Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantitativ deteksjon av DNA-protein-tverrbindinger og deres posttranslasjonelle modifikasjoner

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65315
Automatic Translation
1
1Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

Den nåværende protokollen fremhever en modifisert metode for å oppdage og kvantifisere DNA-protein-kryssbindinger (DPC) og deres posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM), inkludert ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering indusert av topoisomerasehemmere og av formaldehyd, og dermed tillate studiet av dannelse og reparasjon av DPC og deres PTM.

Abstract

DNA-protein-tverrbindinger (DPC) er hyppige, allestedsnærværende og skadelige DNA-lesjoner, som oppstår ved endogen DNA-skade, enzym (topoisomeraser, metyltransferaser, etc.) som ikke fungerer, eller eksogene midler som kjemoterapeutika og kryssbindingsmidler. Når DPC er indusert, blir flere typer posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) raskt konjugert til dem som tidlige responsmekanismer. Det har vist seg at DPCer kan modifiseres av ubiquitin, liten ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) og poly-ADP-ribose, som primer substratene for å signalisere deres respektive utpekte reparasjonsenzymer og i noen tilfeller koordinere reparasjonen i sekvensielle måter. Siden PTM-er kommer raskt og er svært reversible, har det vært utfordrende å isolere og oppdage PTM-konjugerte DPC-er som vanligvis forblir på lave nivåer. Presentert her er en immunoassay for å rense og kvantitativt oppdage ubiquitylerte, SUMOylerte og ADP-ribosylerte DPCer (legemiddelinduserte topoisomerase DPCer og aldehydinducerte ikke-spesifikke DPCer) in vivo. Denne analysen er avledet fra RADAR-analysen (rapid approach to DNA adduct recovery) som brukes til isolering av genomisk DNA som inneholder DPC ved etanolutfelling. Etter normalisering og nukleasefordøyelse detekteres PTM av DPCer, inkludert ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering, ved immunoblotting ved bruk av deres tilsvarende antistoffer. Denne robuste analysen kan brukes til å identifisere og karakterisere nye molekylære mekanismer som reparerer enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer og har potensial til å oppdage småmolekylære hemmere rettet mot spesifikke faktorer som regulerer PTM for å reparere DPCer.

Introduction

Genomisk DNA-skade oppstår på grunn av spontant forfall, indre skader og miljøfaktorer1. De resulterende DNA-lesjonene omfatter skadede baser, uoverensstemmelser, enkelt- og dobbeltstrengbrudd, tverrbindinger mellom og mellom tråder og DNA-protein-tverrbindinger (DPC). En DPC dannes når et kromatinbundet protein er fanget på DNA gjennom kovalent kobling. DPCer induseres av endogene DNA-lesjoner og reaktive metabolitter, samt eksogene midler som kjemoterapeutika og bifunksjonelle kryssbindingsmidler. Under visse omstendigheter kan enzymdysfunksjon også føre til dannelse av DPCs2. Den store forskjellen i DPC-induktorer resulterer i en forskjell i identiteten til det kovalente bundne proteinet, kromosomområdet der DPC dannes, strukturtypen av DNA kryssbundet til proteinet og den kjemiske egenskapen til den kovalente koblingen mellom proteinet og DNA 2,3,4.

Basert på deres kjemiske natur, er DPCer generelt kategorisert i to grupper: enzymatiske DPCer og ikke-enzymatiske DPCer. Visse enzymer som topoisomeraser, glykosylaser og metyl / acyltransferaser virker ved å danne reversible enzym-DNA kovalente mellomprodukter under deres normale katalytiske reaksjoner. Disse er kortlivede enzym-DNA-mellomprodukter og kan omdannes til langlivede enzymatiske DPCer ved fangst av endogene eller eksogene midler, spesielt ved kjemoterapeutika3. Topoisomerase DPC er blant de hyppigste enzymatiske DPCene i eukaryote celler, som kan genereres av klinisk nyttige topoisomerasehemmere (topotekan og irinotekan for topoisomerase I [TOP1] og etoposid og doksorubicin for topoisomerase II [TOP2]) og er de primære terapeutiske mekanismene til disse hemmerne 5,6. DNA-metyltransferaser (DNMT) 1, 3A og 3B er målet for 5-aza-2'-deoksycytidin (også kjent som decitabin) og danner DPCer ved eksponering for stoffet7. Reaktive midler, samt ultrafiolett lys og ioniserende stråling, induserer ikke-enzymatiske DPCer ved ikke-spesifikt kryssbindende proteiner til DNA. Reaktive aldehyder som acetaldehyd og formaldehyd (FA) genereres ofte som biprodukter av cellulær metabolisme, blant annet FA produseres ved mikromolære konsentrasjoner under metanolmetabolisme, lipidperoksydasjon og histondemetylering. Dessuten er FA et høyvolum produksjon kjemikalie produsert over hele verden, som mange mennesker er utsatt både miljømessig og yrkesmessig 8,9.

