Name: 대동맥 링 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-24T15:33:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 쥐 대동맥 링 분석을 통해 혈관신생을 연구하는 방법을. 3D 매트릭스에서 혈관이 자라나는 과정을 관찰하고 다양한 혈관신생 촉진제 및 억제제의 효과를 평가할 수 있습니다.

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실험 하루 전에 : <ol><li> BME가 (감소 성장 인자, Cultrex, Trevigen) 얼음이나 4에 해동을 허용 ° C, 한번 다시 응고를 방지하기 위해 얼음 계속 해동. </li></ol> 실험 일 : <ol><li> 마우스 (오래된 6~7주)은 anesthetized하고 출혈하는 것입니다. </li><li> 감기 멸균 PBS 가득한 페트리 접시에 흉부 대동맥을 제거합니다. </li><li> 지방 조직 주변에서 기계 청소를 수행합니다. 참고 언제든지 대동맥의 건조하지 마십시오. </li><li> 수술 칼날을 사용하여, 1mm의 고리에 균등하게 대동맥을 슬라이스. 상처가 균일하고 깨끗하게해야합니다. </li><li> 신선한 차가운 PBS로 반지를 전송하고 항상 얼음에 보관. </li><li> 사전 냉각 피펫 팁을 사용하여 48 자 판 150 ML 감기 BME의 둥근 방울의 각 잘 추가할 수 있습니다. 37 응고에 BME 드롭 ° 20~30분 C를 허용합니다. </li><li> 각 돔의 상단 중앙에 하나의 대동맥 반지를 놓습니다. 37 10 분 품어 ° C. </li><li> 각 링 위에 추가 150 ML의 BME를 추가합니다. 37 20~30분에 대한 품어 ° C. </li><li> 매체 준비 : 인간 내피 혈청 무료 매체 (GIBCO, 칼스 배드, CA) 2% FCS, 50 단위 / ML 페니실린 50 μg / ML 스트렙토 마이신 (Cellgro)과 보완. </li><li> 각 역시 포함 500 ML 매체를 추가하십시오 <ol class="lalpha"><li> 실험 샘플. </li><li> 긍정적인 제어 : 내피 세포 성장 보완 (ECGS, 최종 농도가 200 μg / ML, BD Biosciences). </li><li> 대조군 : 혼자 중간. </li></ol></li><li> 37 품어 판 ° 12 일 동안 C 표준 위상 콘트라스트 입체경 미만 일 6 12 일까지 사진 반지. </li><li> 옵션 : supernatants를 수집합니다. </li></ol> 참고 : <ol><li> 항상 살균 조건을 유지. </li><li> BME에 거품 도입하지 마십시오. </li></ol>

<ol><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).</li>
<li>Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aortic+ring+assay%3A+a+new+approach+of+the+molecular+genetics+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis.</a> Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).</li>
</ol>

대동맥 고리 분석은 물론 안티 angiogenic 요인으로 angiogenic 평가할 수있는 방법에 유익한 도구입니다. 그들은 생체내에 neovessels에 해부학적인 몸의 구조와 유사한 것을 의미 내피 세포 튜브와 연결하는 대동맥 고리 모집 평활근 세포와 pericytes에서 밖으로 성장 선박. 또한, 마우스 대동맥 링 분석이 종족에 대한 가능한 유전자 변형 도구의 광대한 배열의 장점을 보유하고 있습니다. 그러나, 대동맥 고리 분석 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 생체내에서 선박의 파생물은 microvessels에서가 아니라 같은 대동맥 같은 주요 혈관에서 발생합니다. 둘째, 반지의 처리에 일관성 및 선박에 남아있는 조직이 주변의 금액은 선박 가지 영향을 미칠 수있다. 다른 aortas하거나 다른 마우스의 연령과 계통의 반지는 또한 angiogenic 반응을 방해할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, Angiogenic 선박 가지가 아닌 이상 사진과 수치하게 삼차원에 발생합니다. 함께 촬영, ...

