연구 과학자를 위해 설계된 오픈 소스 normothermic 관류 시스템

요약

여기에서는 기존 플랫폼의 높은 비용과 제한된 유연성을 극복하도록 설계된 오픈 소스의 수정 가능한 규범 보온 외 관류 시스템에 대한 프로토콜을 제시하여 전임상 생물 의학 연구에서 보다 접근하기 쉽고 비용 효율적이며 반복적인 사용을 가능하게 합니다.

초록

이식 전에 인체 장기를 위한 체외 관류 기계의 통합은 수혜자의 결과를 개선하고 장기 가용성을 높이는 동시에 중개 의학에 대한 새로운 연구 방법을 밝혔습니다. 그러나 이러한 기계는 실험적 수정에 대한 가용성이 제한되어 있으며 연구 과학자에게 상당한 초기 비용 투자와 엄청나게 많은 사용당 비용을 제시합니다. 또한, 다세포 장기 환경에서 세포 과정에 대한 진정한 조사를 가능하게 하는 생물의학 연구에서 개선된 전임상 모델에 대한 상당한 필요성이 있습니다.

더 큰 연구 커뮤니티를 위해 유사한 기술에 대한 액세스를 제공하기 위해 우리는 사용자가 수정할 수 있는 Python 코드로 실행되는 즉시 조달된 부품으로 비용 효율적인 모듈식 노멀롬 관류 기계를 구축했습니다. 시스템에는 맞춤형 하드웨어가 없기 때문에 조사자는 개별화된 연구 응용 프로그램에 필요한 대로 시스템을 구성하고 보강할 수 있습니다.

여기에서는 기계 설정 및 관류 과정을 자세히 설명하고, 돼지 및 인간 장기에 대한 경험을 전달하고, 초기 개념 증명 실험 결과를 제공합니다. 이러한 연구는 온전한 인간 조직을 사용하여 병태생리학 및 복잡한 세포 과정을 조사할 수 있는 잠재력을 보여줍니다.

서론

이식 전에 신장과 간에 단기간(<12시간) 정상온열 기계 관류가 이전에 사용되었지만, ^1,2,3,4,5 이식 전에 장기간의 정상온열 기계 관류가 2020년 Liver4Life 기계⁶으로 현실화되었습니다. 이 기술의 목적은 생존 가능한 기증자 장기의 확장에 맞춰져 있었지만 가능한 번역 응용 프로그램은 연구 커뮤니티에서 쉽게 알 수 있었습니다 7,8,9,10,11,12. 벤치 과학자 및 기존 연구 실험실의 경우 이러한 임상 도구는 상당한 초기 비용과 반복 비용으로 인해 거의 손이 닿지 않는 곳에 있습니다^12,13. 임상 규범 관류 기계는 $ 250,000 USD 이상이며 일회용 일회용품은 실행 당 $ 9,500- $ 60,000 USD 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. 더욱이, 소유권과 기존 기술을 조정할 수 없는 능력으로 인해 과학적 적용이 어려워지고 있습니다.

앞서 언급한 한계와 함께 생물 의학 연구에서 개선된 전임상 모델 24,25,26에 대한 탁월한 필요성은 수정 가능한 오픈 소스 관류 시스템의 생성에 영감을 주었습니다(그림 1). 회로 설계 및 개발은 비용 활용, 실험실 공간 요구 사항 및 번역 응용 분야를 위한 이동성의 원칙에 따라 진행되었습니다. 이 시스템은 $48,000-$66,000 USD로 구축할 수 있으며, 각 관류 비용은 $1,000-$2,300 USD이며, 이는 무료로 다운로드할 수 있는 코드로 실행되는 즉시 소싱된 개별 구성 요소의 통합을 통해 달성되었습니다. 이 시스템은 공여자의 돼지 혈액과 만료된 인간 혈액, 돼지 간 및 수술실의 부분 인간 간 분절을 사용하는 반복적인 프로세스를 통해 최적화되었습니다(보충 표 1, 보충 표 2 및 보충 표 3). 장기는 밀폐된 수조에 보관되어 압력 괴사를 최소화하고, 이상적인 캐뉼레이션 궤적을 허용하고, 유출을 배출하고, 정상혈증을 보장하기 위해 표본을 최적으로 배치합니다. 저수지는 유입 회로로 향하기 전에 약 2-3L의 관류액을 수용합니다. 간 관류에서 전해질 항상성 및 혈액 농축에 중요한 혈액 투석 ^6,27,28,29는 독립적인 롤러 펌프가 있는 측면 회로를 통해 통합되었습니다. 약리학적 주입은 생리적 기능(예: 총 비경구 영양(TPN), 담즙염 등³⁰), 혈관 긴장도 증가(에포프로스테놀, 페닐에프린), 응고(에녹사파린) 및 감염(피페라실린-타조박탐, 암포테리신)을 지원합니다. 생리학적 관류 매개변수는 실시간 인라인 센서를 사용하여 혈액 가스, 압력 및 유량 값을 획득합니다. 이 시스템은 하드웨어 구성 요소의 통합이 회로의 어느 지점에서나 발생할 수 있도록 사용자 적응성을 극대화합니다. 또한 회로 내의 각 개별 구성 요소를 상호 교환하거나 수정하여 특정 연구 질문 및 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 이중 유입 회로는 펌프 헤드 이전의 Y 커넥터를 제거하기만 하면 단일 유입으로 장기(즉, 신장 또는 췌장)의 관류를 위해 변경할 수 있으며, 주입/샘플링을 위한 클레이브는 회로 내 어느 지점에나 설치할 수 있습니다. 또한 이 시스템은 최종 사용자가 지정한 지정된 관류 파라미터 세트를 기반으로 반자동 관류를 허용하는 Python 코드로 실행됩니다(보충 그림 1). 예를 들어, 센서는 연속 동맥혈 가스(ABG), 압력 및 유량 판독값을 획득하여 산소 발생기 가스 유량, 펌프 속도 등을 자동으로 조정하는 출력 명령을 구현하기 위한 입력 역할을 합니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 사용하면 원하는 경우 이 자동화를 수동으로 재정의할 수 있습니다. 회로의 사용자 정의 가능성은 이 회로의 특징이며, 광범위한 실험 조사에 대한 이 시스템의 전반적인 적용 가능성을 넓혀줍니다.

시스템 전체에 대한 액세스는 무료로 사용할 수 있으며(https://github.com/CCR-SOP/OpenSourcePerfusionSystem.git) 중개 과학의 여러 분야에 걸쳐 새로운 깊이의 지식을 구축하기 위한 노력의 일환으로 협업과 혁신을 장려합니다.

그림 1: 오픈 소스 관류 시스템. (A) 간 관류를 위한 이중 유입 설정을 위한 오픈 소스 관류 시스템 회로도. (B) 스크린에서 시연된 바와 같이 소프트웨어 통합을 통한 장기 관류 중 시스템의 3차원(3D) 렌더링. (C) 돼지 관류 실험 중 관류 기계의 사진. 그림에서 노출된 구성은 시연용으로만 사용됩니다. 관류 중에는 멸균 온난화 드레이프가 장기를 덮어 멸균 인클로저를 유지합니다. P/F 센서: 압력 및 유량 센서. HA: 간 동맥. PV: 문맥. HV: 간 정맥입니다. BD: 담관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

이 프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 윤리 기준에 따라 수행되었으며 인간 피험자 및 조직과 관련된 연구에 대해 적용 가능한 모든 지침 및 규정을 준수합니다.

