뇌졸중 전임상 평가 네트워크 혈전색전성 뇌졸중 및 혈전용해 다중 실험실 모델: TE-MCAo

요약

혈전색전성 뇌졸중을 모방하기 위해 이종 쥐 혈액으로 만든 색전을 중뇌동맥에 주입한 후, 재관화를 위한 전신 혈전용해술을 투여하였다. 이 모델은 다중 실험실 네트워크에서 최적화되어 여러 후보 치료제를 테스트할 수 있습니다.

초록

현재의 중개 설치류 뇌졸중 모델은 나일론 필라멘트, 주입 색전, 내관 혈전, 혈관 주위 엔토텔린-1을 사용하여 중뇌동맥 폐색(MCAo)을 유도하여 인간의 뇌졸중을 시뮬레이션합니다. 이 중 혈전색전주사 후 혈전용해술이 인간 환자에서 관찰되는 신경염증 사건을 가장 잘 모방하며, 가장 널리 사용되는 불활성 나일론 필라멘트 방법보다 더 바람직할 수 있습니다. 그러나 주요 단일 실험실에서 사용되는 표준 혈전색전증 모델은 시간이 많이 걸리고 결과가 변동적이며 숙달하는 데 상당한 기술이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 혈관 폐색을 표적으로 삼고 정맥 내 혈전용해를 통해 재관화를 달성하는 혈전색전성 MCAo 모델을 개발했으며, 이는 임상 시나리오에서 시행되는 전신 혈전용해와 유사합니다. 동물 수를 줄이기 위해, 우리는 기증 동물의 혈액을 저장하여 다수의 피험자를 위한 이후 색전술 준비를 위한 방법을 개발했습니다. 저희는 조립식 Doccol 마이크로카테터를 활용하여 혈전색전을 미세카테터에 미리 적재하여 내경동맥에 삽입하여 혈전 준비와 주입을 단순화합니다. 재관화를 위해 Tenecteplase 정맥 주입을 1.5 mg/kg의 용량으로 투여했습니다. 재현성을 촉진하기 위해 표준 운영 절차, 교육 영상, 실습 수술 워크숍을 준비하고 현장 테스트를 진행했습니다. 이 모델은 널리 인정받는 나일론 필라멘트 모델을 사용하는 모든 연구자들에게 익숙할 표준 외과적 접근법을 사용합니다. 미세카테터가 원위 내경동맥으로 통과하는 과정은 나일론 필라멘트 삽입과 유사하게 이루어집니다. 회복 및 뇌졸중 후 평가는 일반적인 행동, 방사선 검사, 조직학적 프로토콜로 이루어질 수 있습니다. 이 모델은 통제된 재관화가 포함된 혈전색전성 MCAo 모델을 찾는 연구자들에게 실용적이고 재현 가능하며 접근하기 쉬운 접근법을 제공합니다.

서론

뇌졸중은 전 세계적으로 사망과 장애의 주요 원인 중^{하나입니다.} 많은 환자가 정맥 내 혈전용해술로 혜택을 받으며, 일부 환자들은 기계적 혈전절제술을 통해 혜택을 받습니다. 모든 환자가 혈전용해술이나 혈전절제술을 위해 병원에 제때 도착하지 않고, 모든 환자가 완전한 회복을 받는 것도 아니므로, 추가적이거나 보조 뇌보호 치료법의 추가 개발이 여전히 상당히 필요합니다. 가장 널리 사용되는 설치류 허혈성 뇌졸중 모델은 중뇌동맥의 단섬유 폐쇄(MCA)와 완전 재관류입니다. 이 모델은 대규모 뇌졸중 환자가 성공적으로 완전한 기계적 혈전절제술을 받는 모습을 시뮬레이션하여 대혈관 폐색(LVO)을 시뮬레이션합니다. 하지만 이 모델은 임상 뇌졸중 중 일부만 포괄합니다. 반면, 더 많은 환자들이 죽상동맥경화(in situ atherosclerotic plaquere 파열 또는 전신 질환에 의한 동맥색전색전)로 인한 혈전색전성 뇌졸중을 겪으며, 전신 혈전용해술만으로 치료받는데, 나일론 모델은 이를 재현하지 못합니다 ^2,3. 또한, 나일론 필라멘트 MCAo 모델은 혈전성 폐색과 관련된 염증 연쇄반응이 없습니다 ^4,5. 혈전색전을 사용한 후 전신 혈전용해제 투여를 수행하는 동물 모델은 많은 뇌졸중 환자에서 발생하는 병태생리와 기본 생물학을 대표합니다 ^4,6. 하지만 지금까지 설치류의 혈전색전성 뇌졸중 모델은 복잡하고 재현이 어려운 것으로 알려져 있습니다. 전담 전문가가 있는 고립된 실험실에서는 혈전색전증 모델을 합리적인 재현성으로 구현할 수 있습니다. 이러한 모델은 다실험실 프로젝트에 필요한 경우 널리 사용되기 쉽지 않습니다.

