질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

요약

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

초록

단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크는 질병에서 동적으로 리모델링되지만 대부분의 시스템 생물학 접근 방식은 단백질 풍부도의 변화에 초점을 맞추고 중요한 상호 작용 수준 기능 장애를 간과합니다. 여기에서 우리는 세포 및 일차 인간 조직에서 PPI 네트워크 기능 장애의 고처리량, 체계적, 질병 맥락 매핑을 가능하게 하는 강력한 화학 단백질 단백질 상호 작용 방법(dfPPI)을 제시합니다. 이 방법은 표지가 없는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 및 네트워크 기반 계산 분석과 함께 에피샤페롬 기반 상호 작용체 어셈블리를 선택적으로 포착하는 화학 생물학 프로브를 통합하여 전사체 또는 단백질체 데이터만으로는 명백하지 않은 단백질 네트워크의 재배선을 밝힙니다. dfPPI 플랫폼은 질병 상태, 종 및 조직 전반에 걸쳐 적용하여 실행 가능한 기능 장애 노드를 식별하고 질병 진행에 대한 고해상도 시스템 수준 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 시료 준비, 화학적 프로브 처리, 친화성 농축, 무표지 LC-MS/MS 분석 및 dfPPI 데이터 세트를 생성하고 해석하는 데 사용되는 생물정보학 워크플로우를 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 이 기사는 이 접근 방식의 재현성과 접근성을 촉진하여 더 넓은 시스템 생물학 및 중개 연구 커뮤니티에서 채택을 지원하는 것을 목표로 합니다.

서론

세포의 기능 및 더 나아가 유기체의 기능은 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크의 정확한 조정에 달려 있습니다 ^1,2. 이러한 네트워크는 거의 모든 생물학적 과정을 조직하고 실행하는 역할을 합니다. PPI 네트워크는 본질적으로 역동적이고 스트레스에 반응하지만 질병에서는 비정상적으로 재배선되어 부적응 기능으로 이어질 수 있습니다. 중요한 것은 이러한 재배선이 반드시 유전자 또는 단백질 발현의 변화를 수반하는 것은 아니라는 것입니다. 오히려 그것은 정상적으로 발현되는 단백질 사이의 변경된 물리적 상호 작용에서 발생합니다 ^3,4,5. 전사체학이나 단백질체학과 같은 시스템 생물학의 전통적인 접근 방식은 이러한 중요한 상호 작용 수준의 변화를 포착하지 못합니다.

PPI 매핑 기술은 셀룰러 네트워크의 구성 및 규제에 대한 통찰력을 제공하면서 크게 발전했습니다 6,7,8,9,10,11. 친화성 정제-질량 분석법(AP-MS), 가교(XL)-MS, 근접 표지 및 공동 분획을 포함하여 일반적으로 사용되는 접근법은 각각 높은 특이성, 공간 분해능 또는 일시적인 복합체 검출 능력과 같은 특정 이점을 제공합니다 6,8,9,10,11 . 그러나 이러한 방법은 종종 미끼 단백질, 유전자 조작 또는 복잡한 생물정보학을 필요로 하며 천연 생물학적 시스템에서 단백질 네트워크의 대규모, 질병 중심 재배선을 포착하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다 6,7,8,9,10,11 . 대부분은 또한 확장성이 부족하여 대규모 샘플 코호트를 분석하거나 조건, 세포 유형 또는 시점 6,7,8,9,10,11 에 걸쳐 상호 작용체 변화를 체계적으로 매핑하는 데 실용적이지 않습니다(표 1).

이러한 격차를 해결하기 위해 우리는 질병 표현형의 원인이 되는 PPI 네트워크 기능 장애를 직접 식별하는 화학 단백질 단백질 상호작용 방법인 dfPPI(Dysfunctional Protein-Protein Interactome) 플랫폼을 개발했습니다¹². 이는 질병 상태에서 분자 샤페론의 하위 집합이 에피샤페롬 13,14,15라고 하는 초분자 스캐폴드를 형성한다는 핵심 생물학적 통찰력을 활용합니다. 이러한 구조는 단백질 접힘에 작용하지 않고 대신 단백질 연결성을 재구성하는 스캐폴딩 상호 작용 허브 역할을 합니다³. 결정적으로, 에피샤페롬에 격리된 단백질은 무작위가 아닙니다. 그들은 질병 표현형 16,17,18,19,20을 유지하는 데 적극적으로 관여하는 사람들입니다. 이러한 에피샤페롬 결합 단백질과 그 상호 작용자를 포착함으로써 dfPPI는 특정 질병 상태를 유발하는 정확한 네트워크 변경을 식별합니다. 에피샤페롬 기반 네트워크 재배선은 질병 전반에 걸쳐 널리 퍼져 있으며, 알츠하이머병 코호트에서는 대다수, 암 표본에서는 ~70%가^16,20 dfPPI의 대규모 질병 중심 연구에 대한 적용 가능성을 뒷받침합니다.

dfPPI 플랫폼은 시료 전처리, 에피샤페롬 친화성 캡처, MS에 의한 상호작용체 식별부터 경로 농축 및 기능적 단백질 네트워크 모델링과 같은 다운스트림 생물정보학 분석에 이르기까지 전체 워크플로우를 포괄합니다(그림 1). 이 방법은 친화성 매트릭스(PU-비드 또는 기타 프로브)13,16,17에 고정된 에피샤페롬 특이적 화학 프로브를 사용하여 세포 또는 조직에서 기능적 상호 작용체를 분리합니다. 이러한 프로브는 이미 에피샤페롬에 대한 특이성과 dfPPI 16,17,18,20,21,22에 대한 적합성에 대해 여러 간행물에서 엄격하게 검증되었습니다. 포획된 복합체는 온비드 및 인겔 분해 워크플로우를 모두 사용하여 MS에 노출된 후 무표지 LC-MS/MS를 사용합니다. 그런 다음 결과 데이터는 상호 작용 수준의 기능 장애를 정의하고 이를 생물학적 과정 및 표현형에 연결하는 전용 생물정보학 파이프라인을 통해 분석할 수 있습니다. 에피샤페롬은 상황별 인터랙톰 17,18,20을 스캐폴딩하기 때문에 dfPPI는 특정 질병, 세포 유형 또는 단계에서 단백질 네트워크가 어떻게 리모델링되는지 밝혀 정밀 표현형 분석을 위한 강력한 시스템 생물학 도구가 됩니다.

이 방법은 확장성이 뛰어나며 암 및 신경변성과 같은 다양한 질병에 걸쳐 사후 인간 조직 및 배양 세포를 포함한 수백 개의 임상 및 실험 샘플에 적용되었습니다 16,17,18,19,20,22,23. 병리학적 상태를 정의하는 PPI 변화를 밝혀냄으로써 dfPPI는 기계론적 통찰력과 실행 가능한 치료 표적 16,17,18,19,20,22,23의 발견을 가능하게 합니다.

이 프로토콜에서는 에피샤페롬 결합 인터랙톰의 친화성 포획에서 LC-MS/MS를 위한 샘플 준비, MS를 통한 인터랙톰 식별에 이르기까지 dfPPI 플랫폼의 실험 구성 요소를 자세히 설명합니다. 계산 분석 파이프라인, 즉 차등 상호 작용 및 기능적 결과를 정의하기 위해 MS에 의해 식별된 단백질 목록으로 수행되는 작업은 공간 제한으로 인해 여기에서 다루지 않습니다. 그러나 https://epichaperomics.mskcc.org 의 dfPPI Shiny 앱(https://dfppi.mskcc.org 으로 업데이트됨)과 https://www.chiosislab.com/resources 의 Chiosis Lab 웹사이트를 통해 자유롭게 액세스할 수 있으며 광범위하게 문서화됩니다. 이러한 포털 외에도 완전한 생물정보학 파이프라인 및 함께 제공되는 스크립트는 dfPPI를 암^16,17,19 및 알츠하이머병^18,20에 적용하는 여러 간행물에 포함되어 있습니다.

프로토콜

프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리 위원회와 동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 따릅니다. 연구에 사용된 장비 및 시약은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 친화성 포획을 위한 시료 준비

