Summary
Das mitochondriale Netzwerk ist extrem komplex, was die Analyse sehr schwierig macht. Ein neuartiges MATLAB-Tool analysiert konfokal abgebildete Mitochondrien in Zeitrafferbildern, führt jedoch zu einem großen Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Routineoptimierung entwickelt, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht.
Abstract
Das komplexe mitochondriale Netzwerk macht es sehr schwierig, lebende Zellen zu segmentieren, zu verfolgen und zu analysieren. MATLAB-Tools ermöglichen die Analyse von Mitochondrien in Zeitrafferdateien und vereinfachen und beschleunigen den Prozess der Bildverarbeitung erheblich. Nichtsdestotrotz produzieren bestehende Werkzeuge ein großes Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert, und einfache Versuchsaufbauten haben eine Ausgabe von Tausenden von Dateien, die jeweils eine umfangreiche und zeitaufwändige Handhabung erfordern.
Um diese Probleme zu lösen, wurde eine routinemäßige Optimierung entwickelt, sowohl in MATLAB-Code- als auch in Live-Skript-Form, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht und das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert. Mit einer Geschwindigkeit von 100 Dateien/min ermöglicht die Optimierung eine insgesamt schnelle Analyse. Die Optimierung erzielt die Ergebnisse durch die Mittelung rahmenspezifischer Daten für einzelne Mitochondrien über Zeiträume hinweg und analysiert die Daten auf definierte Weise, die mit den Ergebnissen bestehender Tools übereinstimmt. Die konfokale Live-Bildgebung wurde mit dem Farbstoff Tetramethylrhodaminmethylester durchgeführt, und die Routineoptimierung wurde durch die Behandlung neuronaler Zellen mit Retinsäurerezeptor (RAR)-Agonisten validiert, deren Auswirkungen auf neuronale Mitochondrien in der Literatur nachgewiesen sind. Die Ergebnisse stimmten mit der Literatur überein und ermöglichten eine weitere Charakterisierung des mitochondrialen Netzwerkverhaltens als Reaktion auf die isoformspezifische RAR-Modulation.
Diese neue Methodik ermöglichte eine schnelle und validierte Charakterisierung des Mitochondriennetzwerks von Ganzneuronen, aber auch die Unterscheidung zwischen Axon- und Zellkörpermitochondrien, ein wesentliches Merkmal für die Anwendung im neurowissenschaftlichen Bereich. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf Experimente mit schnell wirkenden Behandlungen angewendet werden, die die Bildgebung derselben Zellen vor und nach Behandlungen ermöglichen und über das Gebiet der Neurowissenschaften hinausgehen.
Introduction
Zelluläre Mitochondrien befinden sich im Zentrum aller physiologischen Zustände, und ein gründliches Verständnis ihrer Homöostase (Mitostase) und ihres Verhaltens ist von größter Bedeutung, um eine pharmakologische Behandlung für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Alzheimer, zu identifizieren 1,2.
Mitochondrien spielen eine entscheidende zelluläre Rolle bei der Energiehomöostase, der ATP-Erzeugung, der Kalziumpufferung und der ROS-Regulation, und die Mitostase ist für die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase unerlässlich, da molekulare Chaperone energieabhängig sind3. Diese erfordern eine konstante und dynamische Netzwerkmodulation und -anpassung, um die zellulären Bedürfnisse effizient zu erfüllen, und der Mitochondrientransport wird durch verschiedene Signalwege reguliert; frühere Arbeiten haben einen solchen Signalweg beschrieben, den der Retinsäurerezeptoren (RARs)4,5. Retinsäure (RA) fördert das Wachstum von Axonen und Neuriten durch RAR-Aktivierung. In primären kortikalen Neuronen der Maus fördert die Aktivierung von RAR-β das mitochondriale Wachstum, die Geschwindigkeit und die Beweglichkeit im Neuriten6.