대동맥 링 분석

Aortic Ring Assay

Angiogenesis는 전부터 vasculature의 혈관이 돋아는 자연과 병리 학적 프로세스를 모두와 연결되어 있습니다. 다양한 angiogenesis assays의 문화의 조건 (1)에서 개별 내피 세포의 연구를 포함하고 있습니다. 대동맥 링 분석은 장기 문화를 기반으로 angiogenesis 모델입니다. 이 분석에서는 angiogenic 선박 대동맥 ((2)에서 수정)의 세그먼트에서 성장. 간단히 마우스 흉부 대동맥이 excised이며, 지방 레이어와 adventitia 제거하고, 고리 길이 약 1mm가 준비가되어 있습니다. 개인 고리는 다음 48 잘 접시의 각각의 우물 안으로 캐스팅 지하 매트릭스 추출 (BME)의 작은 고체 돔에 포함됩니다. Angiogenic 요소와 angiogenesis의 억제제 직접 고리에 추가 될 수 있으며, 대동맥 고리와 다른 세포 유형의 혼합 공동 문화 paracrine angiogenic 효과 연구에 대한 고용 수 있습니다. 돋아은 6-12 일 기간 동안 stereomicroscope 이하 검사로 관찰합니다. 6 plicates의 대동맥 세그먼트 실험에서 부정으로 인한 큰 변화로 인해 적극 권장합니다. Neovessel의 가지는 위상 현미경을 사용하여 실험을하고 몇 군데에 걸쳐 모니터링하고, supernatants는 관련 angiogenic 및 안티 angiogenic 요인, 세포 사망 마커 및 아질산염의 측정을 위해 수집됩니다.

Angiogenesis는, 기존 vasculature의 혈관이 돋아는 자연과 병리 학적 프로세스를 모두와 연결되어 있습니다. 여기 angiogenic potentiators와 억제제가 직접 문화에 대동맥 링으로 추가할 수 대동맥 고리 분석을 보여줍니다. 돋아 및 neovessel의 파생물은 6-12 일 기간 동안 대동맥 고리를 조사하여 결정하실 수 있습니다.

기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 돋아나는 혈관신생(Angiogenesis)은 자연적인 과정과 병리적인 과정 모두와 관련이 있습니다. 다양한 혈관신생...