1. 기계 설정

1. 테이블 준비
   1. 탁상과 이동식 카트를 70% 알코올 스프레이로 소독하고 철저히 닦습니다. 모바일 카트를 테이블 왼쪽에 수직으로 놓습니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 모든 튜브와 하드웨어를 연결하기 전에 70% 알코올 또는 오토클레이브(해당되는 경우)를 분사하여 멸균합니다.
      알림: 장기 취급 또는 개입 전에 멸균 장갑과 알코올 스프레이를 사용하여 관류 전과 관류 전반에 걸쳐 멸균 상태를 촉진하십시오.
   2. 워크스테이션을 멸균 파란색 커튼으로 덮고 흡수성 언더패드로 덮습니다.
   3. 링이 워크스테이션 상단 하단에서 약 12인치 아래 바깥쪽으로 돌출된 벤치에서 가장 가까운 카트 다리에 저장소 홀더를 부착합니다.
   4. 드럼 깔때기를 테이블 앞쪽 가장자리에 돌출된 주둥이와 함께 워크스테이션의 오른쪽에 놓습니다. 드럼 바닥을 채우기 위해 원형 메모리 폼을 잘라내어 스파우트 근처에서 유출을 위한 4인치 간격을 허용합니다. 호흡기에 연결된 폼 아래에 다이어프램을 놓습니다.
   5. 2개의 물 가열 담요를 구하여 담요의 왼쪽 상단을 향하는 커넥터 튜브가 있는 폼 인서트 위에 놓습니다. 튜브에서 흰색 클램프를 잘라내고 각 튜브에 3/16" 수컷 Luer 미늘을 삽입합니다. Y'ed 물 가열 탱크 라인에서 각 담요까지 1개의 유입 라인과 1개의 유출 라인을 확보합니다.
   6. 멸균 워머 드레이프를 얻고 중앙의 파란색 사각형을 식별합니다. 반으로 두 번 접고 접힌 모서리에서 2mm 잘라 유출 구멍을 만듭니다. 절단된 구멍이 유출 추출구와 일치하도록 드럼 위에 멸균 드레이프를 놓습니다.
   7. 3D 프린팅 콘센트 커넥터를 구하고 자석을 홈에 놓습니다. 유출 스파우트를 통해 드레이프 아래에 놓고 절단된 구멍을 커넥터와 자석의 구멍에 맞춥니다. 유출에 정렬된 두 번째 자석을 배치하여 드레이프를 고정합니다.
   8. 드럼 깔때기 전체를 덮도록 여분의 드레이프를 올리고 고무 밴드/탄성 타이로 고정합니다. 여분의 드레이프를 맨 위로 접어 멸균 장벽을 만듭니다. 접힌 드레이프 위에 두 번째 워터 재킷을 교체합니다.
   9. 30/1" 튜브의 ~4" 조각을 자르고 드럼 깔때기 스파우트 바닥에서 배출구 조각에 근위부를 부착하고 원위부를 저장소 유입 미늘에 부착합니다.
2. 펌프 및 산소 공급기 준비
   1. 스탠드와 두 개의 cl이 있는 워크스테이션 가장자리에 가장 가까운 모바일 카트에 펌프를 놓습니다.amps 펌프보다 6인치 위에 있도록 펌프 바로 뒤에 있습니다.
   2. 2개의 펌프 헤드를 얻고 펌프에 고정합니다.
   3. 2개의 산소공급기를 구하고 cl 안에 배치합니다.amp수평 구성의 스탠드에 부착된 s. 미늘이 바깥쪽을 향하고 측면 미늘이 오른쪽을 가리키는 산소 공급기의 방향을 지정합니다.
      알림: Luer 커넥터가 있는 산소공급기는 라벨이 바깥쪽을 향하고 내부 갈래가 위쪽을 향하는 대체 구성이 필요합니다.
3. 가스 혼합기 준비
   1. 2/4" 튜빙 4개 1개를 자르고 각 튜브 끝에 수컷 1/8" 루어를 삽입합니다. 각 동맥 및 정맥 가스 유입에 하나의 튜브를 연결합니다.
   2. 2/1" 튜빙 2" 조각 4개를 자르고 한쪽 끝에 1/4" 암컷 루어를 부착합니다. 각 산소 공급기의 오른쪽 상단 미늘에 이러한 각 튜브 조각을 끼웁니다.
   3. 동맥 및 정맥 1/8" 가스 유입 튜브를 해당 산소 공급기의 오른쪽 상단 Luer 커넥터에 연결합니다.
4. 혈액 투석 회로 준비
   1. 혈액 투석 키트에서 필터로 직접 연결되는 튜브(파란색, 빨간색, 녹색 및 노란색 선)를 제외한 모든 튜브를 제거합니다. 워크스테이션 뒤쪽의 페그보드, 펌프 오른쪽으로 ~12인치 또는 저장소와 일직선으로 필터를 고정합니다.
   2. 혈액 유입을 위해 필터의 바로 오른쪽에 1개의 대형 롤러 펌프를 놓습니다. 혈액 롤러 펌프의 오른쪽에 2개의 작은 연동 펌프를 놓습니다.
      1. 두(2) 1/8^연동 튜브를 구하여 흰색 펌프 cl 안에 놓습니다.amp. 각 튜브의 각 끝에 2개의 암 1/8^루 어 미늘을 부착합니다.
   3. 5L 투석액 백을 워크스테이션의 오른쪽 측면에 걸어둡니다.
      1. 백의 Luer 커넥터에 1/8^번째 튜브를 연결하여 투석액 백을 혈액 투석 필터 유입액에 연결합니다. 수 1/8th Luer를 이 튜브의 끝에 부착하고 유입 연동 펌프 튜브에 부착합니다.
   4. 투석액 유입/유출: 각 끝에 수컷 1/^{8 루어}가 장착된 3 1/8^튜빙을 얻습니다.
      1. 유입: 근위부 끝을 펌프 튜브의 원위부에 연결하고 원위부 끝을 노란색 유입 튜브(1/8 여성 루어 포함)에 혈액 투석 필터에 연결합니다.
      2. 유출: 근위 끝을 녹색 유출 튜브(1/8 여성 Luer 포함)에 연결하고 원위 끝을 유출 연동 펌프 튜브에 연결합니다. 1/8 튜브를 연동 펌프의 원위부에 연결하고 Luer 커넥터를 통해 쓰레기 봉투로 배출합니다.
5. 근위 회로 생성
   1. 저장소 홀더 내에 저장소를 놓고 외부 번호와 노란색 덮개가 있는 커넥터가 바깥쪽을 향하도록 합니다.
   2. ~36인치의 5/16" 튜브를 자르고 근위 끝을 저장소 바닥의 유출 말뚝에 연결합니다. 5/16" Y 커넥터를 이 튜브의 말단에 연결합니다.
   3. 2/4" 튜브의 5인치 길이를 자르고 Y 커넥터 끝에 연결합니다. 이 4인치 튜브의 각 끝을 각 펌프 헤드의 수평 단자에 부착합니다.
   4. 2/4" 길이의 1/4" 튜빙 2개를 자르고 펌프 헤드의 각 수직 미늘에 1개를 연결합니다. 원위부를 각 산소공급기의 왼쪽 아래쪽 갈래에 연결합니다.
   5. 2/1" 튜브의 2" 길이를 자르고 암 Luer를 한쪽 끝에 연결합니다. 수컷 Luer 캡을 추가하고 각 산소 공급기의 오른쪽 아래쪽 단자에 부착합니다.
6. 정맥 회로 생성
   1. 30/5" 튜빙 1개를 자르고 근위 끝을 정맥 산소 공급기의 유출(오른쪽) 미늘에 부착합니다. 반으로 자르고 말단 절단 끝 부분에 5/16" Y 커넥터를 놓습니다. 나머지 절반을 Y 커넥터의 상단 미늘에 다시 부착합니다.
   2. 측면 샘플링 회로: 1/2" 튜브 1개를 자르고 4개의 니들 드라이버를 사용하여 근위 끝을 늘립니다. 이것을 5/16" Y 커넥터의 다른 미늘에 연결합니다.
      1. 큐벳 센서를 구합니다. 가시가 있는 쪽을 Y 커넥터에 연결된 2인치 튜브에 연결합니다. 원위 큐벳 튜브의 1-2"를 잘라내고 수컷 1/4" 루어에 연결합니다. 보정이 완료되면 션트 센서의 근위 끝에 부착하고 원위 측면에서 수 1/8" 루어를 1/8" 튜브에 연결합니다.
      2. 암 T 커넥터의 수평면을 1/8" 튜빙 및 수 Luer에 연결합니다. 수직 측면에는 샘플링 클레이브를 연결합니다. 1/8" 수 Luer를 T 커넥터의 나머지 수평 면에 연결합니다.
      3. 1/8" 튜브 12인치를 자르고 근위 끝을 샘플링 클레이브에 부착하고 1/8" 수컷 Luer를 말단 끝에 부착합니다. 이것을 다른 암 T 커넥터에 연결합니다. 암 T 커넥터의 한쪽에 1/4" 수형 루어를 부착하고 2"의 1/4" 튜브를 사용하여 유입 채널에 연결합니다.
   3. 5/16" 튜빙의 말단 끝으로 돌아가서 다른 5/16" Y 커넥터를 연결합니다. ~55"의 1/4" 튜브를 가져와 5/16" Y 커넥터의 상단 끝에 부착합니다.
   4. 혈액 투석 혈액 회로 생성: 1/4" 튜브의 말단 끝에 1/4" 수컷 Luer를 부착합니다. 대형 롤러 펌프를 통해 튜브를 놓습니다. 혈액 투석 필터(파란색 안감이 있는 튜브) 상단의 혈류에 연결합니다.
      1. 1/24" 튜빙 1/4" 조각 하나를 자르고 수컷 1/4" 루어를 근위부에 연결합니다. 이 튜브를 혈액 유출 혈액 투석 필터(빨간색 줄이 그어진 튜브)에 연결합니다. 원위부를 저수지의 유입 미늘에 연결합니다.
   5. 샘플로 이어지는 정맥 유입 회로를 완료하려면 돌아갑니다. 1/36" 튜빙 1/4" 조각 하나를 자르고 5/16" Y 커넥터의 미늘에 맞도록 늘립니다.
   6. 약물 주입 부위: 3개의 4방향 스톱콕을 획득하고 선형으로 연결합니다. 이 조각을 암 T 커넥터의 수직 암에 연결합니다. 암 T 커넥터의 인라인 암에 두 개의 수 1/4" 루어를 부착합니다. 튜브의 왼쪽에서 12인치 떨어진 곳에 조각을 삽입합니다.
   7. 약물 주입 부위 뒤의 1/4" 튜브에 외부 유량 센서를 부착합니다. 1 9" 마운트를 가져와 드럼 깔때기 높이에 고정합니다. 유량 센서 끝에서 말단으로 2인치를 자르고 미늘이 있는 압력 센서를 1/4" 튜브에 삽입합니다. 튜브의 원위부를 드럼 깔때기의 중앙에 놓습니다. 표본에 정맥 캐뉼레이션을 위해 1/4" 수컷 Luer 1개를 예약합니다.
7. 동맥 회로 생성
   1. 30/5" 튜브의 또 다른 ~16" 조각을 자르고 동맥 산소 공급기의 오른쪽 유출 미늘의 근위 끝을 부착합니다. 이 튜브를 대략 반쯤 자르고 1 5/16" Y 커넥터 하나를 부착합니다.
   2. 측면 샘플링 회로: 1.6.2단계에서 설명한 대로 중복 측면 샘플링 회로를 생성하고 큐벳을 생략하고 Y 커넥터의 하위 측면에 부착합니다. 완료되면 유출 1/8" 루어를 T 커넥터에 부착합니다.
   3. 36/1" 튜빙 1개를 잘라 5/16" Y 커넥터의 미늘에 끼웁니다.
   4. 1.6.7단계를 반복합니다. 표본에 동맥 캐뉼레이션을 위해 1/4" 수컷 Luer 1개를 예약합니다.
8. 정맥 유출 생성
   1. ~30"의 1/4" 튜브를 절단하고 근위 끝에 1개의 수컷 1/4" 루어를 부착하여 표본의 하대정맥(IVC) 유출에 부착합니다. 저수지의 유입 미늘 중 하나에 말단 끝을 부착합니다.
   2. 저장소에서 이 튜브를 ~6인치 자르고 양쪽 끝에 2 1/4인치 수컷 루어를 부착합니다. 샘플링을 위해 수직 측면에 부착된 클라베가 있는 암 T를 삽입합니다.
9. 4단계에서 설명한 대로 회로에 관류물을 주입합니다. 6.1.4단계에서 설명한 대로 표본을 다시 데우고 연결합니다. 또는 6.2.4단계. 관류를 시작합니다.