In Anbetracht der Anpassungsfähigkeit und Dynamik des mitochondrialen Netzwerks ist die Möglichkeit, die Mitostase in "Echtzeit" zu bewerten, nicht nur für die Untersuchung der Energiehomöostase, sondern auch für die Proteostase, die Zellgesundheit, die Proliferation oder die Signalübertragung unerlässlich. Eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung der Mitostase beruht auf der konfokalen Mikroskopie nach Hervorhebung der Mitochondrien mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder -marker sowie einem spezifischen Mikroskopieaufbau, der eine Temperatur- und/oder CO2 -Regulierung ermöglicht7. Bei dieser Art von Versuchsaufbau wird jeweils eine experimentelle Wiederholung durchgeführt. Zusätzlich zur experimentellen Wiederholung verschiedener Behandlungen sollte berücksichtigt werden, dass die meisten Experimente ihre technischen Replikate haben sollten (bei denen mehr als eine Position pro Platte abgebildet wird), wobei eine Reihe von Fokusebenen (z-Stapeln) in einer Reihe von Zeitpunkten aufgezeichnet wird. So ergibt ein Versuchsdesign mit drei Wiederholungen einer Kontrolle und zwei Behandlungen, mit fünf Bildgebungspositionen pro Platte und 15 Zeitpunkten, 225 zu bearbeitende Stacks. Klassischerweise wurden Videos von lebenden Mitochondrien analysiert, indem Kymographen geplottet wurden, die einzeln analysiert wurden8, in einem zeitaufwändigen Prozess, der umfangreiche manuelle Eingaben erforderte, selbst wenn man sich auf Computertools stützte.
Kürzlich wurde ein Algorithmus beschrieben9 , der eine automatisierte Segmentierung und Verfolgung von Mitochondrien in lebenden 2D- und 3D-Zeitrafferdateien ermöglicht. Es gibt andere Quantifizierungstechniken, die alle ihre Grenzen haben10. Mitometer, eine automatisierte Open-Source-Anwendung, eignet sich besonders für Zeitraffer- und Mitochondriendynamikanalysen, die nur geringe Benutzereingaben erfordern. Diese Anwendung hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen bestehenden MATLAB-basierten Werkzeugen, nämlich die automatische Verarbeitung einzelner TIF-Stacks unter Verwendung von bis zu 13 verschiedenen Parametern, was besonders für die Neurowissenschaften interessant ist, da sie zwischen peri- und telenukleären Mitochondrien unterscheidet.
Bei einem Experiment wie dem oben beschriebenen ergeben diese 13 Parameter, die auf 225 Stapel angewendet werden, jedoch 2.925 einzelne Ausgabedateien. Diese erfordern vier einzelne Computereingaben, was sich auf über 10.000 manuelle Eingaben summiert, die zum Herunterladen aller Ausgabedateien erforderlich sind. Bei großen Versuchsdesigns führt dies zu einer unnötig extrem zeitaufwändigen Analyse jeder Datei und Datenintegration. Hier stellen wir eine Routineoptimierung vor, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht, das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert und Daten auf definierte Weise analysiert, die mit der Ausgabe bestehender Tools übereinstimmt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll besteht aus zwei Hauptschritten: einem Nasslaborschritt, der Zellkultur und konfokale Lebendmikroskopie umfasst, um Bilder von lebenden Mitochondrien zu erhalten (Abbildung 1), und einem In-silico-Schritt zur Analyse der erhaltenen Bilder (Abbildung 2). Für die automatisierte Datenanalyse von 3D-Live-Mitochondrien wurde die MATLAB-Anwendung Mitometer verwendet, wie sie von Lefebvre et al.9 bereitgestellt wurde. Die Routineoptimierung ist in MATLAB geschrieben. Die Software, aktualisierte Versionen und die Verarbeitung von ImageJ-Makros sind online über GitHub unter https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB frei verfügbar.
1. Live-Mikroskopie
Abbildung 1: Versuchsprotokoll. SH-SY5Y-Zellen wurden differenziert und mit Retinoiden behandelt. (A) TMRM wurde verwendet, um gesunde Mitochondrien in behandelten Zellen mit einem konfokalen Mikroskop live abzubilden, wobei ein Zeitraffer-Z-Stapel von fünf Gesichtsfeldern aufgenommen wurde. (B) Mitometer-Anwendung MATLAB segmentiert und analysiert automatisch Mitochondrienbilder. Zusätzlich zur Analyse unterscheidet diese Software automatisch Mitochondrien nach Kernnähe. Blaue Punkte sind mitochondriale Anfangspositionen; Rote Punkte sind Endpositionen. Maßstabsbalken = 30 μm. Abkürzung: TMRM = Tetramethylrhodamin, Methylester. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Zellkultur
- Inkubieren Sie SH-SY5Y-Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 und 95 % Luft, kultiviert zu gleichen Teilen aus MEM (Minimal Essential Medium) und F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS).
