bereiten Sie ein PCR-Röhrchen pro Reaktion vor und erhitzen Sie es in einem Thermocycler 10 Minuten lang bei 98 °C. Bereiten Sie die Röhrchen chargenweise vor und lagern Sie sie verschlossen. Legen Sie die sterilisierten PCR-Röhrchen auf Eis, wenn sie gebrauchsfertig sind.
- Reinigen Sie die Pipettenstation mit 70%igem Ethanol und setzen Sie sie in die Laminar-Flow-Haube ein. Stellen Sie die Parameter auf 1.900 V, 20 ms und einen Impuls ein.
- Nehmen Sie ein Transfektionsröhrchen vorsichtig aus der Verpackung, um es steril zu halten, und füllen Sie es mit 3 ml "E"-Puffer. Stellen Sie sicher, dass der E-Puffer vor der Elektroporation Raumtemperatur hat. Führen Sie den Schlauch in die Station ein und drücken Sie ihn nach unten, bis er einrastet.
- Für jede Reaktion werden 2,5 μl sgRNA in einer Konzentration von 1.100 ng/μl aliquotiert. Verdünnen Sie die sgRNA in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,9 mM CaCl2und 0,5 mM MgCl2( PBS + Ca/Mg). Auf Eis lassen.
- Bereiten Sie zwei Platten vor: eine unbeschichtete 12-Well-Platte für die Zellen und eine zusätzliche 24-Well-Platte für die Nährmedien. Aliquotieren Sie 1,5 ml antibiotikafreies Medium pro Reaktion in die Vertiefungen der 24-Well-Platte.
- Bereiten Sie Cas9-Protein vor. Es gibt mehrere kommerzielle und akademische Anbieter von steril gereinigtem Cas9-Protein. Cas9 wird mit kaltem PBS + Ca/Mg auf eine Endkonzentration von 20 μM verdünnt. Für jede Elektroporationsreaktion wird 1 μl 20 μM Cas9 in sterile PCR-Röhrchen aliquotiert. Auf Eis lassen.
- Bereiten Sie die Zellen auf die Elektroporation vor.
- Entferne das Nährmedium. Waschen Sie die Zellen mit PBS ohne CaCl2 und MgCl2 (PBS-Ca/Mg), um das Serum und zweiwertige Kationen zu entfernen, die die Adhäsion fördern. Dann PBS + 1 mM EDTA zugeben und bei Raumtemperatur ca. 5 min inkubieren, bis sich die Zellen zu lösen beginnen.
- Pipettieren Sie vorsichtig nach oben und unten, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Pelletieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 Minuten.
HINWEIS: Makrophagen haften an Kunststoffwaren. Durch den Einsatz von Zentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung wird die Zellausbeute deutlich verbessert. - Arbeiten Sie schnell, um eine längere Inkubation von Zellen in PBS + EDTA zu vermeiden. Entfernen Sie den größten Teil des Überstandes und lassen Sie etwa 1 ml Überstand im Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen im verbleibenden Überstand und überführen Sie sie dann in ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.
- Entferne ein kleines Aliquot von Zellen, die gezählt werden sollen. Die restlichen Zellen werden durch Zentrifugieren bei 500 x g bei Raumtemperatur für 5 Minuten pelletiert.
- Zählen Sie während der Zentrifugation die Zellen und erwärmen Sie die Cas9- und sgRNA-Röhrchen auf Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den gesamten Überstand aus dem Zellpellet. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS + Ca/Mg in einer Konzentration von 4 x 107 Zellen/ml (4 x 105 Zellen pro 10 μl Reaktion).
HINWEIS: Jedes Kit wird mit einer begrenzten Menge an Elektroporationspuffer (Buffer R, Buffer T) geliefert. Wir stellen jedoch fest, dass die Elektroporationseffizienz unter Verwendung von PBS + Ca/Mg äquivalent zu den proprietären Puffern ist. - Bei der Elektroporation von sgRNAs für verschiedene Gene werden die Zellen für jedes Gen in verschiedene Röhrchen mit geringer Proteinbindung aliquotiert, um eine Kreuzkontamination zwischen den sgRNAs zu vermeiden. Bewahren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf, bis sie für die Elektroporation bereit sind.