여기서는 최신 및 표준화된 혈전색전성 중뇌동맥 폐색(TE-MCAo)과 전신 혈전용해 모델에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 구체적으로, 혈전 준비를 단순화하고, 혈전 적재를 카테터로 표준화했으며, 이 모델의 다중 실험실 시험 확장 가능성을 검증했습니다. 우리는 이 모델을 뇌졸중 전임상 평가 네트워크(SPAN)에서 사용하기 위해 개발했습니다. 그러나 우리는 이 모델이 새로운 후보 치료제의 대량 전임상 네트워크 시험을 실행하려는 모든 네트워크에 유용하게 활용되기를 의도했습니다. 표준화된 모델을 사용하여, 연구 기간 동안 각 연구 지점마다 하루 6마리의 쥐에게 TE-MCAo를 유도할 수 있었습니다.

SPAN과 유사 네트워크는 유망한 뇌보호제를 전임상 환경에서 임상 실무에서 성공으로 전환하는 데 반복적이고 지속적인 실패가 반복적으로 발생함에 대응하여 성장해 왔습니다^7. 2019년, 미국 국립신경질환 및 뇌졸중연구소(NINDS)는 SPAN⁸을 시작했습니다. SPAN은 중앙집중식 마스킹, 무작위 배정, 자동화된 중앙집중식 결과 분석을 통해 편향을 최소화하여 잠재적 치료제를 보다 효과적으로 선별하는 것을 목표로 합니다. SPAN 1은 처음 두 차례 동안 나일론 필라멘트 모델을 사용했는데, 이는 모든 참여 실험실이 이미 사용하고 있었고⁹개의 플라멘트 배치가 쉬웠기 때문입니다. 혈전색전증과 혈전용해증의 여러 측면을 보다 충실하게 모델링하기 위해 SPAN은 여기서 설명한 TE-MCAo 모델을 만들고자 했습니다. 이 모델은 나일론 필라멘트 모델에서 TE-MCAo 모델로 전환하는 전임상 외과의사들에게 도움이 될 것입니다. 전임상 실험실에서 MCAo(또는 TE-MCAo) 발생 후 24시간 또는 48시간 이내에 영상 기법(예: MRI)을 사용하여 뇌졸중 존재를 확인할 것을 권장합니다.

SPAN 네트워크는 이전 연구⁹에서 완전히 설명되었으며, 모든 SPAN 표준 운영 절차(SOP)는 SPAN 웹사이트에서 확인할 수 있습니다. 간단히 말해, 네트워크는 약물 유통, 데이터 품질 관리, 프로토콜 준수 검증, 네트워크 통신을 담당하는 조정 센터(CC)에 의해 관리됩니다. 모든 SOP는 CC에서 작성하고 검토 후 운영위원회에서 승인합니다. SPAN에서는 모든 설치류가 연구소에 도착할 때 MRI 호환 바코드 귀태그가 부착되며, 모든 피험자는 SPAN 연구 전자 데이터 캡처(REDCap) 데이터베이스에 등록됩니다. 동물은 CC에 의해 부위와 성별별로 층화된 무작위화 표를 사용해 무작위화됩니다. SPAN 1과 SPAN 2에서는 6개 참여 연구실에서 치료 가능성을 조사하였습니다. 모든 시험 약물은 동일한 모양의 바이알에 포장되어 조정 센터에서 라벨이 붙어 프로젝트 시작 시 연구소로 배송되었습니다.

프로토콜

USC의 조정 센터를 포함한 모든 참여 SPAN 연구소는 동물에 대한 인도적이고 윤리적인 처우를 위한 NIH와 AAALAC 지침을 준수했습니다. 모든 현장에서 지역 IACUC의 승인을 받았습니다.

1. 혈전 준비

참고: 모든 혈액과 혈전은 생물학적 위험에 관한 모든 지역 기관 지침에 따라 처리되어야 합니다. 혈액과 접촉하는 모든 물질은 생물학적 위험 폐기물로 폐기하거나, 수술용 기구의 경우 오토클레이브로 철저히 세척 및 소독해야 합니다. 이 임상시험에서 헌혈 동물의 사용을 줄이기 위해, 우리는 헌혈 혈액을 저장한 후 필요에 따라 혈액을 이용해 혈전색전을 만드는 방법을 개발했습니다.

1. 동맥에서 신선한 기증자 혈액을 1.5mL 마이크로 원심분리관 또는 소아용 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA) 마이크로튜브에 500 μL 수준만 채웁니다.
   참고: 저희는 대퇴동맥 캐닐레이션을 선호합니다. 대퇴동맥은 큰 하강 직경으로 카테터 삽입이 가능하고, 양측 동맥 관식으로 두 번의 혈액 채취가 가능하며, 설치류에게는 생존 가능한 수술입니다. 저희 경험상 혈액은 4°C에서 4주 동안 저장할 수 있습니다.
2. 저장된 항응고 혈액 500 μL에 CaCl₂ 용액 1mL(5mg/mL)를 첨가합니다.
3. _CaCl2로 항응고 역전 효과를 받은 직후, 미세원심분리관에서 100cm 길이의 PE-50 튜브로 부드러운 흡입을 통해 혈액을 흡인합니다.
   참고: 지연 시 PE-50 튜브로 혈액이 끌어들이기 전에 혈액이 응고됩니다.
4. 코일된 튜브를 미리 데운 인산염 완충 식염수(PBS)에 37°C에서 테이블탑 오븐에서 2시간 동안 배양합니다.
   참고: 열판 위에 배양 접시를 놓으면 열 분포가 일정하지 않아 결과가 일관되지 않습니다.
5. 2시간 배양이 끝나면 즉시 혈액이 채워진 PE-50 튜브를 4°C로 옮겨 보관합니다. 20시간에서 72시간 사이에 다음 단계로 계속 사용할 수 있습니다.