1. 조직에서 단백질 추출
   참고: 이 프로토콜은 사후 뇌 조직 샘플에 최적화되었습니다.
   1. 20mM Tris(pH 7.5), 20mM KCl, 5mM MgCl₂ 및 0.01% NP-40(천연 용해 완충액)을 포함하는 단백질 추출 완충액을 준비합니다. 사용 직전에 프로테아제와 포스파타제 억제제를 첨가하십시오. 버퍼를 얼음 위에 보관하십시오.
   2. 냉동 조직(목표 부피 약 50mm³)을 유봉이 장착된 특수 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 구성된 미세 조직 균질화 튜브에 넣습니다. 500-700μL의 천연 용해 완충액을 첨가하여 조직 조밀함과 균질화 용이성에 따라 부피를 조정합니다. 균질한 현탁액이 형성될 때까지 유봉을 균질화 튜브의 연마벽에 대고 유봉을 위아래로 부드럽게 움직여 얼음 위에서 샘플을 균질화합니다.
      참고: 단백질 어셈블리를 원래 구성으로 유지하고 단백질 분해를 방지하기 위해 얼음 위에서 모든 단계를 수행합니다.
   3. 바이알을 회전 장치에 놓아 4°C에서 30분 동안 용해물을 배양합니다. 회전을 사용하여 배양하는 동안 샘플을 부드럽게 혼합합니다.
   4. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10 분 동안 샘플 을 13,000×g에서 원심분리하여 파편을 제거합니다.
   5. 상청액을 수집하여 투명한 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이송 중에 펠릿을 방해하지 마십시오.
   6. 제조업체의 지침에 따라 비신코닌산(BCA) 분석 키트를 사용하여 상청액의 총 단백질 농도를 측정합니다.
      참고: 단백질 용해물은 사용할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오. 반복되는 동결-해동 주기 및 보관 온도가 단백질 어셈블리의 무결성에 미치는 영향에 대해서는 이전 간행물²⁴ 를 참조하십시오.
2. 샘플 정규화
   참고: HSP90α 및 HSP90β는 에피샤페롬의 핵심 구성 요소이며 상호 작용체 포획에 사용되는 화학적 프로브의 직접 결합 파트너입니다 13,21,23. HSP90α(또는 HSP90β)를 기반으로 샘플을 정규화하면 프로브 표적 가능한 에피샤페롬의 양이 샘플 간에 일치하도록 보장하며, 이는 캡처된 상호 작용체의 정확한 비교에 필수적입니다. 샘플은 웨스턴 블롯으로 결정된 HSP90 수준을 기반으로 정규화할 수 있지만 다른 방법도 사용할 수 있습니다. HSP90 수준이 샘플 간에 비교할 수 있는 경우 이 섹션을 건너뛰고 1.3단계로 진행합니다. 여기서 HSP90α/β 블로팅의 사용은 입력 정규화를 위한 것이며 에피샤페롬 풍부도 측정으로 해석되어서는 안 됩니다.
   1. 4% 도데실 황산나트륨(SDS), 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올, 0.02% 브로모페놀 블루 및 0.125 M Tris-HCl, pH ~6.8로 구성된 2× Laemmli 샘플 완충액을 준비합니다.
      주의: 2-메르캅토에탄올은 독성이 있고 휘발성이 있으므로 연기에서 취급해야 합니다.
   2. 총 뇌 단백질 추출물 5μg(1.1단계에서) 1:1(v/v)을 1.5mL 투명 미세 원심분리기 튜브에 2× Laemmli 샘플 완충액과 결합합니다.
   3. 샘플을 가열 장치에서 95°C에서 3-5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킨 후 도데실-황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 로딩합니다.
   4. 샘플을 프리캐스트 8% Tris-Glycine 단백질 겔에 로드합니다. 또는 핸드 캐스팅 젤을 사용하십시오.
   5. 예를 들어 단백질 분자량을 결정하기 위해 5 μL의 사전 염색된 단백질 표준물질을 각 겔(예: 첫 번째 웰)에 로드합니다.
   6. RT에서 1× TGS(Tris-Glycine-SDS) 러닝 버퍼에서 겔을 실행합니다. 일반적인 실행 시간은 100V에서 1.5-2시간입니다.
   7. 25mM Tris, 192mM 글리신 및 20% 메탄올을 포함하는 전사 완충액을 준비합니다.
      주의 : 메탄올은 가연성이므로 안전 지침에 따라 취급해야 합니다.
   8. 단백질을 4°C의 전사 완충액에 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 정전압(100V)에서 60분 동안 전사합니다.
   9. 멤브레인 세척액(1× TBS-0.1% Tween-20)과 차단액(1× TBS-0.1% Tween-20에 5% 우유)을 준비합니다. 이 프로토콜은 상업용 공급원의 분유 무지방 분유를 사용합니다.
   10. 멤브레인을 실온(RT)에서 1시간 동안 차단 용액에 넣고 플랫폼 로커에서 부드럽게 교반합니다. 미니 젤당 10mL의 차단 용액을 사용합니다.
   11. 차단 용액을 제거하고 멤브레인을 항-HSP90α 항체(10mL 차단 용액에서 1:6,000 희석)와 함께 플랫폼 로커에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
   12. 항체 용액을 제거하고 멤브레인을 10mL의 세척액으로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
   13. HRP 접합 염소 항토끼 2차 항체(10mL 1× TBS-0.1% Tween-20에서 1:5,000 희석)를 첨가하고 플랫폼 로커에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
   14. 2차 항체를 제거하고 멤브레인을 세척액으로 4회 세척합니다(위와 동일한 부피 및 타이밍).
   15. 제조업체의 지침에 따라 향상된 화학발광(ECL) 키트를 사용하여 HSP90α 특이적 화학발광 신호를 검출합니다. 화학발광 이미징 시스템 또는 자방사선 필름을 사용하십시오.
   16. 신호 강도를 기반으로 샘플의 HSP90α 수준을 정량화하고 다운스트림 풀다운에 대한 정규화 계수를 계산합니다.
       참고: HSP90 신호의 강도는 각 샘플에서 프로브 표적 가능한 에피샤페롬의 양을 반영합니다. 샘플 간의 신호 강도를 비교하고 모든 젤에서 실행되는 참조 샘플로 정규화함으로써 상호 작용체 캡처를 위한 입력 볼륨을 적절하게 조정할 수 있습니다. 밀도계 소프트웨어를 사용하여 정량화를 수행할 수 있습니다. 블롯 전체에서 정규화를 허용하기 위해 항상 각 젤에 참조 샘플의 분취량을 포함하십시오.
3. PU 비드 준비
   참고: PU-비드 및 대조 비드는 이전에 보고된^21,25와 같이 사내에서 합성하거나 재료 이전 계약(MTA) 체결 시 Chiosis 실험실에 요청할 수 있습니다. 이소프로판올에 -20°C에서 보관해야 합니다.
   1. 폴리우레탄(PU)-비드의 분취량을 취하거나 이소프로판올 스톡에서 직접 대조군 비드를 취하십시오. 세탁 및 취급 중 비드 손실을 고려하여 약 30%의 초과분을 포함하십시오.
   2. 저장 용매 제거: 구슬이 가라앉도록 한 다음 이소프로판올을 흡인합니다. 천연 용해 완충액(1.5mL 튜브의 경우 1mL, 15mL 원뿔형의 경우 5mL)을 추가하고 부드러운 피펫팅 또는 반전으로 완전히 재현탁합니다.
   3. 세 번 세척 및 평형화: 각 세척에 대해 소용돌이에서 재현탁, 원심분리(1.5mL 튜브: 10,000 × g, 1분; 15mL 원뿔형: 3,000 × g, 5분) 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫 팁이 장착된 진공 라인으로 상청액을 흡인합니다.
   4. 세척된 비드에 1:1 부피비(비드:버퍼)로 천연 용해 완충액을 첨가하여 균일한 작업 비드 슬러리를 생성합니다.
   5. 샘플당 40μL의 PU-비드(또는 대조군 비드) 슬러리(예: 1:1 v/v 비드:완충액)를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다. 비드를 쉽게 분배할 수 있도록 끝이 잘린 피펫 팁을 사용하십시오.
      참고: PU 비드는 빛에 민감합니다. 풀다운 단계에서 어둡거나 호일로 감싼 1.5mL 튜브를 사용하십시오. 소분자 에피샤페롬 바인더로 소수성 표면 코팅으로 인해 PU-비드는 뭉쳐서 플라스틱 표면에 부착되는 경향이 있습니다. 부드럽게 피펫팅하고 균일한 재현탁을 보장하기 위해 완전히 혼합하십시오. 일관되지 않거나 재현할 수 없는 결과로 이어질 수 있는 단백질 포획의 변동성을 피하기 위해 각 샘플에 동일한 양의 비드 슬러리를 분배하는 것이 중요합니다.
   6. 각 튜브에 완충액 1mL를 첨가하고, 소용돌이치고, 10,000× g 에서 1분 동안 원심분리하고, 흡인에 의해 상청액을 버려 천연 용해 완충액으로 비드를 세 번 세척합니다. 각 세탁 사이에 구슬이 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오.
      알림: 흡인할 때 구슬을 만지지 마십시오. 액체를 제거하는 동안 피펫 팁을 튜브 벽에 부드럽게 누릅니다.
   7. 최종 세척 후 비드 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 튜브에서 대부분의 액체를 제거합니다.
      참고: 세척된 비드는 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 일반적으로 구슬은 준비 후 1-2일 이내에 사용됩니다.
4. 인터랙톰 풀다운
   참고: 풀다운의 첫 번째 단계는 에피샤페롬에 결합하지 않는 불활성 소분자에 접합된 대조군 비드를 사용한 사전 제거 단계입니다¹⁶. 이 단계는 용해물에서 비특이적으로 상호 작용하는 단백질, 응집체 및 불용성 파편을 제거하여 후속 PU-비드 풀다운의 특이성을 향상시킵니다. 사전 클리어링은 백그라운드 결합을 줄이고 특정 에피샤페롬 관련 단백질의 검출을 향상시킵니다.
   이 프로토콜에 의해 회수된 인터랙톰은 실험 오염 물질에 매우 민감한 MS에 의해 분석됩니다. 정확한 단백질 식별을 보장하고 데이터 품질을 유지하려면 항상 새로 준비된 완충액과 시약을 사용하고, 먼지와 각질에 대한 노출을 최소화하고, 샘플, 소모품 또는 장비를 다룰 때 깨끗하고 분말이 없는 장갑을 착용하십시오. 모든 풀다운 및 겔 내 분해 단계에 MS 전용 유리 제품/소모품을 사용하고 웨스턴 블로팅에 사용되는 모든 품목은 물리적으로 분리하십시오. 유리 제품을 재사용하는 경우 100% 메탄올, 초순수, 80% 아세트산, 초순수로 순차적으로 헹구고 오염을 제거한 후 자연 건조하십시오. 세제를 사용하지 마십시오. 미량의 잔류물도 LC 컬럼과 이온 소스를 오염시킬 수 있습니다.
   1. 정규화된 단백질 추출물(1.2단계에 따라, HSP90 블롯 강도를 기준으로 계산됨)을 40 μL의 대조군 비드 슬러리(즉, 20 μL 비드 + 20 μL 완충액)가 들어 있는 개별 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 추가하고, 적절한 부피의 천연 용해 완충액을 추가하여 최종 부피를 250 μL로 조정합니다.
      참고: 샘플별 투입 부피를 결정하려면 공식 A1 = (60 / C1) × X1을 사용하며, 여기서 A1은 추가할 정규화된 총 단백질의 부피(μL), C1은 측정된 단백질 농도(μg/μL), X1은 HSP90 블로팅에서 파생된 정규화 계수입니다(단계 1.2에 설명된 대로). 추가할 추가 완충액의 부피는 250μL에서 A1을 뺀 값으로 계산됩니다. 정규화가 필요하지 않은 경우 250μL에 총 단백질 250μg을 사용합니다.
   2. 샘플을 4°C에서 30분 동안 배양하여 엔드 오버 엔드 로테이터(10-15rpm)에서 회전시킵니다.
   3. 튜브를 10,000 × g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하여 응집 또는 불용성 단백질과 함께 대조군 비드를 펠릿화합니다.
   4. 1mL 피펫을 사용하여 대조군 비드에서 상청액을 조심스럽게 수집하고 세척된 PU-비드 슬러리 40μL가 들어 있는 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   5. 샘플을 4°C에서 3시간 동안 배양하여 엔드 오버 엔드 로테이터(10-15rpm)에서 회전시킵니다.
   6. 각 튜브를 10,000× g 에서 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 1mL의 천연 용해 완충액으로 비드를 4회 세척합니다. 각 세척에 대해: 1.3단계에서 설명된 매개변수를 사용하여 와류, 원심분리기 및 흡인.
      참고: 이 단계에서 샘플은 (1) SDS-PAGE 후 겔 내 분해 또는 (2) 포획된 단백질의 온비드 분해의 두 가지 워크플로 중 하나를 사용하여 LC-MS/MS에 대해 처리할 수 있습니다.
      겔 내 분해 워크플로의 경우 작성된 프로토콜을 계속 진행합니다. 온비드 분해를 위해 비드를 차가운 PBS로 두 번 더 세척하고 즉시 섹션 3으로 진행합니다. 비드 소화를 진행하는 경우 비드를 얼리지 마십시오. 샘플은 당일 신선하게 처리되어야 합니다. 비드 결합 단백질 복합체를 동결하면 단백질 용해도의 응집 또는 손실을 촉진하여 분해 효율을 손상시켜 펩타이드 회수율이 낮아지고 변동성이 증가할 수 있습니다. MS 핵심 권장 사항에 따라 일관된 온비드 분해를 보장하기 위해 샘플을 당일 신선하게 처리해야 합니다.
5. 겔 내 분해를 위한 시료 전처리
   1. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 들어 있는 1.4.6단계에서 준비된 비드 샘플에 25μL의 2× Laemmli 샘플 완충액을 추가합니다.
      참고: 이 시점의 샘플은 -80°C에서 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다. 프로테옴 커버리지를 최대화하고 인터랙톰의 완전한 표현을 보장하기 위해 항상 전체 샘플 부피를 겔 내 분해를 위해 SDS-PAGE 겔에 로드하십시오. 부분 로딩은 권장되지 않습니다. 시료량이 제한되어 있고 부분 로딩이 불가피한 경우 나머지 물질은 동결-해동 주기를 최소화하고 상호 작용체 무결성을 보존하기 위해 분취량으로 보관해야 합니다.
   2. 각 샘플을 95°C에서 3분 동안 가열하고(위와 같이 2× Laemmli 샘플 완충액을 첨가함) 단백질 복합체를 변성시키고 SDS-PAGE에 로딩하기 전에 비드에서 용리합니다. 완충액의 SDS와 환원제는 PPI를 파괴하고 매트릭스에서 단백질을 방출합니다.
   3. 각 튜브를 10,000 × g 에서 RT에서 1분 동안 원심분리합니다.
   4. 각 상청액을 4-20% 프리캐스트 그래디언트 SDS-PAGE 젤에 로드합니다.
   5. RT에서 1× TGS 러닝 버퍼에서 겔을 실행하고 중간에 실행을 중지합니다(100V에서 겔에 ~3.5-4cm, 일반적으로 30-60분 런타임).
   6. 전기영동 장치에서 젤을 제거하고 제조업체의 지침에 따라 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색을 진행합니다.
      참고: 플라스틱 용기에 담긴 5-7mL의 초순수에 담근 염색된 젤은 단백질 식별을 위해 MS 시설로 운반할 수 있습니다. 즉시 처리하지 않으면 초순수에 4°C에서 최대 1-2주 동안 보관하십시오. 작업을 수행한 핵심 시설과 실험 목표에 따라 두 가지 대체 단백질체 워크플로우가 사용되었습니다: 섹션 2에서는 사중극자 orbitrap 질량 분석기를 사용한 데이터 독립적 획득(DIA)-MS 분석에 이어 겔 내 분해에 대해 설명합니다. 섹션 3에서는 병렬 축적-직렬 단편화(diaPASEF)²⁶을 사용한 트랩된 이온 이동성 분광법에 최적화된 온비드 분해 프로토콜을 자세히 설명합니다. 적절한 경우 단계를 상호 참조할 수 있습니다.