4. RNP-Bestückung
- Bewahren Sie die sgRNA und Cas9 bei Raumtemperatur auf, um eine Ausfällung zu vermeiden. Geben Sie 2,5 μl sgRNA zu 1 μl des verdünnten Cas9 in sterilisierten PCR-Röhrchen. Geben Sie die sgRNA langsam über 15 s ab und mischen Sie sie, um eine Ausfällung zu verhindern.
- 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bildung des RNP-Komplexes zu ermöglichen.
5. RNP-Lieferung durch Elektroporation
- Bereiten Sie die Elektroporationsspitze (Küvette) vor. Drücken Sie den Kolben, um den Schaft zu verlängern. Stecken Sie den Stiel in die Spitze.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze fest sitzt und dass der Kolben sanft gleitet und über die Spitzenscheide hinausragt. Wenn die Spitze nicht richtig positioniert ist, können Luftblasen in die Spitze gelangen, was zu einem Versagen der Spitze führen kann. - Resuspendieren Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren und laden Sie dann die Elektroporationsspitze mit den Zellen. Ziehen Sie die volle Volumenkapazität von 10 μl aus der Spitze heraus und vermeiden Sie Blasenbildung.
- Beginnend mit der Negativkontroll-sgRNA werden 10 μl Zellen in der Elektroporationsspitze in das Probenröhrchen mit 3,5 μl RNP aus Schritt 4 überführt. Dreimal auf- und abpipettieren, um gut zu mischen. Ziehen Sie 10 μl der Mischung zurück in die Spitze und stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind.
- Setzen Sie die Spitze in die Elektroporationsstation ein und senken Sie sie in den Puffer. Vermeiden Sie es, Kunststoffoberflächen mit der Spitze zu berühren, um die Sterilität zu erhalten. Drücken Sie auf dem Touchscreen-Display auf Start .
- Nach Beendigung des Vorgangs zeigt das Display einen erfolgreichen Impuls an. Nehmen Sie die Pipette aus dem Gerät und legen Sie die Zellen in eine trockene Vertiefung der beschrifteten, unbeschichteten 12-Well-Platte.
- Spülen Sie die Spitze ab, indem Sie zweimal 15 ml PBS + Ca/Mg auf und ab pipettieren. Legen Sie die Pipette beiseite, während die Spitze noch aufgesteckt ist. Achten Sie darauf, dass die Spitze nichts berührt und steril bleibt.
HINWEIS: In vielen Experimenten ist es möglich, die Spitze für mehrere Proben wiederzuverwenden, z. B. nach der inaktiven negativen Kontroll-sgRNA-Probe oder während der ersten Auswertungen der Guide-Aktivität, wenn vier bis fünf sgRNAs pro Gen getestet werden und das einzige Auslesen die Editiereffizienz ist. Bei der funktionellen Analyse an editierten Zellen wird jedoch für jedes Gen eine neue Spitze empfohlen, da geringe Mengen an sgRNA oder Zellverschleppung die experimentellen Ergebnisse beeinflussen könnten. - Geben Sie sofort 1 ml antibiotikafreies Medium (in Schritt 3.6 aliquotiert) zu den Zellen und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sie zu mischen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis 5.6 für die restlichen Reaktionen.
- Legen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.
- Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen 1-2 h nach der Elektroporation. Die Zellen sollten zu >90% adhär sein. Optional: Geben Sie 1-2 Stunden nach der Elektroporation Gentamicin (5 μg/ml) zu den Zellen, um eine Kontamination zu vermeiden, wenn dies die nachgeschalteten Experimente nicht stört.
6. Bewertung der Bearbeitungseffizienz
HINWEIS: Die meisten Bearbeitungen sind nach 48 Stunden abgeschlossen.
- Überprüfen Sie die Zellmonoschicht 48 h nach der Elektroporation. Wenn die Zellen zu mehr als 50 % konfluent sind, fahren Sie fort. Wenn die Zellen zu <50% konfluent sind, warten Sie weitere 1-2 Tage. Für die genomische DNA-Analyse zur Bestimmung der Editiereffizienz werden zusätzlich zu den Zellen, die für das nachgeschaltete Experiment benötigt werden, 1 x 105 Zellen benötigt.