2. 카테터 로딩

1. 코일형 PE-50 튜브(내경: 0.58mm)를 3 또는 5cc 식염수가 채워진 주사기에 연결하고, 혈전을 PBS가 들어있는 배양 접시에 부드럽게 배출합니다.
   참고: 이는 상당한 힘이 필요할 수 있습니다. 카테터와 주사기가 압출 시 분리되지 않도록 연결 부위의 압력을 억제하세요. 필요하다면 PE-50 카테터는 압출을 용이하게 하기 위해 10-50cm 정도 더 작은 구간으로 절단할 수 있습니다.
2. 면도날로 약 6cm 길이의 혈전 조각을 절단합니다.
3. 각 혈전 구간을 PE-50 카테터에 부드럽게 넣고 5번 완전히 배출하여 세척하세요.
4. 다음으로, 혈전을 PE-10 카테터(내경: 0.279mm)에 부드럽게 넣고 15번 완전히 배출하여 세척합니다.
   참고: 이 단계에서 자주 파손이 발생한다면, 수술용 현미경이나 수술용 루페로 확대하여 혈전이 카테터 입구와 일직선상으로 흡입되는지 확인하는 것을 고려하세요.
5. 선택 사항: 혈전을 시각화하기 위해 에반스 블루 사용
   1. 4% 에반스 블루를 1x PBS 용액에 준비하세요.
   2. 4% 에반스 블루 200 μL 1x PBS가 든 배양 접시에 넣습니다. 이 용액은 더 농축된 용액일 것입니다 = 에반스 블루 희석 #1.
   3. Evan's Blue Dilution #1 400 μL 추출을 별도의 페트리 접시에 1x PBS 20mL를 넣어 혼합합니다. 이것은 에반스 블루 = 에반스 블루 희석 #2의 희석된 용액입니다.
   4. 더 농축된 Evan's Blue 페트리 접시 용액(희석 #1)에 혈전을 1초간 넣은 후 희석된 Evan's Blue 페트리 접시(희석 #2)로 옮깁니다.
6. 세척된 혈전 하나를 공기 색전법을 습식 루어 잠금 없이 조립식 마이크로카테터(내경: 0.2mm, 외경: 0.360mm, 길이: 300mm, 여성용 루어 록에 연결)에 주입합니다.
   참고: 이 단계에서는 배율(예: 2.5배 루페)을 사용하는 것을 권장합니다.
7. 혈전이 완전히 적재되면, 미세카테터 내에 정확히 5.0cm가 남도록 충분히 혈전을 돌출합니다. 면도날로 남은 부분을 다듬으세요.
   참고: 적재된 혈전의 길이는 원하는 스트로크 크기에 따라 다양한 용도에 맞게 조정할 수 있습니다.
8. 미세카테터를 끝에서 16mm 떨어진 곳에 표시하여 총경동맥의 분기점을 넘어 내루미소 범위까지 표시하세요.

3. 동물 수술 및 마취

1. 30:70 산소-아산화질소 혼합물에 4% 이소플루란으로 마취를 유도하고, 같은 가스 혼합물에 1-2% 이소플루란으로 마취를 유지하세요.
2. 수술 중 동물의 편안함을 유지하기 위해 진통제 카프로펜 5 mg/kg을 피하 투여, 아트로핀 0.05 mg/kg을 복강 내 투여하세요.
   참고: 많은 외과의사가 절개 부위에 1.0 mL 부피바카인(2.5 mg/mL)을 주입합니다.
3. 수술 기간 내내 직장 온도 프로브로 제어되는 온열 패드를 사용해 체온을 37± 0.5 °C로 유지하세요.