Både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer er svært giftige for celler, da deres store proteinkomponenter effektivt hindrer nesten alle kromatinbaserte prosesser, inkludert replikasjon og transkripsjon, noe som fører til cellesyklusarrest og apoptose hvis de ikke repareres. I løpet av de siste to tiårene har reparasjon av DPC blitt grundig studert, og flere proteiner / veier har blitt identifisert som nøkkelfaktorer som enten direkte reparerer DPC eller modulerer reparasjonsprosessene. For eksempel har det vært veletablert at proteolyse av proteinets hoveddel av en DPC er et sentralt trinn i DPC-reparasjon, og at proteolyse kan katalyseres av proteasene SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 eller 26S proteasomkomplekset 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 på en celletype- eller cellulær kontekstavhengig måte. Identifisering og karakterisering av disse proteasene har i stor grad stått på in vivo-komplekset av enzymet (ICE) analyse28,29 og den raske tilnærmingen til DNA-adduktgjenoppretting (RADAR) analyse30,31, som begge isolerer DNA-molekyler og deres kovalente bundne proteiner fra frie cellulære proteiner for å tillate påvisning av DPCer ved slot-blot ved bruk av antistoffer rettet mot de tverrbundne proteiner. Også den innestengte agarose-DNA-immunfargingsanalysen (TARDIS) ble brukt som et middel til å oppdage og kvantifisere DPCer på enkeltcellenivå32. For tiden velger forskere RADAR-analysen over ICE-analysen for å måle DPCer, da ICE-analysen er avhengig av rensing av nukleinsyrer ved bruk av cesiumkloridgradient-ultrasentrifugering, noe som er ekstremt tidkrevende, mens RADAR-analysen utfeller nukleinsyrer ved bruk av etanol innen en mye kortere periode.

I de senere år har det fremkommet bevis for at flere posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) er involvert i signalering og rekruttering av DPC-målrettede proteaser 3,33,34,35. For eksempel ble både TOP1- og TOP2-DPCer funnet å være konjugert av liten ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) -2/3 og deretter SUMO-1 av SUMO E3-ligasen PIAS4, uavhengig av DNA-replikasjon og transkripsjon. De sekvensielle SUMO-modifikasjonene ser ut til å være et mål for ubiquitin, som er avsatt til SUMOylated TOP-DPCs og danner polymerkjeder gjennom lysin 48-resten av en SUMO-målrettet ubiquitinligase kalt RNF4. Deretter fremkaller ubiquitinpolymeren et signal til og rekrutterer 26S-proteasomet til TOP-DPCs23,36. Den samme SUMO-ubiquitin-banen ble nylig vist å virke på DNMT1-DPCer samt PARP-DNA-komplekser for reparasjon37,38. I tillegg har SUMO-uavhengig ubiquitylering av ubiquitin E3 ligase TRAIP blitt rapportert til prime DPCs for proteasomal nedbrytning på en replikasjonskoblet måte39. I likhet med den proteasomale nedbrytningen av TOP-DPC, krever proteolyse av enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer ved replikasjonskoblet metalloprotease SPRTN også allestedsnærværende av DPC-substratene som en mekanisme for å engasjere SPRTN40,41. Avgrensning av rollen til SUMOylering og ubiquitylering krever deteksjon av DPCer som er merket med disse PTM-ene. Siden den originale ICE-analysen og RADAR-analysen er avhengige av slot-blot / dot-blot-apparat for å måle ufordøyd DNA-prøver, er ingen av disse to analysene i stand til å løse og visualisere PTM-konjugerte DPC-arter med forskjellige molekylvekter. For å overvinne dette problemet fordøyde vi DNA-prøvene etter rensing ved etanolutfelling og prøvenormalisering med mikrokokknuklease, et DNA og RNA endo-eksonuklease for å frigjøre de tverrbundne proteinene, noe som gjorde det mulig for oss å løse proteinene så vel som deres kovalente PTM med natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Elektroforesen tillot oss å oppdage og kvantifisere PTM-konjugerte DPCer ved hjelp av spesifikke antistoffer rettet mot PTM-ene. Vi kalte opprinnelig denne forbedrede metoden DUST-analysen, for å markere dens robusthet i påvisning av ubiquitylerte og SUMOylerte TOP-DPCer23. Senere utvidet vi bruken av analysen for kvantitativt å vurdere ADP-ribosylering av TOP1-DPC in vivo, ved bruk av antistoffer mot poly-ADP-ribosepolymerer20.