대동맥 링 분석(aortic ring assay)의 전반적인 목적은 3D 매트릭스 내에서 마우스 대동맥 전체 조각으로부터 혈관이 발아하는 유연한 실험 시스템을 제공하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스에서 흉부 대동맥을 박리한 후, 주변에 남아 있는 조직을 조심스럽게 제거하여 세척합니다. 세척된 대동맥의 단면 또는 대동맥 링을 돔 형태로 성형된 기초 매트릭스 추출물(basal matrix extract) 또는 BME가 들어 있는 48-웰 플레이트의 개별 웰에 배치합니다.BME 한 방울을 추가로 떨어뜨려 링을 3D 구조 내에 가둡니다. 매트릭스에는 선택한 임의의 실험 시약을 포함할 수 있습니다. 수일간 배양 후, 대동맥 링에서 혈관이 생성되는 것을 관찰할 수 있으며, 테스트 화합물의 혈관 형성 잠재력을 평가할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 이스라엘 베에르셰바에 위치한 네게티브 베온 대학교 임상 생화학과의 E. Lewis 박사 연구실 소속 Karen Bein입니다. 오늘은 마우스 대동맥 링 분석법(mouse aortic ring assay) 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 혈관 형성에 미치는 다양한 물질의 효과를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 기저막 추출물(basement matrix extract, BME)을 얼음 위 또는 4 °C에서 해동하십시오. 해동 후에는 BME가 다시 응고되는 것을 방지하기 위해 계속 차갑게 유지하십시오.실험 당일에 6~7주령의 마우스를 표준 케타민 및 자일라진 주입법으로 안락사시킨 후, 경동맥을 통해 빠르게 방혈하고 경추 탈구를 실시합니다. 멸균 라미나 플로우 후드 내에서 70% ethanol로 동물을 닦아내어 절차를 시작합니다. 다음으로, 해부 현미경 하에서 멸균 핀셋과 해부용 가위를 사용하여 피부를 수직으로 절개하고 복벽을 엽니다.늑골을 절개하고 횡격막을 제거하여 흉골 상단이 노출되도록 절개해야 합니다. 모든 장기를 조심스럽게 옆으로 밀어 척추를 따라 위치한 흉부 대동맥을 완전히 노출시킵니다. 대동맥이 노출되면 대동맥과 척추 사이에 얇은 멸균 핀셋을 삽입합니다. 핀셋을 벌려 대동맥을 서서히 들어 올려, 흉부 분절을 나머지 대동맥 부분과 분리합니다.대동맥이 분리되었으면, 날카로운 가위를 사용하여 신혈관과 가까운 끝부분부터 시작하여 심장 근처까지 절개하여 마우스로부터 제거합니다. 적출한 흉부 대동맥을 차가운 멸균 PBS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 대동맥이 제거되었으므로, 이제 이안현미경 하에서 두 개의 멸균 핀셋을 사용하여 대동맥 링을 준비할 수 있습니다.흉부 대동맥 주변의 지방 조직을 제거합니다. 대동맥이 손상되지 않도록 주의하며 가장자리 부분만 잡고 조작하십시오. 최종적으로 세척이 완료될 때까지 대동맥의 탈수를 방지하기 위해 PBS가 담긴 페트리 접시에 반복적으로 담가 두어야 합니다.흉부 대동맥을 깨끗하게 세척한 후, 수술용 칼을 사용하여 실체 현미경 하에서 대동맥을 1 mm 두께의 고리 모양으로 균일하게 자릅니다. 절단면 아래에 놓인 자를 가이드로 삼아 절단하며, 예리함을 유지하기 위해 새 칼날을 사용하고 주기적으로 교체하십시오. 대동맥의 양 끝단은 사용하지 않습니다. 각 고리를 자른 후에는 핀셋을 사용하여 차가운 PBS가 담긴 새 접시에 매우 조심스럽게 옮깁니다.분석의 무작위성을 보장하기 위해 모든 링을 동일한 PBS 포함 플레이트에 넣으십시오. 대동맥의 각 분절은 혈관 형성 잠재력이 어느 정도 다르므로, 링을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 분석 플레이트를 준비하십시오.48-웰 플레이트의 각 웰에 차가운 BME 약 150 µL를 첨가합니다. 이때 BME 방울은 투하 도중 돔 형태로 응고됩니다. BME는 물질의 수송과 세포의 화학성 유인, 그리고 가장 중요하게는 신생 혈관 형성으로 이어지는 세포 분화와 이동을 가능하게 합니다. BME의 탈수를 방지하기 위해 외곽 웰은 PBS로 채우고, BME 방울이 37 °C에서 20~30분 동안 응고되도록 둡니다. BME가 응고되면 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 대동맥 링을 조심스럽게 들어 올립니다. 손상을 방지하기 위해 링은 핀셋 팁 사이에 형성된 지질 방울 내부에 위치시켜 옮겨야 합니다. 액체의 표면 장력을 이용하여 각 돔의 상단 중앙에 대동맥 링 하나를 배치하고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 각 링의 위에 BME 150 µL를 추가로 첨가하고 20~30분 동안 배양합니다.37°C에서 링이 BME로 둘러싸였으며 이제 분석이 가능합니다. 분석을 시작하기 위해 플레이트에 재료를 추가할 수 있습니다. 이전에 준비한 인간 혈관 내피 세포 무혈청 배지에 실험 재료 또는 음성 대조군에 대한 양성 대조군으로 혈관 내피 세포 성장 보충제를 보충하십시오.배지만을 사용합니다. 각 웰에 보충제가 포함된 배지 500 µL를 추가하고 37 °C에서 6~12일 동안 배양합니다. 이 배양 기간 동안 현미경으로 플레이트를 관찰하여 대동맥에서 뻗어 나오는 혈관과 추가적인 분지 혈관으로 확인되는 고도로 성숙한 혈관이 있는지 확인합니다.표준 위상차 실체 현미경을 사용하여 6일에서 12일 사이에 고리 조직으로부터 3차원으로 뻗어 나오는 고리를 촬영해야 합니다. 또한, 6일에서 12일 사이의 다양한 날짜에 상층액을 수집하여, 하루 이내에 사용할 경우 4°C에 보관하고 향후 사용할 경우 -20°C 또는 -80°C에 보관하십시오. 상층액은 vgf에 대한 ELISA 또는 산화질소 수치 측정을 위한 Griess assay와 같은 다양한 기술로 분석할 수 있습니다.이 이미지들은 웰에 링을 배치하고 상단 행의 이미지에 보이는 배지 또는 하단 패널에 보이는 혈관 발아의 양성 대조군으로 사용된 ECGS와 함께 배양한 지 12일 후에 수집되었습니다. 각 이미지는 조건당 분석에 통상적으로 사용되는 12개의 링 중 4개의 대표적인 스냅샷입니다.각각의 별도 웰에 있는 각 대동맥 링의 모서리는 검은색입니다. 이렇게 촬영했을 때, ECGS에 노출된 대동맥 링은 혈관 성장을 보이며, 화살표는 형성된 수많은 혈관 중 몇 가지를 가리킵니다. 각 혈관은 내피세포의 사슬 형태로 특징지어지며, 때때로 분지(branching)가 나타나는 것은 이들이 성숙했음을 나타냅니다.배양물에서 발아 혈관이 관찰되지 않습니다. 상단 패널의 배지 웰입니다. 지금까지 이 절차를 통한 대동맥 원형 분석법의 수행 방법을 보여드렸습니다. 정확하게 작업하고 멸균 조건을 유지하는 것이 중요함을 기억하십시오.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