4. 기증자 혈액 채취

1. 대퇴동맥 카테터 삽입 을 통해 기증자 혈액을 채취합니다. 기증자와 수혜자의 생물학적 성별을 일치시키세요.
2. 같은 날 혈액을 사용할 경우:
   1. 1.5mL 원심분리기 튜브 세 개를 준비하세요. 각 튜브는 지울 수 없는 실험실 펜으로 500 μL 지점에 표시하세요.
   2. 길이 100cm의 PE-50 튜브 세 세트를 준비하고, 23게이지 둔기 바늘 로 1.0 mL 주사기에 연결하세요.
3. 혈액을 보관할 경우, 소아용 EDTA 마이크로튜브 6개를 준비하세요. 나중에 더 쉽게 사용할 수 있도록 캡을 느슨하게 하세요.
4. 10.0cm 길이의 PE-50 튜브를 준비하고, 한쪽 끝은 고무 쇄 클램프로, 다른 쪽 끝은 무딘 베벨로 마감하세요.
   1. 고무 쇄 클램프를 만들려면, 표준 지혈 클램프 한 마리를 PE-100 튜브와 트림에 삽입해 맞출 수 있도록 하세요. 반대편에서 반복하세요.
   2. PE-50을 둔탁한 베벨로 만들려면 먼저 끝부분을 베벨 각도로 잘라야 합니다. 그 다음 미세 가위로 베벨 포인트의 아주 끝을 잘라내세요.
      참고: 삽입 후 동맥 뒷벽을 뚫지 않도록 포인트를 제거하는 것이 중요하지만, 끝부분을 너무 많이 제거하면 경사 효과가 사라져 카테터를 내광 삽입이 매우 어려워집니다.
5. 대퇴동맥에 표준 절개를 시행하세요.
6. 동물을 준비시키고(허벅지 안쪽 면도), 수술 테이블에서 등쪽 누운 자세로 위치하세요. 70% 에탄올 세척 3회 후 베타딘 또는 기타 소독제로 1회 세척해 피부를 소독하세요.
7. 부드러운 구속구를 사용해 뒷다리를 벌린 자세로 고정하세요.
8. 서혜부 접힘과 다리가 만나는 자연스러운 주름을 따라 허벅지 안쪽에 약 1.5-2cm 길이의 수직 절개를 하세요. 이 절개는 대퇴동맥의 예상 해부학적 경로와 직교 방향으로 이루어집니다.
9. 둔한 해리를 사용해 대퇴동맥까지 조심스럽게 해부하세요. 대퇴동맥을 같은 다발을 따라 흐르는 정맥과 신경에서 조심스럽게 분리하세요.
10. 5-0 실크 결찰로 대퇴동맥을 원단적으로 막고, 봉합선 꼬리를 이용해 지혈고정기로 원위쪽에 약간의 장력을 제공합니다.
11. 대퇴동맥을 가능한 한 근위까지 골격화하여 동맥의 후복막 기원까지 추적합니다. 대퇴동맥 주위에 5-0 실크 고리를 느슨하게 감고, 다시 꼬리를 사용해 동맥 근위 쪽에 부드러운 장력을 가합니다. 이 시점에서 실크 매듭을 조이지 마세요. 이 장력은 동맥 절개 후 혈류 효과를 제공합니다.
    참고: 루프는 동맥류 클램프를 사용해 근위쪽으로 더 이동시킬 수 있습니다.
12. 근위 봉합선 루프에서 약 2/3 거리 지점에 실크 봉합사 한 조각을 동맥 아래에 놓고, 미세한 가위로 느슨한 봉합선 말위부에 작은 동맥 절개를 합니다. 느슨한 봉합선은 관식 후 배관 내 카테터를 고정하기 위해 묶습니다.
13. 날카로운 겸자를 사용해 동맥 절개술의 윗부분을 들어 올리고 둔한 경사 카테터를 입구에 넣습니다. 카테터를 가능한 한 가까운 쪽으로 밀어주세요.
    참고: 카테터와 혈관 내부 벽 사이에 마찰이 있을 수 있습니다. 이 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있는 두 가지가 있습니다: 1) 혈관에 삽입하기 직전에 다리 안쪽에서 나온 혈액액을 카테터 끝 바깥쪽에 코팅하는 것, 2) 둔하고 홈이 있는 겸자를 사용해 혈관 바깥쪽을 잡으면서 동시에 카테터를 앞으로 내밀 수 있습니다. 이로 인해 혈관이 카테터와 함께 전진하는 것을 막을 수 있습니다.
14. 카테터 끝이 근위 루프 지점에 거의 도달하면 그 봉합사 꼬리의 장력을 풀어줍니다. 출혈은 혈관 내부에 카테터가 꽉 끼어 있어 예방해야 합니다.
15. 카테터를 충분히 앞으로 밀어서 느슨한 루프가 조일 때 카테터를 감싸게 하세요. 봉합선을 부드럽게 조이되, 카테터가 막히지 않도록 하세요. 또한, 이 카테터 구간이 점점 가늘어지는 구조를 고려할 때, 봉합사가 카테터의 경사면에 있지 않은지 꼭 확인하세요.
16. 고무 쇄 클램프를 풀어. 카테터는 즉시 혈액으로 채워질 것입니다.
17. 개방형 원심분리관 또는 소아 EDTA 마이크로튜브를 채우고, 두 수집 용기에는 500 μL를 초과하지 않습니다.
18. 미세관이 채워지면 대퇴동맥에서 PE-50 카테터를 제거하고, 근위부를 결찰한 뒤, 절개 부위를 중단한 5-0 프로린 봉합사로 봉합합니다.
19. 나중에 혈액을 사용할 경우, 캡을 채운 소아 EDTA 튜브에 덮어 4°C에 보관하세요.
20. 혈전을 당일 사용에 대비하려면 위 1.2단계를 진행하세요.
21. 남은 원심분리관도 즉시 반복하세요.
22. 일측 카테터 삽입이 시행된 경우 마취 후 동맥 헌혈자를 다시 비바리움으로 복귀시킬 수 있습니다. 반대쪽 대퇴동맥은 나중에 카테터를 삽입할 수 있으나, 양측 대퇴동맥 카테터 삽입 후에는 IACUC 규정에 따라 기증자를 안락사시켜야 합니다.

5. 테-MCAo

참고: TE-MCAo 접근법은 표준 절개법을 총경동맥 쪽으로 사용합니다. 마취 종류와 단축 방식은 사용자에게 달려 있습니다. 여기서 프로토콜은 외과의가 이미 총경동맥(CCA), 내경동맥(ICA), 외경동맥(ECA)을 분리한 시점부터 시작합니다.