Presentert her er en detaljert protokoll for analysen som oppdager og måler ubiquitylerte, SUMOylerte og ADP-ribosylerte DPCer, som ble optimalisert for de modifiserte TOP-DPCene som er indusert av deres hemmere og ikke-spesifikke / ikke-enzymatiske DPCer som er indusert av FA. Denne analysen isolerer PTM-konjugerte DPCer ved å lysere celler med et kaotropisk middel, utfelle DNA med etanol og frigjøre de ellers kryssbundne proteinene og deres modifikatorer med mikrokokknuklease. De ellers DNA-bundne proteinene og deres PTM kvantifiseres ved immunblotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. Denne analysen baner en ny vei for å belyse de molekylære mekanismene som cellen reparerer både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer. Spesielt muliggjør det detaljerte studier av induksjon og kinetikk av PTM-er som er viktige for regulering av TOP-DPC-nedbrytning og reparasjon, og tillater dermed oppdagelsen av nye faktorer som E3-ligaser som dikterer PTM-ene, samt hemmere rettet mot disse faktorene. Siden noen av PTM-ene som er ansvarlige for TOP-DPC-reparasjon, sannsynligvis er involvert i reparasjon av DPCer indusert av andre kjemoterapeutika, for eksempel platinabaserte legemidler22, har denne analysen også potensial for anvendelse på oppdagelsen av nye stoffer og rasjonell optimalisering av kombinatoriske terapier med topoisomerasehemmere eller platinabaserte antineoplastikker i pasientceller for å veilede behandlingsregimer.

Protocol

1. Cellekultur og medikamentell behandling i den humane embryonale nyre 293 (HEK293) cellelinjen

  1. Forbered kulturmedium, Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM), supplert med 10% føtal bovint serum, 1% 2 mM L-glutamin og 100 enheter / ml penicillin-streptomycin.
  2. Frø 1 x 10 6 celler i en 60 mm plate eller en 6-brønns plate per behandlingstilstand pluss kontroll.
  3. Neste dag, behandle cellene med DPC-induktorer av valg.
    1. For å indusere TOP1-DPCer og deres ubiquitylering og SUMOylering, legg til TOP1-hemmeren camptothecin ved 20 μM til cellene og samle cellene ved 20, 60 og 180 minutter.
    2. For å indusere TOP2a- og β-DPCer og deres ubiquitylering og SUMOylering, utsett cellene for å legge til TOP2-hemmeren etoposid ved 200 μM til cellene og samle cellene ved 20, 60 og 180 minutter.
    3. For å indusere ikke-enzymatiske DPCer og deres ubiquitylering og SUMOylering, legg til FA ved 1 mM og samle cellene 2 timer etter eksponeringen.
    4. For å indusere PARylering av TOP1-DPCs, forhåndsbehandle cellene i 1 time for å blokkere dePARylering med poly (ADP-ribose) glykohydrolase (PARG) hemmer PDD00017273 ved 10 μM, etterfulgt av samtidig behandling med 20 μM camptothecin i 20, 60 og 180 minutter.