- Bereiten Sie genomische DNA (gDNA) vor.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS(-Ca/Mg). Fügen Sie 1 ml PBS + 1 mM EDTA hinzu. Bei Raumtemperatur ca. 5 min inkubieren, bis sich die Zellen von der Platte lösen.
- Lösen Sie die Zellen durch Pipettieren ab. In ein Mikrofugenröhrchen mit geringer Proteinbindung überführen.
- Zählen Sie die Zellen und entfernen Sie ein Aliquot von 1 x 105 Zellen. Die verbleibenden Zellen können für weitere Experimente neu beschichtet werden. In der Regel werden die Experimente 5 Tage nach der Elektroporation durchgeführt, um den Zerfall des Proteins zu ermöglichen.
- Die Zellen für die gDNA-Analyse werden 15 s lang bei maximaler Geschwindigkeit in einem Mikrofugenröhrchen pelletiert.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 50 μl Lysepuffer. Vortex, um alle an den Wänden des Röhrchens haftenden Zellen zu lösen, und 10 Minuten lang bei 98 °C erhitzen, um die Zellen zu lysieren und die endogene DNase zu inaktivieren.
- Lege die Röhrchen auf Eis.
- Fügen Sie 1 μl Proteinase K (20 mg/ml) hinzu. Mindestens 1 Stunde bei 37 °C inkubieren; Der Einfachheit halber kann es über Nacht stehen lassen.
- 10 min auf 98 °C erhitzen, um die Proteinase K zu inaktivieren.
- Bei Raumtemperatur 5 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, der die DNA enthält. Dieses rohe Präparat ohne weitere Reinigung eignet sich gut für die meisten PCR-Reaktionen.
- Bewerten Sie die Bearbeitungseffizienz mit der Sanger-Sequenzierung.
- Entwerfen Sie PCR-Primer 200-300 bp stromaufwärts der meisten 5'-Führungsstellen und 200-300 bp stromabwärts der meisten 3'-Führungsstellen. Die typische Amplikongröße beträgt ~500 bp. Entwerfen Sie einen verschachtelten Sequenzierungsprimer, der mindestens 125 bp von der nächstgelegenen Führungsstelle entfernt ist (Abbildung 2A).
- Führen Sie eine PCR mit 2 μl gDNA durch.
- Bereiten Sie das PCR-Produkt für die Sequenzierung vor. Dieses Protokoll verwendet eine Behandlung mit Exonuklease I/Garnelen-alkalischer Phosphatase (ExoI/SAP). Kommerzielle DNA-Aufreinigungskits funktionieren ebenfalls, erfordern aber mehr praktische Zeit.
- Bereiten Sie 15 μl des PCR-Produkts vor. Fügen Sie 7,5 μl Wasser, 1 μl 10x ExoI-Puffer, 10 U ExoI und 1 U SAP hinzu, um die dNTPs und Primer abzubauen, die die Sanger-Sequenzierung stören.
- Bei 37 °C für 30 Minuten inkubieren, gefolgt von 85 °C für 20 Minuten, um die Enzyme zu deaktivieren.
- Durchführung der Sanger-Sequenzierung des mit Exo/SAP behandelten PCR-Produkts; eine bekannte Menge an DNA-Größenmarker verwenden, um die Größe des in der Probe vorhandenen PCR-Produkts abzuschätzen. Die Sequenzierungsreaktionen müssen möglicherweise optimiert werden, da die TIDE-Software qualitativ hochwertige Sequenzchromatogramme benötigt, um die Bearbeitungseffizienz genau abzuschätzen. Das Sequenzchromatogramm für den uneditierten Locus sollte klare Peaks mit minimalem Hintergrund liefern (Abbildung 2B, C).