2. 겔 내 단백질 분해를 통한 LC-MS/MS에 의한 단백질 동정

1. 시스테닐화 단백질의 겔 내 환원 및 알킬화
   1. 각 Coomassie로 염색된 젤 레인의 염색 부위를 절제하고 약 5개의 동일한 크기의 젤 슬라이스로 자릅니다. 온도 제어 마이크로튜브 셰이커에서 700rpm으로 교반하면서 500μL의 50%(v/v) 메탄올에 37°C에서 1분 동안 3회 배양하여 각 슬라이스를 염색합니다.
      참고: 각 겔 슬라이스는 다음 단계에서 시약의 효율적인 확산과 밤새 효율적인 겔 내 트립신 분해를 보장하기 위해 ~1cm × 0.5cm × 1cm보다 크지 않아야 합니다. 화학 프로브 및 에피샤페롬 15,16,23의 핵심 성분의 직접 결합제를 나타내는 HSP90 및 HSC70과 같이 심하게 염색된 단백질에 해당하는 겔 영역을 겔의 나머지 부분과 별도로 절제합니다. 그렇지 않으면 LC-MS/MS 분석 중 저풍부도 상호 작용기의 검출 및 정량화를 방해할 수 있습니다.
   2. 30% 아세토니트릴(ACN)으로 제조된 500μL의 5mM 중탄산암모늄(ABC)에서 각 겔 슬라이스를 37°C에서 배양하고 온도 제어 마이크로튜브 셰이커에서 700rpm으로 15분 동안 흔들어 잔류 얼룩을 제거합니다. 젤 슬라이스가 완전히 탈색될 때까지 배양을 반복합니다.
      참고: 눈에 보이는 단백질 염색이 남아 있으면 펩타이드 클린업 단계에서 펩타이드가 C18 매트릭스에 결합하는 것을 방해하여 회수율 및 다운스트림 MS 감도를 감소시킬 수 있습니다.
   3. 미세한 팁 피펫을 사용하여 ABC/ACN 용액을 제거하고 폐기하고 젤 조각을 잃지 않도록 주의합니다(즉, 액체와 함께 젤 조각을 흡인하지 마십시오). 그런 다음 각 튜브에 500μL의 100% ACN을 첨가하여 젤 조각이 완전히 잠기도록 합니다. 궤도 셰이커에서 700rpm의 RT에서 10분 동안 또는 젤 조각이 반투명해지고 크기가 줄어들며 백서처럼 보일 때까지 배양합니다.
      주의 : ACN은 가연성이므로 연기통에서 취급해야 합니다.
   4. 젤 조각이 흡인되지 않도록 주의하면서 가는 팁 피펫을 사용하여 각 튜브에서 ACN을 제거하고 폐기합니다. 1,000 × g 에서 10초 동안 잠시 원심분리하여 잔류 액체를 수집하고 미세한 팁 피펫으로 남은 물방울을 조심스럽게 흡인합니다. 열린 튜브를 RT에서 진공 원심분리기에 10-15분 동안 또는 젤 조각이 건조되고 단단해질 때까지 넣습니다.
      알림: 과도하게 건조하지 마십시오. 젤 조각이 갈라지거나 과도하게 수축되지 않도록 주기적으로 확인하십시오. 건조되면 젤 조각을 소화될 때까지 밀봉된 저결합 튜브 또는 미세 원심분리 튜브에 4°C에서 보관합니다. 겔 결합 및 정제된 단백질은 4°C에서 보관할 때 최대 며칠 동안 안정적입니다.
   5. 환원: ~100μL의 10mM 디티오스레이톨(DTT)(50mM 중탄산암모늄의 500mM 스톡에서 신선하게 준비됨)을 각 샘플 튜브에 첨가하여 겔 조각이 완전히 잠기도록 합니다. 온도 조절 마이크로튜브 셰이커에서 700rpm으로 교반하면서 56°C에서 45분 동안 배양합니다.
      주의: DTT는 피부 및 호흡기 자극제입니다. 화학 연기 후드 내부를 다루고 장갑을 착용하십시오.
      알림: 증발을 방지하고 DTT 농도를 유지하기 위해 배양하는 동안 튜브가 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오.
   6. 알킬화: 젤 조각을 방해하지 않도록 주의하면서 미세한 팁 피펫을 사용하여 각 튜브에서 DTT 용액을 제거합니다. 50mM ABC에 ~100μL의 55mM 요오도아세트아미드(IAA)를 즉시 첨가하여 겔 슬라이스를 완전히 덮습니다. 어둠 속에서 30분 동안 700rpm에서 교반하면서 RT에서 배양합니다.
      주의: IAA는 독성이 있고 빛에 민감합니다. 장갑을 끼고 흄 후드에서 모든 취급을 수행하십시오.
      참고: 알킬화 반응의 담금질을 방지하기 위해 IAA를 추가하기 전에 DTT를 완전히 제거해야 합니다. IAA 분해를 최소화하기 위해 배양 중에 튜브를 알루미늄 호일로 감싸거나 빛을 차단하는 용기를 사용하십시오.
   7. 튜브를 RT에서 5초 동안 1,000 × g 에서 잠시 원심분리하여 바닥에 잔류 액체를 수집합니다. 젤 조각을 방해하지 않도록 미세 구멍의 피펫 팁(예: P10 팁)을 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 튜브를 약간 기울이고 가장자리에서 흡인하여 젤 조각이 흡인될 위험을 최소화합니다.
   8. 평형: 30% ACN에 500μL의 50mM ABC로 겔 조각을 덮습니다. 가열된 오비탈 셰이커에서 700rpm으로 교반하면서 RT에서 10분 동안 배양합니다. 이 단계는 과도한 알킬화 시약을 제거하고 탈수 전에 겔의 평형을 만드는 데 도움이 됩니다.
   9. 용액 제거: 1,000 × g 에서 5초 동안 잠시 회전하고 위에서 설명한 대로 미세 팁 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다.
   10. 다시 탈수: 2.1.3 및 2.1.4단계를 반복하여 100% ACN을 사용하여 겔 조각을 다시 탈수한 다음 건조될 때까지 진공 원심분리합니다. 이 단계는 효소 소화 중에 최적의 펩타이드 회수를 보장합니다.
2. 겔 내 단백질 분해 및 펩타이드 세척
   1. 50mM ABC에 최종 농도 5ng/μL의 MS 등급 트립신을 첨가하여 건조된 겔 샘플을 분해하여 겔 조각을 완전히 재수화합니다(일반적으로 총 부피 50-100μL 또는 겔 슬라이스를 덮을 수 있을 만큼). 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 37°C에서 밤새 배양하고 증발을 방지하기 위해 튜브를 단단히 밀봉합니다. 가능하면 부드럽게 교반하십시오(예: 온도 조절 마이크로튜브 셰이커에서 300rpm).
   2. 10% 포름산(FA)을 적가하여 1%(v/v)의 최종 농도를 달성하여 하룻밤 분해 후 샘플을 산성화합니다(예: 100μL 분해에 1μL의 10% FA 추가). 부드럽게 혼합한 다음 펩타이드 추출을 향상시키기 위해 RT 수조 초음파 처리기에서 10분 동안 튜브를 초음파 처리합니다.
   3. 펩타이드 함유 상청액을 미세한 팁 피펫(예: P10 협구경 팁)을 사용하여 조심스럽게 제거하고 겔 매트릭스를 방해하거나 젤 조각을 흡인하지 않도록 주의합니다. 수집된 상청액을 결합력이 낮은 500μL 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
   4. 각 튜브에 5% FA/50% ACN(v/v) 용액(일반적으로 ~50-100μL 또는 겔 조각을 완전히 덮을 수 있을 만큼)을 추가하고 RT에서 부드럽게 교반합니다(예: 70rpm의 셰이커에서 10-15분 동안) 잔류 펩타이드를 추출합니다. 상층액을 조심스럽게 수집하여 2.2.3단계의 원래 펩타이드 용액과 결합합니다.
   5. 작은 물방울만 남을 때까지 RT에서 진공 원심분리(예: ~30분 동안 1,000 × g )를 사용하여 결합된 펩타이드 추출물을 농축합니다. 튜브 벽에 부착되어 펩타이드 손실이 발생할 수 있으므로 샘플을 완전히 건조시키지 마십시오. 부분적으로 건조된 추출물을 탈염을 위해 즉시 사용하거나 밀봉된 저결합 튜브에 -20°C에서 보관하십시오.
   6. 앞서 설명한 대로^200μL 피펫 팁에 삽입된 두 개의 적층된 C18 추출 디스크로 준비된 손으로 포장된 소규모 C18 포장 피펫 팁(즉, StageTips)을 사용하여 펩타이드를 탈염합니다.
   7. 40μL의 메탄올을 첨가하여 C18 디스크를 활성화합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 디스크가 포함된 피펫 팁(빈 200μL 피펫 팁에 삽입하고 500μL 튜브 내부에 넣음)을 1,500 × g에서 3분 동안 원심분리합니다.
      알림: 모든 단계에서 C18 디스크가 건조되지 않도록 하십시오. 건조는 펩타이드 결합 및 용출을 방해합니다. 손으로 포장된 소규모 C18 포장 피펫 팁을 고정하는 외부 200μL 피펫 팁(슬리브)은 튜브 내 2개 어셈블리가 원심분리기에 제대로 맞도록 끝에서 ~1cm 절단하여 짧아야 할 수 있습니다.
   8. 0.1% FA를 추가하고 위와 같이 원심분리하여 디스크를 평형화합니다.
   9. 20μL의 0.1% FA로 재구성된 펩타이드 용액을 적층된 디스크 상단에 직접 도포합니다.
   10. C18 디스크에 대한 펩타이드 결합을 촉진하기 위해 1,500 × g에서 5분 동안 원심분리합니다.
   11. 40μL의 0.1% FA를 컬럼에 통과시켜 결합된 펩타이드를 세척합니다.
   12. 0.1% FA를 함유한 70% ACN 40μL로 펩타이드를 용리합니다. 용출된 펩타이드를 LC-MS/MS 분석까지 -80°C의 저결합 튜브에 보관합니다. 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오.
3. DIA를 사용한 MS 분석과 결합된 Nano-LC
   1. 진공 원심분리(예: RT에서 20-30분, 1,000×g)를 사용하여 탈염된 펩타이드 용출액을 농축하여 작은 물방울을 남깁니다. LC-MS 등급 물에 10μL의 0.1% FA로 펩타이드를 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 잠시 소용돌이치면서 재구성합니다. 계속하기 전에 잠시 회전하여 튜브 바닥에 액체를 모으십시오.
   2. 나노-LC-MS/MS로 재구성된 펩타이드 샘플의 4 μL 분취량을 분석합니다. 50°C에서 유지된 자체 충전 역상 컬럼(75 μm ID × 2 cm, C18 수지, 3 μm 입자 크기)에서 펩타이드를 분리합니다. 압력 폭탄 28을 사용하여 압력 폭탄²⁸ 을 사용하여 C18 수지 슬러리(메탄올, 1:3 v/v)를 10 μm 스프레이 팁(360 μm OD × 75 μm ID × 10 μm 팁)이 있는 용융 실리카 모세관에 패킹합니다. 나노스프레이 이온화를 통해 컬럼을 DIA 워크플로우를 지원하는 고분해능 하이브리드 질량 분석기(사중극자-Orbitrap 유형)에 연결합니다.
      참고: SDS-PAGE 겔 슬라이스에서 생성된 펩타이드 혼합물에 대한 최적의 분리를 제공하기 때문에 20cm의 컬럼 길이를 권장합니다.
   3. 일관된 펩타이드 보유 및 분리를 보장하기 위해 컬럼 오븐 또는 가열 블록을 사용하여 분석 컬럼을 50°C로 유지합니다. 변동이 재현성에 영향을 미칠 수 있으므로 실행 전반에 걸쳐 안정적인 온도 제어를 보장하십시오.
   4. 250nL/min의 유속에서 110분 동안 0.1% FA에서 3-40% ACN의 선형 구배를 사용하여 펩타이드를 용리합니다. 이 구배는 MS 검출 전에 효과적인 펩타이드 분리를 제공합니다. 컬럼 평형을 포함한 총 분석 시간은 120분입니다.
   5. 앞서 설명한 대로 고분해능 MS를 사용하여 DIA 모드에서 데이터를 수집합니다²⁹.
      1. 300-1650 m/z의 스캔 범위에서 120,000(m/z 200에서)의 해상도로 프로파일 모드에서 전체 MS1 측량 스캔을 획득하도록 설정합니다. 슬라이딩 격리 창 체계를 사용하여 30개의 순차적 전구체 창(364-1370 Th)의 MS2 단편화로 각 MS1 스캔을 따릅니다.
      2. 25.5, 27.0 및 30.0의 단계적 정규화된 충돌 에너지를 사용하여 단편화를 수행합니다. 기본 최대 전구체 충전 상태는 4입니다. MS/MS 스캔에서 고정된 첫 번째 질량을 200Da로 설정하고 30,000의 분해능으로 MS2 스펙트럼을 획득합니다.
      3. MS2의 경우 자동 주입 시간 설정을 사용하고 MS1의 경우 최대 주입 시간 60ms를 사용합니다. MS1 및 MS2 스캔 모두에서 이온 타겟(AGC)을 3e6으로 설정합니다.
4. 친화성 포획 인터랙톰의 상대적 정량화
   참고: 친화성 포획 에피샤페롬 상호작용체의 DIA-MS 분석에서 확인된 단백질을 정량화하려면 DIA 워크플로우를 지원하고 펩타이드 강도 또는 스펙트럼 수를 기반으로 신뢰할 수 있는 정량화를 제공하는 소프트웨어 플랫폼을 사용하십시오. 이 프로토콜은 펩타이드/단백질 식별 및 무표지 강도 기반 정량화를 위해 MaxQuant(예: 버전 2.5.1.0) 및 MaxDIA 워크플로우^20,29를 사용했습니다. 검색은 PSM/펩타이드 및 단백질 수준에서 1% FDR을 사용한 역순 미끼 전략을 사용했습니다. "역방향" 및 "잠재적 오염 물질" 항목은 생물정보학 전에 필터링되었습니다. 스파이크인은 사용되지 않았습니다. 기기 준비 상태는 내부 ID 및 RT 안정성 기준을 충족하는 250ng의 HeLa 분해물(및 간헐적 10 fmol 6-단백질 혼합물)로 확인되었습니다.
   1. 모든 시료에서 일관된 파라미터로 원시 DIA-MS 데이터를 분석합니다. 최대 2개의 누락된 절단을 포함하고 다음과 같이 수정을 설정합니다: 시스테인의 고정, 카르바미도메틸화; 가변, 메티오닌의 산화 및 단백질 N-말단의 아세틸화.
   2. UniProt 인간 단백질 데이터베이스(예: ~20,000개 항목)를 기반으로 하는 인실리코 예측 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 정확한 FDR(False Discovery Rate) 추정을 위해 미끼 및 오염 물질 서열이 포함되도록 합니다. 대체 효소를 사용하지 않는 한 트립스 소화를 지정하십시오. 검증된 인간 스펙트럼 라이브러리(2020년 6월 18일 UniProt 릴리스, 20,956개 항목 기반)는 막스 플랑크 생화학 연구소 저장소³⁰에서 사용할 수 있습니다.
      참고: 예측된 라이브러리를 사용하는 이 워크플로의 대안으로, 3.4단계는 이러한 데이터 세트에서 유사한 식별 및 정량화를 생성한 라이브러리 없는 처리를 보여줍니다.
   3. 다운스트림 PPI 네트워크 분석에 더 적합하므로 강도 값(LFQ[Label-Free Quantification] 강도가 아님)을 사용하여 단백질 풍부도를 정량화합니다. 선호도 강화 데이터를 왜곡할 수 있는 정규화 아티팩트를 방지하기 위해 LFQ를 선택 취소해야 합니다. 대신 전체 단백질 발현이 아닌 상호 작용 강도를 반영하는 펩타이드 스펙트럼 일치에서 파생된 원시 강도 값을 사용하십시오. 적절한 필터링 기준(예: 단백질 그룹당 최소 하나의 고유한 펩타이드)을 적용하여 단백질 식별 및 정량화의 신뢰성을 개선합니다. 후속 통계 및 네트워크 기반 분석을 위해 결과 단백질 강도 표를 내보냅니다.
      참고: LFQ 값이 전체 용해물에 대한 단백질 로딩을 정상화하는 데 도움이 되는 표준 단백질체학 워크플로우와 달리 여기서 단백질은 에피샤페롬의 친화성 포획을 통해 농축됩니다. 이 농축 단계는 LFQ 정규화가 모호할 수 있는 생물학적 분산을 도입합니다. 따라서 원시 강도 값은 조건 전반에 걸쳐 차등 단백질-에피샤페롬 상호 작용을 더 잘 반영하고 다운스트림 네트워크 수준(예: dfPPI) 분석에 필요한 신호를 보존하기 때문에 선호됩니다. Mascot 기반 검색을 사용한 이전 연구에서^16,18, 강도 대신 MS/MS 스펙트럼 수 값도 사용되었습니다. 이와 같은 친화성 캡처 워크플로에서 스펙트럼 수는 상호 작용 빈도를 반영하며 조건 전반에 걸쳐 차등적으로 상호 작용하는 단백질을 식별하는 데 매우 적합합니다. LFQ 값과 달리 MS/MS 수는 프로테옴 전반에 걸쳐 전반적인 정규화를 가정하지 않으므로 에피샤페롬 농축 단계에서 생물학적으로 의미 있는 분산을 보존합니다.