2. Isolering og normalisering av DNA som inneholder kryssbundne proteiner

  1. Aspirer mediet raskt med en sugende pipette etter behandling og skyll cellene med iskald 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Umiddelbart lyse cellene i 600 μL av DNAzol reagens inneholdende 1x protease cocktail inhibitor, 1 mM dithiothreitol (DTT), og 20 mM N-ethylmaleimide (hemmer av deSUMOylating og deubiquitylating enzymer).
  2. Beveg platen sakte på en vibrerende plattform i 10 minutter ved 4 °C.
  3. Tilsett 1/2 volum 100 % kald etanol (0,3 ml) direkte på platen og gjenta trinn 2,2 til ugjennomsiktig nukleinsyreaggregat blir synlig. Overfør cellelysatet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og utsett røret for maksimal sentrifugering (20 000 x g) i 15 minutter ved 4 °C for å utfelle nukleinsyren og dens tverrbundne proteiner.
  4. Aspirer supernatanten med en sugepipette og vask nukleinsyrepelleten i 1 ml 75 % etanol etterfulgt av 2 minutter med sentrifugering på 20 000 x g ved 4 °C.
  5. Aspirer supernatanten, spinn ned med samme hastighet og fjern den gjenværende væsken med en P20-pipette. Lufttørk pelleten i 5 min.
  6. Løs raskt opp nukleinsyrepelleten i 0,1 ml ddH2O. Resuspender pelleten ved gjentatt pipettering, og inkuber deretter i et vannbad på 37 °C til pelleten sveller til minst tre ganger større (ca. 30 minutter).
  7. Sonikere prøvene med en ultralydsprosessorsonde ved 30% amplitude i 10 s for å fullstendig oppløse pelleten.
  8. Valgfritt trinn: Behandle prøvene med RNase A/T1-blanding (10 μg RNase A og 25 U RNase T1) og inkuber ved 37 °C i 15 minutter. Tilsett 1/10 volum av 3 M natriumacetat og to volumer iskald 100% etanol til røret, etterfulgt av sentrifugering ved 20.000 x g i 10 minutter for å hente DNA. Fjern supernatanten og oppløs det utfelte DNA i 0,1 ml ddH2O.
  9. Valgfritt trinn: Sentrifuger prøven i 5 minutter ved 20 000 x g og overfør supernatanten til et nytt rør.
  10. Kvantifiser DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et ultrafiolett-synlig (UV-Vis) spektrometer. Det typiske DNA-utbyttet er rundt 600-800 ng / μL. A260/A280-forholdet bør reduseres fra 2,0-2,1 til 1,8-1,9 etter RNA-fjerning.
  11. Juster konsentrasjonen av DNA til 400-500 ng / μL i 0,12 ml ddH 2 O. Overfør 20 μL av prøven til et nytt mikrosentrifugerør som ufordøyd DNA-lastkontroll (se trinn2.4).
  12. For å fordøye DNA oppløst i de resterende 100 μL ddH2O, tilsett 2000 gelenheter av mikrokokknuklease sammen med 1/10 volum (~ 11 μL) av 10x kalsiummikrokokknukleasereaksjonsbuffer til prøven. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.

3. Vestlig blotting av fordøyde DNA-prøver

  1. Tilsett 4x Laemmli prøvebuffer, kok deretter prøven i 5 minutter.
  2. Legg 5-6 μg fordøyd prøve (~15 μL) på 4%-20% polyakrylamidgel, etterfulgt av SDS-PAGE42 for å løse umodifiserte og PTM-konjugerte DPC-er.
  3. For å oppdage FA-induserte ikke-enzymatiske DPC-arter, inkuber gelen med Coomassie blå flekk over natten ved romtemperatur. Vask gelen med ddH 2 O i2timer og skaff deg et bilde ved hjelp av et bildesystem.
  4. Overfør gelen og inkuber membranene over natten ved 4 °C med passende fortynning av primærantistoff som blokkerende buffer.
    1. For å oppdage ubiquitylering, gjør en 1:100 fortynning av anti-ubiquitin antistoff.
    2. For å oppdage SUMO-1 eller SUMO-2/3 modifikasjon, gjør en 1:250 fortynning av anti-SUMO-1 eller anti-SUMO-2/3 antistoff.
    3. For å oppdage ADP-ribosylering, gjør en 1:500 fortynning av anti-PAR antistoff.
    4. For å oppdage totale TOP1-, TOP2a- eller TOP2β-DPCer, gjør du en 1:500 fortynning av anti-TOP1, anti-TOP2α eller anti-TOP2β antistoff.
      MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om antistofffortynning.
  5. Inkuber en 1x PBS-T (0,1% tween 20) vasket membran med et sekundært antistoff fortynnet 5000 ganger i blokkeringsbuffer i 60 minutter ved romtemperatur.
  6. Utvikle membranen med forbedret kjemiluminescens (ECL) reagens og få et bilde ved hjelp av bildesystemet.

