대동맥 링 분석

대동맥 고리 분석의 전반적인 목표는 3D 매트릭스 내부의 전체 마우스 대동맥 조각에서 혈관이 싹을 틔우는 유연한 실험 시스템을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 흉부 대동맥을 절개한 다음 주변에 남아 있는 조직을 조심스럽게 청소함으로써 달성됩니다. 깨끗한 대동맥 또는 대동맥 고리의 조각은 각각 돔으로 성형된 기저 기질 기질 추출물 또는 BME를 포함하는 48웰 플레이트의 개별 웰에 배치됩니다.

BME의 추가 방울은 링을 3D 구조로 둘러쌉니다. 매트릭스에는 선택한 모든 실험 시약이 포함될 수 있습니다. 며칠 동안 배양한 후 대동맥 고리에서 혈관이 싹트는 것을 관찰할 수 있으며 테스트 화합물의 혈관 신생 가능성을 평가할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 이스라엘 Be Sheva에 있는 Beon University of the Negative의 임상 생화학과 Dr.E Lewis 실험실의 Karen Bein입니다. 오늘은 마우스 대동맥 고리 분석 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 다양한 물질이 혈관 형성에 미치는 영향을 연구합니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 지하 매트릭스 추출물 또는 BME를 얼음 또는 섭씨 4도에서 해동시킵니다. 한 번 해동되면 BME가 다시 응고되는 것을 방지하기 위해 BME를 계속 차갑게 유지하십시오.

실험 당일, 6-7주 된 생쥐를 표준 케타민과 자일라진 주사로 안락사시키면 목 동맥을 통해 빠르게 출혈이 발생하고 경추 탈구가 발생합니다. 멸균 층류 후드에서 70% 에탄올로 동물을 닦는 것으로 절차를 시작합니다. 그런 다음 해부 범위에서 작업하면서 멸균 집게와 해부 가위를 사용하여 피부를 수직 절개하고 복막벽을 엽니다.

절개는 흉곽 상부를 노출시키도록 해야 하며, 흉곽도 절단하고 횡격막을 제거해야 합니다. 대동맥이 노출된 척추 옆에 위치한 흉부 대동맥을 완전히 노출시켜 모든 장기를 조심스럽게 옆으로 밀어내고 대동맥과 척추 사이에 얇은 멸균 핀셋을 삽입합니다. 핀셋을 벌리고 대동맥을 침대에서 서서히 들어 올려 흉부 분절을 대동맥의 나머지 부분과 분리합니다.

이제 대동맥이 분리되었으니, 날카로운 가위를 사용하여 신장 혈관에 가까운 끝에서 시작하여 심장 근처에서 끝나는 쥐로부터 대동맥을 잘라냅니다. 절제된 흉부 대동맥을 차갑고 멸균된 PBS로 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 이제 대동맥이 제거되었으므로 두 개의 멸균 핀셋을 사용하여 쌍안경으로 작업하여 대동맥 고리를 준비할 수 있습니다.

주변 지방 조직에서 흉부 대동맥을 청소합니다. 대동맥이 손상되지 않도록 하고 가장자리만 잡으십시오. 대동맥은 최종적으로 청소될 때까지 탈수를 방지하기 위해 페트리 접시가 포함된 PBS에 반복적으로 담가야 합니다.

이제 흉부 대동맥이 깨끗해졌으므로 수술용 칼날을 사용하고 쌍안경 아래에서 작업하여 대동맥을 1mm 고리로 고르게 자릅니다. 절단면 아래에 있는 자를 가이드로 사용하여 새 날을 사용하고 수시로 교체하여 선명도를 유지하십시오. 대동맥 끝을 사용하지 않음 각 고리를 자른 후 핀셋을 사용하여 차가운 PBS가 들어있는 새 접시에 아주 부드럽게 옮깁니다.

모든 고리를 동일한 PBS 함유 플레이트에 배치하여 분석이 무작위화되도록 합니다. 대동맥의 각 분절은 약간 다른 혈관 형성 전위를 가지고 있기 때문에 고리를 얼음 위에 두십시오. 다음으로, 사전 냉각 피펫 팁을 사용하여 분석 플레이트를 준비합니다.

48 웰 플레이트의 각 웰에 약 150 마이크로 리터의 차가운 BME 방울을 추가하면 드롭이 돔 동작으로 응고됩니다. BME는 물질의 수송, 세포의 화학주성, 그리고 가장 중요한 것은 신혈관 형성으로 이어지는 세포 분화 및 이동을 허용합니다 주변 웰은 PBS로 채워집니다 BME 탈수를 피하기 위해 BME 방울이 섭씨 37도에서 20-30분 동안 응고되도록 합니다. BME가 응고되면 손상을 방지하기 위해 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 대동맥 고리를 조심스럽게 들어 올리고, 핀셋 팁 사이에 형성되는 지질 방울 내부로 고리를 옮겨야 합니다.액체 표면 장력의 결과로, 각 돔의 상단 중앙에 단일 대동맥 고리를 놓고 각 고리 위에서 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 150마이크로리터의 BME를 추가로 첨가하고 20-30분 동안 배양합니다.

섭씨 37도에서 링은 이제 BME와 분석으로 둘러싸여 있습니다. 분석을 시작하기 위해 플레이트에 재료를 추가할 수 있습니다. Pres 보충제는 이전에 실험 물질 또는 내피 세포 성장 보충제를 음성 대조군에 대한 양성 대조군으로 사용하여 인간 내피 혈청이 없는 배지를 준비했습니다.

매체만 사용하십시오. 500 마이크로리터의 프레스 보충제 배지를 각 웰에 첨가하고 섭씨 37도에서 6-12일 동안 배양합니다. 이 잠복기 동안 현미경으로 플레이트를 검사하고 대동맥에서 싹이 트는 혈관과 추가 분기 혈관으로 식별된 성숙한 혈관을 찾습니다.

고리 조직에서 안으로 확장되어야 하며, 표준 위상차 입체경으로 6일째와 12일째 사이에 고리를 3차원으로 촬영해야 합니다. 또한 6일째부터 12일까지의 다양한 날에 상등액을 채취하여 4도에서 보관하여 하루 이내에 사용하거나 Eloqua를 사용하여 향후 사용을 위해 영하 20도 또는 영하 80도로 보관합니다. 상등액은 vgf에 대한 Eliza 또는 산화질소 수준에 대한 그리스 분석과 같은 다양한 기술로 분석할 수 있습니다.

이러한 이미지는 웰에 고리를 배치하고 배양, 이미지의 맨 윗줄에서 볼 수 있는 배지 또는 혈관 발아에 대한 양성 대조군으로 사용된 ECGS로 배양한 후 12일 후에 수집되었습니다. 아래쪽 패널에서. 각 이미지는 12개의 고리 중 4개의 대표적인 스냅샷이며, 이는 일반적으로 조건별 분석에 사용됩니다.

각 개별 웰에 있는 각 대동맥 고리의 모서리는 검은색입니다. 이런 식으로 사진을 찍으면 ECGS에 노출된 대동맥 고리는 혈관 성장을 보이며 화살표는 형성된 많은 혈관 중 몇 개를 가리킵니다. 각 혈관은 내피 세포의 사슬로 특징지어지며 때때로 분지가 있어 성숙했음을 나타냅니다.

배양물에서 싹이 트는 혈관은 관찰 할 수 없습니다. 상단 패널의 중간 웰, 이 절차를 수행할 때 대동맥 cor assay를 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 정확하게 일하고 그들의 조건을 이해하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.