3. 온비드 단백질 분해를 통한 LC-MS/MS에 의한 단백질 동정

1. 온비드 분해
   참고: 최적의 단백질 회수를 보장하고 MS 분석을 위한 온비드 단백질 분해 중 샘플 손실을 최소화하려면 저단백 결합 미세 원심분리기 튜브를 사용하는 것이 필수적입니다. 이 튜브는 튜브 벽으로의 단백질 흡수를 줄여 시료 회수율을 향상시키도록 설계되었습니다. 이 섹션에 사용되는 모든 시약은 LC-MS 등급의 물과 화학 물질을 사용하여 새로 준비해야 합니다. 단백질체학 코어에 샘플을 제출하는 경우 일부 시설에서는 모든 완충액을 사용하기 전에 필터 멸균하도록 요구할 수 있으므로 현지 정책을 확인하십시오.
   1. 1.4.6단계에서 튜브에 남아 있을 수 있는 잔류 PBS를 제거합니다. 50mM ABC, pH 8.5에서 새로 준비된 80μL의 2M 요소에 비드를 재현탁합니다. 피펫팅 또는 짧은 와류를 통해 완전한 혼합을 보장합니다.
      알림: 비드 수량과 유형에 따라 비례적으로 부피를 조정하십시오. 이 프로토콜은 40μL의 PU-비드 슬러리에 최적화되어 있습니다.
   2. DTT를 추가하여 최종 농도 1mM을 달성합니다.
      참고: DTT는 용액에서 산화되기 쉽기 때문에 사용하기 직전에 LC-MS 등급 물에 1M DTT 원액에서 신선한 10mM DTT 용액을 준비하십시오. 필요한 부피를 샘플에 직접 추가하고 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
   3. 튜브를 캡치하고 가열된 오비탈 셰이커에서 1,100rpm으로 흔들면서 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 증발을 최소화하기 위해 뚜껑을 단단히 밀봉하십시오.
   4. IAA를 첨가하여 최종 농도 3.67mM에 도달합니다. 1,100rpm에서 흔들면서 RT에서 45분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
      참고: 사용하기 직전에 LC-MS 등급 물에 신선한 10mM IAA 스톡을 준비하십시오. 샘플에 필요한 부피를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
   5. DTT를 추가하여 미반응 IAA를 담금질하여 최종 농도 3.67mM에 도달합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.
      참고: 반응되지 않은 IAA를 담금질하면 프로테아제 활성과 소화 효율을 손상시킬 수 있는 과알킬화를 방지할 수 있습니다. DTT를 신선하게 준비하고 현재 샘플 부피를 기준으로 부피를 계산하여 목표 농도를 달성합니다.
   6. 750ng의 0.5 mg/mL의 MS 등급 Lys-C 프로테아제를 샘플에 첨가합니다. 37°C에서 1,150rpm으로 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
      참고: LC-MS 등급 물에 용해시켜 Lys-C를 준비합니다. 효소 분취량을 -80°C에서 보관하고 여러 번의 동결-해동을 피하십시오.
   7. 새로 준비된 0.5 mg/mL의 시퀀싱 등급 트립신 750 ng를 추가합니다. 37°C에서 1,150rpm으로 흔들면서 밤새 배양합니다. 과소화 및 펩타이드 분해를 방지하기 위해 16-18시간 이상 배양하지 마십시오.
   8. 다음날, RT에서 1-5분 동안 샘플을 1,000-5,000 × g 으로 원심분리하고 신선한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 상청액을 옮깁니다. 구슬을 버리십시오.
   9. 50% 트리플루오로아세트산(TFA)을 적가하여 분해물의 pH를 3도 미만으로 조정합니다. pH 지시약 스트립을 사용하여 pH를 확인합니다.
      참고: 일반적인 pH 범위는 ~2.5-3.0이어야 하며 탈염 전에 샘플을 산성화해야 합니다.
      주의: TFA는 부식성이 있고 휘발성이 있습니다. 연기를 추가하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
2. 펩타이드 탈염
   참고: 펩타이드 탈염 및 세척을 위해 소규모 C18 포장 피펫 팁(즉, StageTips)을 사용하십시오.³¹. C18 재료(예: C18 고체상 추출 디스크)의 3개 층을 200μL 피펫 팁에 포장하여 C18 StageTips를 준비합니다. 미리 만들어진 상업적으로 이용 가능한 C18 스핀 컬럼도 사용할 수 있습니다. 컨디셔닝, 샘플 로딩 및 펩타이드 용출에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 성능(예: 유지 효율, 회수 수율)은 수제 장치와 상용 장치에 따라 다를 수 있습니다. 소규모 C18 포장 피펫 팁은 바이패스 흐름을 피하기 위해 단단히 포장해야 합니다.
   1. 소규모 C18 포장 피펫 팁을 (1) 100μL 메탄올로 순차적으로 컨디셔닝합니다. 400 × g 에서 원심분리하고 플로우스루를 버립니다. (2) 70% ACN/0.1% TFA 100μL. 400 × g 에서 원심분리하고 플로우스루를 버립니다. (3) 0.1% TFA 100μL. 400 × g 에서 원심분리하고 플로우스루를 버립니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
      알림: 컨디셔닝은 소수성 C18 수지의 완전한 습윤을 보장합니다. 미리 만들어진 상용 C18 스핀 컬럼의 경우 진공 매니폴드도 사용할 수 있습니다. 사용자는 특정 취급 권장 사항에 대해 제조업체의 지침을 참조해야 합니다.
   2. 샘플을 팁에 직접 천천히 피펫팅하여 산성화된 펩타이드 분해물을 컨디셔닝된 소규모 C18 포장 피펫 팁에 로드합니다. 300 × g 에서 원심분리하여 분해물이 수지를 통과하도록 하고 흐름을 버립니다. 샘플 부피가 용량을 초과하면 여러 라운드에 걸쳐 로드합니다.
      참고: 기포를 피하고 압축된 레진 베드에 다이제스트를 직접 피펫팅합니다. 저보유 팁을 사용하는 경우 소규모 C18 포장 피펫 팁의 내벽을 만져 액체를 천천히 고르게 방출합니다.
   3. 100μL의 0.1% FA를 소규모 C18 포장 피펫 팁에 직접 피펫팅하여 용액이 C18 물질을 완전히 포화시킵니다. 400 × g에서 원심분리하고 플로우스루를 버립니다. 이 단계를 두 번 반복하여 염분과 간섭 물질을 제거합니다.
      알림: 각 회전 전에 액체가 C18 재료를 통해 완전히 흐르는지 확인하십시오. 세척액을 피펫 팁의 벽 아래로 천천히 분배하여 기포가 갇히지 않도록 하십시오.
   4. 50μL의 70% ACN/0.1% FA를 소규모 C18 포장 피펫 팁에 피펫팅하여 결합된 펩타이드를 용리합니다. 300 × g 에서 원심분리하고 깨끗한 저결합 미세 원심분리기 튜브에 용출액을 수집합니다. 이 단계를 두 번 반복하여 완전한 용출을 보장합니다.
      참고: 용출액을 완전히 회수하려면 여러 차례의 원심분리가 필요할 수 있습니다. 잔류 액체가 팁 베이스에 갇혀 있는 경우 소규모 C18 포장 피펫 팁을 부드럽게 두드리거나 잠시 추가 회전하여 남은 부피를 수집합니다. 계속하기 전에 용출액을 결합하고 최종 부피를 확인하십시오.
   5. 용출된 펩타이드를 진공 농축기를 사용하여 건조될 때까지 동결하고 건조시킵니다. 통풍이 가능하도록 뚜껑이 느슨하게 놓여 있는지 확인하되 튀지 않도록 하십시오.
   6. LC-MS 등급 물에 12μL의 0.1% FA를 튜브 바닥에 직접 첨가하여 건조된 펩타이드를 재구성합니다. 펩타이드를 완전히 용해시키기 위해 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 초음파 처리합니다.
      알림: 전체 펠릿 또는 건조된 필름이 완전히 재구성되었는지 확인하십시오. 피펫 기반 용해는 팁 표면에 부착되어 펩타이드 손실의 위험이 있습니다.
   7. 완전히 용해되고 과열을 방지하기 위해 시원한 물로 채워진 수조 초음파 발생기에서 재구성된 펩타이드를 5분 동안 초음파 처리합니다.
   8. 펩타이드를 4°C에서 20,000 × g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 펩타이드 상청액을 적절한 자동 시료 주입기 바이알로 옮겨 LC-MS 시스템에 로딩합니다. 소량, 고품질, 가스 크로마토그래피(GC) 테스트를 거친 폴리프로필렌 바이알을 접착 실리콘/폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 격막 캡과 함께 사용하여 시료 손실을 최소화합니다. 샘플 ID 및 주입 순서로 바이알에 명확하게 라벨을 붙입니다.
   9. 280nm에서 분광 광도계를 사용하여 펩타이드 농도를 추정합니다. 이는 대략적인 수치이며 방향족 잔류물 함량 또는 오염 물질의 영향을 받을 수 있습니다. 또는 보다 정확한 정량화를 위해 비색 펩타이드 분석을 사용하십시오.
3. LC 및 MS 매개변수
   참고: 다음 LC 및 MS 매개변수는 현재 프로토콜에 사용되는 질량 분석기와 결합된 nano-LC 시스템에 최적화되어 있습니다. 다른 나노 LC 시스템 및 질량 분석기의 경우 그에 따라 매개변수를 조정해야 합니다.
   1. LC-MS 호환성을 보장하고 오염을 최소화하기 위해 매주 이동상을 준비합니다: (1) 이동상 A: LC-MS 등급 물 1 L에 LC-MS 등급 FA 1 mL를 첨가하고, (2) 이동상 B: LC-MS 등급 ACN 1 L에 LC-MS 등급 FA 1 mL를 첨가합니다.
      참고: LC-MS 등급 용매와 산만 사용하십시오. 깨끗한 유리병에 두 상을 모두 준비하고 LC 시스템에서 필요한 경우 가스를 제거합니다. 미생물의 성장이나 분해를 방지하기 위해 사용하지 않는 단계는 매주 폐기하십시오.
   2. 길이 25cm, 내경 75μm의 용융 실리카 모세관 컬럼을 1.7μm C18 역상 입자로 채워 설치합니다.
      알림: 기포가 발생하거나 포장재가 손상되지 않도록 컬럼을 조심스럽게 다루십시오. 설치 및 컬럼 평형에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
   3. 3% 이동상 B를 사용하여 유속을 50 nL/min에서 300 nL/min으로 점진적으로 증가시켜 컬럼을 컨디셔닝합니다.
      참고: 이 단계는 고정상이 적절하게 습윤되고 평형을 이루도록 합니다.amp르 주입. 유량 램핑 중 컬럼 압력을 모니터링합니다. 갑작스러운 압력 스파이크는 기포 또는 컬럼 막힘을 나타낼 수 있습니다. 평형은 기준선 압력이 안정화되면 완료된 것으로 간주될 수 있습니다.
   4. 최적의 크로마토그래피 성능을 보장하기 위해 컬럼 온도를 50°C로 유지하십시오.
   5. 시스템 성능을 평가하기 위해 품질 관리(QC) 표준물질로 HeLa 세포 트립산 분해물 100ng를 주입합니다.
      참고: 이 QC 주입은 실행 전반에 걸쳐 LC 머무름 시간 일관성, MS 감도 및 프로테옴 커버리지를 평가하기 위한 벤치마크 역할을 합니다. 단백질 식별 횟수, 머무름 시간 재현성 및 신호 강도를 참조 QC 데이터 세트와 비교하여 실험 샘플을 분석하기 전에 시스템 준비 상태를 확인합니다. 실험 전반에 걸쳐 재현성을 위해 알려진 농도로 준비된 상용 HeLa 분해 표준물질을 사용하십시오.
   6. 300nL/min의 유속으로 90분 동안 2%에서 35% 이동상 B의 그래디언트 용출을 사용합니다. 90분 그래디언트는 복잡한 프로테옴에 적합한 고분해능 펩타이드 분리를 제공합니다. 그래디언트에 따라 95% 이동상 B에서 7분 동안 유지하여 컬럼을 세척합니다.
      참고: 다음 주입 전에 재평형 단계(예: 10-15분 동안 2% B로 되돌리기)를 포함하여 실행 전반에 걸쳐 컬럼 재현성을 보장합니다. 머무름 시간 안정성과 피크 모양에 영향을 미칠 수 있는 급격한 기울기 변화를 피하십시오.
   7. 나노플로우 호환 일렉트로스프레이 이온화 소스(예: CaptiveSpray 스타일)가 장착된 질량 분석기를 사용하여 MS 분석을 수행합니다.
      참고: CaptiveSpray 이온 소스는 낮은 나노유속에서 안정적인 전기 분무를 제공하여 이온화 효율과 감도를 향상시킵니다. 대체 질량 분석기를 사용하는 실험실의 경우 그에 따라 획득 및 이온화 매개변수를 조정하십시오. 정확성과 분해능을 유지하기 위해 분석 전에 적절한 조정 및 교정을 확인하십시오. 스프레이 이미터를 적절하게 배치하고 실행 중에 스프레이 안정성을 모니터링하여 신호 끊김을 방지하십시오.
   8. 데이터 독립적인 획득 diaPASEF 방법³²를 활용합니다. diaPASEF에 익숙하지 않은 사용자의 경우 제조업체의 기술 문서 또는 트랩 이온 이동도 분광법(TIMS)-DIA 워크플로우를 설명하는 최신 프로토콜³³ 을 참조하여 다양한 샘플 유형 또는 그래디언트 길이에 맞게 최적화하십시오.
      참고: diaPASEF는 TIMS와 DIA를 결합하여 이동성 차원³⁴에서 전구체 및 단편 이온을 정렬하여 시퀀싱 속도와 감도를 증가시킵니다. TIMS 장치가 적절하게 보정되고 사중극자와 동기화되어 이온 이동성 및 질량 도우의 정렬 불량을 방지하십시오.
   9. 다음 기기 설정을 사용하십시오. (1) 질량 범위: 100 - 1700 m/z; (2) 이온 이동도 범위: 0.60-1.60V·s/cm²; (3) 충돌 에너지: 20-59eV, 램프; (4) 램프 시간: 100ms; (5) 축적 시간: 100ms; (6) diaPASEF의 질량 범위: 400-1201 Da; (7) 매스 창 너비: 26 Da, 1 Da 겹침; (8) 사이클당 질량 단계 수: 32; (9) 사이클 시간: ~1.8초
      참고: 이러한 설정은 적용 범위 깊이와 스캔 속도의 균형을 맞추도록 최적화되어 있습니다. 시료 복잡성, 그래디언트 길이 및 LC-MS 시스템 성능에 따라 약간의 조정(예: 창 너비 또는 단계 수)이 필요할 수 있습니다. HeLa 다이제스트에 대한 7,500개 이상의 단백질 식별을 달성하면 최적의 시스템 성능을 나타냅니다. 신원 확인의 수는 기기에 따라 다를 수 있으며 그에 따라 평가해야 합니다.
   10. 분석 컬럼에 과부하가 걸리지 않도록 주입당 300-400ng의 펩타이드 샘플을 로드합니다. 과부하는 피크 확장, 이온 억제 및 재현성 감소로 이어질 수 있습니다. 분광 광도계 또는 비색 펩타이드 분석을 사용하여 주입 전에 펩타이드 농도를 확인하여 실행 전반에 따른 변동성을 피하십시오.
   11. 이월을 방지하기 위해 샘플 그룹 간에 블랭크 주입을 실행합니다. 100% 이동상 A(0.1% FA가 함유된 물)를 주입 블랭크로 사용합니다. 이렇게 하면 컬럼에서 잔류 펩타이드가 세척되고 실행 사이의 오염이 줄어듭니다. 베이스라인 및 배경 이온을 모니터링하여 적절한 세척을 확인합니다.
4. DIA 데이터 분석
   1. directDIA 워크플로^우(35 )를 사용한 데이터 분석 및 DIA 단백질체학 데이터의 라이브러리 없는 처리를 지원하는 적절한 소프트웨어를 사용하십시오. 표준 검색 매개변수 및 기본 정량화 설정을 사용하여 UniProt FASTA 데이터베이스³⁶을 기반으로 단백질 식별 및 정량화를 수행합니다.
      참고: 효소 특이성, 변형 설정, FDR 임계값 및 분석 후 출력을 포함한 모든 매개변수는 보충 파일 1에 자세히 설명되어 있습니다. DIA-NN³⁷ 과 같은 대체 DIA 분석 플랫폼도 유사한 워크플로 및 출력을 지원하는 경우 사용할 수 있습니다.
   2. 전구체, 펩타이드 및 단백질 그룹 수준에서 1% FDR에 해당하는 q-값 컷오프로 라이브러리가 없는 directDIA를 실행합니다. 다운스트림 분석 전에 미끼 식별을 제외합니다.
      참고: iRT 표준은 추가되지 않았습니다. 성능은 사전 정의된 식별 및 머무름 시간 안정성 기준에 대해 HeLa 다이제스트 실행으로 벤치마킹되었습니다.