4. Slot-blotting av ufordøyd DNA-prøver

  1. Fortynn den 20 μL ufordøyde DNA-prøven i 180 μL natriumfosfatbuffer (25 mM, pH 6,6).
  2. Skjær nitrocellulosemembranen (0,45 μm) og øk vekten i 5 minutter i natriumfosfatbufferen.
  3. Monter slot-blot-apparatet i henhold til produsentens instruksjoner og koble det til et vakuumsystem.
  4. Vask brønnene med natriumfosfatbuffer ved å påføre vakuumet. Pass på at det ikke lekker ut brønnene.
  5. Stopp vakuumet og last 200 μL DNA per prøve (1 μg). Fyll de tomme brønnene med 200 μL natriumfosfatbuffer.
  6. Påfør vakuumet.
  7. Når alle brønnene er helt tomme, stopp vakuumet, last 200 μL natriumfosfatbuffer i hver brønn og gjenta trinn 4.6.
  8. Hent membranen og blokken med 5% blokkeringsbuffer i 0,5 timer ved romtemperatur.
  9. Sonde med anti-dobbeltstrenget DNA (dsDNA) antistoff ved en 1:5 000 fortynning over natten ved 4 °C.
  10. Vask 3x med 1x PBS-T og inkuber med 1: 5,000 fortynnet pepperrotperoksidase (HRP) -bundet anti-mus sekundært antistoff.
  11. Utvikle membranen med forbedret kjemiluminescens (ECL) reagens og få et bilde ved hjelp av bildesystemet.

5. Densitometrisk analyse

  1. Ved hjelp av ImageJ beregner du forholdet mellom intensiteten til hvert bånd / smør i forhold til intensiteten av sporet av ufordøyd DNA og normaliserer forholdet til det for celler uten / før medikamentell behandling.

Representative Results

De representative resultatene presentert i figur 1 viser dannelsen og kinetikken til legemiddelinduserte TOP1-DPC og deres SUMOylering og ubiquitylering. TOP1 spaltet en streng av DNA duplex og dannet et enzym-DNA kovalent mellomprodukt, kalt TOP1 spaltningskompleks (TOP1cc). Behandlingen av camptothecin (CPT), en TOP1-hemmer, bundet til og stabilisert TOP1cc, som fører til dannelsen av lang levetid TOP1-DPCs. TOP1-DPC ble observert indusert og topp 20 minutter etter eksponering for CPT. Samtidig ble TOP1-DPC modifisert av SUMO-2/3, som også toppet seg 20 minutter etter CPT-behandling. Siden SUMO-2 og SUMO-3 deler 95% sekvensidentitet, skiller antistoffet ikke det ene fra det andre. Ved 60 minutter ble TOP1-DPCer og deres SUMO-2/3-modifikasjon redusert, ledsaget av kulminasjonen av deres SUMO-1-modifikasjon og ubiquitylering. Etter 60 minutters medikamentell behandling begynte nivåene av TOP1-DPC SUMO-1-modifikasjon og ubiquitylering å avta. Hos pattedyr virker TOP2-isoenzymer α og β ved å introdusere et DNA-dobbeltstrengbrudd, samt via dannelsen av et forbigående og reversibelt enzym-DNA-kovalent kompleks (TOP2cc). TOP2-hemmere, som etoposid (ETOP), konverterer TOP2cc til TOP2-DPC og induserer deres SUMOylering og ubiquitylering. I likhet med kinetikken til TOP1-DPCer og deres PTM-er, nådde TOP2a- og β-DPCer og deres SUMO-2/3-modifikasjon en topp på 20 minutter, og begynte deretter å avta; I mellomtiden nådde deres SUMO-1 og ubiquitin modifikasjoner på 60 minutter (figur 2). Det er vist at clearance av TOP-DPC skyldes proteasomal nedbrytning, og clearance av TOP-DPC SUMOylering og ubiquitylering skyldes sannsynligvis resirkulering ved henholdsvis deSUMOylering og deubiquitylering av deres reverserende enzymer. Eksperimentene i figur 3 undersøkte FA-induserte ikke-enzymatiske DPCer og deres PTM. Det ble observert at DPCene og deres SUMO-2/3, SUMO-1 og ubiquitylering dannet og akkumulerte på en FA doseavhengig måte. Til slutt ble PARylering av TOP1-DPC kvantitativt påvist med et anti-PAR-antistoff med samme metode (figur 4). TOP1-DPC PARylering var ikke detekterbar med mindre en PARG-hemmer ble lagt til cellen, noe som tyder på at PARylering skjer raskt og er svært dynamisk. I samsvar med tidligere funn syntes hemming av dePARylering ved PARGi å akkumulere TOP1-DPC, sannsynligvis ved å blokkere proteolytisk nedbrytning.