2. CDI 센서 교정

1. 교정기 가스통이 가득 찼고 사용자 사용 설명서에 따라 설치되었으며 모니터가 보정 모드로 설정되어 있는지 확인하십시오. 제조업체의 지침에 따라 보정합니다.
2. 보정이 완료되면 모니터에서 센서-케이블-헤드 장치를 분리하고 즉시 해당 정맥 및 동맥측 회로에 통합합니다. Luer 연결은 1.6.2 및 1.7.2단계에서 생성됩니다.

3. 코드 시작

1. GitHub 리포지토리에 있는 Python 코드를 다운로드, 설치 및 엽니다. Python 및 PyCharm 소프트웨어가 올바르게 설치되었는지 확인합니다.
2. 정확한 데이터 기록을 위해 각 관류 실행에 대해 고유한 분기를 만듭니다. 시작되면 GUI에 두 개의 창이 표시됩니다. 디스플레이당 하나의 창을 배치하여 하드웨어를 쉽게 제어하고 관류 매개변수를 표시할 수 있습니다.
3. 관류 매개변수를 수동으로 조정하거나 GUI에 표시된 각 버튼을 통해 관류를 자동화합니다(보충 그림 1).

4. Perfusate 생성 및 시스템 프라이밍

1. 장기 관류 약 2시간 전에 회로를 프라임하여 대사/전해질 교란을 교정하고, 정상 체질로 가온하고, 항응고제, 항생제 및 기타 의약품을 투여할 수 있도록 합니다.
2. 돼지 관류물
   1. OO형 통돼지 혈액 2L를 채취하여 열린 50-100mL 주사기를 통해 배출하여 저장고에 주입합니다. 약 1mL의 전혈을 복용하고 현장 진단 기계에서 기준선 pH, 전해질 및 헤마토크릿을 측정합니다.
   2. 냉혈 방부제로 인한 산도를 중화하기 위해 필요에 따라 8.4% 중탄산나트륨의 분취액을 투여합니다. 필요에 따라 고칼륨혈증과 젖산혈증을 정상화하기 위해 혈액 투석을 시작하고 원하는 헤마토크릿 농도로 적정합니다. 생리학적 pO2 및 pCO2 수준으로 적정하도록 가스 흐름을 조정합니다.
   3. 아래 설명된 대로 의약품을 투여합니다(섹션 5).
   4. 관류 실험 전반에 걸쳐 헤마토크릿을 ~30-40%로 유지하기 위해 필요에 따라 간헐적 덩어리를 위해 1-2L OO형 전혈을 보존합니다.
3. 인간 관류액
   1. 혈액 은행에서 유형이 일치하는 혈액 제제를 얻습니다(유통 기한이 임박했거나 연구 목적으로 기증됨).
      참고: 각 관류 실험에는 포장된 적혈구(RBC)와 혈장이 각각 약 4단위씩 필요합니다.
   2. 프라이밍 전에 pRBC를 세척하여 방부제를 제거하고 RBC 펠릿에서 전해질 혼란을 정상화합니다. 적혈구를 두 번 세척하십시오.
      1. 적혈구 세척: pRBC와 0.9% NaCl을 1:1 비율로 원심분리 튜브에 넣습니다. 1300 × g 에서 15분 동안 원심분리기. 피펫으로 상층액을 제거하고 새로운 0.9% NaCl을 RBC 펠렛에 1:1 비율로 재투여합니다. 위와 같이 다시 원심분리기를 하고 최종 세척된 RBC 펠릿을 위해 2차 상등액을 제거합니다.
   3. 열린 50-100mL 주사기를 사용하여 세척된 RBC 펠릿을 저장소에 넣습니다. 플라즈마 4단위를 저장소에 넣고 순환을 시작합니다.
   4. 투석을 시작하고, 담요를 따뜻하게 하고, 관류액이 순환하면 가스 유입을 시작합니다.
   5. 장기 관류 전에 가능한 한 생리학적 관류액에 가까운 수준을 보장하기 위해 필요에 따라 샘플을 관류하고 약리학적 개입을 적용합니다.
   6. 추가로 세척된 pRBC 펠릿을 세척 및 도입하고 필요에 따라 혈액 투석을 통해 부피 상태를 적정하여 헤마토크릿 수치를 30-40%로 유지합니다.