결과

프로토콜이 성공적으로 실행된 후 사용자는 다운스트림 dfPPI 분석에 적합한 고품질 상호 작용 데이터 세트를 얻어야 합니다. 단백질 식별은 1% FDR(PSM 및 단백질 수준)에서 DIA 데이터에서 수행되며 정량화는 원시 강도 또는 MS/MS 스펙트럼 수(LFQ 아님)를 사용합니다. 예상되는 QC 시그니처에는 PCA에 의한 기술 복제의 긴밀한 클러스터링, 약 10-12%의 중앙 전구체/단백질 CV, 복제가 아닌 생물학적 기원에 의해 구동되는 계층적 클러스터링, g:Profiler/Reactome의 강력한 경로 수준 농축이 포함됩니다.

사용 전 PU-비드 프로브 생성 및 활성 검증

PU-비드는 앞서 기술한 바와 같이 에피샤페롬 결합 소분자 유사체를 NHS-활성화 아가로스에 결합하여 제조됩니다²⁵. 표준 25mL 수지 팩은 이소프로판올에 1:1 슬러리로 저장된 ~25mL의 PU 비드를 생성합니다. 저결합 튜브에 분취하고 빛으로부터 보호된 -20°C에서 보관합니다(예: 알루미늄 호일로 포장). 이러한 조건에서 배치는 ≥12개월 동안 안정적으로 유지됩니다. 사용하기 전에 이소프로판올을 제거하고 천연 결합 완충액에서 비드를 평형화합니다(1.3단계). 각 로트는 합성 시 적격화되고 그 후 주기적으로 두 가지 분석을 사용하여 검증됩니다(그림 2): (i) 생물학적 특이성-동일한 조건(총 단백질 250μg을 함유한 40μL 비드 슬러리, 4°C에서 3시간, 천연 세척), 용리/변성 및 HSP90에 대한 면역블롯, HSC70 및 HOP. 수용: 낮은 샘플에서 최소 신호로 epichaperome-high 샘플에서 강한 농축; 기준 로트(±20-30%)와 유사한 밴드 강도 비율. (ii) PU-비드가 있는 에피샤페롬 높은 용해물과 일치하는 불활성 대조 비드, SDS-PAGE에 동일한 용출액 부피 로드 및 Coomassie-염색에서 글로벌 화물 프로파일 실행 병렬 캡처. 수용: PU-비드는 컨트롤 비드 레인에서 최소한의 배경으로 풍부하고 고분자량 화물을 보여줍니다. 25mL 배치는 샘플당 40μL에서 ~600개의 캡처를 지원합니다. 재세척/재평형 후 특이성 또는 화물 프로필이 허용 범위를 벗어나는 경우 많이 폐기하십시오.

in-gel 및 on-bead 프로토콜의 대표적인 결과

에피샤페롬 높은 MDA-MB-468 세포에 대한 파일럿 일대일 비교에서 겔 내 및 비드 내 워크플로우는 매우 일치하는 상호 작용체를 생성했습니다: 6,333개의 단백질 중 4,616개(73%)가 단백질 그룹 수준에서 공유되었으며, 1,275개(20%)는 인겔로만 검출되었고 442개(7%)는 온비드에서만 검출되었습니다. 경로 수준 일치는 훨씬 더 높았습니다: 860개의 Reactome 용어 중 727개(85%)가 일반적이었고 81개(9%)는 인겔에 고유하고 52개(6%)는 on-bead에 고유했습니다. 단백질 강도 중앙값은 겔 용출 농도와 일치하는 온비드보다 in-gel의 경우 ~3× 더 높았지만 이는 경로 일치에 실질적인 영향을 미치지 않았습니다.

코호트 규모 예제 및 QC 서명

예를 들어, 우리는 12개의 생물학적 샘플을 분석했습니다(그림 3). 4개의 샘플을 용출하고 겔 내 분해에 의해 처리했습니다. 8개의 샘플은 에피샤페롬 복합체의 친화성 정제를 거친 후 온비드 분해 및 나노-LC-MS/MS를 기술적으로 복제했습니다. 예상되는 QC 시그니처가 관찰되었습니다: PCA에 의한 기술 복제의 긴밀한 클러스터링, ~10-12%의 중앙 전구체/단백질 CV, 복제가 아닌 생물학적 기원에 의해 구동되는 계층적 클러스터링, g:Profiler/Reactome에서 강력한 경로 수준 농축. 이러한 결과는 워크플로 구성 요소 전반에 걸친 재현성, 에피샤페롬 결합 단백질의 광범위한 검출, 경로 수준에서 차등 상호 작용자의 명확한 기능적 해석 가능성을 보여줍니다. 두 워크플로에서 파생된 경로 농축은 여러 생화학적 및 기능적 직교 분석에 의해 검증된 이 라인에 대해 발표된 dfPPI 출력과 일치했습니다¹⁷.

투입 물질 및 소화의 품질

대표적인 Coomassie-염색 SDS-PAGE 겔은 겔 내 분해로 처리된 샘플 중 4개에 대해 표시됩니다(그림 3A). 이 겔은 재현 가능한 단백질 포획과 레인 전반에 걸친 밴딩의 일관된 분포를 보여주며, 질량 분석 전에 천연 용해물에서 단백질 복합체가 성공적으로 농축되었음을 확인합니다. 이러한 변성 인터랙톰 프로파일은 친화성 포획 단계가 다운스트림 MS 분석을 위한 충분하고 일관된 단백질 입력을 산출한다는 것을 보여줍니다.

포획된 인터랙톰은 분자량 전반에 걸쳐 광범위한 단백질 커버리지를 보여주며, 이는 천연 용해물에서 단백질 어셈블리의 성공적인 농축을 반영합니다. 중요한 것은 이러한 회수율이 풍부한 단백질에만 국한되지 않고 저풍부 상호 작용자를 포함하여 시스템 수준 분석에 필요한 복잡성과 깊이를 제공한다는 것입니다.

대규모 제어 및 특이성

이 워크플로에서는 사전 클리어링에만 컨트롤 비드를 사용합니다(1.3 및 1.4단계 참조). 우리는 각 생체 표본에 대해 일상적인 "불활성 프로브" 비교 캡처를 수행하지 않습니다. 대규모 임상 코호트의 경우 불활성 포획은 귀중한 물질을 소비하지만 다운스트림 통계가 단일 단백질 수준이 아닌 네트워크/경로 수준에서 작동하기 때문에 dfPPI에 대한 해석 가치를 거의 추가하지 않습니다. 무작위 또는 수지 끈적끈적한 오염 물질은 동일한 경로의 구성원 간에 조정된 방식으로 나타나지 않으므로 경로 수준 농축 테스트 또는 코호트 수준 일관성 필터에서 살아남지 못합니다. 실제로 특이성은 (i) 사전 클리어링, (ii) 단단한 복제 재현성(PCA/CV), (iii) 임계값 및 재샘플링 전반에 걸친 경로 안정성에 의해 보장됩니다. 역사적으로 우리는 불활성 포획 및 가용성 경쟁자(PU-H71) 블록 실험을 평가했으며 대체할 수 없는 임상 물질을 소비하는 동안 dfPPI 경로 결과 16,17,21을 변경하지 않았다는 것을 발견했습니다. 따라서 파일럿 검증용으로만 예약합니다. 명시적인 실행 수준 검사를 선호하는 그룹의 경우 두 옵션 모두 프로토콜과 호환되지만 코호트 규모 dfPPI 분석에는 필요하지 않습니다.

복제 번호

dfPPI의 경로 추론은 집합 기반이며 고정된 반복 횟수가 필요하지 않습니다. 강력한 획득을 통해 조건당 단일 샘플로 탐색적 경로 호출을 생성할 수 있습니다. 확증 분석을 위해 배양 세포에 대해 조건당 ≥3개의 생물학적 복제(가능한 경우 중복 LC-MS/MS 주입 포함)와 인간 조직에 대한 코호트에 적합한 Ns(일반적으로 발견을 위해 그룹당 5-10개≥공변량으로 계층화하는 경우 더 큼)를 권장합니다. 복제 클러스터링(PCA), 중앙값 전구체 CV(목표 ~10-15%) 및 농축 결과의 부트스트랩/리샘플링을 통해 안정성을 평가합니다.

실행 전반에 걸친 기술적 재현성

기술적 재현성은 온비드 소화 샘플(8개의 쥐 뇌, 이중으로 실행)의 펩타이드 강도 데이터의 주성분 분석(PCA)(그림 3B)을 사용하여 평가되었습니다. 복제본은 각 생물학적 샘플에 대해 촘촘하게 모여 있는 반면, 서로 다른 샘플은 처음 두 주성분을 따라 깨끗하게 분리되었습니다. 처음 두 주성분은 각각 전체 분산의 28.6%와 22.0%를 설명했으며 기술적 노이즈가 아닌 생물학적 차이에 따라 샘플을 분배했습니다. 이 구조는 높은 분석 일관성을 반영하고 이 방법이 생물학적으로 관련된 차이를 보존한다는 것을 확인하며, 이는 dfPPI가 조건별 네트워크 재배선을 감지할 수 있도록 하는 데 중요합니다.

샘플 간 검출의 일관성

전구체 이온 강도에 대한 변동 계수(CV) 분포는 대부분의 특징이 20% CV 미만으로 떨어지며 중앙값은 조건 전반에 걸쳐 9.7%에서 11.9% 사이임을 보여줍니다(그림 3C). 이러한 결과는 반복실험 전반에 걸쳐 일관된 MS 검출 및 펩타이드 회수를 확인합니다.

다이내믹 레인지 및 프로테옴 커버리지

로그 변환된 단백질 풍부도 값의 계층적 클러스터링(그림 3D)은 MS 실행에서 캡처된 광범위한 동적 범위를 반영하는 동시에 샘플의 강력한 분리와 샘플 간 변동의 보존을 보여주었습니다. 단백질 강도는 파란색에서 노란색으로의 그라데이션으로 시각화된 바와 같이 저풍부 상호 작용자에서 고도로 풍부한 단백질 그룹에 이르렀습니다. 데이터는 프로토콜이 다양한 단백질 어셈블리 및 상호 작용자를 검출하여 핵심 및 주변 구성 요소를 모두 캡처할 수 있음을 확인합니다.

dfPPI를 통한 기능 해석

해석 및 재현성을 지원하기 위해 dfPPI 데이터 세트 분석을 위한 두 가지 보완 리소스, 즉 (i) 대화형 Shiny 웹 애플리케이션(https://epichaperomics.mskcc.org/ https://dfppi.mskcc.org 으로 업데이트됨) 및 (ii) 이전 dfPPI 연구(GitHub/Zenodo)와 함께 공개된 개방형 스크립팅 가능한 워크플로 및 Cytoscape 세션 파일(GitHub/Zenodo)38,39,40,41. 이 앱은 원시 강도 또는 MS/MS 스펙트럼 카운트 테이블을 수집하고, 품질 관리(복제 클러스터링, 결측값 검사), 선택적 노이즈/배치 처리(공변량 회귀)를 수행하고, 차등적으로 결합된 단백질을 식별하고, 코딩 없이 대화형 플롯 및 다운로드 가능한 보고서를 통해 경로/네트워크 판독값을 제공합니다.

dfPPI는 측정된 강도 또는 스펙트럼 수를 "epichaperome 참여"의 프록시로 취급합니다. 사용자는 간단한 양측 t-검정(기본값)에서 공변량 인식 선형 모델에 이르는 차분 연결성(DC) 모델을 선택합니다. DC 단계를 건너뛸 수도 있습니다. DC 이후 사용자는 접기 변경 및 p-값 임계값(기본값은 이전 dfPPI 작업을 반영합니다. 예: FC > 1.0, 공칭 p ≤ 0.25)을 설정하여 후보를 농축으로 전달합니다. 두 가지 보강 엔진을 사용할 수 있습니다: 순위 기반 GSEA(부호 있는 통계에 대해) 및 다중 테스트 보정이 있는 g:Profiler를 통한 과잉 표현(초기하학적). 샤페론 중심 컨텍스트의 경우 파이프라인은 샤페론 스캐폴드 단백질의 직접 상호 작용자가 차등적으로 결합된 단백질 중에서 과도하게 대표되는지 여부를 테스트하기 위해 상호 작용 농축 분석(iEA)도 제공합니다. 네트워크는 효과 크기 및/또는 통계적 지원별로 노드/에지의 가중치를 표시하여 단일 단백질 효과가 아닌 조정된 재배선을 시각화할 수 있습니다. 스크립팅된 워크플로우를 선호하는 사용자의 경우, 네트워크 맵 및 그림을 구성하는 데 사용되는 기본 R 코드 및 Cytoscape 세션 파일은 관련 간행물 17,18,19,20과 함께 공개적으로 사용할 수 있으며(예: GitHub/Zenodo)38,39,40,41 로컬에서 실행하거나 새로운 데이터 세트에 맞게 조정할 수 있습니다.