Figure 1
Figur 1: Kvantitative analyser av dannelse og kinetikk av TOP1-DPC og deres SUMOylering og ubiquitylering ved CPT-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler ble behandlet med 20 μM CPT i indikerte tidsperioder. Cellelysater ble høstet og utsatt for modifisert RADAR-analyse og vestlig blotting med indikerte antistoffer. Ufordøyde DNA-prøver ble utsatt for spalteblotting ved bruk av anti-dsDNA-antistoff som lastekontroll. (B) Båndintensiteter ble kvantifisert med ImageJ-programvare og plottet med Prism-programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kvantitative analyser av dannelse og kinetikk av TOP2-DPC og deres SUMOylering og ubiquitylering ved ETOP-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler ble behandlet med 200 μM ETOP i indikerte tidsperioder. Cellelysater ble høstet og utsatt for modifisert RADAR-analyse og vestlig blotting med indikerte antistoffer. Ufordøyde DNA-prøver ble utsatt for spalteblotting ved bruk av anti-dsDNA-antistoff som lastekontroll. (B) Båndintensiteter ble kvantifisert med ImageJ-programvare og plottet med Prism-programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvantitative analyser av ikke-enzymatiske DPC og deres SUMOylering og ubiquitylering ved FA-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler ble behandlet med FA med indikerte konsentrasjoner i 2 timer. Cellelysater ble høstet og utsatt for modifisert RADAR-analyse og vestlig blotting med indikerte antistoffer. Ufordøyde DNA-prøver ble utsatt for spalteblotting ved bruk av anti-dsDNA-antistoff som lastekontroll. (B) Båndintensiteter ble kvantifisert med ImageJ-programvare og plottet med Prism-programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvantitative analyser av TOP1-DPC og deres PARylering ved CPT-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler ble forhåndsbehandlet med 10 μM PARGi i 1 time og deretter samtidig behandlet med CPT i indikerte tidsperioder. Cellelysater ble høstet og utsatt for modifisert RADAR-analyse og vestlig blotting med indikerte antistoffer. Ufordøyde DNA-prøver ble utsatt for spalteblotting ved bruk av anti-dsDNA-antistoff som lastekontroll. (B) Båndintensiteter ble kvantifisert med ImageJ-programvare og plottet med Prism-programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den beskrevne metoden tillater måling av enzymatiske og ikke-enzymatiske DNA-protein-tverrbindinger i pattedyrceller og er den eneste egnede tilnærmingen for å studere deres ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering. Slot-blotting etter ICE- eller RADAR-analysen tillater rask påvisning av spesifikke enzymatiske DPCer som TOP-DPCer ved bruk av antistoffene. En advarsel til denne metoden er imidlertid dens manglende evne til å skille proteiner med forskjellige molekylvekter, noe som gjør det umulig å bestemme størrelsene på PTM-konjugerte DPCer. Den beskrevne metoden løser problemet ved å frigjøre tverrbundne proteiner med mikrokokknuklease, som nedbryter DNA til oligonukleotider med terminale 3'-fosfater, og derved tillater full separasjon av proteinene (konjugert med oligonukleotider) av SDS-PAGE. DPC-er modifisert med ubiquitin-, SUMO- eller ADP-ribosemonomerer og polymerer av forskjellige størrelser kan derfor visualiseres og kvantifiseres av antistoffer rettet mot disse PTM-ene, noe som muliggjør detaljert undersøkelse av deres dannelse og kinetikk. For å sikre reproduserbarhet og beregne statistisk signifikans kreves biologiske replikater av forsøkene.