1. CCA를 노출시키고 3-0 실크 리가처로 당기세요. ECA와 ICA도 같은 방식으로 하세요.
2. 결찰이나 소작을 사용하여 후두동맥을 노출시키고 막으세요.
3. pterygopalatine artery(PPA)를 노출시키고 후퇴하거나 막아야 합니다.
   참고: 충분한 경험이 있다면 이 단계를 생략할 수 있습니다. 절차를 배울 때 항상 이 단계를 반드시 수행하는 것을 권장합니다.
4. 부드러운 리트랙션을 사용해 ECA와 ICA를 "T" 모양으로 이동시킵니다.
5. 위의 모든 단계를 완료한 후에만 CCA 합자를 묶으세요.
6. ECA(Zea Longa CCA 오픈 방법론¹⁰)에서 미세 가위를 사용해 동맥 절개술을 하세요.
7. 4.4.2 단계에서 설명한 둔탁-베벨 방법을 사용하여 이미 장전된 마이크로 카테터 중 하나의 팁(내경: 0.2 mm, 외경: 0.360 mm, 길이: 300 mm, 암형 루어 잠금장치에 연결)을 준비합니다.
8. 미리 장전된 혈전이 포함된 미세카테터를 조심스럽게 ECA에 삽입하세요. ICA 억제 루프를 느슨하게 하고, 경동맥 분기점에서 직접 관찰한 상태에서 미세카테터를 두개내로 16mm까지 전진시켜 두개외 PPA의 실수로 관을 삽입하는 것을 방지합니다.
   참고: 카테터가 CCA로 들어가는 것을 선호한다면, 뾰족한 면 팁 적용기를 이용한 부드러운 압력이 진행 카테터를 ICA에 맞추는 데 도움이 될 수 있습니다.
9. 3-0 실크로 ICA와 CCA에 배관 내 미세카테터를 고정하되, 너무 조이지 않도록 주의하세요.
10. 모터 주사기 펌프로 10 μL/분의 속도로 20 μL를 1mL 주사기에 2분 동안 주입합니다.
    참고: 일반적으로 주사기 펌프는 충분한 압력이 쌓일 때까지 처음에는 진행하지 않습니다.
11. 동일한 펌프 설정으로 20 μL 무균 생리식염수를 추가로 주입합니다.
    참고: 레이저 점점 영상을 이용한 혈류 연구에서 20 μL 플러시에서 100% 성공을 확인했습니다.
12. 미세카테터를 제거하고 동맥 절개 부위 근위에 봉합하는 봉합으로 ECA를 영구적으로 결찰하세요. 모든 제압 고리를 제거하세요. 혈액 누출이 있는지 주의 깊게 관찰하고 필요하면 추가 결찰로 고정하세요.
13. 피부 절개는 스테이플러나 5-0 프로렌 봉합사로 임시로 봉합하세요.
14. 동물을 마취에서 떼어내고 따뜻한 회복 케이지에 넣으세요.
15. 선택적으로: 검사실에서는 성공적인 MCA 폐색을 확인하기 위해 레이저 도플러 플로우메트리를 사용할 수 있습니다. 또는 24시간 또는 48시간에 자기공명영상을 촬영하여 뇌경색을 확인하고 정량화할 수도 있습니다.
    참고: 많은 사용자는 수술 후 1.5mL의 식염수 또는 젖이 첨가된 링거 용액을 피하 투여하는 것을 선호합니다.

6. 전신성 혈전용해증

참고: Tenecteplase(TNK, 1.5 mg/mL)는 전신 혈전용해용으로 구매할 수 있습니다. 사용자는 다른 용해제를 선호할 수 있습니다. 개별 50 mg 바이알은 50 mL의 증류수로 재구성한 후, 2.5 mL를 정확히 3.0 mL 바이알로 분리합니다. 알리코트는 나중에 사용하기 위해 -20°C에서 냉동할 수 있습니다. -20 °C에 저장된 재구성된 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제의 안정성은 60일¹¹일입니다.

1. 각 과목마다 냉동 TNK 한 개씩 해동하세요. 실온에서 약 15분간 해동하세요.
2. 1cc 주사기를 사용해 정확히 1.5 mg/kg을 뽑아주세요. 예를 들어, 300g 쥐는 0.45mg이 필요합니다.
3. 동물에게 다시 마취를 시키고 임시 피부 봉합을 제거하세요.
4. 외경정맥의 어떤 가지든 노출하세요.
   참고: 실험실에서 이 경로에 더 익숙하다면 꼬리정맥을 사용할 수도 있습니다. 우리는 경정맥을 선호했는데, SPAN 외과의사들은 외부 경정맥 동원에 더 익숙하며, 이는 필라멘트 모델에서 일상적으로 이루어지고 있습니다.
5. 30G 또는 32G 바늘을 사용해 정맥에 직접 찔러 TNK를 주입합니다.
   참고: 처음에는 3-0 실크 루프 사이에 정맥을 분리하고 싶어 할 수 있습니다. 연습하면 이런 일은 필요 없을 거예요.
6. 절개 부위는 중단된 5-0 프로린이나 다른 흡수성 봉합사로 봉합하세요.
7. 5.14단계에 따라 동물을 회수 케이지로 다시 넣으세요.

7. 통계적 방법

1. 기술적 통계를 만들 때는 정규 분포 수치 데이터에는 평균과 표준편차를, 비정규 분포 데이터에는 중간값과 4분위 범위를 사용하세요. 범주별 데이터를 빈도 분포로 제시합니다. 가설 검정의 경우, 정규 분포 모수 데이터에 따라 t-검정 또는 ANOVA를 적용하라; 그렇지 않으면 가설 검정을 하지 마십시오.

결과

그림 1: 기증 동물의 혈액 채취 및 혈전 준비. 기증 동물의 혈액은 대퇴동맥 카테터 삽입을 통해 채취되어 EDTA(최대 4주간 보관 가능) 또는 EDTA(당일 사용 포함) 없는 마이크로 원심분리관으로 옮겼습니다. 혈전을 준비하기 위해 저장된 혈관에 염화칼슘 용액을 첨가하고 즉시 PE-50 카테터로 흡입했습니다. 코일드 PE-50 튜빙은 탁상용 오븐에서 37°C에서 미리 가열된 인산염 완충식염수(PBS)에 2시간 동안 배양되었습니다. 2시간 후, 혈액이 채워진 PE-50 튜브를 즉시 4°C로 옮겨 보관했습니다. 자세한 내용은 프로토콜 1절을 참조하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 주입을 위해 혈전을 카테터에 적재하는 과정. (A) MCAo 수술 당일, 혈전이 PE-50 튜브에서 PBS가 포함된 배양 접시로 배출되었습니다. (B) 페트리 접시에서 혈전을 면도날로 약 6cm 길이로 다듬었다. (C) 혈전은 PE-50 튜빙에 5번 당겨 배출한 뒤, PE-10 튜빙에 15번 배출하여 PBS로 세척했습니다. (D) 혈전이 농축된 에반스 블루 용액이 담긴 페트리 접시로 옮겨졌다. (E) 혈전은 희석된 에반스 블루 용액이 담긴 배양 접시에 옮겨져 조립식 마이크로카테터에 주입되었습니다. (F) 미세카테터는 쥐의 내경동맥을 통과해 카테터 끝에서 16mm 떨어진 곳에서 총경동맥의 경동맥 분기점에서 통과한 후 모터 주사기 펌프로 주입되었다. 자세한 내용은 프로토콜 2절을 참조하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요. 

파일럿 타당성 연구에서 우리는 6개 연구소에서 135명의 피험자를 등록시켰습니다. 피험자들은 8가지 치료 중 하나에 무작위로 배정되었으나, 이 모델은 모델의 실현 가능성을 보여주기 위해 집계 데이터를 보고합니다. 135명의 등록 대상 중 132명(98%)은 TNK가 적절한 용량과 시간에 투여되었습니다. 102마리(75%)에서 동물 사망 후 스캔 전에 MRI를 촬영하였으며, 33명(24%)은 TE-MCAo 후 3일 후에 MRI를 받았습니다. 3일차 이전의 동물 손실은 6개 실험실 모두에서 일관되게 나타났으며(표 1), 이 모델이 여러 장소에 배포될 수 있음을 나타냅니다. 병변의 평균 ± SD 크기는 13± 16%였으며(병변 면적은 허혈과 부종 포함 비율을 포함), 실험실별로 다소 변동이 있었다(표 2). 대표적인 MR 이미지와 사후 색전은 보충 그림 1에서 확인할 수 있습니다.

	실험실
가변	AG	죽음	IW	MG	SD	YL
표본 크기 (N)	23	30	11	28	24	19
MRI 완료	19	24	9	23	14	13

표 1: 실험실별 타당성. 연구실은 어거스타 대학교(AG), 듀크(DK), 아이오와 대학교(IW), 매사추세츠 종합병원(MG), 샌디에이고 대학교(SD), 예일 대학교(YL)였습니다. 등록된 동물 수(N)와 뇌졸중 3일째에 MRI 촬영을 받은 생존자 수가 나와 있습니다. 이 데이터는 모델의 실현 가능성을 뒷받침합니다.

부지	표본 크기 (N)	병변 부피(%) 평균 ± SD	중간 이동 지수 (%) 민± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
죽음	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	19± 4일
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

표 2: 3일차 MRI 스캔에서 부위별로 관찰된 병변 부피. 모델의 재현성을 6개 연구 부지에서 확립하기 위해 병변 부피(허혈 및 부종)와 정중 이동을 비교하였다. 병변 부피는 동측 반구의 면적 비율로 표현됩니다. 정중 이동은 두개내 공간의 최대 너비의 선형 백분율로 표현됩니다. 데이터는 실험실 간 이질성을 확인시켜 줍니다.

보충 그림 1: 대표 이미지. (A-E) TE-MCAo 후 48시간 후에 촬영한 쥐 뇌의 다양한 다중 에코, 다중 스캔(MEMS) 이미지. 단면은 브레그마보다 약 1mm 앞쪽에 위치해 있습니다. (F-J) MCA 기원에 박힌 색전의 여러 사례. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

우리는 다실험실 전임상 검사 네트워크인 SPAN에 사용하기 위해 허혈성 뇌졸중의 혈전색전성 설치류 모델을 정교화했습니다. 우리는 기증자 혈액을 보관하는 방법을 개발하여 사용되는 동물 수를 크게 줄였습니다. 또한 혈전색전증 준비와 수술 절차를 단순화하여 하루에 여러 MCAo 시술을 수행할 수 있도록 했습니다. 저희의 목표는 TE-MCAo가 널리 사용되는 나일론 필라멘트 버전의 MCAo와 동일한 사용자 편의성과 수술용 볼륨을 달성하는 것입니다. 이 결과를 얻기 위해 우리는 두 차례의 대면 외과의사 교육 워크숍을 개최했으며, 이 연구에 참여한 모든 외과의사들은 이미 수개월, 심지어 수년간의 표준 필라멘트 모델 경험을 갖추고 있었습니다. 우리는 6개의 서로 다른 연구소에서 타당성을 입증했고, 우수한 프로토콜 준수를 보여주었습니다.

이 프로토콜을 시행하기로 결정할 때, 조사자는 프로토콜의 성공을 결정하는 다음 항목들을 고려해야 합니다. 첫째, 혈액 채취에 대한 철저한 주의가 혈전 형성의 성공에 영향을 미칩니다. 조기 응고를 방지하기 위해 정맥이 아닌 동맥 혈액을 채취해야 합니다. 둘째, 필요 이상으로 많은 혈액을 채취하는 것이 중요합니다. 때로는 한 개체가 하룻밤 사이에 혈전이 형성되지 않고, 다른 개체들은 그렇지 않을 때도 있습니다. 셋째, 카테터 로딩은 광학 확대기, 즉 헤드램프가 달린 수술용 루페나 조명이 있는 확대 렌즈를 사용하는 것을 강력히 권장합니다. 넷째, CCA, ICA, ECA를 신중하고 신중하게 해리하여 파열과 혈관 내 혈전증을 예방하는 것이 필수적입니다. 또한, 분만 카테터가 ICA에 제대로 들어갈 수 있도록 PPA를 시각화하는 것이 필수적입니다. 다섯째, 혈전용해제 주사로 인해 설치류에게 부작용이 나타나는 경우는 드뭅니다. 저희 연구에서는 TNK 주사 후 혈관부종이나 말초 출혈과 같은 부작용이 나타나지 않았습니다. 불가능하다는 뜻은 아니지만, 설치류에서 혈전용해제의 전신 부작용 보고는 알려진 바가 없습니다. 이 프로토콜을 처음 도입하기로 선택한 연구자는 여기서 공동 저자로 지정된 연구자 중 한 명과 상담하는 것이 좋을 수 있습니다. 저희는 맞춤형 지도가 매우 도움이 되었습니다.

후보 치료제를 시험할 동물 질병 모델을 선택할 때는 약물이 치료하려는 환자 집단을 정확히 나타내는 것이 중요합니다. 국소 허혈성 뇌중 모델에는 로즈 벵갈 광혈전 모델, 피질 회암동맥 폐색, 입체정위 엔도텔린-1 주사^13,14,15가 포함됩니다. 이 모델들은 예측 가능한 피질 영역에 고도로 재현 가능한 병변을 만들어낸다는 장점이 있습니다. 이러한 이점은 세포 기전 연구나 병변 위치와 행동 결과를 연관 짓는 데 선호됩니다. 추가적인 비용, 복잡성, 재관류 요소가 없어 약물 검사에 덜 유용합니다.

대혈관 폐쇄(LVO^)의 MCAo가 주요 혈관 폐색(LVO)의 주요 모델^입니다. 실리콘 코팅 모노필라멘트 모델은 실행이 간단하며 널리 사용됩니다. 병변의 위치와 크기는 예측하기 어렵지만, 대규모 약물 검사에서는 인간 뇌졸중 역시 상당히 이질적이기 때문에 이러한 이질성이 장점으로 여겨집니다^18,19. 단필라멘트 방법의 단점은 폐쇄가 생물학적으로 불활성이라는 점입니다. 환자에서 혈전과 혈전용해증은 트롬빈, 플라스미노겐 및 기타 혈전 요소 방출과 관련된 염증성 연쇄 반응을 일으킵니다 20,21,22. 이 한계를 극복하기 위해 많은 연구들이 토끼, 돼지, 개, 비인간 영장류 연구에서 혈전색전증 모델을 제안했습니다 ^{23,24,25,26,27}. 이러한 연구는 복잡하며 전반적으로 전문성이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 우리는 다실험실 전임상 검사 네트워크에 적용하기 위해 혈전색전증 모델을 적용하고자 노력했습니다. 이를 위해 혈전색전검사 준비를 단순화하고, 수술 절차를 간소화하며, 필요한 동물 수를 크게 줄여야 했습니다. 우리는 6개의 서로 다른 실험실에서 우수한 프로토콜 준수율(표 1)와 병변 크기가 비교적 일정한 상태로 성공적으로 배포될 수 있는 혈전색전증 모델인 TE-MCAo를 고안했습니다(표 1). 처리량은 충분하여 주당 평균 6명의 피험자를 처리했습니다.