친화성 농축에 의해 도입된 상호 작용 상태 신호를 유지하기 위해 허용 컷오프(폴드 변화 > 1.0, 공칭 p ≤ 0.25)가 권장됩니다. 그런 다음 통계적 제어를 경로 수준으로 전환합니다: 후보 단백질은 g:Profiler를 사용하여 선별된 온톨로지(예: GO, Reactome)에서 농축에 대해 테스트되고 다중 테스트로 조정된 경로 p-값이 유의성과 순위를 결정합니다. 이 설계는 단일 단백질 차등 발현이 아닌 조정된 네트워크 재배선을 감지하는 dfPPI의 목표를 반영하고 풀다운 데이터 세트에서 농축 신호를 모호하게 할 수 있는 프로테옴 전체 정규화를 방지합니다. 이전 dfPPI 연구^17,20에서 나타난 바와 같이, 보다 관대한 단백질 수준 임계값은 안정적인 질병 관련 경로 호출을 산출하는 반면, 다른 모델(예: 경험적 베이즈 수축이 있는 선형 모델)은 분산 또는 배치 공변량이 이를 보증할 때 핵심 경로 중심 추론을 변경하지 않고 사용할 수 있습니다.

친화성 포획은 필연적으로 "끈적끈적한" 단백질(예를 들어, 케라틴, 세포골격 단백질, 리보솜 단백질)을 공동 농축하며, PU-비드는 또한 일반적인 샤페론 상호작용자를 포획할 수 있습니다. dfPPI에서 이들은 여러 가지 이유로 생물학을 주도하지 않습니다. 첫째, 사전 세척 및 엄격한 세척을 통해 대부분의 비특이적 결합제가 제거됩니다. 둘째, 많은 샤페론 상호작용자를 포함한 제네릭 바인더는 조건 및/또는 일관되지 않은 검출에 걸쳐 1.0에 가까운 배율 변화를 나타내므로 FC/p-값 스크리닝에 실패합니다. 셋째, 경로 농축은 집합 기반이며 배경을 인식합니다: 유의성은 실험별로 검출된 프로테옴에 대해 계산되며 공변하려면 동일한 경로의 여러 구성원이 필요합니다. 무작위 또는 고풍부 오염 물질은 여러 항에 분산되어 있으므로 일관되고 FDR 유의 농축을 형성하지 않습니다. 단일 단백질(오염 물질 또는 기타)은 경로 호출을 "수행"할 수 없습니다. 넷째, dfPPI는 단일 단백질이 아닌 네트워크 수준의 일관성을 해석합니다. 경로 호출은 다중 테스트 보정(예: g:Profiler 조정 p-값), 최소 유전자 세트 크기 및 복제 일관성을 견뎌야 합니다. 일치하는 불활성 비드 프리클리어 및 공통 오염 물질 필터링과 함께 이 프레임워크는 dfPPI를 배경에 견고하게 만듭니다: 수백 개의 비유익 단백질이 존재하더라도 농축은 단백질 목록의 전체 길이가 아니라 경로 내부의 일치 단백질의 수에 따라 달라지기 때문에 경로 순위를 변경하지 않습니다. 더욱이, 현재까지 발표된 모든 dfPPI 연구는 광범위한 실험적 검증(예: 표적 생화학, 신호 판독, 유전적 또는 약리학적 교란)16,17,18,19,20을 통해 경로 및 네트워크 수준 예측을 확증했으며, 이는 dfPPI 출력이 단순히 시끄러운 단백질 목록이 아니라 질병 관련 PPI 네트워크 기능 장애의 재현 가능한 맵임을 보여줍니다.

그림 3D의 dfPPI 데이터 세트로 캡처한 기능적 환경을 평가하기 위해 g:Profiler⁴²(그림 3E)를 사용하여 농축 분석을 수행했습니다. 결과는 유전자 온톨로지 생물학적 과정(GO-BP), 분자 기능(GO-MF) 및 세포 구성 요소(GO-CC)뿐만 아니라 Reactome, KEGG 및 WikiPathways와 같은 선별된 경로 리소스를 포함한 모든 주요 기능적 온톨로지에 걸쳐 강력한 주석 범위를 보여줍니다. 이 대표적인 분석은 dfPPI 접근 방식의 주요 강점, 즉 상대적으로 작은 표본 크기에서도 다양한 주석 유형에 걸쳐 생물학적으로 의미 있는 경로 연관성을 밝히는 능력을 보여줍니다. 여기에서 관찰된 광범위한 Reactome 적용 범위는 dfPPI가 Reactome의 구조에서 잘 표현되는 다성분 프로세스 및 신호 전달 캐스케이드에 직접 매핑되는 단백질 네트워크의 상호 작용 수준 변화 캡처 재배선을 기반으로 한다는 사실을 반영할 수 있습니다. dfPPI는 발현보다는 연결성의 변화를 활용하기 때문에 전사체학 또는 풍부도 전용 단백질체학에서 놓칠 수 있는 시스템 수준의 기능 변화를 감지하는 데 특히 적합합니다. 이 발견은 Reactome이 dfPPI 유래 단백질 세트 14,15,16,17,18,20,21에서 가장 일관되고 질병 관련 농축을 일관되게 산출한 다른 연구와 일치합니다.

Reactome은 다중 단백질 과정 및 복합체(신호 전달 캐스케이드, 세포 주기 모듈, 대사 어셈블리)를 중심으로 구성됩니다. dfPPI는 에피샤페롬 관여 상호작용자, 즉 기능적으로 질병 스캐폴드에 공동 모집되는 단백질 그룹을 풍부하게 하기 때문에 그 출력에는 자연스럽게 고립된 히트가 아닌 응집력 있는 경로 모듈이 포함됩니다. 이 조정된 캡처는 관련 하위 경로 및 계층 구조에 걸쳐 광범위하고 중요도가 높은 Reactome 범위를 생성합니다. 대조적으로, 풍부 중심 오믹스(전사체학, 글로벌 단백질체학)는 상호 작용 상태가 아닌 발현 변화를 보고합니다. 단일 미끼 AP-MS 또는 근접 라벨링은 한 번에 하나의 엔지니어링 미끼 주위에 지역 이웃을 제공합니다. 가교/공동 분획은 종종 희소 연결성을 제공합니다. 이들 중 어느 것도 단독으로는 dfPPI가 세포 또는 조직의 단일 내인성 포획에서 반환하는 컨텍스트 선택, 시스템 수준 세트를 일상적으로 생성하지 않습니다. 그 결과 광범위하고(여러 Reactome 가지가 켜짐) 기계적으로 일관성이 있는 경로 농축이 이루어집니다(단백질은 단순히 양이 아닌 상호 작용이 epichaperomes에 의해 다시 연결되기 때문에 함께 이동함). 그러나 우리는 dfPPI가 대체가 아니라 보완적이라는 점에 주목합니다: 각 상호 작용체학 방법에는 뚜렷한 강점과 한계가 있으며 최적의 선택(또는 조합)은 생물학적 질문, 샘플 제약 조건 및 필요한 해상도에 의해 결정되어야 합니다.

이러한 결과는 프로토콜이 질병 상태 또는 실험적 교란에 걸쳐 차등 상호 작용체 리모델링을 밝히는 데 사용할 수 있는 재현 가능하고 생물학적으로 유익한 데이터 세트를 산출한다는 것을 확인합니다. dfPPI 출력은 경로 강화 프레임워크와의 통합에 매우 적합하며 표준 풍부도 기반 방법으로 감지할 수 없는 기능적 재배선 이벤트의 매핑을 가능하게 합니다.

그림 1: dfPPI 플랫폼 개요. (A) dfPPI(dysfunctional Protein-Protein Interactome) 플랫폼을 사용하면 화학단백질 워크플로우를 통해 질병 특이적 PPI 네트워크 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 섹션 1에는 친화성 매트릭스(예: PU-비드)에 고정된 에피샤페롬 표적 화학 프로브를 사용한 샘플 준비 및 상호 작용체 캡처가 포함됩니다. 섹션 2 및 3에서는 상호 작용체 식별을 위한 두 가지 호환 가능한 분해 워크플로(비드 온 또는 겔 내 및 라벨 없는 LC-MS/MS)에 대해 간략하게 설명합니다. 통계 모델링 및 경로 농축을 포함한 계산 분석은 이 프로토콜에서 다루지 않지만 https://epichaperomics.mskcc.org/ 에서 무료로 사용할 수 있는 dfPPI 생물정보학 파이프라인을 사용하여 수행됩니다. (B) dfPPI의 원리. 질병 관련 맥락에서 내인성 상피샤페롬은 PPI 네트워크를 재구성하는 초분자 스캐폴드를 형성합니다. 에피샤페롬 지시 화학 프로브(예: PU-비드 또는 이에 상응하는 것)는 손상되지 않은 세포 또는 천연 용해물에서 직접 결합된 상호 작용자와 함께 이러한 스캐폴드를 포획하여 단일 실험에서 다중 미끼 풀다운을 생성합니다. 일치하는 컨트롤(예: 불활성 비드 컨트롤 및/또는 자유 프로브와의 경쟁)을 병렬로 처리할 수 있습니다. 포획된 물질은 비드 또는 겔 내에서 용출 및 분해되고 LC-MS/MS로 분석되고 단백질이 정량화됩니다(강도 또는 MS/MS 스펙트럼 수). 결과 상호 작용체는 조건 전반에 걸쳐 차등 상호 작용자를 계산하고 경로/네트워크 강화를 수행하는 데 사용되어 시스템 수준에서 상황별 PPI 기능 장애를 드러냅니다. 이 워크플로는 유전자 태깅이나 과발현이 필요하지 않으며 세포 및 조직 모두와 호환되며 코호트 연구에 맞게 확장됩니다. 반대로, 기존의 친화성 정제-MS는 한 번에 하나의 태그가 지정된 미끼를 중심으로 구성당 로컬 이웃을 생성하며 일반적으로 네트워크를 샘플링하기 위해 많은 구성/실행이 필요합니다. 대조적으로, dfPPI는 내인성 에피샤페롬을 미끼로 사용하여 기본 시스템에서 많은 기능 장애 PPI를 동시에 포착하여 질병 특이적 네트워크 재배선의 발견을 가속화하고 단일 캡처에서 경로 수준의 판독값을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PU-비드 로트 검증 및 캡처 특이성. (A) 생물학적 특이성 및 로트 간 일관성. MDA-MB-468(epichaperome-high) 및 ASPC1(epichaperome-low) 세포를 천연 완충액(20 mM Tris, pH 7.4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 0.01% NP-40; 프로테아제/포스파타제 억제제)에서 용해시켰다. 각 포획에 대해 40μL의 PU-비드 슬러리를 250μg의 총 단백질(1μg/μL)과 함께 4°C에서 회전하면서 3시간 동안 배양했습니다. 구슬은 천연 완충액으로 세척되었습니다. 복합체는 ~100 μL의 SDS 샘플 완충액에서 변성/용출되었습니다. 각 용출액 5-10 μL를 SDS-PAGE로 분리하고 HSP90, HSC70 및 HOP에 대해 면역블롯했습니다. 입력 용해물은 참조용으로 표시됩니다. 두 개의 PU 비드 로트(배치 1, 신선; 배치 2, 숙성)은 MDA-MB-468에서 강력한 농축을 생성하고 ASPC1에서 최소 신호를 생성하여 보존된 특이성과 로트 일관성을 보여줍니다. (B) 글로벌 화물 대 컨트롤 비드. MDA-MB-468 용해물은 PU-비드 또는 일치하는 대조군 비드로 (A)와 같이 처리되었습니다. ~20μL의 각 용출액을 로드하고 SDS-PAGE로 분리하고 Coomassie-염색했습니다. PU-비드는 에피샤페롬 결합 어셈블리의 특징인 복잡한 고MW 화물을 회수하는 반면, 대조군 비드는 최소한의 배경을 보여줍니다. 분자량 마커(kDa)가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: dfPPI 친화성 포획, 상호작용체 식별 및 생물정보학 분석의 대표적인 결과. (A) 4개의 대표적인 인간 뇌 샘플(PT1-PT4)에서 에피샤페롬 결합 상호작용체의 PU-비드 친화성 포획에서 용출된 단백질의 Coomassie-염색 SDS-PAGE 겔. 비드 결합 단백질 어셈블리는 SDS 샘플 완충액에서 끓여서 변성되고, SDS-PAGE에 의해 분해되었으며, 분자량에 걸쳐 상호 작용체 회복을 평가하기 위해 염색되었습니다. 각 샘플은 교차 오염을 최소화하기 위해 샘플 사이에 빈 레인이 있는 별도의 레인에 적재되었습니다. 이러한 빈 레인에서 가끔 관찰되는 희미한 신호는 전기영동 중 약간의 샘플 유출을 반영합니다. 이 젤은 MS 시설에 제출된 샘플을 대표하며, 각 레인은 MS에 의한 겔 내 소화 및 단백질 식별을 위해 5개의 슬라이스로 분할되었습니다. (B) 8개의 대표적인 쥐 뇌 샘플(이중으로 실행)에서 비드에 소화된 에피샤페롬 인터랙톰에서 확인된 단백질 강도의 주성분 분석(PCA)은 기술적 복제의 긴밀한 클러스터링과 PC1 및 PC2를 따라 명확한 생물학적 분리를 보여줍니다. 이는 강력한 dfPPI 분석을 위한 높은 기술적 재현성과 충분한 생물학적 분산을 확인합니다. 데이터 구조는 기술적 인공물이 아닌 상호 작용 수준의 차이가 샘플 분리를 주도하여 인위적인 정규화 없이 다운스트림 차등 상호 작용체 모델링을 위한 강력한 기반을 제공한다는 것을 보여줍니다. (C) 8개 샘플 그룹에 걸쳐 전구체 이온 강도에 대한 변동 계수(CV) 분포는 일관되게 낮은 분산을 나타내며 중앙값 CV는 9.7%에서 11.9%(세로 점선으로 표시됨) 범위입니다. 이러한 낮은 CV는 MS 검출 및 정량화 파이프라인의 재현성과 견고성을 강조합니다. 일관성은 전체 단백질 발현이 아닌 상호 작용 강도의 분산이 관심 있는 생물학적 신호인 dfPPI 분석을 위한 신뢰할 수 있는 입력으로 원시 강도 또는 MS/MS 값을 사용할 수 있도록 지원합니다. (D) 모든 샘플에서 로그₂ 변환된 단백질 강도 값의 계층적 클러스터링 히트맵(기술적 중복 표시 포함). 샘플은 복제가 아닌 생물학적 기원에 따라 클러스터링되어 에피샤페롬 결합 상호 작용체의 강력한 포획과 생물학적으로 관련된 분산의 보존을 확인합니다. 단백질 전반에 걸친 광범위한 동적 범위와 일관된 검출은 dfPPI 분석을 위한 데이터 세트 품질을 더욱 지원합니다. 스케일 바는 2(파란색, 낮은 풍부도)에서 14(노란색, 높은 풍부도) 범위의 로그₂ 변환된 단백질 강도 값을 나타냅니다. (E) dfPPI에 의해 식별된 차등적으로 상호 작용하는 단백질에 대해 수행된 경로 농축 분석의 맨해튼 플롯. 농축은 g:Profiler를 사용하여 수행되었으며, 중요한 항은 주석 소스로 색칠된 -log₁₀(p-값)으로 플로팅됩니다: GO 분자 기능(GO:MF), GO 생물학적 과정(GO:BP), GO 세포 구성 요소(GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways 및 HP(Human Phenotype Ontology). 이 출력은 dfPPI의 핵심 유용성을 나타냅니다: 에피샤페롬 구동 상호 작용체 리모델링을 통해 교란된 생물학적으로 의미 있는 기능적 경로를 밝힙니다. 광범위한 주석 범위는 이 접근 방식을 통해 달성할 수 있는 시스템 수준의 통찰력을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