Et av de vanligste problemene med denne analysen er lavt DNA-utbytte etter etanolutfelling. På den ene siden kan DNA-utbyttet økes med mer utgangsmateriale (celler). På den annen side kan inkubering av cellelysater med etanol i en flat plate i stedet for et Eppendorf-rør markant forbedre aggregeringen av DNA-molekyler og dermed lette nedbøren. Uspesifikke signaler observert i prøver uten medikamentell behandling kan indikere ikke-kovalent proteinkontaminering. Hvis dette er tilfelle, kan man vurdere å vaske DNA-pellets med høy saltbuffer for å fjerne forurensningene før sonikering. Det anbefales også å spinne ned DNA-prøver etter sonikering og mikrokokknukleasefordøyelse og kaste bort uoppløselig. Ved dårlig eller intet signal kan flere mulige løsninger forsøkes. For det første kan man øke belastningsmengden av DNA for SDS-PAGE og immunoblotting. For å gjøre SUMOylerte og allestedsnærværende DPC-arter detekterbare, anbefales det å laste minst 4 μg DNA på gelen. For det andre kan man øke stoffkonsentrasjonene for å indusere høyere nivåer av DPCer og deres tilknyttede PTM. For det tredje foreslås det å inkubere flekker med primære antistoffer i en annen dag hvis bånd / utstryk ser ut til å være svake. En 2-dagers inkubasjon kan forsterke signalet betydelig og dermed redusere biologisk variabilitet fra uavhengige eksperimenter23. Membranstripping for re-farging resulterer uunngåelig i tap av en viss mengde PTM-konjugerte DPC-arter som allerede er i lav overflod. Derfor anbefales det sterkt å kjøre separate geler for ubiquitin og SUMO-deteksjon i stedet for å undersøke en flekk på nytt. I tillegg må DNA-pellets vaskes med 75% etanol for å fjerne det gjenværende DNAzol som inneholder guanidinsalt før oppløsning i H2O eller andre løsningsmidler, som ellers forårsaker krystallisering av prøven etter tilsetning av Laemmli lastbuffer.

Arbeidsflyten til den beskrevne metoden er mye mer tidseffektiv sammenlignet med den besværlige ICE-analysen, da den er avhengig av rask etanolutfelling i stedet for den tidkrevende cesiumklorid-ultrasentrifugeringen for å isolere genomisk DNA. Til en pris gir etanolbasert rensing en lav mengde proteinforurensninger som normalt er ubetydelige for immundeteksjon. Men når det gjelder analytiske studier, for eksempel massespektrometribasert proteomisk analyse eller neste generasjons sekvensering som krever nøyaktighet og presisjon, er cesiumkloridtetthet-gradientsentrifugering fortsatt en mer pålitelig tilnærming for å isolere rent, høyt overflod DNA. Denne metoden kan også potensielt brukes til profilering av modifikasjonssteder på kryssbundne proteiner og bestemmelse av koblingstyper av poly-ubiquitylering og poly-SUMOylering ved bruk av riktige massespektrometribaserte metoder.

Merk at denne analysen tillater identifisering og karakterisering av faktorer som regulerer PTM-er for DPC-reparasjon. For eksempel er objektive screeningsmetoder med høy gjennomstrømning (RNA-interferens og CRISPR) kraftige verktøy for å oppdage ubiquitin E3-ligaser, SUMO E3-ligaser og tilhørende kofaktorer som reduserer cytotoksisiteten til DPC-induktorer. Den beskrevne metoden muliggjør molekylær validering av disse proteinene ved å bestemme om de hjelper celler å overleve DPC-induktorer ved å reparere DPC-ene. Nye småmolekylære hemmere rettet mot disse proteinene identifisert, for eksempel ved virtuell screening, kan også valideres ved hjelp av denne protokollen. Gitt at topoisomerasehemmere er blant de mest foreskrevne kjemoterapeutika, kan denne robuste analysen utvikles som et verktøy for utvikling av legemidler som synergiserer med kliniske topoisomerasehemmere.