- Um die Editiereffizienz abzuschätzen, verwenden Sie TIDE, um die Sanger-Sequenzierungschromatogrammdateien mit der editierten gDNA und der unbearbeiteten Kontroll-gDNA zu analysieren. (Tabelle 1, Abbildung 2). Laden Sie die Sanger-Sequenzierungsdateien hoch und führen Sie die Software mit den Standardeinstellungen aus.
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Representative Results
Bei der IVT-Vorlage handelt es sich um ein 127-bp-PCR-Produkt (Abbildung 1B). Das IVT-Produkt in voller Länge ist eine 98 nt RNA, die ähnlich wie ein 70 bp langes doppelsträngiges DNA-Fragment migriert (Abbildung 1C).
Nach der Elektroporation sollten die Zellen zu >90 % lebensfähig sein, mit einer Gesamtzellzahl von >70 % der Ausgangszellzahl. Der resultierende Pool mutierter Zellen sollte eine Vielzahl von Indels aufweisen, beginnend in der Nähe der Cas9-Spaltstelle. Die Analyse der Zielgene mittels PCR und Sanger-Sequenzierung sollte mehrere Nukleotide an jeder Position stromabwärts der Cas9-Spaltstelle zeigen (Abbildung 2).
Abbildung 1: Überblick über den sgRNA-Cas9-Editierungsprozess. (A) Schematische Darstellung des Leitfadendesigns, der sgRNA-Generierung und der Cas9-sgRNA-Verabreichung. (B) Das PCR-Produkt aus IVT für die Src-sgRNAs 1, 2 und 3 löste sich auf einem 2%igen Agarose-Gel auf. Der Pfeil zeigt die korrekten 127 bp PCR-Produkte an. (C) Die RNA-Produkte nach IVT für die Src-sgRNAs 1, 2 und 3 lösten sich in einem 2%igen Agarose-Gel auf. Die Klammern zeigen die korrekten sgRNA-Produkte an. Die variable Migration der sgRNA ist auf die Sekundärstruktur der RNA zurückzuführen. Diese Abbildung ist ein Nachdruck aus der Masterarbeit des Erstautors16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Hohe Editiereffizienz für mehrere Zielgene. (A) Schematische Darstellung von PCR- und Sanger-Sequenzierungsprimern. (B) Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs für TIDE zur Bewertung der Bearbeitungseffizienz. (C) Repräsentatives Sanger-Sequenzierchromatogramm des ROSA26-Locus aus BMDMs, die mit einer Kontroll-nicht-zielgerichteten sgRNA-Cas9 RNP (oben) und ROSA26-spezifischer sgRNA (unten) elektroporiert wurden; die Cas9-Spaltstelle ist hervorgehoben. Die TIDE-Ausgabe (rechts) mit der berechneten Bearbeitungseffizienz und dem Prozentsatz der Sequenzen, die die angegebene Anzahl von Indels enthalten. (D,E) Sanger-Sequenzierung von Chromatogrammen der (D) Src- und Cblb-Gene in den editierten BMDMs. Diese Abbildung ist ein Nachdruck aus der Masterarbeit des Erstautors16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Moderate Steigerung der Bearbeitungseffizienz durch den kommerziellen Elektroporationsverstärker. Die BMDMs wurden mit Schablonen mit niedrigem Wirkungsgrad elektroporiert, um die Wirkung eines kommerziellen Editierverstärkers zu bewerten. Vor der Elektroporation wurde 1 μl des Enhancers zu den assemblierten RNPs bis zu einer Endkonzentration von 4 μM zugegeben. Die Editiereffizienz der indizierten Src-sgRNA wurde mit Hilfe von TIDE evaluiert. Diese Abbildung ist ein Nachdruck aus der Masterarbeit des Erstautors16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name des Werkzeugs | Internetadresse | ||
| Synthego - CRISPR-Design-Tool | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Das breite Institut - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Spurensuche von Indels durch Zersetzung (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tabelle 1: URLs von Online-Tools.