메서드	캡처 내용	주요 강점	주요 제한 사항	일반적인 용도	확장성(코호트)
AP-MS(친화성 정제-MS)	단일 미끼의 직접/거의 직접적 상호 작용자	높은 특이성; 양적; 복잡한 구성에 적합	미끼/태그/항체가 필요합니다. 한 번에 하나의 미끼; 일시적/약함을 놓칠 수 있음	관심 있는 단백질의 파트너 정의	낮음-중간(많은 미끼 필요)
근접 라벨링(예: BioID/APEX 변이체)	시간이 지남에 따라 미끼 근처의 나노 스케일 단백질	일시적/약한 이웃을 캡처합니다. 살아있는 세포에서 작동	유전 공학; 표적 외 라벨링; 매개변수 무거운	지역 이웃 지도; 동역학	낮음-보통(미끼당 엔지니어링)
XL-MS(가교 MS)	단백질 내/간 공간적 근접성/접촉	구조적 제약; 일시적인 접촉을 캡처합니다.	복잡한 분석; 낮은 프로테옴 폭; 샘플별	구조적/컨텍스트적 토폴로지	낮음(특수)
공분할/MS(CF-MS)	천연 어셈블리의 공동 용출	태그 지정이 없습니다. 네이티브 어셈블리	노동 집약적인; 복잡한 추론; 제한된 감도	글로벌 복합 풍경	온화한
CETSA/TPP	공동 안정성/공동 응집 프로파일	라벨 없음; 기본 조건	PPI의 경우 간접적입니다. 용해도 제약 조건	타겟 참여; 열 이동	온화한
dfPPI(에피샤페로믹스)	다중 미끼로 내인성 epichaperomes에 의해 캡처된 네트워크 수준 상호 작용 재배선	생; 태그 지정이 없습니다. 한 번의 캡처는 수천 개의 기능 장애 PPI를 조사합니다. 경로/네트워크 판독값; 조직 호환; 코호트 친화적	질병 맥락에만 적용 가능합니다. 특수 프로브(PU-비드, YK5-B); 일반적인 복합 검색을 위한 것이 아닙니다.	질병-맥락 상호작용체 리모델링, 경로 우선순위 지정, 가설 생성	높음(수백 개의 샘플 사용 가능)

표 1: PPI 매핑 접근 방식과 dfPPI의 비교. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 전체 Spectronaut 매개변수 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 설명된 프로토콜은 dfPPI 플랫폼을 사용하여 천연 생물학적 샘플에서 기능 장애 PPI의 매핑을 가능하게 합니다. 풍부함이나 발현 변화로 인해 기능 장애를 추론하는 기존 방법과 달리 이 플랫폼은 에피샤페롬 표적 프로브를 사용한 친화성 정제를 통해 질병 특이적 상호 작용자를 분리한 후 무표지 강도 기반 정량적 MS를 통해 구조적 수준에서 네트워크 재배선을 캡처합니다. 현재 응용 분야는 사후 뇌 조직에 초점을 맞추고 있지만, 이 방법은 암, 신경변성 및 면역 기능 장애 모델로부터 배양된 세포 및 조직을 포함하여 다른 샘플 유형 및 질병 모델에 광범위하게 적용할 수 있습니다 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI는 에피샤페롬을 동역학적으로 선택하고 결합된 상호 작용자와 함께 어셈블리를 가두는 프로브에 의존합니다. PU-비드(PU-H71/PU-AD와 같은 에피샤페롬 결합 화학형에서 파생됨)는 HSP90 유핵 에피샤페롬을 비공유 결합하지만 체류 시간이 길며, 이는 기존의 샤페론 복합체에 비해 에피샤페롬 형태에 대한 동역학적 선택성의 특징입니다²³. YK5-B는 에피샤페롬 내에서 HSC70을 향하는 비오티닐화된 공유 프로브로, 용해 전에 세포 내 포획을 가능하게 하고 내인성 PPI를 보존합니다¹⁷. 선택성은 HSP90/HSC70 형태 및 포켓 화학을 리모델링하고 에피샤페롬 어셈블리를 안정화하는 질병 관련 PTM에서 비롯됩니다 14,23,43,44; 이러한 변화는 PU 유형 비공유 프로브⁴⁵에 대한 고친화성, 느린 k_오프 결합을 생성하고(HSC70 지시 YK5-B로 공유 포획을 가능하게 함), 이에 따라 에피샤페롬 복합체를 동역학적으로 유지하고 LC-MS/MS에 대한 직접 및 간접 상호 작용자를 공동 분리합니다. 실제로 PU-비드는 용해물/균질화 워크플로우에 최적인 반면 YK5-B는 살아있는 세포 포획을 지원합니다. 둘 다 LC-MS/MS로 식별할 수 있고 다운스트림 dfPPI 분석에 사용되는 컨텍스트 종속 어셈블리를 유지합니다.

dfPPI의 경우 포획 프로브를 합성하기 위해 화학에 대한 전문 지식이 필요합니다. 그러나 이 요구 사항은 dfPPI에만 국한된 것이 아닙니다: 널리 사용되는 PPI 방법(AP-MS, 근접 라벨링, XL-MS)은 복제/엔지니어링 태그 미끼, 안정적인 세포주 생성, 라벨링/가교 최적화 및 복잡한 생물정보학 파이프라인과 같은 전문 기술에도 의존합니다. 대조적으로, dfPPI는 유전자 조작 및 미끼 과발현을 피하고, 천연 세포 또는 조직(희소한 임상 생체 표본 포함)에 직접 작용하며, 단백질체학 코어에서 이미 일상적으로 사용되는 표준 친화성 캡처 및 LC-MS 워크플로우를 사용합니다. 채택 장벽을 낮추기 위해 검증된 PU 비드와 일치하는 대조 비드는 Chiosis 실험실에서 MTA를 통해 사용할 수 있으며 취급/QA 단계는 1.3 및 1.4단계에서 완전히 지정됩니다. 마지막으로, 분석은 필요한 통계 및 경로/네트워크 판독값을 구현하는 웹 기반 dfPPI 앱에 의해 지원되어 생물정보학 부담을 줄입니다(즉, 코딩 배경 지식이 없고 기본적인 생물정보학 기술만 있는 사용자의 경우).

AP-MS, XL-MS, 근접 라벨링, 공분할 및 CETSA/TPP는 각각 서로 다른 질문(직접 바인더, 공간적 근접성, 이웃 라벨링, 공동 조립 또는 열 공안정성)에 답합니다. dfPPI는 질병, 특히 유전자 태깅이 불가능한 천연 조직 또는 대규모 임상 코호트에서 내인성, 상황에 따른 재배선을 매핑하는 것이 목표일 때, 그리고 단일 캡처에서 경로/네트워크 수준 판독이 필요한 경우에 선택되는 방법입니다. dfPPI는 에피샤페롬을 멀티플렉스 미끼로 사용하여 한 번의 풀다운으로 여러 단백질에 걸쳐 조정된 상호 작용 변화를 포착하여 1차 물질에서 확장 가능한 LC-MS/MS 식별 및 경로 중심 분석을 가능하게 합니다. 실제로 dfPPI는 다운스트림, 미끼 중심 검증(예: 특정 노드의 AP-MS)을 시드할 수 있는 반면, 기존 방법은 dfPPI로 강조된 복합체에 대한 토폴로지(직접 접촉, 공간적 제약)를 개선할 수 있습니다. 나란히 비교하려면 표 1을 참조하십시오.

몇 가지 중요한 단계가 워크플로의 성공에 영향을 미칩니다. 첫째, 고품질 단백질 추출물이 필수적입니다. 이를 위해서는 단백질 분해를 최소화하고 천연 복합체를 보존하기 위해 조직 또는 세포를 주의 깊게 취급해야 합니다(이상적으로는 급속 냉동 및 -80°C에서 보관). 프로테아제와 포스파타제 억제제의 포함은 타협할 수 없습니다: 이 분석에서 기능적 "미끼" 역할을 하는 에피샤페롬 무결성은 HSP90^23,43과 같은 핵심 구성 요소의 특정 번역 후 변형에 따라 달라집니다. 예를 들어, Ser226 및 Ser255의 인산화는 에피샤페롬 형태를 안정화하고 스캐폴딩 기능을 보존하는 데 필수적입니다²³. 포스파타제 억제제를 누락하면 구조적 붕괴 및 생물학적 특이성 손실이 발생할 위험이 있습니다.

또 다른 주요 결정 요인은 PU 비드 친화성 매트릭스의 품질과 취급입니다. 비드는 -20°C에서 100% 이소프로판올에 보관해야 하며 정의된 활성 기간 내, 이상적으로는 1-2년 이내에 사용해야 합니다. 노화된 비드는 결합 능력이 감소하거나 비특이적 상호 작용이 증가할 수 있으므로 중요한 실험 전에 활성을 검증해야 합니다. 배양 시간과 단백질 입력도 최적화되어야 합니다: 과잉 배양은 배경을 높일 수 있는 반면, 단백질 입력이 충분하지 않으면 검출 깊이가 손상될 수 있습니다. 각 샘플 유형에 적합한 입력을 보정하기 위해 3시간 배양 및 파일럿 풀다운을 권장합니다.

두 가지 분해 전략이 이 프로토콜과 호환됩니다: 온비드 및 인겔. 두 워크플로 모두 재현 가능한 결과를 생성하지만 각각 장단점이 있습니다. 겔 내 분해는 케라틴과 같은 오염 물질을 유입할 수 있으며 추가 처리 단계가 필요합니다. 온비드 분해는 워크플로우를 간소화하며 일반적으로 시료 처리량 또는 투입량이 제한적일 때 선호됩니다. 그러나 프로테아제 양은 총 단백질 투입량을 기준으로 보정해야 합니다: 이 방법은 750ng의 트립신용으로 설계되었지만 단백질 수치가 높으면 불완전한 소화가 발생하여 절단을 놓치고 펩타이드 회수율이 감소할 수 있습니다. 소화 효율을 평가하고 그에 따라 효소 입력량을 조정하는 것이 좋습니다. 모든 분해 단계는 일관성을 보장하고 배경을 최소화하기 위해 새로 준비된 오염 없는 시약을 사용하여 결합력이 낮은 튜브에서 수행되어야 합니다.

LC-MS 주입당 단백질 로딩은 캡처 워크플로우, 펩타이드 수율 및 컬럼 용량에 따라 다릅니다. 표준 nano-LC C18 컬럼(~50-75 μm ID, ~15-25 cm)에서 분석된 온비드 분해물의 경우 일반적으로 주입당 300-500ng를 로드합니다. ~400-500ng 이상의 성능 향상은 관찰되지 않은 반면, 부하가 높을수록 이온 억제 및 피크 확장이 발생할 위험이 있습니다. 겔 내 워크플로(예: 레인당 5개의 슬라이스)의 경우 일반적으로 반복당 슬라이스당 탈염 물질의 ~25%를 주입하고 필요한 경우 재주입을 위한 백업으로 ~50%를 유지합니다. 모든 경우에 주입 전에 펩타이드 농도를 측정하고, QC 분해로 선형 반응을 확인하고, 크로마토그래피 피크 모양과 식별 깊이가 과부하 없이 유지되도록 로드를 조정합니다.