5. 약리학적 개입 및 주입 준비

1. 항생제 및 항진균제 투여
   1. 멸균 검체 컵에 2.5g의 피페라실린/타조박탐 바이알 2개를 멸균 식염수 40mL와 함께 결합합니다. 10mL를 "항생제 프라임"으로 저장용기에 추가합니다.
      1. 나머지 혼합물을 60mL의 멸균 식염수로 희석하고 50mL 주사기 2개로 나눕니다. 하나의 주사기를 주사기 펌프에 연결하고 문맥 약물 주입 부위에 41μL/min을 지속적으로 전달하도록 프로그래밍합니다(단계 1.6.6).
      2. 남은 항생제는 4°C 냉장고에 보관합니다.
   2. 암포테리신 50mg 바이알 1개를 멸균수 10mL와 함께 재구성합니다.
      1. 농축된 암포테리신 1mL를 추출하고 멸균 식염수 9mL와 결합합니다. 10mL 혼합물을 저장조에 투여하여 관류 시작 시 "항진균 프라임" 역할을 합니다.
      2. 12시간마다 농축된 암포테리신 1mL를 저장소에 투여합니다.
2. 항응고제
   1. 에녹사파린 1mL(100mg)와 멸균 식염수 49mL를 혼합합니다. "항응고 프라임"을 위해 관류 시작 시 관류액 1리터당 5mL 혼합물을 투여합니다.
      1. 남은 에녹사파린 용액은 4°C 냉장고에 보관합니다.
      2. 에녹사파린 용액(5mL/1L 관류물)을 12시간마다 저장소에 투여합니다.
3. 스테로이드
   1. 메틸프레드니솔론 1g을 멸균수 20mL로 재구성합니다.
   2. 관류 시작 전에 투여 사양에 따라 시스템 프라임: 돼지 간은 10mL(500mg)의 메틸프레드니솔론을 투여합니다. 부분적인 인간 간은 2mL(100mg)의 솔루메드롤을 투여받습니다.
   3. 50mL 주사기에 나머지 혼합물을 식염수 40mL로 희석하고 주사기 펌프에 넣어 33μL/min을 문맥 약물 주입 부위에 지속적으로 전달합니다(단계 1.6.6).
4. 비경구 영양 및 담즙염
   1. 타우로콜산 1.7g을 멸균 검체 컵에 10% 아미노산 + 전해질 농축 비경구 영양 성분 TPN(포도당과 혼합되지 않음) 50mL와 함께 재구성합니다. 50mL 주사기를 꺼내 주사기 펌프에 넣어 83μL/min을 문맥 약물 주입 부위에 지속적으로 전달합니다(단계 1.6.6).
5. 혈관 톤 조절
   1. 혈관 확장: 0.5mg의 에포프로스테놀을 멸균 컵에 50mL의 멸균 식염수와 함께 재구성하고 50mL 주사기에 넣습니다. 주사기 펌프에 넣고 간 동맥 유량 센서에 근접한 클레이브에 연결합니다.
      1. 원하는 평균 동맥압을 달성하거나 혈관 경련을 막기 위해 필요에 따라 볼루스 또는 지속적으로 주입(10μL/분)합니다.
   2. 혈관 수축: 멸균 컵에 페닐에프린 5mL(50mg)를 멸균 식염수 45mL와 희석하여 50mL 주사기에 넣습니다. 혼합물을 4°C 냉장고에 보관하고 원하는 평균 동맥압을 유지하기 위해 필요에 따라 덩어리를 만듭니다.
      참고: 이는 거의 필요하지 않으며 재구성은 생략하고 필요한 경우에만 구현할 수 있습니다.
6. 압력 및 유량 센서 교정
   1. 압력 교정: 관류액이 흐르지 않도록 압력 센서를 교정합니다. 튜브의 끝이 0mmHg 압력에 대해 공기에 열려 있는 동안 제조업체의 지침에 따라 0이 아닌 압력 판독값이 표시되는 경우 Re-zero 센서. 상승된 압력을 생성하기 위해 튜브의 근위부와 원위부 끝을 모두 부드럽게 막아 적절한 압력 측정을 보장합니다.
   2. 유량 보정: 회로가 순환하면 정확한 측정을 보장하기 위해 장기 관류 전에 관류물을 보정합니다. 유량 센서의 원위부에 튜브를 고정하여 흐름을 차단합니다. Re-zero 유량 센서: 제조업체의 지침에 따라 0이 아닌 유량이 표시되는 경우. 유량과 정확한 유량 측정을 허용하는 Unclamp 튜브.

6. 간 조달

1. 돼지 조달
   참고: 돼지 간은 USDA의 가축 인도적 취급 프로토콜에 따라 지역 정육점에서 조달합니다. 해부는 연구팀의 안내에 따라 하부 및 간상정맥과 담관을 포함합니다.
   1. 멸균 식염수에 희석된 요오드로 간을 살균하고 얼음 위의 멸균 대야에 넣습니다. 문맥, 간동맥, 상대정맥 및 총담관을 확인하고 캐뉼레이트를 하고 4-0 실크 타이로 고정합니다.
      참고: 담관은 직경이 작고 변형 돼지 담즙 시스템의 담즙 폐쇄를 방지하기 위해 천공 혈관 카테터로 캐뉼레이션되는 경우가 많습니다.
   2. 캐뉼레이션 문맥과 간 동맥을 3L의 냉간 멸균 식염수(2L PV:1L HA)로 세척한 다음 1L의 냉장기 보존 용액(750mL PV:250mL HA)으로 세척합니다. 운송을 위해 얼음과 함께 차가운 장기 보존 용액에 간을 담그십시오.
   3. 생리학적 매개변수가 충족될 때까지 위에서 설명한 대로(4.1단계) 시스템을 프라임합니다.
   4. 캐뉼레이션된 간을 데워진 멸균 식염수에 담그면 빠르게 재가열하고 공기 색전을 제거할 수 있습니다. 적절한 유입 튜브를 문맥과 간동맥 캐뉼라에 연결합니다. 생리학적 흐름 및 압력 값에 대한 적정 펌프 속도.
   5. vena cava 캐뉼라를 유출 튜브에 연결하여 저장소로의 유출을 용이하게 하여 회로를 완성합니다.
   6. 주사기 튜브를 담관 캐뉼라와 채취를 위한 원뿔형 바이알에 연결하기 전에 담낭에 남아 있는 담즙을 배출합니다.
2. 인력 조달
   1. 위에서 설명한 대로 시스템을 프라임합니다(4.1단계).
   2. 표시된 표준 치료 종양학적 절제 후 인간 표본을 확보합니다. ex vivo 시스템에서 보정을 위해 수술 중 초음파로 생체 내 유속을 측정합니다. 외과적 절제 중 분절 문맥, 간동맥 및 담관을 확인합니다. 표준 수술 기법에 따라 트라이어드를 절제하고 수술 부위의 표본을 멸균된 백 테이블에 건네줍니다.
   3. 분절 문맥, 간동맥, 간정맥 및 담관을 식별하고 캐뉼레이션하고 4-0 실크 타이 또는 프롤렌 봉합사로 고정합니다.
      참고: 분절에 울혈성 간병증을 피하기 위해 우성 유출 정맥이 없는 경우 유출 캐뉼레이션을 생략합니다. 그런 다음 분지 유출은 간 정맥/IVC 유출 튜브로 기능합니다.
   4. 체외 실험실로 돌아가 표본의 무게를 측정합니다. 검체를 가열된 멸균 식염수에 담그고 각각의 유입/유출 튜브를 연결합니다. 담관 캐뉼러를 주사기 튜브에 연결하여 원뿔형 바이알로 배출합니다.
   5. 원하는 유량 및 압력 관류 매개변수에 대한 관류 및 적정 펌프 흐름을 시작합니다.

7. 관류 파라미터 적정

1. pre-hepatic(HA 및 PV 측 회로) 및 post-hepatic(IVC 또는 분지 유출)의 시료 관류물은 진료 시점 혈액 가스, 전해질, 헤마토크릿 및 헤모글로빈 값을 기반으로 관류 매개변수의 적정을 위해 수많은 시점에 쇄류됩니다.
2. 수동 시편 분석을 사용하여 관류 전반에 걸쳐 CDI 센서를 보정합니다.
3. 그에 따라 혈액 투석 유입 및 유출을 조정하여 부피 상태와 헤마토크릿 농도를 30-40%로 유지하고 대사 및 전해질 혼란을 교정합니다.
4. 전해질 이상을 교정하기 위해 필요에 따라 5% 포도당, 유리수, 8.4% 중탄산나트륨 및 0.9% NaCl의 부분 표본을 수동으로 투여합니다.