| Name des Primers | Reihenfolge | ||
| Leitfaden-spezifischer Primer | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Führungsspezifische Grundierung - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Leitfaden-spezifischer Primer - Cbl-b Guide 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Leitfaden-spezifischer Primer - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGAAGATgttttagagctagaa | ||
| Guide-spezifischer Primer - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Guide-spezifischer Primer - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Führungsspezifische Grundierung - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Führungsspezifische Grundierung - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 Reverse Long Universal Primer | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgaagttgaacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| Universeller Forward Amplification Primer | ggatcctaatacactcactatag | ||
| Universeller Reverse-Amplification-Primer | aaagcaccgactcgg | ||
Tabelle 2: Oligonukleotide, die in der PCR verwendet werden, um das Template für die IVT der sgRNA zu generieren. Die 20 Nukleotid-Zielsequenzen für genspezifische Primer werden großgeschrieben.
| BMDM Nährmedien. Bei 4 °C lagern. | |||
| DMEM | |||
| Fötales Kälberserum | 0.1 | ||
| L-Glutamin | 0,2 Mio. | ||
| MCSF-Überstand aus 3T3-MCSF-Zellen** | 0.1 | ||
| Natriumpyruvat | 11 mg/ml | ||
| Lyse-Puffer. Bei 4 °C lagern. | |||
| 2-Mercaptoethanol (unmittelbar vor Gebrauch zugeben) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 mM | ||
| Tris | 20 mM | ||
| Triton-X 100 | 0.005 | ||
| **3T3-MCSF-Zellen werden in DMEM+10% FCS gezüchtet. Supernatent mit MCSF wird am 5. Tag nach Erreichen von 100% Konfluenz geerntet. Alternativ können 10ng/ml rekombinantes MCSF anstelle von konditionierten Medien verwendet werden | |||
Tabelle 3: Zusammensetzung der Medien und Puffer.
Ergänzungsdatei 1: Raw-Sequenzierungsdatei für ROSA_ Mock Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 2: Raw-Sequenzierungsdatei für ROSA_TargettingGuide Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 3: Raw-Sequenzierungsdatei für ScrambleGuide Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 4: Raw-Sequenzierungsdatei für SrcG5+SrcG6 Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 5: Raw-Sequenzierungsdatei für CBLB_Mock Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 6: Raw-Sequenzierungsdatei für CBLB_TargetingGuide Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 7: Raw-Sequenzierungsdatei für Mock_Guide2Locus Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 8: Raw-Sequenzierungsdatei für Mock_Guide6Locus Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 9: Raw-Sequenzierungsdatei für SrcGuide2_Enhancer Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 10: Raw-Sequenzierungsdatei für SrcGuide2_NoEnhance Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 11: Raw-Sequenzierungsdatei für SrcGuide6_Enhancer Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 12: Raw-Sequenzierungsdatei für SrcGuide6_NoEnhancer Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Genom-Editierung mit elektroporierten Cas9-sgRNA-Komplexen ermöglicht eine effektive Störung der Genfunktion in BMDMs. Die Editiereffizienz variiert je nach Zielsequenz und Gen. In der Regel werden vier bis fünf sgRNAs gescreent, um eine hochaktive zu identifizieren. Einige Loci weisen eine geringere Editiereffizienz auf, was höchstwahrscheinlich auf die Chromatinstruktur zurückzuführen ist. In diesen Fällen können mehrere Änderungen vorgenommen werden, um die Bearbeitungseffizienz zu erhöhen. Die gleichzeitige Verabreichung von zwei aktiven sgRNAs an dasselbe Exon führt zu einer verbesserten Editierung einiger Gene. Wenn jedoch zwei Führungen co-transfiziert werden, haben wir beobachtet, dass TIDE an Genauigkeit verlieren kann. Daher können alternative Techniken zur Beurteilung der Bearbeitung, wie z. B. Western Blotting, erforderlich sein. Darüber hinaus erhöht die Einbeziehung eines kommerziell erhältlichen NHEJ-Enhancers die Bearbeitungseffizienz oft um ~20% (Abbildung 3).
Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile. Die direkte Verabreichung von sgRNA-Cas9 an Zellen erfordert nicht die zeitaufwändigen Schritte der Plasmidkonstruktion oder der lentiviralen Vektorproduktion, um BMDMs zu transduzieren. Der Prozess der Synthese von sgRNA, der Elektroporation und der Erzeugung mutierter Zellen kann in 1 Woche abgeschlossen werden. Diese Technik kann auch mit BMDMs verwendet werden, die aus genetisch veränderten Mäusen stammen, um Doppelmutanten zu erzeugen. Obwohl es chemische Methoden gibt, um primäre Immunzellen mit siRNA oder mRNA17 zu transfizieren, sind diese chemischen Methoden bei der Abgabe von Cas9-sgRNA-Komplexen an Immunzellen deutlich weniger effektiv als die Elektroporation18. Es gibt verschiedene Arten von Elektroporationsgeräten, die im Handel erhältlich sind. Es wird erwartet, dass diese Geräte für die Verabreichung von Cas9-sgRNA-Komplexen ähnlich funktionieren, obwohl die Spannungsparameter wahrscheinlich für jedes einzelne Gerät optimiert werden müssen. Während dieses Protokoll in erster Linie bei BMDMs von Mäusen verwendet wurde, wurden in begrenzten Experimenten ähnliche Ergebnisse mit BMDMs von Ratten erzielt (unveröffentlichte Daten). Es ist möglich, dass auch andere Arten von primären Makrophagen, wie z. B. Peritonealmakrophagen der Maus oder Alveolarmakrophagen, für diesen Ansatz zugänglich sind, obwohl dies noch nicht getestet wurde.
Diese Methode weist einige Einschränkungen auf. Die Anzahl der Zellen, die mit diesem Protokoll erzeugt werden, ist etwas begrenzt; Unsere Standardbedingungen erzeugen 4 x 105 Zellen pro Elektroporation. Es kann jedoch möglich sein, die Ausbeute deutlich zu erhöhen, da die Effizienz in einer 10-μL-Reaktion mit bis zu 2,4 x 106 Zellen bei gleicher Menge an RNP (unveröffentlichte Daten) unvermindert ist. Darüber hinaus sind 100 μl Elektroporationsspitzen erhältlich. Ein weiterer Nachteil dieser Methode sind die Kosten; Die Kosten sowohl für den Elektroporator als auch für die Elektroporationsverbrauchsmaterialien sind erheblich. Diese Kosten können erheblich gemindert werden, indem die Spitzen bei der Verwendung verschiedener sgRNAs, die auf dasselbe Gen abzielen, wiederverwendet werden und PBS anstelle der proprietären Puffer verwendet werden. Während die Zusammensetzungen der proprietären Puffer nicht bekannt sind, entspricht vermutlich die Elektrolytzusammensetzung von PBS mit 0,9 mMCaCl2 und 0,5 mMMgCl2 der elektrischen Leitfähigkeit des proprietären Puffers. Diese Änderungen reduzieren die Kosten für Verbrauchsmaterialien in diesem Protokoll um etwa 80 %.
Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, deren Abweichungen die Effizienz der Geneditierung dramatisch beeinträchtigen könnten. Einer der potenziellen Fallstricke besteht darin, dass Standard-IVT-Kits, die nicht für hohe Erträge ausgelegt sind, oft unzureichende IVT-Produkte produzieren. Darüber hinaus kann die Verwendung von Standard-Polypropylen-Mikrofugenröhrchen anstelle von Röhrchen mit geringer Bindung zu erheblichen Zellverlusten durch Adhäsion führen. Die unvollständige Dephosphorylierung des IVT-Produkts und das Vorhandensein von Rest-DNA in der sgRNA-Zubereitung können zur Aktivierung von Makrophagen-Immunsensoren und anschließender Toxizität führen. Höhere oder längere Spannungsimpulse können auch zu einem erhöhten Zelltod führen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Genom-Editing-Protokoll, das die Elektroporation zur Verabreichung von Cas9-sgRNA-RNPs verwendet, eine effiziente Methode ist, um Gene in BMDMs von Mäusen zu zerstören. Dies ermöglicht es den Anwendern, schnell nach Phänotypen in Primärzellen zu suchen, die die komplexe Biologie von Makrophagen in vivo genauer rekapitulieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium 5R01AI144149 finanziert. Die schematischen Abbildungen wurden mit BioRender erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
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