DIA를 통한 무표지 정량화는 재현성과 깊이로 인해 단백질체학에서 널리 사용됩니다⁴⁶. 그러나 이와 같은 친화성 포획 실험의 맥락에서 - 목표는 전역 단백질 풍부도를 측정하기보다는 에피샤페롬 스캐폴드와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 것이므로 MaxLFQ와 같은 정규화 전략은 적절하지 않습니다. 이러한 접근법은 균일한 입력과 프로테옴 전체의 유사성을 가정하며, 이는 이 프로토콜에 내재된 농축 단계에 의해 위반됩니다. 대신 강도 값 또는 MS/MS 스펙트럼 수는 다운스트림 기능 분석을 위한 충분하고 생물학적으로 의미 있는 정량화를 제공합니다. 이러한 지표는 조건 전반에 걸쳐 단백질과 에피샤페롬의 상대적 상호 작용 강도 또는 빈도를 반영합니다. 이전 연구 16,17,18,20에서 입증된 바와 같이, 이러한 값은 프로테옴 전체 정규화에 의존하지 않고 변경된 생물학적 경로를 식별하는 dfPPI와 같은 시스템 수준 상호 작용체 분석에 매우 적합합니다. 질병이나 치료에 의해 도입된 진정한 생물학적 분산을 보존함으로써 강도 또는 MS/MS 기반 정량화는 PPI 네트워크 기능 장애의 정확하고 강력한 매핑을 가능하게 합니다.

친화성 캡처는 전체 용해물에 비해 검색 공간을 줄이지만, dfPPI 풀다운에는 여전히 넓은 동적 범위에 걸쳐 수백에서 수천 개의 단백질과 공동 농축된 배경이 포함되어 있습니다. 코호트 규모 비교의 경우, DDA의 확률론적 전구체 선택은 실행 간 결측값과 저풍부도 상호 작용자의 가변 샘플링으로 이어집니다¹⁸. DIA는 사전 정의된 창에서 모든 이온을 체계적으로 단편화하여 다운스트림 추론이 단일 단백질이 아닌 경로/네트워크 수준일 때 중요한 더 큰 깊이, 더 적은 결측값 및 더 높은 실행 간 재현성 특성을 제공합니다. 이것이 우리가 dfPPI에 대한 DIA를 표준화하는 이유입니다.

모든 친화성 포획 방법과 마찬가지로 비특이적 단백질 결합은 고유한 고려 사항입니다. 단백질은 수지에 대한 끈적임, 높은 풍부함 또는 응집으로 인해 유지될 수 있습니다. 이러한 비특이적 상호작용체가 풀다운 용출액에 나타날 수 있지만, 이들의 존재는 이 프로토콜의 다운스트림 분석 목적을 훼손하지 않습니다¹⁷. dfPPI 워크플로는 이진 상호 작용을 정의하도록 설계되지 않고 시스템 수준에서 PPI 재배선 패턴을 추출하도록 설계되었습니다. 기능 강화 분석은 차등 상호 작용자에 대해 수행되고 네트워크 기반 통계를 활용하여 조정된 경로 수준 변경을 밝힙니다. 이전 작업¹⁷에서 입증한 바와 같이, 이 시스템 수준 접근 방식은 분리된 비특이적 단백질의 영향을 최소화하고 코호트 수준 데이터에서 강력한 생물학적 결론을 도출할 수 있도록 합니다.

공동 면역침전, 근접 라벨링 또는 가교와 같은 기존의 상호 작용체 매핑 접근법과 비교할 때 dfPPI 플랫폼은 미끼 공학이나 과발현 없이 질병 관련 조건에서 기능적 상호 작용체 리모델링을 포착하는 뚜렷한 이점을 제공합니다. 이 방법은 초분자 에피샤페롬 주위에 형성된 단백질 복합체를 분리하기 때문에 건강한 시스템에 존재하지 않는 새로운 단백질 집합체를 검출하여 새로운 질병 동인을 발견할 수 있습니다. 이 접근 방식은 조직, 종 및 질병 상태에 걸쳐 확장 가능하고 적응 가능하며 이미 암 및 신경변성의 프로테옴 리모델링에 대한 고유한 통찰력을 제공했습니다. 따라서 이 방법은 인간 질병으로 인해 중단된 기능적 네트워크를 밝히기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

여기의 예 외에도 dfPPI는 (i) 네트워크 기능 장애에 따라 환자를 계층화하고 표적 참여 및 경로 교정에 대해 보고하는 약력학적 바이오마커를 발견하는 대규모 임상 코호트에 적합한 위치에 있습니다. (ii) 재배선 궤적을 추적하고 반응자를 예측하기 위한 종단 샘플링(예: 치료 전/후, 질병 병기); (iii) 상호 작용 상태 변화를 업스트림 신호 전달에 연결하기 위해 인산프로테오믹스 및 기타 PTM 인식 오믹스와의 통합; (iv) 로컬 네트워크 병리생물학을 매핑하기 위해 미세해부 영역(종양-정상 인터페이스, 뇌 하위 영역)에서 공간적으로 분해된 캡처; (v) dfPPI 판독값이 실행 가능한 노드 및 작용 메커니즘을 지명하는 섭동 스크린(유전적 또는 복합물); (vi) 예후 및 치료 설계를 위해 dfPPI 맵에서 질병별 네트워크 기능을 학습하는 그래프/AI 모델링. 방법론적으로 소형화, 자동화(예: 96웰 형식) 및 표준화된 QC를 통해 중개 연구 및 임상 시험을 위한 고처리량 파이프라인이 가능해집니다. 마지막으로, dfPPI 출력은 대상 후속 조치(AP-MS, XL-MS 또는 근접 라벨링)를 시드하여 우선 순위가 지정된 모듈의 토폴로지를 해결하여 상호 작용체학 툴킷 내에서 방법의 보완성을 강조할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-머캅토에탄올	시그마-올드리치	M6250	독성, 가연성
아세토니트릴(ACN) 옵티마	피셔 사이언티픽	A955-1	LC/MS 등급 (가연성)
Affi-Gel 10 활성화 친화도 크로마토그래피 매체	바이오-래드	1536099	PU 비즈 제작과 제어 비즈 (가연성 비드)
탄산암모늄(ABC)	시그마-올드리치	09830-500G
오로라 얼티밋 25x75 C18 UHPLC 컬럼	이온옵틱	AUR3-25075C18-CSI
자동방사선 필름	유엔-파커 엑스레이 코퍼레이 코퍼레이	EBA45	서부 블롯 후 화학발광 신호 검출의 대안
바이오매셔 미세 조직 균질화	DWK 라이프 사이언스 킴블	7496250010	단백질 추출을 위한 동결된 뇌 조직을 균질화하는 데 사용됩니다
브로모페놀 블루	피셔 바이오리시약	BP115-25
1.5 mL 튜브용 원심분리기	에펜도르프	5424
1.5 mL 튜브용 원심분리기	에펜도르프	5417R	온도 조절 장치
15-50 mL 튜브용 원심분리기	에펜도르프	5810R	원뿔 튜브에 사용
ChemiDoc MP 이미징 시스템	바이오-래드	17001402	젤/블롯 밀도측정에 사용됩니다
기둥 오븐	소네이션 GmBH, 독일	ES071/ES072	나노 LC 컬럼을 50 & 도수로 유지합니다; C는 일관된 기억을 의미합니다
원뿔관 (15 mL)	피셔 사이언티브	352096
컨트롤 비즈	키오시스 연구소	해당 없음	탈도네 외 (PMID:  21459002)
쿠매시 G-250 스테인 (바이오세이프)	바이오-래드	1610786
다크 에펜도르프 튜브 (1.5 mL)	USA 사이언티픽	1415-2507
디티오트레이톨 (DTT)	로슈	10197777001	자극
이지 nLC 1000	써모피셔 사이언티브	이지 nLC 1000	Q Exactive HF와 함께 사용되는 LC 시스템
엠포레 고체 상 추출 디스크	3M 중대	2215-C18 (옥타데실)	펩타이드 탈염을 위한 StageTips 준비에 사용; 100% 메탄올로 활성화됨
향상된 화학발광(ECL) 키트	써모피셔 사이언티브	32209
에펜도르프 튜브 (1.5 mL)	피셔 사이언티브	05-408-129
개미산(FA) 옵티마	피셔 사이언티브	A117-10X1AMP	LC/MS 등급
g:프로파일러 (e111_eg58_p18_f463989d)	BIIT 그룹-타르투 & 우울; 리쿨	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	경로 풍부화
글리세롤	피셔 바이오리시약	BP229-1	분자생물학 등급
글리신	피셔 바이오리시약	BP381-5	결정 가루
염소 항생쥐 HRP 결합 2차 항체 (RRID: AB_2619742)	서던 바이오텍	1030-05	H90-10 항체의 2차 질환
염소 항토끼 HRP 결합 2차 항체 (RRID: AB_2632593)	서던 바이오텍	4010-05	HSP90 & 알파의 부차적 모델; 그리고 HOP 항체
염소 항쥐 HRP 결합 2차 항체 (RRID: AB_2716837)	서던 바이오텍	3030-05	HSC70 항체의 2차 항체
가열 궤도 셰이커	에펜도르프	ThermoMixer C (2231001127)
헬라 단백질 다이제스트 스탠다드-피어스	써모피셔 사이언티브	88329	LC-MS 품질 평가에 사용
HOP 항체 (Rrid: AB_10828378)	세포 신호 전달	5670	PU-비즈 품질 관리
HSC70 항체 (RRID: AB_10617277)	엔조	SPA-815	PU-비즈 품질 관리
HSP90 (H90-10) 항체 (RRID: AB_854214)	스트레스마크	SMC-107	PU-비즈 품질 관리
HSP90 알파 항체 (RRID: AB_303423)	앱캠	Ab2928	1.2절에 따른 정규화를 위해
인간 세포주: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	대조 세포주, 에피카페로메 낮음/사페론 높음
인간 세포주: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	대조 세포주, 에피카페롬 높음/샤페론 상승
ImageJ (v1.54p)	웨인 라스밴드	https://imagej.net/ij/	밀도 측정
요오도아세트아마이드 (IAA)	시그마-올드리치	I1149-5G	유독
저단백질 결합 미세원심분리관	사르스테트	72.706.600
리스-C 프로테아제	프로메가	VA1170	LC/MS 등급
염화마그네슘	시그마-올드리치	63068	분자생물학 등급
맥스콴트 (v2.1.1.0)	막스 플랑크 생화학 연구소	https://www.maxquant.org/	펩타이드/단백질 식별 및 라벨 없는 강도 기반 정량화를 위한 MaxDIA 워크플로우
메탄올	피셔 케미컬	A454-4	HPLC 등급, 가연성, 독성
미니 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (완전)	로슈	4693124001
미니 트랜스 블롯 전기영동 전달 셀	바이오-래드	1703930
미니 젤 전기영동 탱크	써모피셔 사이언티브	A25977	Novex 프리캐스트 젤에 사용
미니-프로티안 테트라 수직 전기영동 세포	바이오-래드	1658004	미니-프로티언 프리캐스트 단백질 젤 또는 수작업 주조 젤에 사용됩니다
미니-프로티안  TGX 프리캐스트 단백질 젤 (4– 20%)	바이오-래드	4561094
나노드롭	애질런트	바이오텍 시너지 H1	LC-MS 주입 전 펩타이드 농도를 추정하는 데 사용됨
나노엘루트 2	브루커	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	diaPASEF 워크플로우에서 사용되는 방법
나노스프레이 플렉스 소스	써모피셔 사이언티브	ES071	나노스프레이 ESI 결합을 위한
새로운 객관형 PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	뉴 오브젝티브 주식회사	PF360-75-10-N-5	C18 슬러리를 20cm 길이까지 채워 넣었습니다
니트로셀룰로오스 막	시티바 아머샴	10600006
무지방 건식 우유	연구소 사이언티브	M0841
Novex 8% 트리스-글리신 프리캐스트 젤	써모피셔 사이언티브	XP00080BOX
NP-40	로슈	11754599001
인산염 완충 식염수 (PBS)	깁코	10010023
PhosSTOP 인산효소 억제제 칵테일 정제	로슈	4906837001
피어스 BCA 단백질 분석 키트	써모피셔 사이언티브	23225
플라스틱 용기	피셔 사이언티브	FB0875711A
플랫폼 로커	코 닝	6705
염화칼륨	피셔 바이오리시약	BP366-1	화이트 크리스탈
파워팩 범용 전원 공급 장치	바이오-래드	1645070
프리시전 플러스 단백질 만화경 프리스테인 단백질 표준	바이오-래드	1610375
PU-비즈	키오시스 연구소	해당 없음	탈도네 외 (PMID:  21459002)
Q 익스액티브 HF 오비트랩 질량분석기	써모피셔 사이언티브	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	DIA-MS에 사용
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 및 마이크로; m	Dr. Maisch GmbH, 독일	R13.aq	펩타이드 분리를 위한 실리카 배지; 분말/메탄올 슬러리 (1:3, v/v)
회전 유닛(끝 오버 엔드 회전기)	반스테드와 nbsp; 국제	400110
Sep-Pak C18 카트리지 (100mg)	워터스 코퍼레이션	WAT023590
도데실 황산나트륨 (SDS)	피셔 바이오리시약	BP166-500	전기영동 등급
소닉케이터	브 랜 슨	2510
스펙트라맥스 패러다임 다중 모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치	스펙트라맥스 패러다임
스펙트로노트	바이오그노시스	https://biognosys.com/software/spectronaut/	DirectDIA 워크플로우
SpeedVac 집중기	서모 피셔 사이언티픽	성가SPD111V
흡입 진공	카디널 헬스	CDL-65651-320
TimsTOF HT 질량분석기	브루커	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	diaPASEF 분석에 사용됨
트리플루오르오초아세트산(TFA) 옵티마	시그마-올드리치	T6508-10AMP	LC/MS 등급(부식성 및 가연성)
트리스	피셔 바이오리시약	BP152-5	결정 분말; 분자생물학 등급
트리스, pH 6.8 (1 m)	테크노바	T1068
트리스, pH 7.5 (1 M)	피셔 바이오리시약	BP1757-500	분자생물학 등급
삼중 완충식염수(20x TBS) 버퍼	VWR, 생명과학	97064-338
Tris-Glycine-SDS(TGS 10x) 러닝 젤 버퍼	피셔 바이오리시약	BP13414	전기영동
트립신	프로메가	V5111	시퀀싱 등급
트립신 골드	프로메가	V5280
트윈 20세	피셔 바이오리시약	BP337-100
요소	시그마-올드리치	U0631-500G
소용돌이	피셔 사이언티브	02-215-414
물	피셔 사이언티브	W6-1	LC/MS 등급