기관 삽관과 인공 호흡기의 사용을 제거하면서 최소 침습 가로 대동맥 수축 (MTAC)는 일반 가로 대동맥 수축 (TAC)의 본질을 절약합니다. 그것은 특히 병진 연구에서 좌심실 과부하에 높은 처리량 연구를위한 매우 바람직한 방법으로 증명한다.

마우스의 최소 침습 가로 대동맥 수축

여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

여기, 선물이 측면 thoracotomy 통해 가로 대동맥 수축 (TAC)의 프로토콜. 이 기술은 압력 과부하 및 마우스 활용 표준 전술 실험실 설정에서에서 심장 마비를 시뮬레이션을 최소 침 습, 닫힌 가슴 수술입니다.

마우스에 가로 대동맥 수축 유도를 폐쇄 가슴 모델

여기서 우리는 대동맥 수축의 잘 확립 된 마우스 모델에서 탈밴드 수술 대동맥의 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 비대의 좌심실 역 리모델링 및 회귀의 근본적인 메커니즘을 연구할 뿐만 아니라 심근 회복을 가속화할 수 있는 새로운 치료 옵션을 테스트할 수 있습니다.

설치류에서 대동맥 탈밴드에 의해 왼쪽 심실 역 리모델링 공부

성인 쥐를 위한 심장 해부학 및 기능의 경피성 심초음파 평가를 위한 비침범성 프로토콜은 현재 연구 결과에서 제출됩니다. 심장 판막, 네 개의 심장 챔버 및 오름차순 대동맥, 대동맥 아치 및 내림차순 대동맥이 자세히 연구됩니다.

성인 쥐에서 심장 해부학 및 기능의 심초음파 평가

이 프로토콜은 마우스에서 대동맥 역류(AR)를 생성하는 수술에 대한 실용적인 가이드를 제공합니다. 심장초음파검사 및 침습적 혈류역학적 측정에 의한 AR 마우스의 평가는 부피 과부하 유발 편심 비대의 임상적으로 관련된 특성을 요약하여 심장 비대 연구에서 유망한 응용 프로그램을 제안합니다.

쥐의 대동맥 역류에 의한 외과적으로 유도된 심장 용적 과부하(Surgically Induced Cardiac Volume Overload by Aortic Regurgitation in Mouse)

본 프로토콜은 래트 관상동맥의 혈관 반응성을 측정하기 위한 와이어 근그래프 기술을 기술한다.

표준화 된 쥐 관상 동맥 링 준비 및 용기 직경에 따른 동적 장력 변화의 실시간 기록

본 프로토콜은 심장 비대에 압력 과부하를 유도하기 위해 마우스에서 대동맥 밴딩의 새로운 기술을 기술한다. 밴딩에는 내경이 고정 된 고무 링이 사용됩니다. 이 새로운 기술은 향후 실험을 위해 변동을 줄이고 재현 가능한 데이터를 약속합니다.

O-링 대동맥 밴딩 대 압력 과부하로 인한 심장 비대 모델링을 위한 기존의 횡대동맥 수축

유체역학적 특성을 테스트하기 위해 펄스 복사기에 돼지 대동맥 판막을 장착하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 대형 동물 모델에 사용하기 전에 실험 절차 또는 새로운 의료 기기를 적용한 후 유체 역학의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

실험적 대동맥 판막 시술 및 새로운 의료 기기의 유체역학 테스트를 위한 생체 외 돼지 모델

배우세요 쥐 대동맥 링 분석을 통해 혈관신생을 연구하는 방법을. 3D 매트릭스에서 혈관이 자라나는 과정을 관찰하고 다양한 혈관신생 촉진제 및 억제제의 효과를 평가할 수 있습니다.

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