도움이 될 수 있는 여러 문제 해결 단계가 있습니다. 혈액이 혈전으로 실패하는 것이 프로토콜 실패의 가장 흔한 원인이며, 대부분 수술 테이블에 놓일 경우 EDTA 또는 헤파린으로 카테터가 오염되어 발생합니다. 우리는 철저한 채권 수집 방법을 권장합니다. 또한 EDTA 프레시를 불활성화시키는 데 사용되는 염화칼슘 용액을 매주 또는 격주로 준비하는 것을 권장합니다. 혈전을 제제 카테터에서 용출한 후, 혈전을 필요한 5cm 조각으로 절단하는 것이 어려울 수 있습니다. 일부 혈전은 연약하고 쉽게 골절됩니다. 혈전은 광학 확대기로 준비할 것을 권장하며, 극단적인 경우에는 다른 기증자 혈전으로 옮겨가야 합니다. 흡인과 탈출 혈전은 중간 정도의 기술이 필요합니다; 따라서 꽤 긴 훈련 기간을 권장합니다. 흡인 카테터 끝에 걸림돌이 없는지 광학 확대를 사용해 확인하세요. 혈전은 이식 카테터에 끼워질 수 있으니, 흡인과 용출 사이를 부드럽게 '앞뒤로' 삽입하는 것을 권장합니다. 전형적인 MCAo 필라멘트 모델에 익숙한 외과의사에게 PPA 식별은 새로운 단계일 수 있습니다. 혈전을 에반스 블루로 표시하여 카테터가 ICA를 통과하는 과정을 추적하고 추적할 수 있도록 강력히 권장합니다. ICA/PPA의 분기는 ICA를 따라 신중하고 깊은 박리를 통해 쉽게 찾을 수 있으며, 내경동맥의 가느다란 가지까지 안정적으로 위치합니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 제한이 있습니다. 설치류 경동맥 캐논리화를 수행하려면 외과적 기술의 요소가 필요합니다. 하지만 필라멘트 모델도 마찬가지입니다. 혈전증 처리는 외과적 기술도 필요합니다. 모든 혈전색전증 모델과 마찬가지로, 필라멘트 모델에 비해 성공적인 경색률이 낮습니다. 조사 목표가 경색의 빈번한 발생이라면 필라멘트 모델이 더 바람직합니다. 반면, 혈전과 혈전용해의 복제가 목표라면 이 모델이 바람직합니다.

이 모델은 혈전과 혈전용해를 충실히 활용한 모델을 사용하여 후보 뇌 보호제를 시험하기 위해 설계되었습니다. 향후 방향으로는 리플로이 없음 현상을 겨냥한 보조제 치료 연구도 포함될 수 있습니다. 많은 이들이 이를 위해 항응고제와 항혈소판제를 제안했습니다.

결론적으로, 여기서 제시된 TE-MCAo 프로토콜은 여러 실험실에서 배포할 수 있도록 조정되었습니다. 혈전 준비를 단순화하고 수술 절차를 간소화했습니다. 우리는 기증자 혈액을 저장하는 방법을 고안해 필요한 동물 수를 크게 줄였습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1ml 주사기	BD	309628
10배 루페
1cc 주사기	테루모	SS-01T
23g 둔한 바늘	그레인저	5FVK7
3.0cc 주사기	BD	309656
3-0 실크 리가처
30g 바늘	BD	305128
5-0 프로린 봉합사	에티콘	8698	피부 상처를 닫으려고
5-0 실크 리가처	에티콘	A182
동맥류 클램프
아트로핀 황산염	베테랑 원	NDC86136-006-10	기관지 분비물을 줄이기
둔탁한 홈 겸자
부피바케인	젤리아 제약회사	NDC70594-118-01	국소 마취
염화칼슘	시그마	C7902
카프로펜	조이티스 주식회사	NADA #141-199	진통제
원심분리관	에펜도르프	22364111	혈액 채취를 위해
에탄올	콥텍	UN1170
에반 s 블루	시그마	E2129
온열 패드	하버드 장치	K021-435
정혈 클램프
이소플루란	베테랑 원	NDC13985-528-60
메이드 바이 미 얼티밋 위빙 루프	호라이즌 그룹	해당되지 않음	부드러운 구속구
마이크로 가위	F.S.T.	15000-00
마이크로카테터	닥콜 코퍼레이션	PE-FL-360-200-300	조립식 주사 카테터
PE-10 카테터	BD	427401
PE-100 튜빙	내부 구급	7426
PE-50 튜빙	BD	427410
소아용 EDTA 튜브	BD 마이크로테이너	K2E-363706	기증자 혈액을 보관합니다
페트리 접시	에펜도르프	30702115
인산염 완충 식염수	피셔	B2438
프리반틱	PDI 주식회사	NDC10189-1080-1	소독제
면팁	VWR	89031-288
면도날	AccuTec 프로	71960
생리식염수	호스피라 주식회사	NDC 0409-4888-02
가위	F.S.T.	14958-11
날카로운 겸자
주사기 펌프	뉴 에라 펌프스 주식회사	BS-300
테이블탑 오븐	부켈	132000
테넥테플라제 (TNK)	제넨텍, 샌프란시스코	NDC50242-120-47	혈전용해증
귀 태그	RapID Lab, 샌프란시스코, CA	RapID 태그