8. 관류 회로 변형

1. 교통 적응
   1. 실행 기간 동안 펌프를 이동식 전원에 연결하여 이미징 기계로 가는 동안 지속적인 관류를 용이하게 합니다. 모바일 전원을 AC 콘센트에 연결하여 관류 중에 외부 배터리를 충전합니다.
   2. 관류 실험이 완료되면 벽면 AC 콘센트에서 모바일 전원의 플러그를 뽑습니다.
   3. 산소 공급기로 유입되는 가스를 분리합니다. Clamp 혈액 투석 측 회로를 차단하고 필터로 유입되는 혈액을 차단합니다. 투석액 펌프를 중단하십시오.
   4. 유입 튜브에서 유량 센서를 제거합니다. 약물 주입을 분리하고 마개를 끕니다. 입력/출력 플러그에서 압력 센서의 플러그를 뽑습니다.
   5. 드럼 깔때기와 튜브를 이동식 카트로 조심스럽게 옮기면 이제 독립적인 장치이며 이미징 제품군으로 운반할 수 있습니다.

결과

대표적인 돼지 런
전체 돼지 간은 비용 효율성을 위해 지역 정육점에서 얻었으며 기계 개발의 다양한 최적화 및 테스트 단계를 위해 관류되었습니다(보충 표 1). 3개의 대표적인 간 실행 중 처음 24시간 동안 평가가 여기에 있습니다(그림 2). 평균 간동맥압은 80mmHg ± 11mmHg였고, 평균 문맥압은 7.1mmHg ± 3.3mmHg였으며, 각각 107mL/분 ± 102mL/분 및 501mL/분± 329mL/분의 유량이었다. 압력과 유량에 대한 큰 표준 편차는 간 크기의 큰 차이와 상관관계가 있으며, 돼지는 50파운드에서 350파운드 사이입니다. 이중 유입 회로는 평균 동맥 포화도(SO₂)가 95 ± 7.4%인 생리학적 산소 차이를 허용하며, 평균 문맥 SO₂ 는 85 ± 13%(p < 0.001)입니다. 간 정맥에서 SO₂ 유출은 74 ± 18 %로 산소 소비량 (p < 0.01)을 나타 냈으며 주변 pH 측정은 7.2 ± 0.09의 생리적 범위 내에 있었다. 총 헤모글로빈(9 ± 2.5 g/dL), 헤마토크릿 수치(28.3 ± 6.4%), 포도당 수치(477 ± 15 mg/dL), 젖산(3.0 ± 2.5 mmol) 및 칼륨(-0.77 ± 2.3 mmol)의 변화와 같은 추가 생리학적 매개변수는 일정한 간격으로 샘플링하여 관류 전반에 걸쳐 모니터링되었습니다. 돼지 관류의 경우, 담즙 생성은 장기 생존 능력을 나타내는 지표였다. 장기가 정상온전성이 되면 담낭을 수동으로 배출하고, 총담관을 채취를 위해 작은 튜브에 부착했습니다. 관류 중 총 담즙 생성은 총 41± 6.9mL였으며 속도는 6.9 ± 4.0mL/h였습니다.

그림 2: 돼지 간 관류 중 관류량 측정치(n = 3). (A) 시간 경과에 따른 간 동맥 및 문맥의 평균 혈액 유입량(mL/분). (B) 시간 경과에 따른 간 동맥 및 문맥의 평균 혈액 유입 압력(mmHg). (C) 간동맥, 문맥 및 하대정맥 간의 RBC O₂ 포화 비율 비교는 유출 시 이중 유입과 산소 소비량 사이의 산소 차이를 보여줍니다. 문맥과 동맥 포화도(p < 0.0001), 문맥 및 IVC 포화도(p < 0.01), 동맥 및 IVC 포화도(p < 0.0001) 간에 통계적으로 유의미한 차이가 결정되었습니다. (D) 간동맥, 문맥 및 하대정맥 사이의 혈액 pH 평가. (E) 관류 전반에 걸친 헤마토크릿(%) 및 헤모글로빈(g/dL) 수치(위), 용혈의 지표로서 PV 칼륨(mmol)(아래)의 변화. (F) 관류 전반에 걸쳐 평균 회로 포도당(mg/dL)을 반영하는 저장 포도당 수준. (G) 간 동맥 유입, IVC 유출 및 시스템 관류물의 시간 0 젖산 값과 비교하여 관류 전반에 걸친 젖산 수치(mg/dL)의 변화. (H) 관류 전반에 걸친 시간 경과에 따른 담즙 생성(mL). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

대표적인 인간 달리기
실험의 요구 사항에 따라 관류 지속 시간이 48-72시간 범위인 3개의 종양을 지닌 인간 간 분절을 관류했습니다(그림 3). 대표적인 응용 프로그램 실행 간의 데이터를 비교하기 위해 처음 48시간의 생화학적 값을 평가했습니다. 관류는 지속적인 저압, 고용량 문맥 유입 및 박동 고압, 저용량 동맥 유입을 통해 생체 내 매개변수를 근사화했으며, 이는 실시간으로 표시되어 적정을 용이하게 합니다. 간이 관류 후 2시간 이내에 생리학적 생화학적 수치에 도달하지 못하면 실험을 중단했습니다. 성공적인 간 관류를 위해 평균 간 동맥압은 84mmHg ± 11mmHg였고, 평균 문맥압은 각각 113mL/분 ± 66mL/분 및 317mL/분 ± 302mL/분의 유량으로 9mmHg ± 4mmHg였습니다. 이중 유입 회로는 평균 동맥 포화도(SO₂)가 98% ± 3%인 생리학적 산소 차이를 허용하며, 평균 문맥 SO₂ 는 92% ± 7%(p < 0.0001)입니다. 간정맥 유출의 SO₂ 는 86%± 9%로 산소 소비량을 나타냈으며(p < 0.0001), 시스템 전체의 pH 측정은 7.3 ± 0.09의 생리학적 범위 내에 있었습니다. 총 헤모글로빈(10.2g/dL ± 1.6g/dL), 헤마토크릿 수치(30.2% ± 5.5%), 포도당 수치(170mg/dL ± 68mg/dL) 및 젖산의 변화(3.6mmol/L ± 2.2mmol/L)와 같은 추가 생리학적 매개변수는 일정한 간격으로 샘플링하여 관류 전반에 걸쳐 모니터링되었습니다. 대표적인 실행에서 평균 1.4mL/h의 담즙이 생성되었습니다. 관류 실험 전과 종료 시, 조직 분석을 위해 생검을 실시했습니다. 대표적인 조직 절편은 관류 후 간 실질, 전이성 신경내분비 종양 및 전이성 결장 직장 선암을 보여줍니다.

그림 3: 인간 간 분절 관류 중 관류액 및 조직 지표(n = 3). (A) 간 동맥 및 문맥에 대한 평균 관류액 유입률(mL/분). (B) 시간 경과에 따른 간동맥 및 문맥에 대한 평균 관류액 유입 압력(mmHg). (C) 유입 간동맥, 유입 문맥 및 유출 간정맥에 대한 적혈구 산소 포화도(%). 문맥과 동맥 포화도(p < 0.0001), 문맥과 IVC 포화도(p < 0.0001), 동맥 및 IVC 포화도(p < 0.0001) 간에 통계적으로 유의미한 차이가 결정되었습니다. (D) 유입 간동맥, 유입 문맥 및 유출 간정맥에 대한 pH를 관류합니다. (E) 평균 헤마토크릿(%) 및 헤모글로빈(g/dL) 관류액 수준(위)을 포함한 관류 전반에 걸친 적혈구 지표, 시간에 따른 기준선(아래)에서 관류산 칼륨(mmol)의 변화에 따른 적혈구 수치. (F) 시간 경과에 따른 유입 간동맥, 유입 문맥 및 유출 간정맥에 대한 평균 포도당 농도(mg/dL). (G) 유입 간 동맥, 유출 간 정맥 및 전신 관류물에 대한 시간 경과에 따른 기준선에서 관류산 젖산염 농도(mg/dL)의 변화. (H) 시간 경과에 따른 담즙 생성(mL). (I) 시스템 최적화 후 압력 괴사 부족을 보여주는 관류 중(왼쪽) 및 관류 후(오른쪽) 인간 간 분절(Couinaud II-IV). 수술 중 지혈로 인해 왼쪽 이미지 상단에 존재하는 소작의 표재성 영역. (J) 간 실질(hepatic parenchyma)을 보여주는 관류 후 조직 절편(hematoxylin 및 eosin stain, 10x, 삽입 40x; 스케일 바 50μM). (K) 전이성 신경내분비 종양을 보여주는 관류 후 조직 절편(헤마톡실린 및 에오신 염색, 10x, 삽입 40x, 눈금 막대 250μM). (L) 전이성 결장직장 선암종을 보여주는 관류 후 조직 절편(헤마톡실린 및 에오신 염색, 10x, 삽입 40x, 스케일 바 50μM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

