Summary
O método de manipulação cervical apresentado pode induzir pseudogestantes em camundongos sem a necessidade de fêmeas reprodutoras com machos vasectomizados. A indução da pseudogravidez é necessária para o sucesso da transferência não cirúrgica de embriões e da inseminação artificial não cirúrgica, ambas também apresentadas.
Abstract
Para manter a gravidez com sucesso com transferência de embriões ou inseminação artificial, camundongos receptores fêmeas devem ser induzidos a um estado pseudogestante. Camundongos fêmeas são tradicionalmente emparelhados durante a noite com machos vasectomizados e, na manhã seguinte, a presença de um tampão de cópula é avaliada. Para aumentar a eficiência da produção de fêmeas pseudogestantes, uma técnica de manipulação cervical foi padronizada para ser usada em combinação com técnicas não cirúrgicas de transferência de embriões ou inseminação artificial em camundongos. A extremidade romba de uma pequena haste de plástico é inserida por via vaginal para entrar em contato com o colo do útero e é vibrada por 30 s por contato com um aparador. O procedimento é rápido e não requer anestesia ou analgesia. Esta técnica aumenta a confiabilidade e previsibilidade da produção de fêmeas pseudogestantes e elimina totalmente a necessidade de machos vasectomizados. Para camundongos CD1, a eficiência da indução de pseudogravidez por manipulação cervical foi de 83% para fêmeas no estro (N = 76), mas apenas 38% das fêmeas no estro foram plugadas por machos vasectomizados (N = 24). A inseminação artificial em camundongos CD1 foi realizada por sincronização do estro com hormônios, manipulação cervical e transferência uterina de espermatozoides. As receptoras de inseminação artificial que receberam manipulação cervical (N = 76) apresentaram taxa de prenhez de 72% e tamanho médio de ninhada de 8,3 filhotes. Este método também pode ser usado para produzir fêmeas pseudogestantes para transferência embrionária não cirúrgica. Portanto, a indução de pseudogravidez por manipulação cervical é uma alternativa conveniente e eficiente ao acasalamento com um macho vasectomizado na realização de técnicas de reprodução assistida não cirúrgica. O uso da manipulação cervical proporciona benefícios de 3Rs (substituição, redução e refinamento) para as técnicas de reprodução assistida, reduzindo o número de animais necessários e eliminando a necessidade de machos alterados cirurgicamente.
Introduction
Tecnologias de reprodução assistida são usadas para a produção de modelos de camundongos geneticamente modificados, bem como para a recuperação de cepas a partir da criopreservação, a rederivação de cepas de um estado de saúde comprometido e o manejo estratégico do biotério, incluindo a produção de coortes pareadas por idade. Todas as técnicas de reprodução assistida em camundongos requerem o uso de receptoras pseudogestantes para o desenvolvimento do embrião. Historicamente, receptoras pseudogestantes têm sido geradas pelo acasalamento com machos estéreis, que são vasectomizados cirurgicamente ou geneticamente inférteis, e a presença de um tampão de cópula é avaliada na manhã seguinte1. Recentemente, um protocolo de estimulação sônica em camundongos foi desenvolvido para a transferência cirúrgica de embriões pronucleares ou de camundongos de duascélulas2. Também desenvolvemos um protocolo de manipulação cervical (MC) para uso com inseminação artificial e transferência embrionária não cirúrgica de blastocistos. A justificativa para o uso do procedimento é proporcionar uma redução de 3Rs no número de animais necessários (não necessitando mais de camundongos machos) e um refinamento das técnicas utilizadas (não necessitando mais do procedimento cirúrgico de vasectomia para camundongos machos). A descrição deste protocolo inclui a técnica de reprodução assistida associada para auxiliar na integração do MC em fluxos de trabalho normais. O objetivo geral do método MC é substituir o uso de camundongos machos na geração de fêmeas pseudogestantes para técnicas de reprodução assistida, incluindo inseminação artificial e transferência de embriões.
O protocolo de MC aqui descrito foi primeiramente desenvolvido para auxiliar na inseminação artificial em camundongos. O protocolo de inseminação artificial, como descrito originalmente, alcançou uma taxa de prenhez de 50%, com tamanho médio de ninhada de 7 filhotes3. Camundongos receptores de CD1 foram sincronizados com uma dose baixa de hormônios, incluindo gonadotrofina sérica de égua gestante (PMSG) e gonadotrofina coriônica humana (hCG), em um intervalo de 47 h antes da inseminação. Uma vantagem da sincronização estral foi permitir o uso do protocolo durante o horário normal de trabalho. As fêmeas foram pareadas com machos vasectomizados imediatamente após a inseminação artificial, e o acasalamento foi confirmado pela presença de um tampão de cópula. A inconsistência na taxa de acasalamento com os receptores foi relatada como uma dificuldade no procedimento. Portanto, buscaram-se alternativas ao acasalamento para a indução da pseudogestação.
O presente estudo apresenta uma técnica padronizada de MC para aumentar a eficiência na produção de fêmeas pseudogestantes. Para fêmeas em estro ou proestro, a extremidade romba de uma pequena haste de plástico é inserida por via vaginal para entrar em contato com o colo do útero e é vibrada por 30 s por contato com um aparador. O procedimento é realizado em uma gaiola com tampo de arame. Nenhuma anestesia ou analgesia é necessária. A técnica de MC é conveniente para a produção de fêmeas pseudogestantes, que podem produzir ninhadas após inseminação artificial não cirúrgica sem a necessidade de acasalamento com machos vasectomizados. O MC também pode ser usado para a produção de fêmeas pseudogestantes como receptoras de transferência de embriões. Especificamente, a técnica de MC pode ser pareada com a transferência embrionária não cirúrgica, como descrito aqui. Métodos não cirúrgicos têm se mostrado eficazes na transferência embrionária de embriões em estágio de blastocisto em camundongos 4,5e ratos 6,7. Por ser um método não cirúrgico uma alternativa eficaz aos métodos cirúrgicos, considera-se um refinamento de 3Rs da técnica. Com base em pesquisas anteriores, os níveis de corticosterona fecal, como medida de estresse, indicam que a natureza não cirúrgica do procedimento não aumenta os níveis de estresse em roedores 7,8. Os procedimentos são menos desafiadores tecnicamente do que a transferência cirúrgica de embriões e são muito mais rápidos de serem realizados. Como os embriões são transferidos para o útero, embriões do estágio correto para o desenvolvimento uterino devem ser transferidos. Para camundongos, os blastocistos são transferidos para receptores pseudogestantes 2,5 dias pós-coito (dpc).
Para as duas técnicas não cirúrgicas aqui descritas, o momento da administração hormonal e a técnica de MC são diferentes. O momento do procedimento de MC em relação ao estro é importante para o sucesso, pois substitui o acasalamento natural para a produção de receptoras pseudogestantes. Ao eliminar a necessidade de machos vasectomizados para induzir pseudogravidez, este procedimento proporciona benefícios de 3Rs, reduzindo o número de animais necessários e eliminando a necessidade de machos cirurgicamente alterados. O procedimento em si é rápido (30 s) e não requer anestesia ou analgesia. A técnica aumenta consideravelmente a confiabilidade e previsibilidade da produção de fêmeas pseudogestantes para reprodução assistida.
Protocol
Foram seguidas todas as diretrizes internacionais, nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e uso de animais. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais estavam de acordo com os padrões éticos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da ParaTechs Corporation e conduzidos sob os padrões ditados pelo Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health, Public Health Service, United States Department of Health and Human Services. Camundongos CD1 (ICR) e fêmeas CD1(ICR) e fêmeas com idade de >8 semanas foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Procedimento de manipulação cervical para uso com inseminação artificial em camundongos CD1
- Ovulação sincronizada de ratas nos dias 1 e 3
- Injetar ratinhos fêmeas com PMSG 2,5 UI (ver Tabela de Materiais) por injeção intraperitoneal (IP) no dia 1, 0,5 h antes do início do ciclo escuro do biotério.
NOTA: Cada doador masculino fornecerá espermatozoides suficientes para 10 receptoras do sexo feminino. - Injetar nas fêmeas 2,5 UI de hCG (ver Tabela de Materiais) por injeção IP no dia 3, 1 h antes do início do ciclo escuro do biotério.
NOTA: Os tempos das injeções, transferência de espermatozoides e ciclo de luz em relação uns aos outros são muito importantes. Os tempos especificados para todos os procedimentos deste protocolo são baseados em um ciclo claro/escuro de 12 h.
- Injetar ratinhos fêmeas com PMSG 2,5 UI (ver Tabela de Materiais) por injeção intraperitoneal (IP) no dia 1, 0,5 h antes do início do ciclo escuro do biotério.
- Coleta e capacitação de espermatozoides frescos no dia 4
- Preparar uma gota de 500 μL de meio de pré-incubação de espermatozoides (PM, ver Tabela de Materiais) em uma placa de cultura de tecidos de 60 mm sob óleo de parafina. Prepare um prato por doador masculino. Equilibrar durante pelo menos 30 minutos a 37 °C e 5% de CO2 antes da colheita de espermatozoides.
- Após 1 h do início do ciclo de luz do biotério, eutanasiar(ão) o(s) macho(s) de acordo com as diretrizes institucionais. Cada macho fornecerá espermatozoides suficientes para 10 inseminações artificiais.
- Dissecar rapidamente os epidídimos cauda do rato. Realizar uma incisão transversal abdominal acima da bexiga com tesoura de dissecção e pinça dentada.
- As almofadas de gordura testicular estão localizadas em ambos os lados da bexiga. Segure uma das almofadas de gordura testicular com pinça curva e remova o testículo e o epidídimo da cavidade corporal. Identificar a cauda do epidídimo como uma estrutura tubular oval plana logo abaixo do testículo.
- Segurar a cauda do epidídimo com pinça curva e ressecção com uma tesoura pequena e angulada. Remova ambos os epidídimos da cauda e transfira-os para um tecido absorvente para remover gordura e sangue sob um microscópio dissecante.
- Colocar dois epidídimos cauda em cada gota de 500 μL de PM equilibrado sob óleo de parafina a 37 °C. Corte o tecido fazendo seis incisões usando uma tesoura pequena. Se for utilizado mais de um dador do sexo masculino, utilizar um epidídimo de cada dador para cada amostra de esperma para reduzir a variação entre as amostras.
- Gire suavemente o prato e deixe o esperma sair do tecido por 3 min, girando uma vez por minuto. Remova todos os tecidos.
- Incubar a amostra de esperma durante 45 min a 1 h a 37 °C e 5% de CO2 para capacitar.
- Opcional: Medir a contagem de espermatozoides e avaliar a motilidade ao microscópio usando um hemocitômetro. Para a contagem, dilua os espermatozoides em PM conforme necessário.
- Confirmação da sincronização do ciclo estral por avaliação citológica
- Usando um pequeno cotonete pré-umedecido (ver Tabela de Materiais), colete suavemente as células vaginais da parede vaginal rolando o cotonete contra o tecido, esfregue-as em uma gota de 20 μL de água estéril em uma lâmina de microscópio e seque ao ar.
- Ao microscópio, com aumento de 100x e iluminação de campo claro, avaliar-se a presença de células epiteliais cornificadas. Fêmeas em estro ou proestro tardio terão células epiteliais cornificadas presentes e devem ser selecionadas para manipulação cervical.
- Opcional: Registrar o peso das receptoras antes da inseminação.
- Realizando a manipulação cervical (MC)
- Aproximadamente 0,5 h antes da inseminação, coloque uma fêmea receptora no topo de uma gaiola com uma cremalheira de arame, permitindo que o mouse "agarre" a superfície da barra da gaiola. Segure próximo à base da cauda com o polegar e o indicador e incline a cauda para cima enquanto estabiliza o animal (Figura 1).
Observação : o mouse permanecerá imóvel durante o procedimento quando a técnica de manipulação é executada corretamente. Se o mouse sair da posição, reposicione suavemente e continue. Se um animal agressivo for escolhido como receptor, permitir que o animal entre em um túnel de enriquecimento durante o procedimento pode ser calmante. O uso do túnel é opcional, mas pode auxiliar os pesquisadores no manuseio dos animais, proporcionando uma distração durante esse procedimento. - Insira a extremidade romba de uma pequena haste de plástico (ver Tabela de Materiais) por via vaginal para entrar em contato com o colo do útero e vibre por 30 s por contato com um aparador (consulte Tabela de Materiais).
OBS: Coloque a haste na posição antes de iniciar o aparador. Ambos são segurados em uma das mãos durante o procedimento. Nenhuma anestesia ou analgesia é necessária.
- Aproximadamente 0,5 h antes da inseminação, coloque uma fêmea receptora no topo de uma gaiola com uma cremalheira de arame, permitindo que o mouse "agarre" a superfície da barra da gaiola. Segure próximo à base da cauda com o polegar e o indicador e incline a cauda para cima enquanto estabiliza o animal (Figura 1).
- Transferência não cirúrgica de espermatozoides para inseminação artificial
- Coloque o dispositivo de inseminação (ver Tabela de Materiais) em uma pipeta P200 regulada para 40 μL e remova a tampa protetora.
- Retirar uma alíquota da amostra de esperma capacitada da placa a 37 °C e 5% de CO2 e transferi-la para uma placa de cultura de tecidos de 35 mm sem óleo a 37 °C. A amostra de esperma será utilizada imediatamente para transferência.
NOTA: O esperma perderá a motilidade rapidamente fora da incubadora CO2 . Manter a amostra de esperma capacitada a 37 °C e 5% de CO2 tanto quanto possível. - Pressione o êmbolo da pipeta até a primeira parada, abaixe a ponta do cateter na amostra de esperma a 37 °C e carregue lentamente os espermatozoides no dispositivo de transferência. Evite aglomerações. Remova o óleo residual do exterior do dispositivo de inseminação usando um tecido absorvente. Separe a pipeta.
NOTA: A transferência de óleo de parafina para o corno uterino deve ser evitada. Remova o óleo residual do exterior do dispositivo de inseminação usando um tecido absorvente. - Coloque a fêmea do recipiente na parte superior da gaiola da cremalheira de arame. Segure o mouse na posição utilizando a mesma técnica de manuseio utilizada para o MC; Segure perto da base da cauda usando o polegar e o indicador e incline a cauda para cima enquanto estabiliza o animal.
- Coloque o pequeno espéculo (ver Tabela de Materiais) na vagina.
- Insira o cateter do dispositivo de inseminação no espéculo, através do colo do útero e no útero. Uma vez que o cubo do dispositivo entre em contato com o espéculo, dispense o esperma pressionando o êmbolo da pipeta até a primeira parada. Evite a transferência de ar extra para o corno uterino.
NOTA: Se o cateter não estiver posicionado corretamente, ele atingirá o tecido ao redor do colo do útero, fazendo com que ele flexione e, eventualmente, dobre. Se o cateter não deslizar pelo colo do útero na primeira tentativa, recue suavemente o cateter para fora e tente novamente até obter sucesso. O reposicionamento do espéculo pode ser necessário. - Remova o dispositivo e o espéculo. Não é necessário nenhum acompanhamento pós-procedimento.
- Opcional: Verificação de gravidez nos dias 10-12
- Use o ganho de peso para determinar o estado de gravidez. O ganho de peso será dependente do esforço, mas um aumento de pelo menos 1-2 g correlaciona-se com a gravidez.
Figura 1: Técnica de fixação do mouse para manipulação cervical. O rato repousa sobre uma gaiola de arame e é estabilizado na cauda e em ambos os lados na frente das patas traseiras. A extremidade romba de uma pequena haste de plástico é inserida por via vaginal para entrar em contato com o colo do útero e é vibrada pelo contato com um aparador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Procedimento não cirúrgico de transferência de embriões para uso com manipulação cervical em camundongos CD1
- Ovulação sincronizada das ratas nos dias 1 e 3
- Injetar camundongos fêmeas com 2,5 UI de PMSG por injeção IP no dia 1, aproximadamente 6 h após o início do ciclo de luz do biotério.
- Injetar as fêmeas com 2,5 UI de hCG por injeção IP no dia 3, com um intervalo de 47 h após a injeção de PMSG ou aproximadamente 5 h após o início do ciclo de luz do biotério.
- Confirmação da sincronização do ciclo estral por avaliação citológica
- No dia 3, cerca de 1 h antes do MC, realizar citologia nos potenciais receptores. Usando um pequeno cotonete pré-umedecido, colete suavemente as células vaginais da parede vaginal rolando o cotonete contra o tecido, esfregue-as em uma gota de 20 μL de água estéril em uma lâmina de microscópio e seque ao ar.
- Ao microscópio, com aumento de 100x e iluminação de campo claro, avaliar-se a presença de células epiteliais cornificadas. Fêmeas em estro ou proestro tardio terão células epiteliais cornificadas presentes e devem ser selecionadas para manipulação cervical.
- Opcional: Registre o peso das potenciais receptoras de embriões femininos.
- Realizando o CM
- No dia 3, 1 h antes do início do ciclo escuro do biotério, coloque uma fêmea receptora no topo de uma gaiola com uma cremalheira de arame, permitindo que o animal "agarre" a superfície da barra da gaiola. Segure próximo à base da cauda usando o indicador e o polegar e, em seguida, incline a cauda para cima enquanto estabiliza o animal (Figura 1).
Observação : o mouse permanecerá imóvel durante o procedimento quando a técnica de manipulação é executada corretamente. Se o mouse sair da posição, reposicione suavemente e continue. Se um animal agressivo for escolhido como receptor, permitir que o animal entre em um túnel de enriquecimento durante o procedimento pode ser calmante. - Insira a extremidade romba de uma pequena haste de plástico por via vaginal para entrar em contato com o colo do útero e vibre-a por 30 s por contato com um aparador.
OBS: Coloque a haste na posição antes de iniciar o aparador. Ambos são segurados em uma das mãos durante o procedimento. Nenhuma anestesia ou analgesia é necessária.
- No dia 3, 1 h antes do início do ciclo escuro do biotério, coloque uma fêmea receptora no topo de uma gaiola com uma cremalheira de arame, permitindo que o animal "agarre" a superfície da barra da gaiola. Segure próximo à base da cauda usando o indicador e o polegar e, em seguida, incline a cauda para cima enquanto estabiliza o animal (Figura 1).
- Transferência não cirúrgica de embriões no 6º dia
- Coloque uma gota de 20 μL de meio M2 (ver Tabela de Materiais) na tampa de uma placa de cultura de tecidos.
OBS: A pálpebra é escolhida por ter uma borda mais curta e, assim, ser conveniente para acessar os embriões na gota. Não coloque óleo de parafina em nenhum momento sobre a gota de M2, pois a introdução de óleo no corno uterino parece afetar negativamente a transferência embrionária. - Sob um microscópio e usando iluminação reflexiva, carregue 10-20 blastocistos na gota média usando uma pipeta padrão de manipulação de embriões (consulte a Tabela de Materiais).
NOTA: O número ideal de embriões a transferir depende da estirpe de ratinhos e de quaisquer manipulações a que os embriões tenham sido submetidos. Para embriões saudáveis não manipulados, a transferência de 10-15 embriões deve ser suficiente. Para a rederivação ou embriões geneticamente modificados, a transferência de mais embriões é adequada. - Fixe o dispositivo de transferência de embriões não cirúrgico (ver Tabela de Materiais) em uma pipeta P2 ajustada para 1,8 μL. Remova a tampa protetora do cateter.
- Pressione o êmbolo da pipeta até a primeira parada, abaixe a ponta do cateter para o meio e puxe lentamente os embriões para a ponta do cateter do dispositivo. Retire a ponta do meio.
NOTA: A visualização dos embriões sob baixa ampliação permitirá um carregamento mais fácil dos embriões no dispositivo. Se os embriões estiverem espalhados na gota, agite suavemente a placa de um lado para o outro para concentrar os embriões no centro da gota, ou reposicione-os usando uma pipeta de manipulação de embriões. - Ajuste o volume da pipeta para 2,0 μL para gerar uma pequena bolha de ar na ponta do cateter. Coloque suavemente a pipeta com os embriões carregados perto da gaiola do rato.
- Coloque a fêmea do recipiente na parte superior da gaiola da cremalheira de arame. Segure o mouse na posição usando a mesma técnica de manuseio usada para MC; Segure perto da base da cauda usando o indicador e o polegar e, em seguida, incline a cauda para cima enquanto estabiliza o animal.
- Coloque um pequeno espéculo (ver Tabela de Materiais) na vagina.
- Insira o cateter do dispositivo de transferência no espéculo, através do colo do útero e no útero. Uma vez que o cubo do dispositivo entre em contato com o espéculo, dispense os embriões pressionando o êmbolo da pipeta até a primeira parada. Evite a transferência de ar extra para o corno uterino.
- Sem soltar o êmbolo da pipeta, remova o dispositivo e o espéculo. Não é necessário nenhum acompanhamento pós-procedimento.
- Coloque uma gota de 20 μL de meio M2 (ver Tabela de Materiais) na tampa de uma placa de cultura de tecidos.
Representative Results
Como a estimulação cervical elétrica9 e sônica10 tem sido usada para induzir pseudoprenhez em ratas, este trabalho apresenta um procedimento mecânico padronizado que pode ser usado em camundongos. A citologia vaginal pode auxiliar na identificação de fêmeas em vários estágios do cio. Para confirmar pseudogravidez em fêmeas, esse mesmo método foi empregado. Primeiro, os perfis citológicos das fêmeas foram comparados para camundongos CD1 e C57Bl/6 ao longo dos ciclos estrais, durante a gestação e durante a pseudogravidez induzida por acasalamento ou MC. Os swabs vaginais foram retirados das fêmeas e corados usando um sistema de coloração de Papanicolaou (ver Tabela de Materiais). As células foram observadas sob aumento de 100x com iluminação de campo claro. As células observadas incluíram leucócitos, células epiteliais nucleadas e células epiteliais anucleadas cornificadas. A determinação do estágio do ciclo estral foi baseada na porcentagem relativa de cada tipo celular11,12. O estro é caracterizado pelo predomínio de células epiteliais cornificadas. À medida que o cio termina, o metestro começa e os leucócitos começam a aparecer, enquanto as células epiteliais cornificadas se tornam menos evidentes. O diestro tem celularidade moderada a baixa, com predomínio de leucócitos e início do aparecimento de células epiteliais nucleadas. O proestro distingue-se pela perda de leucócitos, aumento de células epiteliais nucleadas e aparecimento de células epiteliais cornificadas. Após o proestro, o estro começa e o ciclo continua.
Para desenvolver um perfil basal, a citologia vaginal foi registrada por pelo menos dois ciclos estrais completos para cada fêmea (N = 20 para CD1, N = 20 para C57Bl/6) antes do acasalamento. A duração do ciclo e os perfis individuais variaram entre os camundongos; no entanto, observaram-se as tendências gerais esperadas. O comprimento médio do ciclo estral dos camundongos CD1 e C57Bl/6 foi de 3,8 dias, variando de 3 a 5 dias. No dia anterior ao acasalamento natural, todas as fêmeas estavam em proestro. Após o acasalamento, a citologia foi realizada novamente 1,5 dias após o coito (dpc) até que a ciclagem estral fosse retomada. A Figura 2 mostra o perfil citológico de fêmeas pseudogestantes CD1 e C57Bl/6 acasaladas com machos vasectomizados.
Figura 2: Perfil citológico de camundongos fêmeas pseudogestantes. As porcentagens médias de cada tipo celular para leucócitos, células epiteliais nucleadas e células epiteliais cornificadas são mostradas em função dos dias pós-coito (DPC) para (A) CD1 (N = 20) e (B) C57Bl/6 (N = 20) camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Neste trabalho, uma técnica de MC foi padronizada para aumentar a eficiência na produção de fêmeas pseudogestantes. Para fêmeas em estro ou proestro, a extremidade romba de uma pequena haste de plástico é inserida por via vaginal para entrar em contato com o colo do útero e é vibrada por 30 s por contato com um aparador. O procedimento é realizado em uma gaiola com tampo de arame. Nenhuma anestesia ou analgesia é necessária. Para determinar a eficácia do procedimento de MC, a citologia vaginal foi comparada para camundongos fêmeas CD1 (N = 20) e C57Bl/6 (N = 20) após acasalamento com machos vasectomizados e após MC (N total = 40). O perfil citológico da pseudogestação induzida pelo MC foi semelhante ao perfil da pseudogestação induzida pelo acasalamento, como mostra a Figura 3.
Figura 3: Perfil citológico de camundongos fêmeas pseudogestantes após manipulação cervical (MC). A porcentagem de cada tipo celular para leucócitos, células epiteliais nucleadas e células epiteliais cornificadas é mostrada em função de dias pós-coito (DPC) ou dias pós-manipulação cervical (DPCM). As porcentagens médias de tipo celular são mostradas para os camundongos CD1 e C57Bl/6 (N = 40) (A) acasalados com machos vasectomizados ou (B) após MC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para determinar se a técnica de MC é suficiente para estabelecer a gravidez para reprodução assistida, o MC foi realizado como parte de um protocolo de inseminação artificial não cirúrgica (AINE) em mulheres CD1. O protocolo de inseminação artificial incluiu sincronização do cio das fêmeas com baixa dose dos hormônios PMSG e hCG antes da transferência espermática. O MC foi realizado imediatamente antes da transferência espermática. Para camundongos CD1, a eficiência da indução de pseudogestantes usando MC para fêmeas no estro (N = 76) com esta técnica foi de 83%. Em um experimento controle, apenas 38% das fêmeas em cio foram tamponadas por machos vasectomizados (N = 24). As receptoras de inseminação artificial que receberam manipulação cervical (N = 76) apresentaram taxa de prenhez de 72% e tamanho médio de ninhada de 8,3 filhotes. Assim, a indução de pseudogestacional por MC é uma substituição conveniente e eficiente para o acasalamento com um macho vasectomizado durante a realização de AINE. O uso de MC para preparar receptoras de CD1 (N = 4) no cio para a transferência embrionária não cirúrgica de blastocistos CD1 frescos resultou em uma taxa de gravidez de 100%. A transferência de 9-15 embriões produziu três ninhadas saudáveis com uma taxa de nascimento de 45% e um tamanho médio de ninhada de 6 filhotes. Em comparação, as receptoras de CD1 (N = 20) que foram acasaladas com machos vasectomizados para induzir pseudogravidez tiveram uma taxa de gravidez de 80% e uma taxa de nascimento de 46% após a transferência de 20 blastocistos B6C3F2 frescos.
Os resultados das técnicas de reprodução assistida provavelmente serão específicos da cepa, uma vez que variáveis como a dose e o momento da administração hormonal para a superovulação mostraram-se dependentes da cepa13. Além disso, fatores como idade e peso do receptor podem afetar a reação aos hormônios14. Neste trabalho, ao realizar o procedimento de MC para inseminação artificial, apenas fêmeas em proestro ou estro tardio mostraram-se responsivas. Em geral, para aumentar o número de receptores disponíveis em uma população, as fêmeas são sincronizadas primeiro com uma baixa dose de hormônios3. A sincronização do estro com 2,5 UI de PMSG e hCG foi 78% efetiva para fêmeas CD1 de 11-14 semanas (N = 27) e 60% efetiva para fêmeas C57Bl/6 de 18-32 semanas (N = 22) neste trabalho. A eficiência da indução de pseudogestantes por manipulação cervical em fêmeas CD1 foi de 83% para fêmeas no estro (N = 76) e 82% (N = 100) para fêmeas C57Bl/6 no estro com esta técnica.
Discussion
Os 3Rs são um marco ético para o uso de animais em pesquisas, conforme descrito em 1959 por Russel e Burch em "The Principles of Humane Experimental Technique"15. Os 3Rs representam substituição, redução e refinamento no uso animal. Os protocolos destacados aqui estão alinhados com os 3Rs. A técnica de manipulação cervical reduz o número de animais necessários por não necessitar mais do uso de machos para produzir fêmeas pseudogestantes. A técnica também elimina a necessidade de realização de vasectomias nos machos, proporcionando refinamento por reduzir a dor e o sofrimento. As técnicas de reprodução assistida aqui descritas (inseminação artificial e transferência de embriões) não são cirúrgicas e, portanto, ambas proporcionam um refinamento de 3Rs por reduzir a dor e o sofrimento8causados por suas alternativas cirúrgicas.
O uso de fêmeas pseudogestantes é necessário para a recuperação de filhotes ao realizar reprodução assistida em camundongos1. O procedimento de MC é um método eficaz para a produção de fêmeas pseudogestantes, mas a sincronização da fase do ciclo estral das fêmeas receptoras é um primeiro passo crítico no processo. A sincronização estral pode reduzir drasticamente o número de fêmeas necessárias na colônia para preparar potenciais receptoras e auxilia na produção de fêmeas pseudogestantes cronometradas sob demanda. O uso de uma dose baixa de hormônios não parece causar efeitos deletérios na recuperação de ninhadas vivas em camundongos CD1. Deve-se tomar cuidado com outras cepas para encontrar a combinação hormonal e de concentração que produz as fêmeas receptoras de melhor qualidade para os embriões ou espermatozoides transferidos. A sincronização pode ser obtida usando PMSG e hCG16, mas doses que produzem fêmeas superovuladas podem não ser apropriadas para uma gestação sustentada17.
Para determinar se uma fêmea está em cio, uma avaliação citológica foi realizada neste trabalho. A fase estral também pode ser avaliada pela observação da abertura vaginal11,18. Embora este método seja extremamente útil e possa ser usado por si só ou como confirmação, é mais subjetivo do que o uso da citologia. A citologia vaginal sem coloração é rápida e eficaz para a escolha de fêmeas no cio, pois as células epiteliais cornificadas podem ser facilmente identificadas. Nesse protocolo, a avaliação citológica é realizada previamente ao MC para determinação de potenciais receptores. É importante realizar citologia prévia ao MC, pois o procedimento tende a fragmentar as células arrancadas da área vaginal, dificultando a identificação. A avaliação citológica para pseudogravidez ou gravidez pode ser realizada aos 3,5-11,5 dias pós-MC (dpcm) por 3 dias consecutivos. O perfil de uma fêmea cicladora de estro deve ter pelo menos 1 dia com infiltração considerável de células epiteliais cornificadas. Fêmeas pseudográvidas/grávidas devem apresentar um perfil de diestro (principalmente leucócitos com números de células potencialmente baixos) por 3 dias consecutivos.
Com o desenvolvimento da técnica de MC, alguns camundongos mostraram-se mais receptivos ao procedimento do que outros. Camundongos fêmeas CD1 são excelentes candidatas por causa de sua natureza calma e excelentes instintos nutritivos. Esta cepa é de fácil manuseio e apresenta bom desempenho durante as técnicas de MC e reprodução assistida não cirúrgica. Camundongos C57Bl/6 tendem a ser mais agressivos e menos nutritivos. Embora esse protocolo tenha efetivamente produzido fêmeas C57Bl/6 pseudográvidas usando MC, elas foram menos propensas a serem consistentemente permissivas ao procedimento. Isso pareceu correlacionar-se um pouco com a fase estral durante o MC. As fêmeas no estro ou proestro foram mais receptivas. O uso de um tubo de enriquecimento para o animal entrar permitiu o acesso à vagina para o procedimento e ajudou a acalmar a fêmea. O procedimento em si não restringe totalmente a fêmea, então o animal pode se afastar a qualquer momento. Se isso ocorrer, o animal pode ser reposicionado, e o procedimento pode então ser continuado. O tempo do procedimento pára se a fêmea se afasta e retoma quando o procedimento é retomado. Fundamentais para o sucesso do procedimento são a fase do ciclo estral (proestro e estro tardios) e o contato da haste com o colo do útero. A vibração do aparador fornece CM padronizado. Para garantir o contato com o colo do útero, uma pressão suave é aplicada à haste, e o posicionamento da haste contra o colo do útero é assegurado com pequenos movimentos de vai e vem da haste.
O uso de MC melhorou o protocolo de AINE, pois fêmeas na fase correta do ciclo estral podem ser escolhidas antes da transferência espermática, e o protocolo não depende mais do acasalamento com machos vasectomizados. A sincronização do ciclo estral da inseminação artificial é cronometrada de tal forma que a maturação oocitária corresponde à transferência de espermatozoides na manhã do dia 4. Fundamental para o sucesso do protocolo é a adaptação do momento da ovulação para que a fecundação possa ocorrer. Deve-se tomar cuidado para administrar hCG 15-17 h antes da transferência esperada de espermatozoides, como é sugerido para os horários utilizados para fertilização in vitro 1. A qualidade da amostra de esperma afetará diretamente o resultado da inseminação artificial. Espermatozoides frescos que foram capacitados terão melhor desempenho. Espermatozoides criopreservados de boa qualidade podem produzir embriões fertilizados in vivo. No entanto, deve-se tomar cuidado com a transferência direta de espermatozoides descongelados, pois crioprotetores residuais transferidos para o corno uterino podem inibir a implantação (observações não publicadas).
O uso do MC em conjunto com a transferência embrionária é conceitualmente de fácil adaptação. A sincronização do ciclo estral reduz o número de fêmeas necessárias para a produção do pool receptor. A determinação do estágio estral anterior ao MC aumenta a probabilidade de obtenção de receptoras pseudogestantes. Uma desvantagem do método é que a citologia das receptoras no momento da transferência do embrião está em um estágio de fluxo. Todos os tipos celulares estão presentes se a fêmea estiver fazendo a transição do cio para o perfil de pseudogravidez, e a pseudogravidez só se torna óbvia se a citologia for rastreada por vários dias. Com base no sucesso (>80%) da transição do cio para pseudogestação para camundongos CD1 e C57Bl/6, espera-se que este método seja adequado para receptoras de transferência de embriões. Os resultados preliminares mostram bom sucesso com a limitada transferência não cirúrgica de embriões. Em geral, a eficiência da transferência não cirúrgica de embriões é comparável à da técnica cirúrgica4,5, e a transferência não cirúrgica pode substituir as transferências cirúrgicas de embriões na fase de blastocisto. Para embriões em estágio inicial, a cultura de embriões para o estágio de blastocisto é necessária. No entanto, se a transferência cirúrgica for preferida, é possível adaptar a técnica de MC ao momento correto necessário para receptoras apropriadas de pseudogestantes2. Em geral, as receptoras de embriões estão 1 dia menos avançadas que o embrião. Por exemplo, os blastocistos são colhidos a 3,5 dpc de doadores e transferidos para receptores de 2,5 dpc. Portanto, o MC precisará ser realizado de forma que a receptora esteja em um estado pseudogestante menos desenvolvido do que os embriões.
Em conclusão, a técnica de MC aqui descrita mostra-se excelente para integração com outras técnicas de reprodução assistida para camundongos. Fornecemos protocolos bem sucedidos para inseminação artificial e transferência de embriões usando técnicas não cirúrgicas. Em combinação, a técnica de MC proporciona vantagens de 3Rs, incluindo (1) uma redução no número de animais pela eliminação da necessidade de machos vasectomizados e (2) um refinamento das técnicas pela substituição de técnicas cirúrgicas por alternativas não cirúrgicas.
Disclosures
Barbara Stone e Sarah Srodulski trabalham na ParaTechs Corporation, Lexington, KY, EUA. A ParaTechs detém direitos exclusivos de licenciamento para fabricar o dispositivo mNSET para ratos. A ParaTechs Corp desenvolveu e vende os dispositivos mNSET e mC&I, que podem ser usados para transferência não cirúrgica de embriões e inseminação artificial não cirúrgica, respectivamente.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Escritório do Diretor, Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa, dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R43OD020304 e pelo Instituto Nacional de Saúde dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R44MH122117. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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