- SH-SY5Y-Zellen in Glasboden-Zellschalen mit einer Dichte von 15 × 104 Zellen/ml aufteilen.
- Differenzieren Sie die Zellen mit einer 5-tägigen Behandlung mit 10 μM all-trans-Retinsäure in 1 % FBS-haltigem Kulturmedium, gefolgt von einer 2-tägigen Behandlung mit 10 ƞg/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
- Zellbehandlung
- Waschen Sie die Zellen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und behandeln Sie sie 72 h lang mit 10-7 M RAR-Isoform-Agonisten, zu gleichen Teilen aus MEM (Minimal Essential Medium) und F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, ergänzt mit 1% FBS.
HINWEIS: Der verwendete RARα-Agonist war AM580; Der verwendete RARβ-Agonist war CD2314; Ch55 wurde als Agonist als RARα und β Co-Agonist verwendet; beiRA wurde als Positivkontrolle verwendet; BMS493 wurde als RAR-Pan-Antagonist verwendet.
- Waschen Sie die Zellen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und behandeln Sie sie 72 h lang mit 10-7 M RAR-Isoform-Agonisten, zu gleichen Teilen aus MEM (Minimal Essential Medium) und F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, ergänzt mit 1% FBS.
- Konfokale Live-Bildgebung
- Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches 1% FBS-haltiges Kulturmedium mit 20 nM Tetramethylrhodamin, Methylester (TMRM) für 45 Minuten.
HINWEIS: TMRM ist ein zellpermeierter Fluoreszenzfarbstoff, der von aktiven Mitochondrien sequestriert wird, und diese Inkubationszeit ermöglicht es TMRM, ein Gleichgewicht zu erreichen und von polarisierten Mitochondrien aufgenommen zu werden11. Die Bildgebung sollte begonnen werden, bevor ein Gleichgewicht hergestellt ist, da die TMRM-Signalintensität während der Bildgebung künstlich ansteigen könnte. - Legen Sie die Zellen in einen Inkubator, der an ein konfokales Laserscanning-Mikroskop bei 37 °C angeschlossen ist.
- Erfassen Sie Bilder mit einem 63-fachen Öl-Immersions-Apochromat-Objektiv mit einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln , die mit einer Lochblende von 1 luftigen Einheit erhalten wurden, und erfassen Sie eine Zeitreihe von 15 Bildern aus fünf verschiedenen Gesichtsfeldern in jeder Zellplatte und einen Z-Stapel von 8 äquidistanten Z-Ebenen. Die resultierende LSM-Datei ist ein Zeit-, Positions- und Z-Stapel.
HINWEIS: Die Einstellungen für Verstärkung, Kontrast und Helligkeit müssen zunächst mit der minimalen Laserleistung optimiert werden, die erforderlich ist, um den gesamten Dynamikbereich des Detektors zu nutzen, und während der gesamten Studie konstant gehalten werden, um sicherzustellen, dass alle Bildgebungen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden. In dieser Hardware-Software-Kombination können bis zu neun verschiedene Positionen aufgezeichnet werden und das Mikroskop wechselt automatisch zwischen den Aufnahmepositionen.
- Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches 1% FBS-haltiges Kulturmedium mit 20 nM Tetramethylrhodamin, Methylester (TMRM) für 45 Minuten.
2. Bildanalyse
Abbildung 2: Routineoptimierung. (A) Repräsentativer Code der Routineoptimierung. (B) Live-Skript zur Routineoptimierung. (C) Routinemäßiger Optimierungsworkflow. (D) Validierung der Ergebnisse der Routineoptimierung: repräsentatives Bild der Mitochondrien in unbehandelten Zellen (linkes Bild), behandelt mit RA(10-7 M, 72 h, mittleres Bild) und behandelt mit dem RAR-Antagonisten BMS493 (10-7 M, 72 h, rechtes Bild), aufgenommen nach Inkubation mit TMRM (20 nM, 45 min Inkubation). Maßstabsbalken = 30 μm. (E) TMRM-Intensität in Zellkörpermitochondrien. Signifikante Abnahme bei all-trans-Retinsäure-Behandlung (beiRA, 10-7 M, 72 h) im Vergleich zur Kontrollgruppe (p = 0,0062), nicht beobachtet bei Behandlung mit RAR-Antagonisten (BMS493, 10-7 M, 72 Stunden). Fünf Zellen wurden aus jeder der drei Wiederholungen pro Bedingung quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Bildverarbeitung
- Öffnen Sie Dateien in ImageJ 2.1.0 und trennen Sie Stapel nach Sichtfeld: Öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Menüleiste | Bild | Duplizieren | Eingabe-Slices/Frame-Nummer | In Ordnung.
HINWEIS: Um sich wiederholende Eingaben in die Software zu reduzieren, wurde ein ImageJ-Makro entwickelt, um das Duplizieren und Speichern von Gesichtsfeldbildern zu erleichtern.
- Öffnen Sie Dateien in ImageJ 2.1.0 und trennen Sie Stapel nach Sichtfeld: Öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Menüleiste | Bild | Duplizieren | Eingabe-Slices/Frame-Nummer | In Ordnung.
- Makro-Protokoll
- Zeichnen Sie mit dem freien Auswahlwerkzeug einen Interessenbereich (ROI) um die Zelle.
- Führen Sie das Makro aus, indem Sie ImageJ öffnen und zu Menüleiste navigieren | Plugins | Makros | Führen Sie das Makro Hintergrund löschen und Bilder speichern aus.
HINWEIS: Bei diesem Prozess können Bilder nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden, wobei der Lösungsschlüssel gemäß den Optimierungsanforderungen gespeichert wird. - Bestimmen Sie die Pixelgröße und die Voxeltiefe: Öffnen Sie ImageJ | das Bild und navigieren Sie zu Menüleiste | Bild | Eigenschaften.
- Alternatives direktes Protokoll
HINWEIS: Diese Alternative verwendet kein Makro zum Verarbeiten von Bildern- Ermitteln der Pixelgröße und Voxeltiefe: Öffnen Sie ImageJ | Bild öffnen und zu Menüleiste navigieren | Bild | Eigenschaften.
- Zeichnen Sie mit dem freien Auswahlwerkzeug eine ROI um die Zelle herum und stellen Sie sicher, dass sie die gesamte Zelle in den 15 Frames umfasst.
- Navigieren Sie zur Menüleiste | Bearbeiten | Draußen klar.
- Navigieren Sie zur Menüleiste | Datei | Speichern unter | Wählen Sie Tiff aus.
- Wählen Sie Ordner speichern und klicken Sie auf Speichern.
HINWEIS: Bilder können an dieser Stelle manuell verblindet/randomisiert werden, bevor mit der Analyse fortgefahren wird.
- Automatisierte Bildanalyse
- Bereiten Sie die Ordner für Analysedateien vor.
- Erstellen Sie drei Hauptordner mit den Titeln "Alle Titel", "Perinukleare Spuren" und "Telenuklearspuren".
HINWEIS: Diese entsprechen den wichtigsten automatisierten Track-Optionen. - Erstellen Sie in jedem Hauptordner einen Unterordner für jedes zu verarbeitende Bild, der numerisch von 1 aufwärts identifiziert wird.
- Fügen Sie jedem Image-Ordner eine Kopie der beiden ergänzenden Dateien zur Routinenoptimierung (mitometer2table.m und getTXTfiles.m) hinzu.
HINWEIS: Diese Dateien helfen bei der Datenanalyse und der endgültigen Formatanordnung. Die Anzahl der Ordner muss mit der Anzahl der Elemente in der zufälligen Tabelle (.xlsx) übereinstimmen. Nachdem Sie alle nummerierten Unterordner mit ergänzenden Dateien für einen Datensatz erstellt haben, können diese im Stapel kopiert und in die verbleibenden Datensätze eingefügt werden.
- Erstellen Sie drei Hauptordner mit den Titeln "Alle Titel", "Perinukleare Spuren" und "Telenuklearspuren".
- Bereiten Sie die Ordner für Analysedateien vor.
- Verwenden Sie die MATLAB-Anwendung Mitometer, um Bilder zu analysieren.
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde auf einem Mitometer ausgeführt, das auf MATLAB R2022a installiert ist. Laden Sie Bilder in Stapeln von 30 für eine optimale Zeit- und Ausgabebalance. Die maximale MAT-Dateigröße wird durch das native Dateisystem vorgegeben: Standardmäßig können "Speichern"-Operationen eine Datei < 231 Bytes (~2 GB) erstellen; Das Speicherformat MAT-Files Version 7.3 kann stattdessen verwendet werden, da es maximale Variablengrößen von mehr als 2 GB zulässt.- Identifizieren/Ändern der Standardversion der MAT-Datei: Klicken Sie auf der Registerkarte Start im Abschnitt Umgebung auf Einstellungen und wählen Sie MATLAB | Allgemein | MAT-Akten.
- Verwenden Sie das MATLAB-Tool Mitometer zur Analyse: Öffnen Sie MATLAB und navigieren Sie zur Menüleiste | APPS | Offenes Mitometer | Wählen Sie Start 3D | Eingabedaten (Pixelgröße (μm): 0,1395089 / Zeit zwischen den Bildern (s): 2 / Anzahl der Z-Ebenen: 8 / Axialer Abstand zwischen den Z-Ebenen (μm): 0,418809 | Wählen Sie die einzugebenden Bilder aus.
- Gehen Sie zum Mitometer-Seitenmenü, wählen Sie Bild aus, klicken Sie auf Hervorgehoben auswählen, navigieren Sie zur Mitometer-Menüleiste | Auswählen von Titeln | Ansichten verfolgen | Wählen Sie All-Tracks, Telenuclear oder Perinuclear | mitometer Menüleiste | Wählen Sie Analyse | Wählen Sie ein Element (z. B. Länge) | Wählen Sie Speichern unter ".txt".
HINWEIS: Es können mehrere Parameter gleichzeitig heruntergeladen werden, wenn sie gleichzeitig ausgewählt werden. - Extrahieren Sie die Ergebnisdateien in die erstellten Ordner (2.2.1).
- Routineoptimierung und Datenanalyse
- Vorbereiten/Anpassen der "Randomization.xlsx"-Datei, die den Schlüssel für die Bildkodierung enthält.
- Fügen Sie eine Liste aufeinanderfolgender ganzer Zahlen von 1 aufwärts in Spalte A ein.
HINWEIS: Es ist ratsam, einen duplizierten Ordner mit ursprünglich benannten Bildern aufzubewahren. - Platzieren Sie die analytischen Variablen in Spalte B, die aus alphanumerischen Zeichen besteht.
HINWEIS: Die Anzahl der Zeilen im Dokument muss mit der Anzahl der Ordner im Hauptdatensatz übereinstimmen. Kopieren Sie diese "Randomization.xlsx"-Datei und fügen Sie sie in die beiden anderen Hauptdatensätze ein.
- Fügen Sie eine Liste aufeinanderfolgender ganzer Zahlen von 1 aufwärts in Spalte A ein.
- Optimierte Datenanalyse
- Doppelklicken Sie auf "executable.mlx", geben Sie die Anzahl der Ordner ein, geben Sie das Ordnerverzeichnis an (kopieren Sie das Verzeichnis vom Anfang des Ordners) | das Speicherverzeichnis (kopieren Sie das Verzeichnis vom Anfang des Ordners) | den Tabellenkalkulationsnamen in der Ausgabedatei und klicken Sie auf Ausführen.
- Führen Sie bei Bedarf statistische Analysen durch.
HINWEIS: Die optionale Erstellung einer .xlsx Datei in jedem Ordner mit den .txt Daten und der akustischen Warnung bis zum Ende der Analyse kann ausgewählt werden. Live Script gibt eine einzelne Tabellenkalkulationsdatei in einem Tabellenformat aus. In dieser Ausgabe stellen Spalten analysierte Parameter dar (z. B. "Hauptachsenlänge"; "Intensität") und Linien stellen visuelle Felder analytischer Variablen dar (z. B. "Kontrolle").
- Vorbereiten/Anpassen der "Randomization.xlsx"-Datei, die den Schlüssel für die Bildkodierung enthält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Analyse von Ausgabedateien in .txt Format zu verbessern und zu beschleunigen, wurde eine Routineoptimierung codiert, die Daten liest, die mit den Ausgabedateien von Mitometer .txt übereinstimmen, wobei Spalten einen Rahmen und Linien identifizierte Mitochondrien darstellen. Die Routineoptimierung erzeugt Daten in einem einzigen Wert pro Parameter, indem die Rahmen für jedes identifizierte Mitochondrium gemittelt werden und dann die Ergebnisse aller Mitochondrien pro Gesichtsfeld gemittelt werden. Die entwickelte Routine liest Dateien aus Ordnern, die von 1 aufwärts nummeriert sind. Die Optimierung der Live-Skript-Routine gibt eine einzelne Tabellenkalkulationsdatei in einem Tabellenformat aus. In dieser Ausgabe stellen Spalten analysierte Parameter dar (z. B. "Hauptachsenlänge"; "Intensität") und Linien stellen visuelle Felder analytischer Variablen dar (z. B. "Kontrolle").
Zuvor veröffentlichte Ergebnisse beschreiben, dass das mitochondriale Membranpotenzial im Zellkörper primärer neuronaler Kulturen abnimmt und die axonale Mitochondrienbewegung nach RARβ Aktivierung zunimmt6.
Ähnliche Behandlungen wurden in differenzierten Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen durchgeführt, die 72 Stunden lang mit den Retinsäurerezeptoragonisten und -antagonisten behandelt wurden (Abbildung 3). Die gesammelten Daten wurden mit dem nichtdirektionalen, 2-seitigen, 2-Stichproben-, gleichvarianzmäßigen Student's t-Test aufgetragen und analysiert. In der Ausgabetabellendatei wurden Vergleiche zwischen geeigneten Gruppen mit α = 0,05 durchgeführt.
Abbildung 3: Regulation der mitochondrialen Homöostase durch isoformspezifische Retinoid-Signalgebung. (A) Repräsentatives Bild der Mitochondrien nach der Behandlung (oben), entsprechendes Oberflächendiagramm (Mitte) und automatisierte Segmentierung (unten). Blaue Punkte sind mitochondriale Anfangspositionen; Rote Punkte sind Endpositionen. Maßstabsbalken = 30 μm. (B) Heatmap, die alle gefundenen Variationen der Mitochondrienparameter zusammenfasst; Es wurde eine signifikante Varianz zwischen Zellkörper und Neurit gefunden (Zwei-Wege-ANOVA, p=0,0158), mit signifikantem Einfluss der RAR-Isoform-spezifischen Modulation in allen Mitochondrien (Zwei-Wege-ANOVA, p=0,0082). (C) Mitochondriale Länge - eine signifikante Abnahme wurde in mit AM580 behandelten Zellen beobachtet (p = 0,0179). (D) Mitochondriale Oberfläche - signifikante Abnahmen wurden in Zellen beobachtet, die mit AM580 (p = 0,000406) und mit BMS493 (p = 3,01 × 10-8) behandelt wurden. (E) TMRM-Intensität, normalisiert für das mitochondriale Volumen - signifikante Abnahmen wurden in Zellen gefunden, die mit RA (p = 0,00621) und Ch55 (p = 0,000542) behandelt wurden. * p < 0,05; ** p < 0,01; # p < 0,0001. Fünf Zellen wurden aus jeder der drei Wiederholungen pro Bedingung quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Analyse zeigt, dass die Behandlung differenzierter SH-SY5Y-Zellen mit dem RAR-α-Agonisten AM580 zu einer Verringerung der durchschnittlichen Mitochondrienlänge und -oberfläche führt; Dieser Effekt wurde bei der Behandlung mit Agonisten für andere Isoformen als ausschließlichRAR α nicht gefunden, aber es gab eine interessante Abnahme von 35,42 ± 0,5% in der mitochondrialen Oberfläche nach Behandlung mit dem RAR-Panantagonisten BMS493 (p = 3,01 x 10-8). Im Gegensatz dazu scheinen Retinoide einen gegenteiligen Effekt in Bezug auf die TMRM-Intensität zu haben, der sich auf die Polarisation der Mitochondrienmembranbezieht 11: Während die Behandlung mit RARα Agonisten keinen signifikanten Effekt auf die TMRM-Intensität zu haben scheint, führt die Behandlung mit RAR-Panagonisten beiRA zu einer dramatischen Abnahme von 54,82 ± 18,01% (p = 0,00621). Diese Abnahme wird auch nach der Behandlung mit dem RARα/β-Agonisten CH55 (28,99 ± 4,97 % Abnahme, p = 0,000542) und möglicherweise auch nach der Behandlung mit RARβ spezifischen Agonisten CD2314 (37,01 ± 28,96 % Abnahme, p = 0,09134) festgestellt. Wichtig ist, dass diese Methode zwischen axonalen Mitochondrien und denen im Zellkörper unterscheidet, was die Untersuchung des isoformspezifischen RAR-Stimulus und der mitochondrialen Modulation ermöglicht.
Abbildung 4: Minimales Photobleaching während des gesamten Bildgebungsprotokolls. (A) Z-Stapel-Zeitraffer wurden in Fidschi verarbeitet und Z-Projektionen mit durchschnittlichen Intensitäten für alle Zeitpunkte exportiert. (B) Ein z-Achsenprofil der gleichen Verarbeitung wurde nach Zeit aufgetragen. (C) Photobleaching-Quantifizierung für den Versuchsaufbau. Es wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet (p = 0,7607; gepaarter t-Test für die mittlere Signalintensität des ersten und letzten Frames). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Bildgebung lebender Zellen erzeugt große Dateien, die eine ernsthafte Computerverarbeitung erfordern, aber selbst die neuesten Tools erfordern umfangreiche manuelle Eingaben zur Verarbeitung. Diese Routineoptimierung konzentriert sich auf die Vereinfachung des Prozesses der Mitochondrienanalyse auf dem Mitometer, da dieses Tool ein sehr gutes Gleichgewicht zwischen Benutzereingabe und Datenausgabe bietet. Ein umfassender Vergleich zwischen verschiedenen Werkzeugen für die Mitochondrien-Bildanalyse wurde zuvor überprüft10. Während sich andere Pipelines mehr auf die Analyse von Mitochondriennetzwerken und Clustermassen oder die Analyse der Membranpotentialvariation konzentrieren, ermöglicht diese hier vorgestellte neue Methodik eine schnelle und validierte Charakterisierung des Ganzzell-Mitochondriennetzwerks und ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen Axon- und Zellkörpermitochondrien, ein wesentliches Merkmal für die Anwendung im neurowissenschaftlichen Bereich.
Die MATLAB-Anwendung Mitometer9 analysiert Mitochondrien in Bildreihen: Von jedem Zeitrahmen und jeder Z-Ebene in der Serie wird ein diffuser Hintergrund subtrahiert, der dann mit einem Gaußschen Kern gefaltet wird, um hochfrequentes Rauschen zu eliminieren, gefolgt von einer Intensitätsschwelle, die zu einer Maskierung der segmentierten Mitochondrien führt. Die idealen Einstellungen maximieren die mediane Anzahl der identifizierten Mitochondrien und minimieren gleichzeitig die Fluktuation der Mitochondrienzahl und -fläche über benachbarte Zeitrahmen des Bildes, wobei ein Mitochondrium seiner Spur aus dem vorherigen Bild für die Translationsbewegung zugewiesen wird.
Differenzierte SH-SY5Y-Zellen wurden als neuronales Modell zur experimentellen Validierung der Routineoptimierung verwendet. Diese menschliche Zelllinie ist eine homogene Neuroblasten-ähnliche Zelllinie, die mehrere neuronale Merkmale wie Enzymaktivität, Rezeptoren oder Neurofilamente exprimiert, die sich in Kultur leicht vermehren. Dieses Modell ermöglicht das Experimentieren mit Zellen menschlichen Ursprungs ohne die damit verbundenen ethischen Bedenken und mit viel geringeren Kosten als die Verwendung von Primärkulturen12. Undifferenzierte SH-SY5Y sind proliferativ und haben kurze Prozesse; Die Differenzierung dieser Zellen mit sequentieller Retinsäure und BDNF-Behandlung stoppt die Proliferation und fördert die Neuritenverlängerung, was ein nützliches neuronales In-vitro-Modell darstellt13.
All-trans-Retinsäure (10-7 M) wurde als Pan-RAR-Agonist verwendet; AM580 (10-7 M) ist ein RAR-α-Agonist; CD2314 (10-7 M) ist ein RAR-β-Agonist; Ch55 (10-7 M) ist einRAR-α- und RAR-β-Agonist; BMS493 (10-7 M) ist ein RAR-Pan-Antagonist und wurde als pharmakologische Kontrolle verwendet. Diese Methodik wurde mit einem ähnlichen Modell validiert, das kürzlich beschrieben wurde: Die Aktivierung von RAR in neuronalen Zellen reguliert die Mitochondrienhomöostase im Neuron6. In ähnlicher Weise stimmen die mit dieser optimierten Routine erzielten Ergebnisse mit der Literatur überein und zeigen eine signifikante Veränderung mehrerer mitochondrialer Parameter (Mitochondrienlänge, Oberfläche und Mitochondrienmembranpotential), die Mitochondrien im Neuriten von denen im Zellkörper unterscheiden (Abbildung 3). Das Mitometer kann Mitochondrien automatisch identifizieren und trennen, je nach Entfernung vom Zellkern (Abbildung 1). Dies ist ein Feature aus der ursprünglichen Anwendung9 und wurde so verwendet, wie es ist.
Diese Optimierung ermöglichte eine schnelle Verarbeitung von Bildgebungsdateien, wodurch der Bedieneraufwand, das Lesen von Dokumenten und die Datenverarbeitung (auf eine Geschwindigkeit von 100 Dateien pro Minute) erheblich reduziert wurden, Verzerrungen reduziert und die experimentelle Verblindung erhöht wurden. Bei diesem Versuchsaufbau dauert jeder der Frames ungefähr 1 Minute, um einen Zyklus abzuschließen. kürzere Intervalle können durch Verringerung der Anzahl der erfassten Z-Ebenen (möglicherweise begleitet von einer Erhöhung der Lochblendenöffnung) oder der Anzahl der Gesichtsfelder erreicht werden; Längere Intervalle können erreicht werden, indem eine Verzögerungszeit vor der Erfassung ausgewählt wird.
Ein Versuchsaufbau mit fünf Positionen mit 8 z-Ebenen und 15 Frames dauert ca. 19 min pro Zellkulturschale, was zu einem minimalen Photobleaching führt (Abbildung 4). Die größte experimentelle Einschränkung bei der Live-Bildgebung von Mitochondrien besteht darin, das Gleichgewicht zwischen ausreichender Konfluenz für gesunde Zellen und Sparsamkeit zu finden, um eine Unterscheidung zwischen Zellen und insbesondere Neuriten zu ermöglichen. Wenn Zellen zu konfluent in den Glasbodenschalen plattiert sind, führt ihre Proliferation während des Differenzierungsprozesses zu überlappenden Zellen und zur Bildung von Neuritennetzwerken, Schwierigkeiten bei der Abbildung einzelner Zellen und Neuriten und der Identifizierung der Transportrichtung, was die Kartierung des Mitochondriennetzwerks stört. In Bezug auf die Verarbeitung hat MATLAB nicht die gleiche Rechenleistung wie andere Sprachen wie Python, aber MATLAB ist besonders gut in der Signalverarbeitung, was es ideal für Mitochondrien-Bildgebungsexperimente macht.
Dieses Protokoll ermöglicht auch die Bildgebung vor und nach der Akutbehandlung mit einer flüssigen Lösung. Dazu muss die Inkubationskammer des Mikroskops vorsichtig geöffnet werden, um Zugang zur Glasbodenschale für die Behandlungsanwendung zu erhalten. Dies funktioniert am besten bei größeren Volumina (>100 μl), da die Turbulenzbehandlungsanwendung es über das gesamte Präparat verteilen kann, während kleinere Volumina ein Rühren des Präparats erfordern würden, wodurch möglicherweise seine Ausrichtung relativ zum Objektiv/Plattenhalter verschoben würde. Sollte eine solche Drift nicht auftreten, beziehen sich die in der Software aufgezeichneten Positionen auf dieselben Zellen, die vor der Behandlung abgebildet wurden, und eine neue Bildgebungsschleife kann initiiert werden. Es sollte jedoch bedacht werden, dass diese Variation das Photobleaching erhöhen würde, und es müssen Kompromisse bei der anfänglichen Laserintensität eingegangen werden. Darüber hinaus kann dasselbe Protokoll auf andere zelluläre Modelle angewendet werden, wie z. B. neuronale Primärkulturen6 oder sogar andere Zelltypen14, aber es würde eine Optimierung des Mikroskopieabschnitts erfordern, wenn mobilere Zellen oder längere Bildgebungszeiträume abgebildet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Acknowledgments
Die Bildaufnahme wurde in der LiM-Einrichtung von iBiMED, einem Knoten von PPBI (Portuguese Platform of BioImaging), durchgeführt: POCI-01-0145-FEDER-022122. Diese Arbeit wurde unterstützt durch FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), ein Stipendium für DT von der Fundação para a Ciência e Tecnologia des Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), ein Stipendium von ATG-The Gabba Alumni Association an VP und das Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E.
- Clare, D. K., Saibil, H. R.
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