대표적인 용도 : 관류시료의 CT 촬영
컴퓨터 단층 촬영(CT) 또는 자기 공명(MR) 영상과 같은 임상 데이터 소스를 병리학과 통합할 수 있는 능력은 맞춤형 진단 및 의학을 발전시킬 수 있습니다. 그러나 병리학 보고서는 요약 소견이며, 고형 종양에 내재된 이질성은 인간의 설명 능력을 훨씬 능가합니다. 잠재적인 해결책은 생체 외 이미징을 수행한 후 거시적 조직 절편을 즉시 준비하여 공간적으로 보존하는 세포 데이터(예: 공간 전사체학, 고도의 다중 면역 형광)의 방사선 통합을 허용하는 것입니다. 시스템에 대한 기존 이미징을 수용하기 위해 운송 및 이미징 중에 중단 없는 전원을 제공하기 위해 펌프를 외부 배터리 소스로 전환하는 것을 포함한 모바일 설정이 구성되었습니다(그림 4A). CT 테이블에 간을 놓고 요오드화 조영제를 투여하고 생체 내에서 획득한 것과 일관된 방사선 사진을 보여주는 이미지를 얻었습니다(그림 4B).

대표적인 용도 : 신장 및 췌장 관류
설계에 걸맞게, 이 시스템은 추가 장기의 관류에 적응할 수 있으며(그림 4C-F), 이중 유입의 필요성을 없애고 따라서 사용 당 비용을 절감합니다. 이를 입증하기 위해 단일 동맥 유입을 위해 문맥 회로를 제거하고(보충 그림 2) 인간의 신장(그림 4C)과 인간의 부분 췌장(그림 4E)을 관류했습니다. 관류 후 대표적인 조직 절편은 사구체(그림 4D)와 랑게르한스 섬(그림 4F)을 보여줍니다.

그림 4: 관류 기계의 대표적인 응용 분야: CT 영상 및 장기 모듈성. (A) 운송을 위한 시스템의 모바일 적응. (B) 요오드화 조영제 투여 후 in vivo (위) 및 관류 후 ex vivo (아래) 투여 후 종양이 있는 간의 대표적인 CT 이미지. (C) 단일 유입을 위해 재구성된 기계에서 인간 신장 관류. (D) 관류 후 조직 절편은 신장 사구체 및 수집 관(hematoxylin 및 eosin 염색, 8x, 스케일 바 250μm)을 보여줍니다. (E) 단일 유입을 위해 재구성된 기계에서 인간 원위 췌장 관류. (F) 관류 후 조직 절편은 췌장섬(헤마톡실린 및 에오신 염색, 8x, 스케일 바 250μm)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 반자동 관류를 용이하게 하는 Python 코드 설정. 코드에서 사용하는 입력 및 출력 매개변수를 나타내는 회로도로, 일반적으로 사용되는 수동 조정을 추가하여 반자동화를 가능하게 합니다(표). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 신장 및 췌장 관류에 사용되는 단일 유입 회로도. P/F 센서: 압력 및 유량 센서. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 적혈구 최적화. (A) 혈액 단독 관류 실험은 혈장이 없는 헤모글로빈을 세포 용해의 대용품으로 사용하여 높은 RPM 조건(p < 0.01)에 비해 낮은 RPM 조건에서 현저히 적은 용혈을 보여주었습니다. (B) 시간 경과에 따른 혈장 용혈의 정성적 비교는 높은 RPM 상태와 비교할 때 낮은 RPM 상태에서 더 적은 용혈을 시각적으로 보여줍니다. (씨-에프) 저항성 수준이 상이하고 혈장 대리모와 분지 통합이 다른 시스템에서의 용혈 평가: (C) 병렬 회로 설정과 폐쇄 및 분지 설정 간에 젖산 수준의 상당한 차이가 결정되었습니다(각각 p < 0.0001 및 p < 0.0001). (D) 칼륨 수치의 유의미한 차이는 병렬 회로 설정과 분지 설정이 있는 직렬 폐쇄 및 직렬 둘 다 (각각 p < 0.0001 및 p < 0.0001) 간에 결정되었습니다. (E) 병렬 회로 설정과 직렬 폐쇄 및 분지 설정이 있는 직렬 모두(각각 p < 0.0001 및 p < 0.0001) 간에 헤마토크릿 수준의 상당한 차이가 결정되었습니다. (F) 병렬 회로 설정과 직렬 폐쇄 및 분지 설정이 있는 직렬 간에 헤모글로빈 수치의 유의한 차이가 측정되었습니다(각각 p < 0.0001 및 p < 0.0001). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 돼지 장기 최적화 관류. 최적화 단계에서 25개의 부분 간, 2개의 신장 및 8개의 전체 간을 포함하여 35개의 돼지 관류 실험이 수행되었습니다. 관류 기간과 종결 사유가 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 인간 간 검증 및 적용 관류. 단일 세그먼트 관류 실험에 걸친 공식적인 좌측 및 우측 간절제술을 포함한 14건의 인간 부분 간 관류. 여기에는 병리학, 실험적 목표, 관류 기간 및 종결 근거가 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 3: 관류액 전용 최적화. 종 유형, 실험 목표, 실험 기간 및 종료 이유를 포함한 22개의 관류물 전용 최적화 실행. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

고형 장기 이식 전에 일반적으로 사용되는 규범 관류 기계는 체외 관류에서 상당한 발전을 이루었습니다. 일부^{경우에는 부분} 장기를 사용하는 것이 기술적으로 가능하지만^7,8,9 높은 비용과 제한된 가용성으로 인해 연구 과학자가 접근할 수 없습니다. 이 작업에서 우리는 쉽게 소싱할 수 있는 구성 요소와 자유롭게 액세스할 수 있는 코드를 사용하여 광범위한 연구 엔드포인트에 대한 시스템을 실행함으로써 더 큰 연구 커뮤니티에 필적할 수 있는 오픈 소스 대안을 제공하고자 했습니다.

프로토콜 내의 여러 단계는 안정적인 장기 관류를 달성하는 데 필수적입니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 실질 붕괴 및 정현파 팽창을 방지하기 위한 효과적인 압력 하역입니다. 이는 진동 다이어프램으로 지지되는 메모리 폼을 구현하여 장기 무게를 고르게 분산시키고 적절한 배액을 위해 대기에 가까운 문맥 압력을 유지함으로써 달성되었습니다. 간을 지지하기 위해 금속 화격자를 처음 사용하면 관류 중 조직학적 분석 및 초음파 영상에서 관찰된 바와 같이 실질 허탈과 정현파 울혈이 발생했습니다. 이것은 구멍이 뚫린 실리콘 해먹으로 전환함으로써 부분적으로 해결되었습니다. 심압 괴사는 해결되었지만, 높은 문맥 압력과 관류 48시간 후 현저하게 혼잡한 표본에 의해 입증된 바와 같이 실질 붕괴의 주목할만한 증거가 여전히 있었습니다. 간을 식염수나 혈액에 담그는 것도 시도되었고 울혈과 문맥 고혈압을 완화하는 데 성공적이었다. 그러나 많은 양의 관류액이 필요하고 멸균 유지가 어려우며 저장소로 효율적으로 배출되지 않았기 때문에 실현 가능하지 않았습니다. 부유 기법과 비교했을 때, 체중을 더 균등하게 분산시키기 위해 진동하는 다이어프램이 있는 메모리폼 쿠션 위에 간을 놓았을 때 동일한 근 대기 문맥 압력을 관찰했습니다(그림 1B 및 그림 3I). 이 설계는 더 부드럽고 관류가 잘 되는 세그먼트를 만드는 동시에 표본에서 혈액 유출을 쉽고 효율적으로 배출할 수 있도록 합니다.