Disclosures

Forfatteren oppgir ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence i Postdoctoral Research Transition Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher 70011069
4–20% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561096
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
AcquaStain (coomassie blue) Bulldog Bio AS001000
anti-dsDNA (mouse monoclonal) Abcam 27156 1: 5,000 dilution is recommended
anti-PAR (mouse monoclonal) R&D systems 4335-MC-100 1: 500 dilution is recommended
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4940 1: 250 dilution is recommended
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4971 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP1 (mouse monoclonal) BD Biosciences 556597 1: 500 dilution is recommended
anti-TOP2α (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-365799 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP2β (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-25330 1: 250 dilution is recommended
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-8017 1: 100 dilution is recommended
Calcium chloride Sigma-Aldrich 499609 Used for micrococcal nuclease digestion
Camptothecin Sigma-Aldrich PHL89593
ChemiDo MP imaging system Bio-Rad 12003154
Disodium phosphate Sigma-Aldrich 5438380100 Used to make sodium phosphate buffer
DNAzol Thermo Fisher 10503027
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher R0861
Dulbecco's modified eagle's medium Sigma-Aldrich 11965084
Ethyl alcohol, 200 proof Sigma-Aldrich E7023
Etoposide Sigma-Aldrich 1268808
Formaldehyde Sigma-Aldrich 47608
Graphpad Prism Software GraphStats Prism 9.0.0
HRP-linked Mouse IgG Cytiva NA931 1: 5,000 dilution is recommended
HRP-linked Rabbit IgG Cytiva NA934 1: 5,000 dilution is recommended
ImageJ Software NIH, USA ImageJ 1.53e
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
Maximum sensitivity ECL substrate Thermo Fisher 34095
Micrococcal nuclease New England BioLabs M0247S
Monosodium phosphate Sigma-Aldrich S3139 Used to make sodium phosphate buffer
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
N-ethylmaleimide Thermo Fisher 23030 DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm Bio-Rad 1620115
Non-fat dry milk Bio-Rad 1706404XTU
PDD00017273 Selleckchem S8862 Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Protease inhibitor cocktail Thermo Fisher 78430
Q700 sonicator Qsonica Q700-110
Ready-to-assemble PVDF transfer kit Bio-Rad 1704274
Slot-blot apparatus Bio-Rad 1706542
Slot-blot filter paper Bio-Rad 1620161
Trans-Blot turbo transfer system Bio-Rad 1704150
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer Bio-Rad 1610732
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179
Vertical electrophoresis cell Bio-Rad 1658004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
  3. Weickert, P., Stingele, J. DNA-protein crosslinks and their resolution. Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).
  4. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  5. Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
  6. Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
  7. Ruggiano, A., Ramadan, K. DNA-protein crosslink proteases in genome stability. Communications Biology. 4 (1), 11 (2021).
  8. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  9. Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
  10. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  11. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  12. Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  13. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
  14. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
  15. Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
  16. Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
  17. Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
  18. Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
  19. Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
  20. Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
  21. Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
  22. Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
  23. Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
  24. Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
  25. Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
  26. Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
  27. Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
  28. Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
  29. Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
  30. Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. Topoisomerase assays. Current Protocols. 1 (10), e250 (2021).
  31. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
  32. Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
  33. Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
  34. Kuhbacher, U., Duxin, J. P. How to fix DNA-protein crosslinks. DNA Repair. 94, 102924 (2020).
  35. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).
  36. Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
  37. Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
  38. Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
  39. Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
  40. Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
  41. Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
  42. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).

Tags

Biokjemi utgave 194
Kvantitativ deteksjon av DNA-protein-tverrbindinger og deres posttranslasjonelle modifikasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Y. Quantitative Detection of… More

Sun, Y. Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications. J. Vis. Exp. (194), e65315, doi:10.3791/65315 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter