유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

미생물군(즉, 고세균, 박테리아, 진핵생물 및 바이러스)은 개인의 장 장벽, 상피 표면 및 점액 기능 내에서 공생적 상호 작용을 통해 생리학적 및 병리학적 과정에 영향을 미침으로써 숙주의 건강을 유지하고 다양한 질병의 발병에 기여하는 데 중요한 역할을 합니다 ^1,2,3. 유아기에서 청소년기, 성인기, 노화기에 이르기까지 다양한 생애 단계에 걸친 미생물군의 구성과 비강, 구강, 피부 및 장 부위와 같은 다양한 위치에 존재하는 미생물총은 다양한 서식지와 환경에 의해 동적으로 형성됩니다⁴. 유기체의 장내 미생물군은 영양소 흡수, 면역 반응, 병원체 침입, 대사 조절 등에 관여합니다 ^5,6. 환자에 대한 연구에 따르면 장내 미생물군의 교란은 인간의 비만, 수면 장애, 우울증, 염증성 장 질환(IBD), 신경 퇴행성 질환(파킨슨병, 알츠하이머병), 노화 및 다양한 암과 관련이 있습니다 ^7,8,9. 또한, 장내 미생물군과 숙주 사이의 상호 작용 경로에는 염증 요인, 신경 전달 물질, 대사 산물, 장 장벽 및 산화 스트레스가 포함되며, 이는 생쥐와 어류 모델을 사용한 이전 연구에서 관찰되었습니다^10,11.

최근에는 임상 및 동물 모델에서 이러한 질환에 대한 잠재적인 프로바이오틱스 및 분변 미생물군 이식(FMT)을 포함한 여러 박테리아 관련 접근법 또는 치료법이 탐구되었습니다. 이러한 탐색은 미생물군-장-뇌/간/신장 축, 미생물군 유래 산물 및 변형된 수용체 활성과 관련된 발견을 기반으로 합니다^12,13. 그러나 미생물군 숙주 시스템의 개발, 다양한 기능 및 메커니즘은 미생물 군집의 복잡성과 강력한 인간과 유사한 질병 모델을 생성해야 하는 과제로 인해 여전히 완전히 이해되고 식별되지 않습니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 19^세기 중반에 무균(GF) 동물 모델이 긴급히 제안되었으며 주로 20^세기에 개발되었습니다. 미생물 검출 및 관찰 기술의 발전과 함께 항생제 처리 및 gnotobiotic 모델을 포함한 후속 개선은 이러한 모델을 더욱 완성했습니다 14,15,16. 자신의 배경을 지우고 환경 미생물을 피함으로써 만들어진 GF 동물은 미생물과 숙주 사이의 상호 작용을 탐구하기 위한 훌륭한 전략을 제공한다¹⁷. 동물 모델과 정제된 프로토콜의 적용을 통해 연구원들은 GF 마우스와 어류의 환자에서 발견되는 유사한 미생물 구성을 성공적으로 복제했습니다. 또한, 개, 닭, 돼지와 같은 다른 GF 동물 모델은 연구 대상(^18,19,20,21)으로서 다양한 옵션을 제공한다. 이 접근법은 인간의 암 면역 요법을 포함하여 다양한 질병에 대한 공생 마이크로바이옴의 잠재적 치료 효과에 대한 연구를 가능하게 했습니다^16,18. GF 모델은 숙주 내 특정 박테리아 집락화, 이동, 증식 및 상호 작용의 특성과 메커니즘에 대한 보다 정확한 통찰력을 제공합니다. 이는 미생물총(microbiota) 관련 질병의 발생 및 발병에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다^22,23. 미생물 연구에서 GF 제브라피시를 확립하고 적용하는 역사는 2004년 Rawls et al.과 2006년 Bates et al.의 보고서에서 2017년 Melancon et al.의 프로토콜(16,24,25)로 발전했습니다. 그러나 성체 또는 번식 GF 모델의 실현 가능성은 여전히 장기간의 과정이며 다양한 수명, 성공률 및 건강 문제를 수반합니다.

다양한 동물 모델 중에서 제브라피시(Danio rerio)는 인간 장기 및 유전체학과의 유리한 유사성, 짧은 발달 주기, 높은 번식력 및 투명한 배아로 인해 기초 및 생물 의학 연구 모두에 중요한 도구로 두드러집니다^19,26. 제브라피쉬는 신뢰할 수 있는 인간 질병 모델 역할을 하며, 생체 내에서 생리학적 및 병리학적 과정을 시각적으로 표현하여 숙주-미생물 상호 작용의 매력적인 특징에 대한 통찰력을 제공합니다. 특히, 제브라피쉬는 뚜렷한 세포 계통을 나타내어 장 생리학, 미생물 역학, 생식선 및 생식 발달, 숙주 면역 체계의 성숙, 행동 및 신진대사를 이미징할 수 있습니다²⁷. 제브라피시 배아는 부화할 때까지 보호 융모막 내에서 발달하여 수정 후 3일(dpf)에 유충이 됩니다. 그들은 5 dpf에서 적극적으로 먹이를 사냥하고 수정 후 약 3 개월 (mpf) ²⁸ 성적 성숙에 도달합니다. Rawls et ^al.24에 의해 보고된 최초의 성공적인 무균(GF) 제브라피쉬는 난황 흡수 후 오토클레이브 사료를 먹인 유충이 8 dpf에서 조직 괴사와 20 dpf에서 총 폐사를 나타냈다는 것을 보여주었습니다. 이는 장기(>7 dpf) GF 물고기를 대상으로 한 실험에서 식이요법의 효과 또는 외인성 영양소 공급을 고려하는 것의 중요성을 나타냈다²⁹. 후속 연구는 다양한 물고기 모델에서 완성된 멸균 식품과 방법을 사용하여 GF 물고기의 생성 프로토콜을 개선했습니다¹⁶.

그러나 GF 제브라피시 모델에 대한 대부분의 연구는 24시간에서 48시간 동안 5dpf에서 세균 감염을 포함하는 초기 생애 단계에 초점을 맞추었으며, 실험 종료 시 7dpf 이전에 수집된 샘플은 25,30,31입니다. 인간과 제브라피시를 포함한 유기체의 미생물총(microbiota)은 생명이 시작될 때 군락을 이루고 성장과 발달 과정에서 형성된다는 것은 널리 알려진 사실입니다. 이 조성은 성인 단계에서 안정적으로 유지되며, 숙주에서 미생물군의 역할은 특히 노화, 신경 퇴행성, 대사 관련 비만 및 장 질환 측면에서 일생 동안 매우 중요합니다³. 따라서 생존 기간이 더 긴 GF 동물의 관점은 어린 시절 어류 유충의 미성숙한 면역 및 생식 시스템을 고려할 때 숙주 기관 발달 및 기능에서 미생물 역할의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 제브라피쉬 장의 박테리아 균주는 이전 연구에서 분리 및 확인되어 GF 동물 모델을 감염시켜 프로바이오틱스를 선택하거나 숙주^19,25에서 박테리아 기능을 연구할 수 있는 가능성을 제공했지만, GF 피쉬 모델의 생성 및 적용은 주로 초기 생애 단계로 제한되어 왔습니다. 복잡한 생산 공정, 높은 유지 보수 비용, 식품 및 면역과 관련된 문제로 인한 이러한 한계는 숙주에서 미생물군의 발달 및 만성 영향을 조사하기 위한 연구 노력을 방해합니다.

특히 무균(GF) 모델에서 어류의 생존율, 행동, 성장, 성숙 및 전반적인 건강은 초기 유충에서 유년기에 이르기까지 입을 벌리고 있는 기간 동안의 영양 섭취 및 흡수를 포함하는 먹이 관행에 의해 크게 영향을 받는다^32,33. 그러나 GF 어류 사육의 과제 중 하나는 적절한 멸균 식단이 부족하여 유충의 성장과 생존을 유지하기 위한 영양 지원의 효과를 제한한다는 것입니다. 이 문제를 해결하는 것은 장내 미생물군집의 부재로 인한 발달 방어 메커니즘과 약한 소화 능력을 고려할 때 GF 물고기의 생명을 회복하는 데 매우 중요합니다. 먹이 측면에서 살아있는 소금물 새우 (Artemia sp.)는 어린 물고기에게 입을 벌리고 있는 유충에게 가장 적합한 식단으로 부상하고 있습니다. 살아있는 소금물 새우를 먹인 물고기는 조리된 달걀 노른자 또는 기타 천연 및 합성 미끼를 먹인 물고기에 비해 더 높은 성장률과 생존율을 보이는 것으로 관찰되었습니다³⁴. GF 물고기의 초기 모델은 노른자 지원으로 생존할 수 있고 GF 유충 모델은 멸균 공급으로 유지할 수 있지만 유충에서 유년기에 이르기까지 장기적인 모델을 생성하고 성적 성숙에 도달하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 또한 플레이크 또는 분말 식품은 불균등한 영양 구성으로 인해 제한되며 수질에 영향을 미칠 수 있습니다. 대조적으로, 살아있는 쑥은 바닷물과 담수 모두에서 생존하고, 유충에서 성충까지 적합한 작은 크기, 배치의 용이성, 더 높은 부화 품질 등의 장점이 있습니다³⁵. 이전 방법 16,24,30을 기반으로 우리는 복잡한 처리 과정을 단순화하고 쉽게 배양할 수 있는 GF 살아있는 Artemia sp.를 초기 생전 GF 물고기보다 더 오랜 기간 동안 멸균 식품으로 설정함으로써 다이어트 문제를 해결했습니다.

이 연구는 (1) 생성, (2) 유지, (3) 멸균 속도 식별, (4) 무균(GF) 제브라피쉬의 배아에서 유충 및 유년기 성장까지 보장하기 위한 유지 관리 및 먹이를 포괄하는 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 결과는 GF 제브라피쉬의 부화, 생존, 성장 및 불임에 대한 예비 증거와 함께 GF Artemia sp.에 대한 필수 지표를 제공합니다. 멸균 생식품의 모델 생성 및 준비에 대한 자세한 단계는 장기 GF 물고기 모델을 구성하고 적용하는 데 중요한 기술 지원을 제공할 뿐만 아니라 미생물군-숙주 상호 작용 연구에서 GF Artemia sp.를 제공합니다. 이 프로토콜은 GF 물고기 모델에 대한 박테리아 분리, 식별 및 감염을 다루고, 박테리아 형광 라벨링 방법을 설명하고, 현미경으로 물고기 내장에서 집락을 관찰합니다. GF 물고기, 박테리아 감염이 있는 gnotobiotic 물고기 또는 이식된 인간 미생물군 모델은 숙주 면역, 소화, 행동, 전사체 조절 및 대사 측면에 대한 기능과 효과를 설명하기 위해 다양한 검출을 거칩니다. 장기적으로 이 프로토콜은 해양 메다카와 같은 다양한 야생형 어종으로 확장될 수 있으며, 잠재적으로 특정 조직이나 질병과 관련이 있는 다른 선택된 형질전환 제브라피시 계통으로 확장될 수 있습니다.

물고기 실험은 중국 충칭 동물 관리 및 사용 위원회와 중국 충칭 의과대학 기관 동물 보호 및 사용 위원회의 지침과 국가 품질 기술 감독국(승인 ID: GB14922-2001 - GBT14927-2001)에서 발행한 실험 동물 표준에 따라 수행되었습니다. 제브라피시(Danio rerio, 야생형, AB 균주)는 중국과학원(Chinese Academy of Sciences)의 수생물학 연구소(Institute of Hydrobiology)에서 공급받았으며, 이전에 보고된 절차에 따라 실험실에서 관리되었다³⁶.

1. 성체 제브라피시 유지 및 배아 채취

참고: 이전 연구 및 보고서 16,37,38,39의 수정 사항을 바탕으로 우리 실험실에서 성체 제브라피시, 유충 사육 및 무균(GF) 모델에 대한 관행의 유지 관리는 아래에 설명된 단계에 따라 수행되었습니다. 어류 양식을 위한 초순수 흐름 시스템은 상업적으로 획득되었습니다(재료 표 참조). 균형 잡힌 pH, 염분 및 알칼리로 유지되는 물은 깨끗한 상태를 보장하기 위해 사이클링 중에 여과를 거칩니다.

1. 어두운 광주기로 자동 순환 시스템 ( 재료 표 참조)에서 다음 표준 절차에 따라 성인 물고기를 유지하십시오 : 빛 = 10 시간 : 28 ° C ± 0.5 ° C에서 14 시간 및 신선한 배양 된 Artemia sp. 하루 2회.
2. 성적으로 성숙한 성인 제브라피시(수컷: 암컷 = 2:1)를 전날 밤에 신선하고 깨끗한 물이 있는 수조에 넣습니다.
3. 물고기가 다음날 아침(대략 오전 8시 30분)에 실험실에서 정기적인 가벼운 자극을 받아 산란하도록 합니다. 1-2시간 후 물고기를 다른 수조로 옮깁니다.
4. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 배양 접시의 사육 배지로 자동 순환 시스템에서 배아를 물로 수집합니다.

2. 배아에서 유충으로 GF 제브라피쉬의 생성

참고: 무균(GF) 어류를 생성하는 절차는 그림 1에 요약되어 있으며, 일반(CR) 및 GF 모델의 기본 발달 지수는 보충 그림 1에 나와 있습니다. 클린룸에서 멸균 무균 기술을 사용하여 탁상용 생물 안전 캐비닛 또는 층류 후드에서 아래에 설명된 단계를 따르십시오.

1. 물고기 배양수를 사용하여 배아를 씻고 배설물, 불순물, 죽은 난자 또는 수정되지 않은 난자를 제거합니다.
2. 2hpf의 배아를 무항생제 무균 제브라피시 배지(AB-GZM, 재료 표 참조) 용액으로 채워진 멸균 플레이트(직경 10cm의 멸균 접시당 최대 480개의 배아)로 옮기고 28.5°C에서 6-8시간 동안 배양합니다.
   참고: AB-GZM은 표면 미생물을 제거하기 위해 몇 시간 동안 배아를 처리하는 데 사용되며 항생제가 없는 GZM은 GF 물고기를 아염기서열로 배양하는 데 사용됩니다. 일반적으로 완벽한 배양 시간은 6시간입니다.
3. 흰 반점이나 희끄무레한 모양의 계란은 제외하고, 정상적으로 발달한 계란을 선택하여 추가 처리를 위해 투명하고 손상되지 않은 봉투를 표시합니다.
4. AB-GZM을 사용하여 10분 이내에 배아를 세 번 헹굽니다.
5. 배아를 0.2g/L 포비돈-요오드 용액(PVP-I)에 1분 동안 담그십시오( 재료 표 참조).
   참고: 더 높은 농도와 2분 이상은 배아의 죽음과 부화 속도에 영향을 미칩니다.
6. 무균 제브라피시 배지(GZM)를 사용하여 10분 이내에 3회 배아를 세척합니다.
7. 차아염소산나트륨(NaClO) 작업 용액에 배아를 넣고 50mL 미세 원심분리기 튜브를 단단히 덮고 15분 동안 표백합니다. 이 기간 동안 배아를 부드럽게 흔들어 표백제 용액에 현탁시킵니다.
8. GZM을 사용하여 10분 이내에 배아를 세 번 세척합니다.
9. 배아를 웰당 5개의 배아와 10mL의 GZM이 있는 멸균 6웰 플레이트로 옮깁니다. 광주기가 어두운 매우 깨끗한 플랫폼 또는 인큐베이터에서 배양하십시오 : 빛 = 10 시간 : 28 ° C에서 14 시간 ± 0.5 ° C. 배양 밀도는 멸균 속도에 영향을 미칩니다.
10. 사용한 GZM을 제거하고, 멸균 상태 검출을 위한 샘플로 수집하고, 각 웰에 동일한 부피의 멸균 GZM을 보충하여 배양 배지를 매일 갱신합니다.
11. 생존율, 부화율, 심장 박동, 몸 길이 및 체중 등을 포함한 GF 배아/유충의 기본 발달 지표를 기록한다¹⁹.
12. GF 물고기를 부피가 확장된 적절한 용기(접시, 세포 배양 플라스크 또는 덮개가 있는 유리병)로 옮겨 성장 과정 전반에 걸쳐 멸균 식품을 제공합니다.

3. GF 제브라피쉬의 유충에서 유충까지 유지 관리

1. 7 dpf 전에 수유하지 않고 GZM을 갱신하고 매일 멸균 상태를 감지합니다(5단계 참조).
2. GZM을 교체하기 전에 매일 한 번 멸균 계란 노른자(웰당 10μL 준비된 원액)를 8dpf에서 유년기까지 제브라피시 유충에게 먹이십시오.
3. 14 dpf의 GF 청소년에게 GF Artemia sp.와 혼합 된 멸균 된 달걀 노른자를 먹이십시오. 하루에 한 번 ( 1-3 Artemia / 유충, 4 단계 참조), GF 물고기의 성장과 발달에 따라 점차적으로 먹이 질량을 늘립니다.
4. 모든 물고기가 Artemia nauplii를 섭취할 수 있을 때까지 달걀 노른자를 제공하십시오.
   참고: GF Artemia 는 사용하기 전에 멸균 테스트를 받아야 합니다. 남은 쑥 의 수를 평가하고, 추격 및 포획 진행 상황을 관찰하고, 섭취한 먹이와 함께 물고기 몸체를 검사하여 먹이 섭취 성공을 나타냅니다.
5. 28 dpf에서 초기 성인 단계까지 GF Artemia 를 하루에 한 번 먹이고( 3-5 Artemia/유충) 미개척 또는 죽은 Artemia와 죽은 물고기를 매일 샘플로 폐기물 GZM에 청소합니다.
6. GF 물고기가 자라는 동안 7dpf 후 6웰 플레이트를 멸균 플레이트 또는 세포 배양 플라스크로 8에서 21dpf로 변경한 다음 21dpf 후에 멸균 병으로 변경합니다. 각 용기에 있는 GF 물고기의 수와 무게에 따라 배양 배지와 음식 질량을 늘립니다.
7. GZM을 매일 갱신하고 샘플을 확인하여 GF 모델의 성공을 보장합니다.
   참고: 초기 성인이 되고 성적 성숙이 될 때까지 무균(GF) 어류 모델을 유지하는 것은 어려운 일이며, 평균 생존율은 30dpf로 낮으며 일반적으로 10% 미만입니다. 이는 주로 면역력 약화, 발달 지연, 장 기능 장애에 기인합니다.

4. 만성 GF 물고기 모델을 위한 멸균 식품으로서의 GF Artemia nauplii 의 준비

참고: 무균(GF) 아르테미아 의 배양 및 준비 방법은 그림 2에 요약되어 있습니다. 다음 단계는 모두 멸균 무균 기술을 사용하여 탁상형 생물 안전 작업대에서 수행됩니다.

1. 0.25g/L 차아염소산나트륨(NaClO, 재료 표 참조)을 사용하여 0.25g의 쑥 낭종을 5분 동안 헹굽니다.
2. 헹군 쑥 낭종을 멸균 된 초고밀도 필터 (조리개에 약 170 메쉬)로 여과하고 멸균 된 초순수로 1-2 분 동안 3 번 세척합니다.
3. 세척된 쑥 낭종을 2.5% 멸균된 식염수 100mL에 옮기고 혼합한 다음 아래에 언급된 단계에 따라 무균 부화를 위해 포장합니다.
4. 50mL 처리된 아르테 미아 낭종 혼합물 용액을 100mL 용량의 멸균 병에 포장하고 필름으로 밀봉한 다음 150rpm, 30°C에서 18시간에서 24시간 동안 빛으로 진탕 인큐베이터에서 배양합니다.
5. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 중간 및 하부층에서 약 30mL의 부화 Artemia nauplii 를 추출합니다.
   알림: 떠다니는 계란과 빈 껍질이 상층에 도달하지 않도록 하십시오. 무균(GF) 아르테미아 낭종과 24시간 동안 배양된 나우플리의 지수는 그림 3에 나와 있습니다.
6. 살균 필터로 쑥 을 여과하고 살균 초순수로 살균 비커에 살균 초순수로 3 회, 매번 약 30 초에서 1 분 동안 세척합니다. 마지막으로 멸균된 초순수 4mL를 추가하여 아르테미아 혼합 용액을 준비합니다.
7. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층에서 활발하게 헤엄치는 쑥 을 회수하고 세척하고 수유 및 무균 식별을 위해 nauplii 용액을 준비합니다.

5. 전체 생애 단계에서 GF 물고기 모델 식별

참고: 무균(GF) 어류의 전체 수명 단계에서 주요 지표와 일일 샘플 검출은 모델의 성공을 보장하는 데 매우 중요합니다. 이 단계에서는 샘플의 일반적인 분류와 일반적인 식별 방법을 요약합니다(그림 4).

1. 매일 GF 제브라피시 유충의 생존 상태와 속도를 관찰하고 계산합니다. 관련 비율을 계산하는 실험에서 GF 물고기는 24 또는 48 웰 플레이트에서 양식되며 웰 당 하나의 물고기가 있습니다.
   1. 생존율 = (관찰 시점의 활어 수 / 총 알 수) × 100 %.
   2. 멸균률 = (멸균 어류 수 / 생존 어류 수) × 100%.
      참고: 이 프로토콜은 활어의 멸균 속도에 중점을 둡니다. 멸균 물고기의 수는 살아있는 물고기 중에서 여러 번 확인한 후 성공적인 GF 물고기를 계산하여 결정됩니다. 박테리아의 존재로 인해 실패한 죽은 물고기 또는 활물고기 GF 모델은 후속 GF 절차 중에 제거됩니다.
2. 다음 GF 제브라피쉬 유충 샘플을 수집합니다.
   1. 각 우물 또는 병 용기에서 추출한 GF 제브라피쉬의 배양 배지.
   2. 멸균 달걀 노른자 및 GF Artemia와 같은 생선 식품.
   3. 부화 후 난자 막 조각과 유충에서 어린 물고기에 이르기까지 먹이 기간 동안의 음식물 찌꺼기 또는 배설물을 포함한 폐기물 매체.
   4. 박테리아의 존재를 확인하기 위한 죽은 물고기 샘플.
   5. 메마른 통제로 배아 처리에서 이용되는 물고기 매체 그리고 대리인.
   6. 재료, 운영 플랫폼 및 인큐베이터 등의 샘플.
3. 여러 방법을 사용하여 매일 수집되는 시료를 검출합니다.
   1. 먼저 spread plate 방법과 배양 플레이트를 30°C의 인큐베이터에서 사용합니다.
      1. 호기성 조건에서 Trypticase Soy Agar (TSA) 플레이트( 재료 표 참조)에 20-50 μL의 폐기물 배지 샘플로 코팅합니다.
      2. 혐기성 조건에서 TSA 플레이트에 20-50 μL의 폐기물 매체 샘플로 코팅합니다.
      3. 호기성 조건에서 혈액 TSA 플레이트( 재료 표 참조)에 20-50μL의 폐기물 배지 샘플로 코팅합니다.
      4. 혐기성 조건에서 혈액 TSA 플레이트에 20-50 μL의 폐기물 배지 샘플로 코팅합니다.
   2. 둘째, 액체 배양법을 사용합니다.
      1. 200 μL의 시료를 Brain Heart Infusion Broth (BHI) 배지( 재료 표 참조)를 사용하여 호기성 튜브에 넣고 30 °C, 150-180 rpm의 진탕 인큐베이터에서 배양합니다.
      2. BHI 배지를 사용하여 혐기성 튜브에 200μL의 샘플을 추가하고 30°C의 인큐베이터에서 배양합니다.
      3. 트립티케이스 대두 육수(TSB) 배지가 있는 호기성 튜브에 200μL의 시료를 추가한 다음 30°C, 150-180rpm의 진탕 인큐베이터에서 배양합니다.
      4. TSB 배지를 사용하여 혐기성 튜브에 200μL의 샘플을 추가하고 30°C의 인큐베이터에서 배양합니다.
   3. 셋째, 분자 기술-16s 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석을 사용합니다.
      1. 두 쌍의 프라이머 27F 및 1492R과 63F 및 1387R을 사용하여 폐수 샘플을 분석합니다(표 1).
         참고: PCR 마스터 믹스는 상업적으로 이용가능한 DNA 중합효소 키트(재료 표 참조)를 사용하여 표 2에 따라 제조하고, PCR 기계는 표 3에 명시된 프로그램으로 설정하였다.
      2. PCR 프로그램이 완료된 후, 1465 bp (프라이머 27F 및 1492R 사용) 또는 1324 bp (프라이머 63F 및 1387R 사용)의 타겟 밴드에서 1 % 아가로스 겔 전기 영동⁴⁰ 으로 제품을 검사하여 샘플의 무균 상태를 추론합니다.
4. 24시간에서 3일 및 7일까지의 플레이트 및 배지 배양을 포함한 무균 테스트를 기록하고 관찰하며, 이 기간 동안 플레이트에 집락이 없고 액체에 탁도가 없다는 것은 GF 모델의 성공적인 구성을 나타냅니다. 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간, 168시간에서 플레이트와 매체를 관찰하고 기록합니다.

6. GF 물고기를 먹기 전에 GF Artemia 샘플 식별

알림: GF 물고기를 먹기 전에 생식품으로 없어서는 안 될 GF Artemia 샘플을 검출하려면(그림 4) 아래 단계를 따르십시오.

1. GF Artemia 모델의 샘플을 수집합니다.
   1. 치료되지 않은 쑥 낭종.
   2. 치료된 GF 아르테미아 낭종.
   3. 부화 GF Artemia nauplii.
   4. 대조군으로 멸균된 초순수.
2. 다음과 같은 방법으로 GF Artemia 를 검출합니다.
   1. 스프레드 플레이트 방법을 사용하여 호기성 및 혐기성 조건에서 TSA 플레이트 및 혈액 TSA 플레이트에 샘플을 코팅하여 검출합니다. 30 °C에서 배양합니다.
   2. 액체 매체를 사용하여 호기성 및 혐기성 TSB 및 BHI 튜브의 샘플을 검출합니다. 150-180 rpm, 30 °C에서 쉐이커에서 배양.
   3. PCR 분석을 사용하여 16s 리보솜 RNA 표적 유전자 프라이머 27F 및 1492R, 63F 및 1387R을 사용하여 수집된 샘플에서 박테리아의 존재를 검출합니다(표 1). 볼륨과 프로그램은 표 2 와 표 3에 나와 있습니다.
3. 결과 기록: 1465 bp (프라이머 27F 및 1492R 사용) 또는 1324 bp (프라이머 63F 및 1387R 사용)를 측정하는 타겟 밴드에 대해 1% 아가로스 겔 전기영동⁴⁰ 으로 PCR 산물을 검출합니다. 플레이트와 액체 매체의 결과는 GF 생선 식품으로 사용되기 전에 GF Artemia 의 무균 상태를 보장할 수 있습니다.

7. 제브라피쉬에서 장내 세균 균주의 분리 및 식별

참고: in vitro 및 in vivo의 장 기능을 조사하려면 GF 동물을 사용하여 감염에 의해 스크리닝된 잠재적인 프로바이오틱스의 종 공급원을 제공하는 제브라피시에서 박테리아 균주를 분리해야 합니다(그림 5). 이 프로토콜에서는 장 내용물을 얻기 위한 전통적인 해부 방법을 설명하며, 샘플은 마취된 살아있는 물고기에서 직접 수집할 수도 있습니다(데이터는 표시되지 않음).

1. 건강한 성인 제브라피시를 선택하고 멸균수로 씻으십시오. 클린 벤치에서 다음 단계를 수행합니다.
2. 100mg/L MS-222로 5-10분 동안 물고기를 마취합니다.
3. 물고기의 신체 표면을 치료하기 위해 75% 알코올을 사용하십시오.
4. 생선 내장을 절개하고 TSB 또는 BHI 배지로 장 내용물을 압출합니다.
5. 호기성 및 혐기성 조건에서 TSA, 혈액판, TSB 및 BHI 배지를 적용하여 장 상층액을 배양합니다.
6. 박테리아를 번역하여 신호 변형률을 얻고 다른 콜로니의 특성을 기록합니다.
7. -80 °C에서 30 % 글리세롤 이내의 박테리아를 보관하십시오.
8. 그런 다음 게놈 DNA 추출 및 PCR 염기서열 분석을 통해 장내 세균을 식별합니다.
   참고: 박테리아 게놈 DNA 추출의 주요 단계에는 액체 원심분리, RNase A 및 프로테아제 K 해리, 에틸 알코올 추출, 헹굼 및 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용한 용해가 포함됩니다( 재료 표 참조).
9. NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 Bacteria and Archaea 데이터베이스^40,41(재료 표 참조)과 함께 16S 염기서열을 분석합니다.
10. 가장 잘 일치하는 박테리아와 특성을 선택하여 속 수준에서 분리된 장내 균주를 식별합니다.
11. 시판되는 키트를 사용하여 박테리아 균주의 대사 기능을 검출합니다( 재료 표 참조).

8. GF 제브라피시 장에 있는 박테리아의 독감 라벨, 감염 및 집락화

참고: GF 제브라피시를 감염시키기 전에 분리된 박테리아를 염료로 변형하고 계수하여 미생물 집락화 및 이동을 연속적으로 그리고 생체 내에서 볼 수 있도록 했습니다(그림 6).

1. 숙주에 풍부하게 존재하는 잠재적인 유익한 박테리아 또는 우성 균주를 선택하여 GF 물고기 모델을 감염시킵니다.
   참고: 이 연구에 사용된 박테리아는 Aeromonas sp. 및 Vibrio sp.( 재료 표 참조)로, 실험실에서 성체 야생형 제브라피시에서 분리 및 식별된 8개 속에서 선택되었습니다(⁴²).
2. CM-Dil 염료로 신선한 박테리아를 라벨링하고(재료 표 참조) 10 6-10⁸ 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 농도로 5dpf의 GF 제브라피시에 노출시킵니다.
3. 형광 현미경으로 3× 배율로 형광을 관찰하여 6dpf 및 14dpf의 GF 제브라피시 유충의 장에서 박테리아의 집락화 및 분포를 나타냅니다.
4. 각 시점에서 플레이트 배양별로 GF 물고기의 박테리아 수를 수동으로 계산합니다.
5. 콜로니와 염기서열을 검출하여 표적 박테리아 균주에 대한 감염이 성공적이었는지 확인합니다.
6. 신경 행동, 발달 지표, 조직 병리학적 분석 및 호르몬 측정 등을 포함한 후속 분석을 위해 박테리아 감염이 있는 GF 물고기의 샘플을 수집합니다 43,44,45.
   참고: 감염 실험에 사용된 박테리아는 새로 회수하여 액체 배지로 신선하게 배양해야 합니다.

GF 제브라피쉬 모델은 제브라피쉬 쌍에 의해 산란되는 풍부한 알을 활용하여 효율적으로 생산할 수 있으며, 이전 GF 피쉬 모델(35)을 기반으로 최적화된 프로토콜로 생산할 수 있습니다. 단일 6웰 플레이트는 약 30-48개의 배아/유충을 배양할 수 있어 충분한 데이터 수집 및 통계 분석이 가능합니다. 멸균 처리 후, GF 배아는 48-72 시간에 유충으로 부화 할 때까지 깨끗한 인큐베이터에서 배양되며, 무균 상태를 유지하는 데 중요한 수집 된 샘플의 검출로 GZM을 매일 변경했습니다 (그림 1). 7 dpf 후에는 유충에서 유년기까지 난황과 살아있는 쑥 의 먹이를 준비해야합니다. 어류의 성장과 발달 과정에서 GZM의 부피, 용기 및 밀도는 멸균 상태의 폐사 및 실패를 방지하기 위해 적시에 조절되거나 변경되어야 합니다. 검출 결과 세균 오염이 나타나지 않으면 성공적인 GF 모델은 청소년기부터 초기 성인기까지 만성 모델로 유지될 수 있지만 실제로는 생존율이 훨씬 낮습니다. 마지막으로, GF 및 CR 어류 모델의 멸균률, 생존율, 발달 지수, 행동, 조직 병리학적 분석 및 전사 프로필을 측정하여 미생물군 및 약물 스크리닝 분야의 영향을 탐색할 수 있습니다. 이 연구에서는 주요 발달 지표를 비교했으며(보충 그림 1), GF 물고기의 부화율은 CR 물고기보다 45.7% 낮았으며 72hpf에서 60%였습니다. 7 dpf에서 GF 유충의 심박수는 22.6 beats/10 s의 CR fish에 비해 18.2 beats/10 s에서 유의하게 낮았지만, 23.5-23.8 beats/10 s의 비율로 14 dpf에서 두 그룹 간에 차이가 없었습니다. 7 dpf에서 GF 어류의 생존율은 86.7 %로 CR 어류와 같았지만 14 dpf에서 60 %로 CR 어류의 80 %에 비해 감소했습니다. 그러나 GF 및 CR 물고기의 생존율은 섭식 능력이나 습관을 습득 한 입 열린 기간 후에 25 % -10 %로 감소했습니다. 물고기의 무균 상태를 유지하지 못한 것이 생존율이 낮은 이유 중 하나였습니다. 따라서 유년기부터 초기 성체기까지 먹이를 주고 영양을 유지하는 것은 어류 양식에서 중요한 과제입니다.

물고기의 성장과 발달에 영향을 미치는 또 다른 핵심 요소는 먹이입니다. 이 연구에서는 청소년 및 성인에게 장기간 GF 제브라피시 유충을 위한 생식품으로 GF Artemia 를 얻는 여러 방법을 탐구합니다( 그림 2 참조). GF 물고기를 위한 음식의 매일 사용으로 인해, GF Artemia 에 대한 최적화된 프로토콜은 실제로 쉽고 시간을 절약하며 경제적이어야 합니다. 현미경으로 관찰한 nauplii 의 적극적인 움직임과 사멸/부동성, nauplii의 특성, 부화되지 않은 알, 껍질을 비교한 후 방법을 완성했습니다. 매일 배양 후 병에서 얻은 신선한 GF Artemia 의 부화, 생존 및 변형률, nauplii의 길이와 무게를 포함한 지표를 현미경으로 관찰하고 측정했습니다(그림 3). 치료 후 쑥 낭종의 부화율은 평균 88.15%로 높았고 , 수영낭 종의 생존율은 77.83%, 기형율은 1.87%였다. 나우플리의 몸길이는 546.70μm, 체중지수는 3.80mg/100으로 유충 개원기부터 유년기 및 성충기까지 물고기를 잡아 먹이기에 적합하다.

GF 물고기와 GF Artemia 의 감지는 모델 유지 관리에도 중요합니다. 샘플 수집 및 여러 테스트 방법에 따르면 결과는 배양 플레이트와 액체 배지에서 처리된 제브라피시 배아 및 아르테미아 낭종의 성공을 제공할 수 있습니다(그림 4). 매일 수집되는 다양한 샘플은 모든 테스트 방법에서 멸균 상태로 감지되어야 하며, 이는 수집 시점의 GF 모델을 나타낼 수 있습니다. GF Artemia 는 GF 물고기를 먹기 전에 감지해야 하며, 또는 플레이트 및 배지 인큐베이터 결과는 신선한 살아있는 nauplii의 멸균 상태를 참조해야 합니다. 즉, 쉐이크 배양에서 TSA 플레이트 또는 TSB 또는 BHI 액체 배지 유리의 낭종에서 GF Artemia 를 배양하여 GF Artemia 와 멸균 검증을 동시에 생성하는 데 사용할 수 있습니다. GF Artemia 프로토콜은 먹이를 위해 제한된 수의 유충을 수용할 수 있습니다. 먹이를 주는 과정에서 GF Artemia 가 GZM 내에서 헤엄친 다음 GF 물고기 유충에게 포획되어 먹히는 것이 분명했습니다.

GF 물고기 모델의 응용 분야에는 생물학 및 의학의 다양한 분야가 관련되어 있어 미생물 기능, 성장 및 발달, 질병 메커니즘, 프로바이오틱스 또는 약물 스크리닝 등을 조사할 수 있습니다46. 예를 들어, 이 연구에서는 두 가지 주요 장내 세균인 Aeromonas sp.와 Vibrio sp.를 제브라피시에서 분리했습니다. 콜로니 특성 및 식별을 수행하고, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 시험관에서 여러 대사 기능을 측정했습니다(그림 5). 이들 박테리아는 16S 염기서열분석으로 분리하고 확인하였으며, 폭발 결과는 이전 보고서(42)에 제시되었다. 확인된 박테리아 균주는 GF 물고기 모델을 감염시켜 단일 또는 결합 미생물군이 숙주 건강에 미치는 영향에 대한 과학적 연구를 가능하게 합니다. 물고기 유충의 투명성으로 인해 CM-Dil 염료를 사용하여 형광 표지 박테리아 세포를 관찰할 수 있어 GF 물고기의 장에서 집락 형성 및 분포를 확인할 수 있습니다( 그림 6 참조). 5 dpf에서 세균 감염 후, GF 제브라피시 유충은 형광 현미경으로 이미지화하고 6에서 14 dpf까지 지속적으로 관찰할 수 있으며, 발달 지표, 조직 병리학적 변화 및 분자 변화와 결합된 미생물 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다47.

그림 1: 배아에서 유충 및 유년기에 이르는 GF 제브라피시의 프로토콜. GF 제브라피시 생성의 주요 단계는 다음과 같습니다: (1) 야생형 제브라피시에서 배아를 채취하고 AB-GZM에 배치합니다. (2) 완전한 멸균을 보장하기 위해 PVP-I 및 NaClO 제제로 헹굼 처리합니다. (3) GZM을 사용한 6웰 플레이트에서 GF 배아/유충 배양, 매일 배지 갱신. (4) 최적의 성장과 발달을 위한 배양 조건의 조절. (5) 다양한 발달 단계에서 샘플링한 후 플레이트 및 액체 배지 방법을 사용한 무균 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: GF 물고기를 위한 살아있는 음식으로서의 GF Artemia 준비 프로토콜. 주요 단계는 다음과 같습니다: (1) 완전한 멸균을 위한 아르테미아 낭종의 헹굼 처리. (2) 배지에서 GF 낭종의 제조. (3) 부화를 촉진하기 위해 24 시간 동안 소금 용액에서 배양합니다. (4) 활성 nauplii를 수집하기 위해 부화에 실패한 알과 빈 알을 여과합니다. (5) 수거된 나우플리를 세척하여 이물질을 제거하여 고품질의 오염되지 않은 생식품을 보장합니다. (6) GF 물고기 유충에 먹이기 전에 GF Artemia 의 무균 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 24시간 동안 배양한 GF 아르테미아 낭종 및 나우플리의 인덱스. (A) 불순물 필름이 있는 처리되지 않은 아르테미아 낭종(눈금바: 500μm). (B) 수분 흡수 후 표면이 약간 볼록하고 더 깨끗한 외관으로 처리된 쑥 낭종(눈금자: 500μm). (C) 신선하게 배양된 살아있는 GF Artemia nauplii (스케일 바: 2000 μm)의 현미경 검사 및 (D) 1000 μm의 스케일 바를 사용한 배율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 각 생애 단계에서 GF 물고기 및 GF Artemia의 멸균 감지. (A) 호기성 및 혐기성 조건에서 TSB 및 BHI 액체 매체, TSA 및 혈액판을 사용한 CR 및 GF 어류 샘플의 멸균 테스트. (B) 호기성 및 혐기성 조건에서 TSB 및 BHI 액체 배지, TSA 및 혈액판을 사용하여 치료되지 않은 아르테미아 낭종, GF 아르테미아 낭종 및 나우플리이 의 멸균 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 제브라피쉬의 장내 세균 분리 및 식별. (A) 박테리아 균주, 콜로니의 특성, 16S 염기서열분석 맵(예: Aeromonas sp. 및 Vibrio sp.). (B) 속(Genus) 및 NCBI 가입. (C) 제브라피시 장에서 분리한 박테리아의 대사 기능. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: GF 제브라피시에서 장내 세균 균주의 감염 및 집락화. (A) 감염 실험을 위해 분리되고 확인된 박테리아 균주의 회수. (B) 형광 염료를 사용한 박테리아 표지 및 5 dpf에서 GF 제브라피시 유충 감염. 배율 : 1x. (C) 생체 내 장내 조직에서 박테리아(Vibrio sp.)의 분포 및 집락화 관찰. 배율 : 3x. (D) 일일 샘플링을 통해 각 물고기 유충에서 박테리아 (Aeromonas sp. 및 Vibrio sp.)의 CFU 계산. 데이터는 SEM± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 박테리아 검출에 사용되는 프라이머.

표 2: 반응당 성분의 최종 농도 및 부피.

표 3: 16S rRNA 유전자의 증폭을 위한 PCR 프로그램.

보충 그림 1: GF 및 CR 제브라피시 모델의 중요한 발달 지수. (A) 72 hpf에서 CR 및 GF 제브라피쉬의 부화 속도, (B) 7 dpf 및 14 dpf에서 CR 및 GF 물고기의 심장 박동 / 10 초. CR 및 GF 물고기의 생존율(%)은 30dpf에서 86%, 60%-80%로 7일 및 14일에서 10%-25%로 감소했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

GF Artemia 의 프로토콜은 중국 국가 지적 재산권국에 의해 특허로 부여되었으며, 저자의 허가를 얻은 후 방법의 제한된 사용을 완화할 것입니다. 저자는 다른 경쟁 또는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.