두 번째 중요한 단계는 용혈을 방지하기 위해 적혈구에 전단 응력을 가하는 회로 저항을 최소화하는 것입니다. 이것은 관류액에 불필요한 압력을 가하지 않고 생리학적 흐름을 촉진하기 위해 제한적인 구성 요소가 있는 측면 회로를 도입함으로써 달성되었습니다. 용혈은 기계 관류 중 불가피하고 지속적인 과정입니다. 시스템의 초기 반복에서 광범위한 용혈은 조기 종료에 중요한 기여를 했습니다. 시스템이 적혈구에 부여하는 전단 응력은 주로 튜브와 멤브레인의 좁은 직경과 더불어 관류, 정체 및 재순환으로 인한 펌프에서 비롯됩니다. 현재 사용되는 펌프는 시간이 지남에 따라 증가하는 어느 정도의 용혈을 유발합니다. 펌프 효율은 용혈에서 중요한 요소이며, 혈액 재활용 및 2차 흐름의 비율이 낮기 때문에 더 높은 유량이 유익할 수 있으며, 더 많은 양의 관류물 및/또는 더 낮은 펌프 속도로 완화될 수 있습니다. 많은 양의 pRBC는 종종 획득하기 어렵기 때문에 더 낮은 펌프 속도에서 생리학적 유량을 제공하고 전체 회로에서 더 낮은 저항을 제공하도록 시스템을 재설계하는 데 노력을 집중했습니다³¹. 회로의 고유 저항을 더욱 줄이기 위해 측면 회로를 병렬로 통합한 결과, 시간이 지남에 따라 젖산 및 칼륨 수치가 낮아지고 헤마토크릿 및 헤모글로빈 수치가 높아졌습니다(보충 그림 3). 마지막으로, 현재의 헤모필터는 필터와 펌프가 모두 전달하는 현저한 저항과 전단 응력으로 인해 상당한 양의 용혈을 제공하는 연동 펌프에 의해 추진되는 혈액과 함께 문맥 측 회로에 통합됩니다. 현재 최적화 노력 중 하나는 혈액 투석 튜브가 저장소에 구현될 가능성을 조사하여 이 측면 회로를 제거하는 데 중점을 두고 있습니다. 임상 등급의 혈액 필터를 제거하면 연동 펌프를 이후에 제거할 수 있고, 용혈을 더욱 최소화하며, 시스템의 전체 비용을 줄일 수 있습니다.

여기에 설명된 시스템의 유용성과 적응성에도 불구하고 제한 사항을 인정해야 합니다. 특히, 생존 가능한 관류 기간은 3-4일 동안 재현 가능합니다. 용혈은 위에서 논의한 바와 같이 관류 수명을 제한하는 중심 요인으로 남아 있습니다. 그러나 총 관류액 부피를 크게 늘리면 더 긴 관류 시간이 필요한 경우 관류 기간을 상당히 연장할 수 있지만, 이는 여기에서 설명하는 것 이상으로 자원 활용도를 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 최적의 관류 기간은 궁극적으로 시스템에 대한 특정 실험 질문에 따라 달라집니다. 예를 들어, 약물 전달 역학 또는 경로 억제를 조사하는 연구는 2-12시간에 걸쳐 효과적으로 수행될 수 있는 반면, 종양 미세환경으로의 세포 동원과 관련된 질문은 48시간³²분이 필요할 수 있습니다. 현재 기간을 넘어 생존 가능성을 확장하는 것은 세포외 기질 리모델링(즉, 섬유증)과 같은 응용 분야에 중요할 수 있지만, 대부분의 암 관련 응용 분야에는 추가 자원 지출이 필요하지 않을 것으로 생각합니다. 주요 초점은 종양학 중심의 중개 응용 프로그램에 중점을 두었으며, 이는 생체 내 시나리오의 복잡성을 보다 밀접하게 복제하는 조건인 온전한 실질 및 종양 혈관 구조를 통해 치료를 전달할 수 있는 통제된 생체 외 환경에서 인간 종양을 유지하는 것을 목표로 했습니다²⁵. 이 시나리오에서 시스템은 약물 전달, 종양 이질성 및 약물 대사와 관련된 현재 전임상 종양학 모델의 오랜 문제를 해결하며, 이는 전임상의 성공을 임상적 효능으로 전환하지 못하는 빈번한 실패를 설명할 수 있습니다^33,34.

기존 상용 기계와 비교했을 때 이 시스템은 상당한 비용 이점, 모듈식 확장성 및 실험적 유연성을 제공합니다. 상용 기기는 종종 독점적이고 비용이 많이 들며 이식 환경에서 전체 장기 관류에 최적화되어 있습니다. 이 시스템은 상용 기계가 아닌 방식으로 확장 가능하므로 적용 가능성을 광범위하게 상상할 수 있습니다. 여기에 제시된 시스템은 최종 제품이 아니라 청사진이며, 다양한 연구 관심 분야와 실험 질문에 맞게 수정, 조정 및 용도를 변경할 수 있어 여러 분야에 걸쳐 과학자들의 공백을 채울 수 있습니다.

이 플랫폼의 향후 방향에는 면역 종양학 응용 프로그램을 지원하기 위해 자가 혈액 제제를 사용할 수 있도록 하위 분절 및 관류량으로 축소하는 것이 포함됩니다. 또한 다중 오믹스 플랫폼과 실시간 이미징을 통합하여 치료 반응에 대한 동적 모니터링을 제공하여 상세한 약리학 연구를 위한 길을 닦고 있습니다. 우리는 이 시스템이 중개 과학의 여러 분야에 걸쳐 새로운 깊이의 지식을 구축하기 위한 노력의 일환으로 협업과 혁신을 장려하기를 바랍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" 벽 Versilon  C-219-A 유연한 PVC 튜브	미국 플라스틱 공사	57682
BD 루어락 팁이 있는 10cc 주사기	BD	302995
BD Luer-Lock 팁이 있는 1cc 주사기	BD	309628
25 Fr 포털 캐뉼라	엑스비보	11.01.520
3D 프린팅 유량 센서 홀더	해당 사항 없음	해당 사항 없음	SDL 파일에 대한 GitHub 참조
3D 프린팅 자석 홀더	해당 사항 없음	해당 사항 없음	SDL 파일에 대한 GitHub 참조
48인치 높이 x 24인치 W 화이트 페그보드	홈디포	109099
4방향 마개, 노란색, 2개의 암 루어 잠금 장치, 스핀 잠금 장치가 있는 수 루어	세계 정밀 기기	14057-10
BD Luer-Lock 팁이 있는 50cc 주사기	BD	309653
ACF00023 타이곤 S3  by 생고뱅 | 5/16" ID x 1/2" OD x 3/32" 벽 | E-3603 비 DEHP | 프탈레이트 프리 실험실 튜브 | 50' 패키지 길이	호스 창고	ACF00023
암포테리신	수의학 약국	해당 사항 없음	https://mms.mckesson.com/product/505635/Xgen-Pharmaceuticals-39822105505
가시 피팅, Y-커넥터, 3/8" 튜브 ID, PP, 5/PK	VWR	MFLX06368-24	재료 유형은 중요하지 않음
CDI 540 교정기	테루모	540CL
CDI 케이블 헤드 브래킷	테루모	CDI519CL
CDI 모니터	테루모	500AVHCTCL
CDI 폴 클램프	테루모	CDI517CL
Clave IV 튜빙 커넥터 바늘 없음 100/Ca	헨리 샤인 치과	1097422
전해질이 함유된 Clinimix	백스터	2B7721	아미노산 쪽만 사용하고 포도당 쪽과 혼합하지 마십시오.
CO2 USP 등급 50 LB	로버트의 산소	R25
GUI 용 컴퓨터 모니터;	해당 사항 없음	해당 사항 없음	GUI를 보기 위한 모든 유형의 화면
데이터 수집 장치	측정 컴퓨팅	USB-202	기계 연결 방법에 따라 2개 또는 3개가 필요합니다.
펌프용 데스크탑 전원 공급 장치	레비트로닉스	100-40015	2개, HA용 1개, PV용 1개
황동 스크린이 있는 Eagle 1662 드럼 깔때기, 직경 18" x 높이 7", 노란색	글로벌 산업	WB440139
에포프로스테놀	수의학 약국	해당 사항 없음	https://mms.mckesson.com/product/1239813/Sun-Pharmaceuticals-62756005940
암컷 루어 ¼ " 천연 나일론 클린룸에서 제조된 미늘; 10 팩	VWR	MFLX40314-26	재료 유형은 중요하지 않음
피팅, 폴리프로필렌, 직선, 암 루어-호스바브 어댑터, 1/8" ID; 25/PK	VWR	MFLX30800-08	재료 유형은 중요하지 않음
피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 수 루어 잠금 장치-호스바브 어댑터, 1/8" ID; 25/PK	VWR	MFLX30800-18	재료 유형은 중요하지 않음
피팅, PVDF, 스트레이트, 호스 미늘 감속기, 5/16" ID x ¼ " 아이디; 10/PK	VWR	MFLX40614-62	재료 유형은 중요하지 않음
플로우 마운트	해당 사항 없음	해당 사항 없음	SDL 파일에 대한 GitHub 참조
유량 센서 클램프	키엔스	FD-XC20R1 시리즈
유량 센서 컨트롤러	키엔스	FD-XA1 시리즈
유량 센서 헤드	키엔스	FD-XS20 시리즈
유량 센서 전원 공급 장치	키엔스	MS2-H50
가스 블렌더	MCQ	GB100+2	2개, HA용 1개, PV용 1개
가스통 A, CDI 500	테루모	CDI506
가스통 B, CDI 500	테루모	CDI507 시리즈
글루카곤 키트, 글루카곤 1 mg, 멸균수 1 mL, 바이알	프레제니우스	0593-03
H / S 큐벳 1 / 4x1 / 4 W / 6 "EXT 1CA = 10EA 70-2006-4298-4	테루모	6934
150 및 마이크로가 있는 하드쉘 저수지; M 필터	헤모네틱스 코퍼레이션	00205-00
열 콜드 패드, Mul-T-Pad, TP12E 패드 크기 13" x 18" Gaymar TP700 펌프용	멀 티패드	8002-062-012	https://www.amazon.com/Heat-Cold-Mul-T-Pad-Gaymar-TP700/dp/B00HFF7876. 의  참고로 Stryker는 "Mul-T-Pad C2Dx 8002-062-012"와 유사한 온수 재킷도 제공합니다.
인슐린	수의학 약국		https://mms.mckesson.com/product/294668/Novo-Nordisk-Pharmaceutical-00169183311
Ismatec 모델 에코라인 펌프 VC-280 II	이스마텍	ISM1078B-115
LTV 1200 소아 인공호흡기	케어퓨전		https://coastbiomed.com/product/carefusion-ltv-1200-ventilator/?srsltid=AfmBOopSCKwTLmKhZXcI CgGQHfiKwj__78jNWxVaznJCS aq3RjXw2E-H. 이 모델 소아용 인공호흡기는 병원 잉여분에서 용도를 변경하여 구입하지 않았습니다. 상업용 간헐적 펌프 또는 폭기 기계는 적절한 대체품입니다.
메인 펌프 케이블	레비트로닉스	190-10331	2개, HA용 1개, PV용 1개
MaPerSol 장기 보존 용액, 1L 백	보존 솔루션	PS005
마스터플렉스  어댑터 피팅, 루어-루어, 티, Avantor	VWR	MFLX45508-56	재료 유형은 중요하지 않음
마스터플렉스  암 루어 3/16" ID 미늘 천연 PVDF 클린룸 제조	VWR	MFLX40314-22	재료 유형은 중요하지 않음
Masterflex Ismatec Reglo 디지털 펌프(MasterflexLive, 4채널, 8롤러 포함); 115/230 VAC	마스터플렉스	MFLX78018-22	https://www.avantorsciences.com/us/en/product/NA5139147/masterflex-ismatec-reglo-digital-multichannel-pumps-avantor
Masterflex Male Luer 1/4" ID Barb in Natural PVDF Cleanroom 제조, 10/PK	VWR	MFLX40318-27	재료 유형은 중요하지 않음
Masterflex Male Luer 3/16" ID Barb in Natural PVDF Cleanroom 제조	VWR	MFLX40318-22	재료 유형은 중요하지 않음
Medline 태반 세면기 표준 트레이	메드라인	딘니스플라센타
MEDTRONIC DLP 2" 혈관 캐뉼라, 3MM 경사진 팁	봉합사	MDT30007
메모리폼	최고의 가격 매트리스		https://www.amazon.com/Best-Price-Mattress-Twin-Topper/dp/B07999TQWB/ref=sr_1_2_sspa?crid=17LQXX80WX5FK&dib=eyJ2Ijo iMSJ9.oRyEE5KwmKy1pb-VvY9MOJg _MF3wr0PmXqKcOrSEbeJWS2X 5BkFs_WSfuE1OU8GS0u_T1qM IJbsoy3omRv1wfBCy2sw2fOUIX JMqAO6BSb7t_D3j745MoXjedLbo BYypyi6_Qgoc32N8bpVcmoT_k9b LECWdi_KpEmxQx2PEok1fjlK3ywO yBXwqPnXefMt5JeW5H1R7RO3fD g4tidmRoEJ-YxfU3d_iprpFpm7A3zi 7CG_BMUAaGpBcRitwqb9Q4TB5bM 1i-GcMhSFKbzaGNd76CoVVVkZRjib c9Ix-CvY.t7xCkzB81vNhO9gYLxoNen WHEwC6JJpw9T4G6iIa5N4& dib_tag =se& 키워드=메모리%2B폼& qid =1748632609& 접두사=메모리%2Bfoam %2Caps%2C133& sr=8-2-스폰& sp_csd =d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& th=1
나사산이 없는 직선 구멍이 있는 네오디뮴 자석	맥마스터 카	336K834
질소, 125 CU FTGrade 4.5 고순도	로버트의 산소	R32
산소, 255 CU FTGrade 4.5 고순도	로버트의 산소	R5
PDMSXA-2500: PermSelect  2500센티미터 제곱미터 멤브레인 모듈 -- MCC가 없는 가시 피팅	퍼마셀렉트	PDMSXA-2500	루어 또는 미늘 피팅을 얻을 수 있지만 연결은 변경됩니다.
페닐에프린 HCI 주사제, USP 10mg/mL 1mL 바이알	건강 우선	1000520
ORS 유체 가온 시스템용 폴리우레탄 가온 드레이프, 멸균, 44" x 66"	메드라인	ORS-300H
돼지 돼지 피	람파이어	7204911
압력 센서 모니터	펜도테크	PMAT2HR
PRISMAFLEX M60 세트	박스터 헬스케어 주식회사	106696
PrismaSol BGK0/2.5 연속 신대체 요법용 대체 용액, 비 PVC	백스터	110240S
펌프 장착 베이스 플레이트	레비트로닉스	190-10313	2개, HA용 1개, PV용 1개
펌프 USB 어댑터	레비트로닉스	100-30391	2개, HA용 1개, PV용 1개
PuraLev 드라이버 시스템	레비트로닉스	100-91025	2개, HA용 1개, PV용 1개
PuraLev IP 어댑터 케이블	레비트로닉스	190-10475	2개, HA용 1개, PV용 1개
션트 센서 SYS500 - CA = 20EA 98-0702-1541-7	테루모	CDI510H	봉합사에서 만료된 것을 구입할 수 있습니다 - 동일하게 작동하며 때로는 약간의 pH 드리프트가 있습니다.
일회용 압력 센서, 비멸균, 폴리설폰 1/4인치 호스 바브	펜도테크	프립스-N-025
일회용 압력 센서	펜도테크	프립스-N-025	멸균과 함께 재사용할 수 있지만 매번 사용하기 전에 센서를 테스트하십시오.
중탄산나트륨 8.4% 용액 실험실 등급	연구실 골목	144-55-8
타우로콜레이트나트륨 수화물	밀리포어 시그마	86339-25G
솔루메드롤	수의학 약국	해당 사항 없음	https://mms.mckesson.com/product/1212228/Dr-Reddys-Laboratories-43598013074
스트라이커 가열 패드	아마존	B01M74Y8DI
SU 펌프헤드, PP, 미늘 3/8", 감마>25kGy, DCP-30.2-G25, PuraLev	레비트로닉스	100-91071	멸균 후 재사용 가능
주사기 펌프(펌프 11 엘리트)	하버드 장치	70-4504	주입된 약물당 하나씩 필요
주사기 튜브	GSS	ME2020
온수기 및 순환기	그랜트 사이언티픽	TC120 시리즈
조신	수의학 약국	해당 사항 없음	https://mms.mckesson.com/product/1009456/Auromedics-Pharmaceuticals-55150011930